композиции внеклеточного матрикса для лечения рака

Формула изобретения

1. Способ ингибирования роста или пролиферации раковых клеток, включающий контактирование раковой клетки с композицией внеклеточного матрикса, полученной культивированием клеток фибробласта человека на гранулах микроносителя в гипоксических условиях при содержании кислорода 1-5%, для получения гипоксического внеклеточного матрикса и сбора композиции внеклеточного матрикса, таким образом ингибируя рост или пролиферацию раковых клеток.

2. Способ по п.1, в котором раковая клетка происходит из опухоли.

3. Способ по п.1, в котором раковая клетка происходит из рака, выбранного из группы, состоящей из меланомы, глиомы и аденокарциномы.

4. Способ по п.1, в котором композицию внеклеточного матрикса получают из культивируемых клеток на двух- или трехмерной поверхности в подходящей ростовой среде.

5. Способ по п.4, в котором клетки человека происходят из тканей взрослого организма или неонатальных тканей.

6. Способ по п.1, в котором композиция представляет собой растворимую фракцию.

7. Способ по п.1, в котором композиция представляет собой нерастворимую фракцию.

8. Способ по п.1, в котором композиция представляет собой комбинацию растворимой и нерастворимой фракции.

9. Способ по п.6, в котором растворимая фракция включает молекулярную фракцию, включающую в себя молекулы, имеющие молекулярную массу менее 30000 дальтон.

10. Способ по п.1, в котором композиция внеклеточного матрикса дополнительно включает химиотерапевтический агент.

11. Способ по п.10, в котором химиотерапевтический агент представляет собой цисплатин.

12. Способ по п.10, в котором композиция внеклеточного матрикса дополнительно включает иммуномодулирующий агент.

13. Способ доставки химиотерапевтического агента к раковой клетке, включающий контактирование раковой клетки с композицией внеклеточного матрикса, полученной культивированием клеток фибробласта человека на гранулах микроносителя в гипоксических условиях при содержании кислорода 1-5%, для получения гипоксического внеклеточного матрикса и сбора композиции внеклеточного матрикса, где композиция внеклеточного матрикса дополнительно включает химиотерапевтический агент.

14. Способ по п.13, в котором контактирование происходит по хирургическому краю области, из которой была иссечена опухоль.

15. Способ по п.13, в котором композицию внеклеточного матрикса получают из культивируемых клеток на двух- или трехмерной поверхности в подходящей ростовой среде.

16. Способ по п.15, в котором клетки происходят из тканей взрослого организма человека или неонатальных тканей.

17. Способ по п.13, в котором композиция представляет собой растворимую фракцию.

18. Способ по п.13, в котором композиция представляет собой нерастворимую фракцию.

19. Способ по п.13, в котором композиция представляет собой комбинацию растворимой и нерастворимой фракции.

20. Способ по п.17, в котором растворимая фракция включает молекулярную фракцию, включающую молекулы, имеющие молекулярную массу менее 30000 дальтон.

21. Способ по п.13, в котором химиотерапевтический агент представляет собой цисплатин.

22. Способ по п.13, в котором композиция внеклеточного матрикса дополнительно включает иммуномодулирующий агент.

23. Композиция для ингибирования клеточной пролиферации, включающая гипоксическую композицию внеклеточного матрикса и химиотерапевтический агент.

24. Композиция по п.23, дополнительно включающая иммуномодулирующий агент.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится, главным образом, к применению композиций внеклеточного матрикса и, более конкретно, к применению композиций внеклеточного матрикса для ингибирования клеточной пролиферации.

ИНФОРМАЦИЯ ОБ УРОВНЕ ТЕХНИКИ

Внеклеточный матрикс (ECM) представляет собой комплексную структуру, окружающую и поддерживающую клетки, которые имеются in vivo в тканях млекопитающих. ECM часто называют соединительной тканью. ECM состоит, главным образом, из трех основных классов биомолекул, включая структурные белки, такие как коллагены и эластины, специализированные белки, такие как фибриллины, фибронектины и ламинины, и протеогликаны.

Рост композиций ECM in vitro и их применение в разнообразных терапевтических и медицинских целях описаны в литературе. Одно терапевтическое применение указанных композиций ECM включает лечение и восстановление мягкой ткани и дефектов кожи, таких как морщины и шрамы.

Восстановление или заращивание дефектов мягких тканей, вызванных такими дефектами как акне, хирургические рубцы или старение, оказалось очень трудной задачей. Ряд материалов использовали для коррекции дефектов мягких тканей с различными степенями успеха, однако, ни один из материалов не был полностью безопасным и эффективным. Например, силикон вызывает ряд физиологических и клинических проблем, включая долгосрочные побочные эффекты, такие как узелки, рецидивирующий целлюлит и кожные язвы.

Композиции коллагена также используются в качестве инъецируемого материала для наращивания мягких тканей. Коллаген представляет собой главный белок соединительной ткани и наиболее распространенный белок у млекопитающих, составляя приблизительно до 25% всего содержания белка. В настоящее время в литературе описано 28 типов коллагена (подробный перечень см., например, в таблицах 1 и 2, ниже). Однако свыше 90% коллагена в организме представляет собой коллагены I, II, II и IV.

Различные коллагеновые материалы использовались для лечения дефектов мягких тканей, такие как растворяемый перед применением бычий коллаген для инъекций, поперечно сшитый коллаген или ксеногенные коллагены. Однако при применении указанных коллагенов существует несколько проблем. Распространенной проблемой является сложность и высокая стоимость изготовления имплантируемых материалов, которые обусловлены необходимостью удаления потенциально иммуногенных веществ, чтобы избежать аллергических реакций у субъекта. Помимо этого, результаты применения указанных коллагенов оказались недолговечными.

