Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" Российской академии медицинский наук (ФГБУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" РАМН) (RU)
Приоритеты:
подача заявки: 2012-08-14
публикация патента: 20.07.2014
Изобретение относится к медицине и касается способа выявления групп изоформ тканеспецифического транскрипционного фактора HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="/images/img_patents/2/2522/2522805/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> в гепатоцеллюлярных карциномах человека. Способ представляет собой иммуногистохимический способ исследования с использованием моноклональных антител к группам изоформ HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="/images/img_patents/2/2522/2522805/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> и характеризуется тем, что для выявления антигенов используют двухступенчатую высокочувствительную полимерную пероксидазную систему. Демаскировку осуществляют в цитратном буфере при рН 6,0 и t=95°, при инкубации с первичными антителами используют высокое разведение антител HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="/images/img_patents/2/2522/2522805/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P2 и HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="/images/img_patents/2/2522/2522805/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P1 - 1,5 мкг/мл и 3 мкг/мл соответственно. Изобретение обеспечивает высокую специфичность и чувствительность способа, высокую точность оценки интенсивности окрашивания ядер опухолевых клеток, оценку степени дифференцировки опухолевых клеток и их злокачественности по уровню экспрессии групп изоформ HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="/images/img_patents/2/2522/2522805/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , сокращение времени исследования до 4 часов. 3 пр., 4 ил.
Формула изобретения
Способ выявления групп изоформ тканеспецифического транскрипционного фактора HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="/images/img_patents/2/2522/2522805/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> в гепатоцеллюлярных карциномах человека, представляющий собой иммуногистохимический способ исследования с использованием моноклональных антител к группам изоформ HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="/images/img_patents/2/2522/2522805/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , отличающийся тем, что для выявления антигенов используют двухступенчатую высокочувствительную полимерную пероксидазную систему, демаскировку осуществляют в цитратном буфере при рН 6,0 и t=95°, при инкубации с первичными антителами применяют высокий титр антител к HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="/images/img_patents/2/2522/2522805/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P2 и HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="/images/img_patents/2/2522/2522805/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P1 - 1,5 мкг/мл и 3 мкг/мл соответственно.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и касается способа выявления групп изоформ тканеспецифического транскрипционного фактора Hepatocyte Nuclear Factor (HNF) 4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> в гепатоцеллюлярных карциномах человека.
Транскрипционный фактор HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> - один из центральных регуляторов дифференцировки клеток печени, почек, кишечника и поджелудочной железы [Sladek F.M., Seidel S.D. Hepatocyte nuclear factor 4a. In "Nuclear Receptors and Genetic Diseases" (Burris, T.P., and McCabe, E., Eds.), 2001, pp.309-361. Academic Press, London]. Описано существование двух промоторов гена HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , P1 и Р2, определяющих транскрипцию двух групп его изоформ - HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P1 и HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P2, соответственно, с разными спектрами тканевой экспрессии, активационными свойствами и спектром регулируемых генов [Torres-Padilla М.Е., Sladek F.M., Weiss M.C. Developmentally regulated N-terminal variants of the nuclear receptor hepatocyte nuclear factor 4alpha mediate multiple interactions through coactivator and corepressor-histone deacetylase complexes. J Biol. Chem. 2002, 277(47): 44677-44687]. Промотор P1 активен в гепатоцитах взрослой печени, активность промотора Р2 выявляется в клетках желчных протоков, эмбриональных клетках печени и трансформированных гепатоцитах [Tanaka Т., Jiang S., Hotta H., Takano K., Iwanari H., Sumi K., Daigo K., Ohashi R., Sugai M., Ikegame С., Umezu H., Hirayama Y., Midorikawa Y., Hippo Y., Watanabe A., Uchiyama Y., Hasegawa G., Reid P.C., Aburatani H., Hamakubo Т., Sakai J., Naito M., Kodama T. Dysregulated expression of P1 and Р2 promoter-driven hepatocyte nuclear factor-4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> in the pathogenesis of human cancer. J. Path. 2006, 208(5): 662-672]. Большинство исследований по сопоставлению уровней синтеза изоформ HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> в нормальных и опухолевых клетках, проводимых с помощью различных способов, не позволяют определять изменения соотношения изоформ.