Также описаны другие материалы, которые можно использовать для восстановления или наращивания мягких тканей, например, такие как биосовместимые керамические частицы в водных гелях (патент США № 5 204 382), термопластические и/или термореактивные материалы (патент США № 5 278 202) и полимерные смеси на основе молочной кислоты (патент США № 4 235 312). Помимо этого, описано также применение композиций секретируемого в естественных условиях внеклеточного матрикса (патент США № 6 284 284). Однако все указанные материалы, как оказалось, имеют ограничения.

Соответственно, требуются новые материалы для восстановления и наращивания мягких тканей, которые не имеют недостатков имеющихся в настоящее время материалов. Существует потребность в создании безопасного, инъецируемого, обладающего длительным действием, биорассасывающегося материала для восстановления и наращивания мягких тканей.

Композиции ECM, культивируемые in vitro, можно дополнительно использовать для лечения поврежденной ткани, такой как поврежденная сердечная мышца и связанная с ней ткань. Композиции являются пригодными в качестве имплантатов или биологических покрытий или имплантируемых устройств, таких как стенты или сосудистые протезы, для ускорения васкуляризации органов, например, сердца и связанной с ним ткани.

Коронарная болезнь сердца (CHD), также называемая коронарной артериальной болезнью (CAD), ишемической болезнью сердца и атеросклеротической болезнью сердца, характеризуется сужением малых кровеносных сосудов, которые снабжают сердце кровью и кислородом. Коронарная болезнь сердца обычно вызывается состоянием, которое называется атеросклерозом, которое наблюдается, когда жировой материал и бляшки откладываются на стенках артерий, вызывая их сужение. По мере сужения коронарных артерий кровоток к сердцу может замедляться или останавливаться, вызывая боль в груди (стабильная стенокардия), одышку, сердечный приступ и другие симптомы.

Коронарная болезнь сердца (CHD) является главной причиной смерти в Соединенных Штатах у мужчин и женщин. Согласно Американской ассоциации сердца (American Heart Association), 15 миллионов человек имеют те или иные формы указанного состояния. Несмотря на то, что симптомы и признаки коронарной болезни сердца являются очевидными на запущенной стадии болезни, у большинства лиц с коронарной болезнью сердца не наблюдается признаков заболевания в течение десятилетий по мере прогрессирования заболевания, пока не возникнет внезапный сердечный приступ. Указанное заболевание является наиболее распространенной причиной внезапной смерти и также является наиболее распространенной причиной смерти у мужчин и женщин старше 20 лет. Согласно современным тенденциям в Соединенных Штатах у половины здоровых 40-летних мужчин в будущем разовьется CHD, а также у одной из трех здоровых 40-летних женщин.

Современные способы улучшения кровотока в больном или каким-либо иным образом поврежденном сердце включают в себя инвазивные хирургические методики, такие как коронарное шунтирование, ангиопластика и эндартерэктомия. Указанные процедуры, естественно, включают в себя риск высокой степени во время и после оперативного вмешательства и часто являются лишь временным средством лечения ишемии сердца. Соответственно, требуются новые дополнительные виды лечения, чтобы повысить успешность имеющихся в настоящее время методик для лечения CHD и связанных с ней симптомов.

Культивируемые in vitro композиции ECM можно дополнительно использовать для восстановления и/или регенерации поврежденных клеток или ткани, такие как хрящевые или костно-хрящевые клетки. Костно-хрящевая ткань представляет собой любую ткань, которая относится к кости или хрящу или содержит кость или хрящ. Композиции по настоящему изобретению являются пригодными для лечения костно-хрящевых дефектов, таких как дегенеративные заболевания соединительной ткани, такие как ревматоидный артрит и/или остеоартрит, а также дефектов у пациентов, которые имеют дефекты хряща травматического происхождения.

Современные попытки восстановления костно-хрящевых дефектов включают в себя имплантацию человеческих хондроцитов в биосовместимые и биорассасывающиеся гидрогелевые имплантаты в попытке усовершенствовать возможности восстановления повреждений хрящевой ткани. Помимо этого, описана методика культуры хондроцитов на альгинатных гранулах или матриксе, включая полисульфатированный альгинат, для генерации гиалиноподобной хрящевой ткани. Однако попытки восстановления энхондральных повреждений суставного хряща посредством имплантации человеческих аутологичных хондроцитов имеют ограниченный успех. Соответственно, требуются новые дополнительные средства лечения для повышения успешности имеющихся в настоящее время методик лечения костно-хрящевых дефектов.

Культивируемые in vitro композиции ECM также являются пригодными в системах культур тканей для генерации сконструированных тканевых имплантатов. Область конструирования тканей включает в себя использование технологии клеточных культур для получения новых биологических тканей или восстановления поврежденных тканей. Получив стимул отчасти благодаря революции в области стволовых клеток, технология конструирования тканей открывает перспективы для регенерации и замещения тканей после травмы или лечения дегенеративных заболеваний. Ее можно также использовать в контексте косметологических процедур.

Технологию конструирования тканей можно использовать для получения как аутологичных, так и гетерологичных тканей или клеток, используя разнообразные типы клеток и методики культивирования. Для создания аутологичного имплантата можно брать донорскую ткань и разъединять ее на отдельные клетки, а затем прикреплять и культивировать их на субстрате, предназначенном для имплантации в желательной области функционирующей ткани. Многие типы выделенных клеток можно размножать in vitro с использованием методик клеточных культур, однако зависимые от закрепления клетки требуют специфического окружения, часто включающего в себя пространственную конструкцию, служащую матрицей для роста.

Современная технология конструирования тканей производит преимущественно искусственные имплантаты. Успешное лечение с использованием трансплантации клеток зависит от разработки подходящих субстратов для клеточных культур как in vitro, так и in vivo. Таким образом, внеклеточный матрикс, который содержит только натуральные материалы и который является пригодным для имплантации, должен иметь больше характеристик эндогенной ткани. Соответственно, разработка натурального материала внеклеточного матрикса представляет собой проблему, имеющуюся в настоящее время в области конструирования тканей.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано, частично, на открытии того факта, что композиции внеклеточного матрикса (ECM) могут ингибировать рост раковых клеток in vivo. Соответственно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения созданы способы ингибирования роста или пролиферации раковых клеток путем контактирования раковых клеток с композицией внеклеточного матрикса, как описано в настоящем документе.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения созданы способы доставки химиотерапевтического агента к клетке или к ткани, включающие в себя контактирование клетки или ткани с композицией внеклеточного матрикса, включающей в себя химиотерапевтический агент.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения созданы композиции, содержащие ECM и химиотерапевтический агент. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиция дополнительно включает в себя иммуномодулирующий агент.

Иллюстрирующие примеры изобретения далее описаны в приложении I, полное содержание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 показывает диаграмму массы опухоли клеток В16 в присутствие и в отсутствии ECM по результатам анализа САМ.

Фигура 2 показывает диаграмму массы опухоли клеток В16 в присутствие и в отсутствии ECM по результатам анализа САМ.

Фигура 3 показывает диаграмму массы опухоли клеток В1, выращенных в отсутствии ECM, смешанных с ECM, или на ECM, по результатам анализа САМ.

Фигура 4 показывает диаграмму массы опухоли клеток С6 в присутствие и в отсутствии ECM, с цисплатином или без него, по результатам анализа САМ.

Фигура 5 показывает диаграмму массы опухоли клеток С6 в присутствие и в отсутствии ECM, с цисплатином или без него, по результатам анализа САМ.

Фигуры 6А и 6В показывают фотографии гистологического анализа глиом С6, выращенных в присутствие или в отсутствии ECM.

Фигура 7 показывает диаграмму массы опухоли клеток MDA 435, выращенных в присутствие и в отсутствии ECM, по результатам анализа САМ.

Фигура 8 показывает фотографию опухолевого роста клеток С6 у бестимусных мышей, не получавших лечения.

Фигура 9 показывает фотографию опухолевого роста клеток С6 у бестимусных мышей, получавших лечение hECM.

Фигура 10 показывает фотографию опухолевого роста клеток С6 у бестимусных мышей, получавших лечение ECM плюс цисплатин.

Фигура 11 показывает фотографию опухолевого роста клеток С6 у бестимусных мышей, получавших лечение цисплатином.

Фигура 12 показывает диаграмму роста глиом С6 у бестимусных мышей в присутствие или в отсутствии ECM, с цисплатином или без него.

Фигуры 13A-13D показывают фотографии опухолевого роста клеток MDA 435 у бестимусных мышей, не получавших лечения (фигура 13А), получавших лечение hECM (фигура 13В), получавших лечение hECM плюс цисплатин (фигура 13С) и получавших лечение hECM с цисплатином (фигура 13D).

Фигура 14 показывает диаграмму роста опухолей MDA 435 у бестимусных мышей в присутствие или в отсутствии ECM, с цисплатином или без него.

Фигура 15 показывает фотографию опухолевого роста клеток В16 у грызунов с ECM (образец справа) и без ECM (образец слева).

Фигура 16 показывает диаграмму массы опухоли клеток В16 в присутствие и в отсутствии ECM по результатам анализа САМ.

Фигура 17 показывает кривую доза-ответ массы опухоли клеток В16, выращенных в присутствие жидкого ECM, по результатам анализа САМ.

Фигура 18 показывает диаграмму массы опухоли клеток В16, выращенных во фракциях жидкого ECM с различной молекулярной массой, по результатам анализа САМ.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам применения композиций внеклеточного матрикса для ингибирования роста или пролиферации раковых клетках как в отдельности, так и в качестве биологического носителя для доставки химиотерапевтического агента.

Перед тем, как ознакомиться с описанием настоящих композиций и способов следует понять, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными описанными композициями, способами и экспериментальными условиями, поскольку указанные композиции, способы и условия могут изменяться. Также следует понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, а не для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничен только прилагающейся формулой изобретения.

Используемые в настоящем описании и прилагающейся формуле изобретения формы единственного числа включают в себя множество ссылок, если в контексте четко не указано иное. Так, например, ссылки на «способ» включают в себя один или более способов и/или этапов типа описанных в настоящем документе, что будет очевидно для специалистов после прочтения настоящего описания, и т.п.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения созданы способы ингибирования роста или пролиферации раковых клеток, которые включают в себя контактирование раковой клетки с композицией внеклеточного матрикса. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ЕСМ может представлять собой растворимую фракцию, а в других вариантах осуществления настоящего изобретения ЕСМ может представлять собой нерастворимую фракцию. В других вариантах осуществления настоящего изобретения ЕСМ может представлять собой комбинацию растворимой и нерастворимой фракций.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения раковая клетка происходит из опухоли. В некоторых аспектах рак выбран из группы, состоящей из меланомы, глиомы и аденокарциномы. В других аспектах рак представляет собой рак надпочечника, мочевого пузыря, кости, костного мозга, головного мозга, позвоночника, молочной железы, шейки матки, желчного пузыря, ганглиев, желудочно-кишечного тракта, желудка, толстого кишечника, сердца, почки, печени, легкого, скелетной мышцы, яичника, поджелудочной железы, паращитовидной железы, полового члена, предстательной железы, слюнных желез, кожи, селезенки, семенника, тимуса, щитовидной железы или матки. В одном аспекте рак представляет собой рак молочной железы, в другом аспекте рак представляет собой меланому.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения созданы способы доставки химиотерапевтического агента к раковой клетке, которые включают в себя контактирование раковой клетки с композицией внеклеточного матрикса, включающей в себя химиотерапевтический агент.