Прототипом заявляемого способа является способ выявления HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> с помощью иммуногистохимического окрашивания опухолевой ткани моноклональными антителами, специфичными к двум группам изоформ HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P1 и HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P2, с использованием стрептавидин-биотиновой системы детекции [Tanaka Т., Jiang S., Hotta H., Takano K., Iwanari H., Sumi K., Daigo K., Ohashi R., Sugai M., Ikegame С., Umezu H., Hirayama Y., Midorikawa Y., Hippo Y., Watanabe A., Uchiyama Y., Hasegawa G., Reid P.C., Aburatani H., Hamakubo T., Sakai J., Naito M., Kodama T. Dysregulated expression of P1 and Р2 promoter-driven hepatocyte nuclear factor-4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> in the pathogenesis of human cancer. J. Path., 2006, 208(5): 662-672]. Моноклональные антитела окрашивали изоформы транскрипционного фактора HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> в ядрах гепатоцитов. Данный способ позволил исследовать тканевую специфичность экспрессии двух групп изоформ в нормальных тканях человека, а также продемонстрировать активацию экспрессии изоформ HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P2 в нескольких образцах ткани гепатоцеллюлярных карцином человека.
Недостатками прототипа являются: 1) стрептавидин-биотиновая система, использованная в данном способе, не обладает достаточным уровнем чувствительности в тканях печени, т.к. биотин содержится в больших количествах в клетках печени, что приводит к неспецифическому связыванию вторичных антител с эндогенным биотином и появлению высокого уровня фоновой окраски, делая недостоверными исследования антигенов в тканях печени, 2) способ иммуногистохимического окрашивания в прототипе является трудоемким. Эти недостатки делают невозможным сопоставить уровень синтеза групп изоформ фактора HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> в нормальных и опухолевых клетках гепатокарцином человека с высокой точностью.
Задачей изобретения является разработка нового специфичного способа выявления групп изоформ тканеспецифического транскрипционного фактора HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> в гепатоцеллюлярных карциномах человека с использованием высокочувствительной полимерной пероксидазной системы.
Заявляемый способ, включающий несколько этапов, осуществляется следующим образом.
1. Подготовка образцов ткани к иммуногистохимическому окрашиванию.
Для дифференциального анализа экспрессии групп изоформ HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P1 и HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> Р2 в гепатоцеллюлярных карциномах человека используют парафиновые блоки образцов гепатоцеллюлярной карциномы человека и неопухолевой ткани печени тех же пациентов. Образцы тканей гепатоцеллюлярной карциномы человека заливают в парафин, предварительно проведя обезвоживание тканей в батарее спиртов с восходящей концентрацией, проводят через промежуточный растворитель (ортоксилол) и пропитывают парафином при температуре 55-56°C, затем быстро охлаждают. Полученные парафиновые блоки нарезают на санном микротоме. Полученные образцы ткани печени толщиной в 5 мкм приклеивают на полилизиновые стекла (Menzel Glasses, Германия).
Затем проводят депарафинизацию образцов ткани гепатоцеллюлярной карциномы: помещают их в ксилол на 5 минут дважды, затем в этиловый спирт 96% и отмывают в дистиллированной воде в течение 5 минут дважды.
Далее для восстановления антигенов проводят их демаскировку в водяной бане при температуре 95°C в цитратном буфере с рН 6.0 (Dako; Дания), затем охлаждают при комнатной температуре в течение 25 минут, промывают дистиллированной водой дважды в течение 5 минут.
Затем проводят инактивацию эндогенной пероксидазы в коммерческом растворе 3% перекиси водорода (Peroxidase-Blocking Solution (Dako, Дания)) в течение 20 минут, после этого промывают в дистиллированной воде дважды в течение 5 минут.
2. Иммуногистохимическое определение уровней синтеза групп изоформ HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P1 и HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P2.
Иммуногистохимическое исследование уровня синтеза и локализации групп изоформ HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P1 и HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P2 проводят на серийных образцах ткани гепатоцеллюлярной карциномы человека для каждой изоформы отдельно.
Для получения иммуногистохимически окрашенных препаратов в качестве первичных антител используют моноклональные антитела мыши к HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P2 (Н6939; R&D systems, США) или HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P1 (К9218; R&D systems, США) человека в разведении 1,5 мкг/мл и 3 мкг/мл, соответственно. Антитела разводят на коммерческом буфере Antibody Diluent with Background Reducing Components (Dako, Дания). В качестве вторичных антител используют двухступенчатую пероксидазную систему детекции BioGenex (США).
На образец ткани гепатоцеллюлярной карциномы наносят предварительно разведенные антитела и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем его промывают в растворе Tris-HCl (50 мМ, рН 7-7.2) дважды в течение 5 минут. Образцы ткани гепатоцеллюлярной карциномы инкубируют со вторичными антителами Super enchancer (BioGenex, США) в течение 20 минут, после чего промывают раствором Tris-HCl дважды по 5 минут и инкубируют с полимерной пероксидазой хрена (HRP полимер) SS Label (BioGenex, США) в течение 30 минут. После инкубации с полимерной пероксидазой их промывают раствором Tris-HCl дважды в течение 5 минут, окрашивают 5-5 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -диаминобензидином (ДАБ) (BioGenex, США) в течение 3-5 минут, промывают в дистиллированной воде дважды по 5 минут.