В одном аспекте контактирование происходит по хирургическому краю области, из которой была иссечена опухоль. В указанных вариантах осуществления настоящего изобретения опухоль удаляют у субъекта с использованием стандартных хирургических методик, известных клиницистам. Композиции ECM по настоящему изобретению можно помещать в пространство, оставшееся после иссечения опухоли (резекции), таким образом, чтобы ECM находился в контакте с хирургическим краем. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ECM может ингибировать рост раковых клеток, находящихся на краю опухоли. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиция ECM может дополнительно включать в себя химиотерапевтический агент с иммуномодулирующим агентом или без него. Применение композиций ЕСМ по настоящему изобретению для лечения рака после хирургической резекции имеет преимущество локализованной доставки и доставки с замедленным высвобождением химиотерапевтического и/или иммуномодулирующего агента в область опухоли. Дополнительные преимущества могут включать в себя улучшение заживления хирургических ран и улучшение косметических результатов.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения созданы композиции, содержащие ЕСМ и химиотерапевтический агент. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиция дополнительно включает в себя иммуномодулирующий агент.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиции внеклеточного матрикса изготавливают культивированием клеток в гипоксических условиях на двухмерной или трехмерной поверхности в подходящей питательной среде. Способ культивирования дает как растворимую, так и нерастворимую фракции, которые можно использовать по отдельности или в комбинации для получения физиологически приемлемых композиций, имеющих ряд применений. В других вариантах осуществления настоящего изобретения клетки можно культивировать в стандартных или нормальных кислородных условиях.

Композиции по настоящему изобретению имеют ряд применений, включая, без ограничения, ингибирование роста или пролиферации раковых клеток, доставку терапевтических агентов, стимуляцию восстановления и/или регенерации поврежденных клеток или тканей, применение в накладках для стимуляции регенерации тканей, применение в системах культивирования тканей для культивирования клеток, таких как стволовые клетки, применение в поверхностных покрытиях, используемых в сочетании с имплантируемыми устройствами (например, водителями ритма, стентами, стентовыми трансплантатами, сосудистыми протезами, сердечными клапанами, шунтами, портами или катетерами для доставки лекарственных средств), стимуляцию восстановления мягких тканей, наращивание и/или улучшение поверхности кожи, такой как морщины, применение в качестве биологического антиадгезионного агента или в качестве биологического носителя для доставки или поддержания клеток в месте доставки.

Изобретение основывается, частично, на открытии того факта, что клетки, культивированные на двух- или трехмерных поверхностях в условиях, которые имитируют раннее эмбриональное окружение (гипоксию и уменьшенные гравитационные силы) до ангиогенеза, продуцируют композиции внеклеточного матрикса, обладающего фетальными свойствами, включая генерацию эмбриональных белков. Рост клеток в гипоксических условиях демонстрирует уникальный ЕСМ с фетальными свойствами и экспрессией факторов роста. В отличие от культивирования ЕСМ в традиционных условиях культивирования, свыше 5000 генов дифференциально экспрессируются в ЕСМ, культивированном в гипоксических условиях. Результатом является культивированный ЕСМ, который обладает иными свойствами и иным биологическим составом. Например, ЕСМ, выработанный в гипоксических условиях, является сходным с фетальной мезенхимальной тканью в том, что он содержит относительно много коллагенов типа III, IV и V и гликопротеинов, таких как фибронектин, SPARC, тромбоспондин и гиалуроновая кислота.

Гипоксия также усиливает экспрессию факторов, которые регулируют заживление ран и органогенез, таких как VEGF, FGF-7 и TGF- , а также многочисленные факторы Wnt, включая wnt 2b, 4, 7a, 10a и 11. Культивированный эмбриональный человеческий ЕСМ также стимулирует повышение метаболической активности в человеческих фибробластах in vitro, что измеряется повышенной ферментативной активностью. Помимо этого, имеет место увеличение количества клеток в ответ на культивированный эмбриональный ЕСМ.

В различных вариантах осуществления настоящее изобретение включает в себя способы изготовления композиций внеклеточного матрикса, которые включают в себя один или более эмбриональных белков, и способы их применения. В частности, композиции генерируют культивированием клеток в гипоксических условиях, на двухмерной или трехмерной поверхности в подходящей питательной среде. Композиции получают выращиванием клеток на каркасе, результатом которого является система многослойной клеточной культуры. Клетки, выращенные на каркасной подложке, в соответствии с настоящим изобретением растут многослойно, образуя клеточный матрикс. Рост культивированных клеток в гипоксических условиях приводит к дифференциальной экспрессии генов в результате гипоксических условий культивирования по сравнению с традиционной культурой.

Внеклеточный матрикс (ЕСМ) представляет собой композицию белков и биополимеров, которые, в основном, составляют ткань, которая продуцируется культивированием клеток. Стромальные клетки, такие как фибробласты, представляют собой тип зависимых от закрепления клеток, которые требуют роста в состоянии прикрепления к материалам и поверхностям, подходящим для клеточной культуры. Материалы ЕСМ, выработанные культивированными клетками, откладываются трехмерно, создавая пространства для образования тканеподобных структур.

Материалы для культивирования, обеспечивающие трехмерные конструкции, называют скаффолдами. Пространство для отложения ЕСМ имеет форму отверстий, например, в тканой сетке, или щелевых пространств, созданных в компактной конфигурации сферических гранул, называемых микроносителями.

Используемый в настоящем документе термин «композиция внеклеточного матрикса» включает в себя как растворимую, так и нерастворимую фракции, или любую их часть, или комбинацию. Нерастворимая фракция включает в себя те белки и биологические компоненты секретированного внеклеточного матрикса, которые откладываются на подложке или скаффолде. Растворимая фракция относится к культуральным средам, в которых культивировались клетки и в которые клетки секретировали активный агент (агенты), и включает в себя те белки и биологические компоненты, которые не откладываются на скаффолде. Обе фракции можно собирать и, необязательно, далее обрабатывать, и использовать по отдельности или в комбинации по различному назначению, как описано в настоящем документе. ЕСМ можно также получать из трупных тканей (патенты США № 6 284 284 и 6 372 494).

Растворимую фракцию можно концентрировать или разбавлять для достижения оптимальной концентрации. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения концентрация может составлять приблизительно 1 мг/мл, приблизительно 5 мг/мл, приблизительно 10 мг/мл, приблизительно 50 мг/мл, приблизительно 100 мг/мл или приблизительно 200 мг/мл. Концентрация может находиться в пределах приблизительно от 0,1 мг/мл до 1000 мг/мл, или приблизительно от 1 до 200 мг/мл, или приблизительно от 10 мг/мл до 100 мг/мл.

Растворимую фракцию можно дополнительно фракционировать по молекулярным массам (например, диализом, фильтрованием или хроматографией), таким образом, чтобы большинство растворенных молекул во фракции соответствовало конкретной предельной величине молекулярной массы. Следует знать, что отсекающие величины не являются абсолютом, и что большинство (например, 70%, 80%, 90% или 95%) растворенных молекул, содержащихся в данной фракции, соответствуют конкретной предельной величине молекулярной массы. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления способов, представленных в настоящем документе, композиция ЕСМ может включать в себя растворимую фракцию, в которой 70%, или 80%, или 90% содержащихся в ней растворенных молекул имеют молекулярную массу менее 5000 дальтон, или менее 10 000 дальтон, или менее 30 000 дальтон, или менее 100 000 дальтон. В других вариантах осуществления ЕСМ может включать в себя растворимую фракцию, в которой содержащиеся в ней растворенные молекулы имеют молекулярную массу более 5000 дальтон, или более 10 000 дальтон, или более 30 000 дальтон, или более 100 000 дальтон. В других вариантах осуществления ЕСМ может включать в себя растворимую фракцию, в которой содержащиеся в ней растворенные молекулы имеют молекулярную массу от 10 000 до 100 000 дальтон, или от 30 000 до 100 000 дальтон, или от 10 000 до 30 000 дальтон.

Двух- или трехмерная подложка или скаффолд, используемая для культивирования стромальных клеток, может быть изготовлена из любого материала и/или иметь любую форму, которая: (а) позволяет клеткам прикрепляться к ней (или может быть модифицирована таким образом, чтобы позволять клеткам прикрепляться к ней); и (b) позволяет клеткам расти более чем одним слоем (т.е., образовывать трехмерную ткань). В других вариантах осуществления настоящего изобретения практически плоский листок или мембрану можно использовать для культивирования клеток, которые имеют достаточно трехмерную форму.

Биосовместимый материал формируют в двух- или трехмерную структуру или скаффолд, в которой имеются щелевые пространства для прикрепления и роста клеток в трехмерную ткань. Отверстия и/или щелевые пространства каркаса в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения имеют размеры, которые позволяют клеткам распространяться по отверстиям или пространствам. Поддержание распространения активно растущих клеток по каркасу, как оказалось, усиливает продукцию репертуара факторов роста, ответственных за виды активности, описанные в настоящем документе. Если отверстия слишком малы, клетки могут быстро достигать слияния, но не способны легко выходить из сетки. Указанные «попавшие в ловушку» клетки могут подвергаться контактному ингибированию и прекращать продукцию соответствующих факторов, необходимых для поддержания пролиферации и сохранения долговечных культур. Если отверстия слишком велики, клетки могут быть не способны распространяться по отверстию, что может привести к уменьшению продукции стромальными клетками соответствующих факторов, необходимых для поддержания пролиферации и сохранения долговечных культур. Обычно щелевые пространства имеют размеры по меньшей мере приблизительно 100 мкм, по меньшей мере приблизительно 140 мкм, по меньшей мере приблизительно 150 мкм, по меньшей мере приблизительно 180 мкм, по меньшей мере приблизительно 200 мкм или по меньшей мере приблизительно 220 мкм. При использовании матрикса типа сетки, как в примере в настоящем документе, заявители установили, что отверстия размером в пределах приблизительно от 100 мкм до 220 мкм являются удовлетворительными. Однако в зависимости от трехмерной структуры и сложности каркаса допустимы и другие размеры. Любая форма или структура, которая позволяет клеткам распространяться и продолжать размножаться и расти в течение продолжительных периодов времени, может функционировать для выработки клеточных факторов в соответствии со способами, описанными в настоящем документе.

В некоторых аспектах трехмерный каркас сформирован из полимеров или нитей, которые сплетены, сотканы, связаны или каким-либо другим образом упорядочены с формированием каркаса, такого как сетка или ткань. Материалы также могут быть сформированы помещением материала или сооружения в пену, матрикс или губчатый скаффолд. В других аспектах трехмерный каркас имеет форму спутанных волокон, изготовленных прессованием полимеров или других волокон с получением материала с щелевыми пространствами. Трехмерный каркас может иметь любую форму или геометрию для роста клеток в культуре. Таким образом, другие формы каркаса, как будет описано ниже, могут быть достаточными для генерации подходящей кондиционированной среды.

Ряд различных материалов можно использовать для формирования скаффолда или каркаса. Указанные материалы включают в себя неполимерные и полимерные материалы. Если используются полимеры, они могут представлять собой любой тип полимера, такой как гомополимеры, неупорядоченные полимеры, сополимеры, блочные полимеры, соблочные полимеры (например, ди-, три- и т.п.), линейные или разветвленные полимеры и сшитые или несшитые полимеры. Неограничивающие примеры материалов для использования в качестве скаффолдов или каркасов включают в себя, среди прочих, стеклянные волокна, полиэтилены, полипропилены, полиамиды (например, нейлон), полиэфиры (например, дакрон), полистиролы, полиакрилаты, поливиниловые соединения (например, поливинилхлорид; PVC), поликарбонаты, политетрафторэтилены (PTFE; TEFLON), терманокс (ТРХ), нитроцеллюлозу, полисахариды (например, целлюлозы, хитозан, агарозу), полипептиды (например, шелк, желатин, коллаген), полигликолевую кислоту (PGA) и декстран.