Образцы ткани гепатоцеллюлярной карциномы докрашивают в растворе гематоксилина Майера (Dako, Дания) в разведении 1:4 на дистиллированной воде в течение 1 минуты, затем отмывают сначала в проточной водопроводной воде, а потом в дистиллированной воде в течение 1 минуты. Далее их заключают в специальный состав Glycergel Mounting Medium (Dako, Дания) и накрывают покровным стеклом.
3. Оценка уровня синтеза двух групп изоформ HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> на образцах ткани гепатоцеллюлярной карциномы после иммуногистохимического окрашивания.
При анализе образцов ткани гепатоцеллюлярной карциномы человека, окрашенных антителами на HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P1 или HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P2 группы изоформ, исследуют весь образец ткани за исключением краевых зон при увеличении 200×. При учете результатов иммуногистохимического окрашивания учитывают процент окрашенных опухолевых клеток антителами к каждой из групп изоформ, а также интенсивность окрашивания и внутриклеточную локализацию исследуемого белка. Интенсивность окрашивания опухолевых клеток оценивают по системе: «+» - слабое окрашивание, «++» - средняя интенсивность окрашивания, «+++» - сильное окрашивание. Негативно окрашенными считают срезы гепатокарцином, в которых доля окрашенных ядер опухолевых клеток составляет менее 10%; срезы гепатокарцином, в которых доля окрашенных ядер опухолевых клеток составляет 10-50%, квалифицируют как умеренно окрашенные; срезы гепатокарцином, в которых доля окрашенных ядер опухолевых клеток составляет 50-100%, - как интенсивно окрашенные. При наличии на образцах ткани гепатоцеллюлярной карциномы участка неопухолевой ткани дополнительно проводят учет перечисленных параметров для нетрансформированных гепатоцитов. При окраске антителами к группе изоформ HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P1 положительным контролем служит окраска ядер гепатоцитов, составляющих окружающую опухоль ткань на том же образце ткани гепатоцеллюлярной карциномы, для группы изоформ HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P2 положительным контролем служит окраска антителами ядер холангиоцитов.
Изобретение иллюстрировано фиг.1-4(А-Б), на которых изображены образцы ткани гепатоцеллюлярной карциномы человека, окрашенные антителами к группам изоформ HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P1 и HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P2. На фиг.1А-1Б представлены образцы ткани, на которых выявлено окрашивание ядер опухолевых клеток антителами к изоформам группы HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P1 и HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P2. На фиг.2А-2Б представлены образцы ткани, на которых выявлено окрашивание ядер опухолевых клеток только антителами к изоформам группы HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P2. На фиг.3А-3Б представлены образцы ткани, на которых выявлено окрашивание ядер опухолевых клеток только антителами к изоформам группы HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P1. На фиг.4А-4Б представлены образцы ткани, на которых не выявлено окрашивания ядер опухолевых клеток ни к одной из групп изоформ HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> . Стрелками под номером 1 указаны ядра опухолевых клеток на образцах ткани гепатоцеллюлярной карциномы человека, окрашенные антителами к группам изоформ HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P1 или HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P2 в коричневый цвет. Стрелками под номером 2 указаны ядра опухолевых клеток, окрашенные в синий цвет гепатоксилином Майера, в которых отсутствует окрашивание ядер опухолевых клеток антителами к изоформам HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> .
Таким образом, при применении заявляемого способа показано, что на ранних стадиях гепатоканцерогенеза в дифференцированных опухолях активируется экспрессия нехарактерных для нормальной печени изоформ HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> P2, на более поздних стадиях опухолевой прогрессии в гепатоцеллюлярных карциномах последовательно подавляется экспрессия всех изоформ HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> .
Технический результат изобретения заключается в том, что заявляемый способ обладает высокой специфичностью и чувствительностью, позволяет с высокой точностью оценивать интенсивность окрашивания ядер опухолевых клеток и локализацию двух дифференциально экспрессирующихся групп изоформ HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> на образцах ткани гепатоцеллюлярной карциномы человека, а также оценить степень дифференцировки опухолевых клеток и их злокачественности по уровню экспрессии групп изоформ HNF4 в гепатоцеллюлярных карциномах человека, патент № 2522859" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , сократить время исследования до 4 часов.
в гепатоцеллюлярных карциномах человека