В некоторых аспектах каркас может быть изготовлен из материалов, которые разлагаются со временем в условиях, в которых они используются. «Биоразлагаемый» также относится к рассасыванию или разложению соединения или композиции после введения in vivo или в условиях in vitro. Биологическое разложение может происходить в силу воздействия биологических агентов как прямо, так и опосредованно. Неограничивающие примеры биоразлагаемых материалов включают в себя, среди прочих, полилактид, полигликолид, поли(карбонат триметилена), поли(лактид-со-гликолид) (т.е., PLGA), терефталат полиэтилена (РЕТ), поликапролактон, шовный материал кетгут, коллаген (например, лошадиная коллагеновая пена), полимолочную кислоту или гиалуроновую кислоту. Например, указанные материалы могут быть сотканы в трехмерный каркас, такой как коллагеновая губка или коллагеновый гель.

В других аспектах, когда культуры должны поддерживаться в течение длительных периодов времени, криоконсервированы, и/или когда желательной является дополнительная структурная целостность, трехмерный каркас может быть изготовлен из биологически неразлагаемого материала. Используемый в настоящем документе термин «биологически неразлагаемый материал» относится к материалу, который не разлагается или не распадается значительным образом в условиях культуральной среды. Примеры биологически неразлагаемых материалов включают в себя, без ограничения, нейлон, дакрон, полистирол, полиакрилаты, поливинилы, политетрафторэтилены (PTFE), вспененный PTFE (ePTFE) и целлюлозу. Примером биологически неразлагаемого трехмерного каркаса является нейлоновая сетка, имеющаяся в продаже под торговым наименованием Nitex®, нейлоновая фильтровальная сетка со средним размером пор 140 мкм и средним диаметром нейлонового волокна 90 мкм (#3-210/36, Tetko, Inc., N.Y.).

В других аспектах скаффолд или каркас представляет собой комбинацию из биоразлагаемого и биологически неразлагаемого материалов. Биологически неразлагаемый материал обеспечивает скаффолду стабильность во время культивирования, в то время как биоразлагаемый материал позволяет формироваться щелевым пространствам, достаточным для получения клеточных сетей, которые продуцируют клеточные факторы, достаточные для терапевтического применения. Биоразлагаемый материал может быть нанесен на биологически неразлагаемый материал в виде покрытия, соткан, сплетен или сформирован в сетку. Можно использовать различные комбинации биоразлагаемых и биологически неразлагаемых материалов. Примером комбинации являются ткани из поли(этилен терефталата) (РЕТ), покрытые тонкой пленкой из биоразлагаемого полимера, поли[D-L-молочной-со-гликолевой кислоты), с целью получения полярной структуры.

В различных аспектах материал для скаффолда или каркаса может быть предварительно обработан перед инокуляцией клеток, чтобы усилить прикрепление клеток. Например, перед инокуляцией клеток нейлоновые сита в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения обрабатывают 0,1 М уксусной кислотой и инкубируют в полилизине, фетальной бычьей сыворотке и/коллагене для образования покрытия на нейлоне. Полистирол можно обрабатывать сходным образом с использованием серной кислоты. В других вариантах осуществления настоящего изобретения рост клеток в присутствии трехмерного поддерживающего каркаса можно дополнительно усилить добавлением в каркас или нанесением на него покрытия из белков (например, коллагенов, эластиновых волокон, ретикулярных волокон), гликопротеинов, гликозаминогликанов (например, гепарансульфата, хондроитин-4-сульфата, хондроитин-6-сульфата, дерматансульфата, кератансульфата и т.п.), фибронектинов и/или гликополимера (поли[N-п-винилбензил-D-лактоамида], PVLA), чтобы улучшить прикрепление клеток. Обработка скаффолда или каркаса является полезной, когда материал представляет собой плохой субстрат для прикрепления клеток.

В одном аспекте для выработки ЕСМ используют сетку. Сетка представляет собой тканый нейлоновый 6 материал в форме миткалевого переплетения с отверстиями размером приблизительно 100 мкм и толщиной приблизительно 125 мкм. В культуре фибробласты прикрепляются к нейлону посредством взаимодействия заряженных белков и врастают в пустоты сетки, продуцируя и откладывая белки ЕСМ. Отверстия сетки, которые являются слишком большими или слишком малыми, могут быть неэффективными, но могут отличаться от упомянутых выше, практически без изменения способности продуцировать или откладывать ЕСМ. В другом аспекте для выработки ЕСМ используют другие тканые материалы, такие как полиолефины, в тканых конфигурациях, дающих адекватную геометрию для роста клеток и отложения ЕСМ.

Например, нейлоновую сетку изготавливают для культивирования на любом из этапов изобретения путем вырезания изделия нужного размера, промывания 0,1-0,5 М уксусной кислотой, с последующим прополаскиванием водой высокой чистоты и стерилизацией паром. Для использования в качестве трехмерного скаффолда для выработки ЕСМ сетку нарезают на квадраты приблизительно 10 см × 10 см. Однако сетка может иметь любой размер, подходящий для конкретного применения, и может использоваться в любом способе по настоящему изобретению, включая способы культивирования для инокуляции, клеточного роста и выработки ЕСМ, и изготовления конечной формы.

В других аспектах скаффолд или каркас для получения культивированных трехмерных тканей состоит из микроносителей, таких как гранулы или частицы. Гранулы могут быть микроскопическими или макроскопическими и размеры их могут устанавливаться дополнительно таким образом, чтобы осуществлять проникновения в ткани или придавать компактность с образованием конкретной геометрической формы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения с использованием проникновения в ткани каркас для клеточных культур включает в себя частицы, которые, в комбинации с клетками, образует трехмерную ткань. Клетки прикрепляются к частицам и к друг другу с образованием трехмерной ткани. Комплекс частиц и клеток имеет размеры, достаточные для введения в ткани или органы, например путем инъекции или через катетер.

Используемый в настоящем документе термин «микроносители» относится к частице, имеющей размеры от нанометров до микрометров; частицы могут быть любой формы или геометрии, неправильной формы, несферическими, сферическими или эллипсоидными. Обычно рост на гранулах или микроносителях называют двухмерной системой или скаффолдом, или каркасом.

Размеры микроносителей, подходящие для целей настоящего изобретения, могут представлять собой любые размеры, подходящие для конкретного применения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения размеры микроносителей, подходящие для трехмерных тканей, могут быть размерами, которые позволяют введение посредством инъекции. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения микроносители имеют размер частиц по меньшей мере приблизительно 1 мкм, по меньшей мере приблизительно 10 мкм, по меньшей мере приблизительно 25 мкм, по меньшей мере приблизительно 50 мкм, по меньшей мере приблизительно 100 мкм, по меньшей мере приблизительно 200 мкм, по меньшей мере приблизительно 300 мкм, по меньшей мере приблизительно 400 мкм, по меньшей мере приблизительно 500 мкм, по меньшей мере приблизительно 600 мкм, по меньшей мере приблизительно 700 мкм, по меньшей мере приблизительно 800 мкм, по меньшей мере приблизительно 900 мкм, по меньшей мере приблизительно 1000 мкм.

В некоторых аспектах микроносители изготовлены из биоразлагаемых материалов. В некоторых аспектах можно использовать микроносители, включающие в себя два или более слоев различных биоразлагаемых полимеров. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере внешний первый слой обладает биоразлагаемыми свойствами для формирования трехмерных тканей в культуре, в то время как по меньшей мере биоразлагаемый внутренний второй слой, имеющий свойства, отличные от свойств первого слоя, изготовлен таким образом, что он эродирует, будучи введенным в ткань или орган.

В некоторых аспектах микроносители представляют собой пористые микроносители. Пористые микроносители относятся к микроносителям, имеющим щелевые пространства, через которые молекулы могут диффундировать в микрочастицу или из нее. В других вариантах осуществления настоящего изобретения микроносители представляют собой непористые микроносители. Непористые микроносители относятся микрочастице, в которой молекулы выбранного размера не диффундируют в микрочастицу или из нее.

Микроносители для применения в композициях являются биологически совместимыми и имеют низкую токсичность для клеток или не имеют токсичности. Подходящие микроносители можно выбрать в зависимости от ткани, которую нужно лечить, типа повреждения, которое нужно лечить, продолжительности желаемого лечения, продолжительности жизни клеточной культуры in vivo и времени, которое требуется для формирования трехмерных тканей. Микроносители могут включать в себя различные полимеры, натуральные или синтетические, заряженные (т.е., анионные или катионные) или незаряженные, биоразлагаемые или биологически неразлагаемые. Полимеры могут представлять собой гомополимеры, неупорядоченные полимеры, блочные сополимеры, привитые сополимеры и разветвленные полимеры.

В некоторых аспектах микроносители включают в себя биологически неразлагаемые микроносители. Биологически неразлагаемые микрокапсулы и микроносители включают в себя, без ограничения, микрокапсулы и микроносители, изготовленные из полисульфонов, поли(акрилонитрил-со-винилхлорида), этиленвинилацетата, гидроксиэтилметакрилат-метилметакрилатных сополимеров. Они являются пригодными для придания тканям объема или в вариантах осуществления, когда микроносители элиминируются организмом.

В некоторых аспектах микроносители включают в себя разлагаемые скаффолды. Последние включают в себя микроносители, изготовленные из натуральных полимеров, неограничивающие примеры которых включают в себя, среди прочих, фибрин, казеин, сывороточный альбумин, коллаген, желатин, лецитин, хитозан, альгинат или полиаминокислоты, такие как полилизин. В других аспектах разлагаемые микроносители изготавливают из синтетических полимеров, неограничивающие примеры которых включают в себя, среди прочих, полилактид (PLA), полигликолид (PGA), поли(лактид-согликолид) (PLGA), поли(капролактон), карбонат полидиоксанонтриметилена, полигидроксиалконаты (например, поли(гидроксибутират), поли(этилглутамат), поли(DTH иминокарбонил(бисфенол А иминокарбонат), поли(ортоэфир) и полицианоакрилаты.

В некоторых аспектах микроносители включают в себя гидрогели, которые обычно представляют собой гидрофильные полимерные сети, наполненные водой. Гидрогели обладают преимуществом селективного триггера набухания полимера. В зависимости от композиции полимерной сети набухание микрочастицы могут запускать ряд стимулов, включая рН, ионную силу, тепло, электричество, ультразвук и ферментативную активность. Неограничивающие примеры полимеров, подходящих для гидрогелевых композиций, включают в себя, среди прочих, полимеры, образованные из полимеров поли(лактид-согликолида); поли(N-изопропилакриламида); поли(метакриловая кислота-g-полиэтиленгликоля); полиакриловой кислоты и поли(оксипропилен-со-оксиэтилен)гликоля; и натуральные соединения, такие как хондроитинсульфат, хитозан, желатин, фибриноген, или смеси синтетических и натуральных полимеров, например хитозан-поли(этиленоксид). Полимеры могут быть поперечно сшитыми, обратимо или необратимо, с образованием гелей, адаптированных для формирования трехмерных тканей.

В соответствии с настоящим изобретением способ культивирования является применимым для пролиферации различных типов клеток, включая стромальные клетки, такие как фибробласты, и, особенно, первичные человеческие неонатальные фибробласты крайней плоти. В различных аспектах клетки, инокулированные на каркас, могут представлять собой стромальные клетки, включая фибробласты, с другими клетками или без них, как дополнительно описано ниже. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетки представляют собой стромальные клетки, которые обычно получают из соединительной ткани, включая, без ограничения: (1) кость; (2) рыхлую соединительную ткань, включая коллаген и эластин; (3) волокнистую соединительную ткань, которая образует связки и сухожилия; (4) хрящ; (5) внеклеточный матрикс крови; (6) жировую ткань, которая содержит адипоциты; и (7) фибробласты.

Стромальные клетки можно получать из различных тканей или органов, таких как кожа, сердце, кровеносные сосуды, костный мозг, скелетная мышца, печень, поджелудочная железа, головной мозг, крайняя плоть, которые могут быть получены биопсией (когда это возможно) или во время вскрытия. В одном аспекте фетальные фибробласты можно получать в большом количестве из крайней плоти, такой как крайняя плоть новорожденных.

В некоторых аспектах клетки включают в себя фибробласты, которые могут иметь фетальное, неонатальное происхождение, происхождение от взрослых или их комбинацию. В некоторых аспектах стромальные клетки включают в себя фетальные фибробласты, которые могут поддерживать рост ряда различных клеток и/или тканей. Используемый в настоящем документе термин «фетальный фибробласт» относится к фибробластам, полученным из фетальных источников. Используемый в настоящем документе термин «неонатальный фибробласт» относится к фибробластам, полученным от новорожденных. При соответствующих условиях фибробласты могут давать начало другим клеткам, таким как костные клетки, жировые клетки и гладкомышечные клетки, и другие клетки мезодермального происхождения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фибробласты включают в себя дермальные фибробласты, которые представляют собой фибробласты, полученные из кожи. Нормальные человеческие дермальные фибробласты можно выделять из крайней плоти новорожденных. Указанные клетки обычно криоконсервируют к концу первичной культуры.

В других аспектах трехмерную ткань можно изготовить с использованием стволовых клеток или недифференцированных клеток-предшественников как в отдельности, так и в комбинации с любым из клеточных типов, обсуждающихся в настоящем документе. Стволовые и недифференцированные клетки-предшественники включают в себя, например, без ограничения, эмбриональные стволовые клетки, гематопоэтические стволовые клетки, нейрональные стволовые клетки, эпидермальные стволовые клетки и мезенхимальные стволовые клетки.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения «специфическую» трехмерную ткань можно изготовить инокуляцией скаффолда клетками, полученными из конкретного органа, например кожи, сердца, и/или от конкретного индивидуума, который позже должен получить клетки и/или ткани, выращенные в культуре, в соответствии со способами, описанными в настоящем документе.

Для определенных вариантов применения in vivo предпочтительно получать стромальные клетки из собственных тканей пациента. Рост клеток в присутствии стромального поддерживающего каркаса может быть дополнительно усилен добавлением в каркас или нанесением на каркас белков, например коллагенов, ламининов, эластических волокон, ретикулярных волокон, гликопротеинов; гликозаминогликанов, например гепаринсульфата, хондроитин-4-сульфата, хондроитин-6-сульфата, дерматансульфата, кератансульфата и т.п., клеточного матрикса и/или других материалов.

Таким образом, поскольку двух- или трехмерная культуральная система, описанная в настоящем документе, является пригодной для роста разнообразных клеточных типов и тканей, в зависимости от ткани, которую необходимо культивировать, и желательных типов коллагена можно выбрать подходящие стромальные клетки для инокуляции каркаса.

Несмотря на то, что способы и применения по настоящему изобретению являются пригодными для использования с различными клеточными типами, такими как тканевоспецифичные клетки или различные типы стромальных клеток, как обсуждалось в настоящем документе, получение клеток для применения по настоящему изобретению также может быть видоспецифичным. Соответственно можно получать композиции ЕСМ, которые являются видоспецифичными. Например, клетки для применения по настоящему изобретению могут включать в себя человеческие клетки. Например, клетки могут представлять собой человеческие фибробласты. Подобно этому, клетки можно получать от других видов животных, такие как клетки лошади, собаки или кошки. Помимо этого, клетки от одного вида или штамма вида можно использовать для генерации композиций ЕСМ для применения у других видов или родственных штаммов (например, аллогенных, сингенных или ксеногенных). Следует понимать также, что клетки, полученные от различных видов, можно комбинировать, чтобы генерировать композиции многовидового ЕСМ.

Соответственно способы и композиции по настоящему изобретению являются пригодными для применения у животных, не являющихся человеком. Используемый в настоящем документе термин «ветеринарный» относится к области медицины, относящейся или связанной с медикаментозным или хирургическим лечением животных, особенно домашних животных. Распространенные ветеринарные животные включают в себя млекопитающих, амфибий, птиц, рептилий и рыб. Например, типичные млекопитающие могут включать в себя собак, кошек, лошадей, кроликов, приматов, грызунов и сельскохозяйственных животных, таких как коровы, лошади, козы, овцы и свиньи.

Как обсуждалось выше, дополнительные клетки могут присутствовать в культуре со стромальными клетками. Указанные дополнительные клетки могут обладать рядом благоприятных эффектов, включая, среди прочих, поддержание долгосрочного роста в культуре, усиление синтеза факторов роста и стимуляцию прикрепления клеток к скаффолду. Дополнительные клеточные типы включают в себя, в качестве неограничивающих примеров, гладкомышечные клетки, клетки сердечной мышцы, эндотелиальные клетки, клетки скелетной мышцы, перициты, макрофаги, моноциты и адипоциты. Указанные клетки можно инокулировать на каркас вместе с фибробластами, или, в некоторых аспектах, в отсутствии фибробластов. Указанные стромальные клетки можно получать из соответствующих тканей или органов, включая, например, без ограничения, кожу, сердце, кровеносные сосуды, костный мозг, скелетную мышцу, печень, поджелудочную железу и головной мозг. В других аспектах, один или более других клеточных типов, исключая фибробласты, инокулируют в скаффолд. В еще одних аспектах, в скаффолды инокулируют только фибробласты.

Фибробласты можно легко выделить путем дезагрегации соответствующего органа или ткани, которые должны служить источником фибробластов. Например, ткань или орган можно дезагрегировать механическим путем и/или обработать ферментами и/или хелатообразующими агентами, которые ослабляют соединения между соседними клетками, делая возможным диспергирование ткани с образованием суспензии отдельных клеток без существенного разрушения клеток. Ферментативную диссоциацию можно осуществлять измельчением ткани и обработкой измельченной ткани любым из ряда пищеварительных ферментов как по отдельности, так и в комбинации. Последние включают в себя, без ограничения, трипсин, химотрипсин, коллагеназу, эластазу, гиалуронидазу, ДНКазу, проназу и/или диспазу и т.п. Механическое разрушение также можно осуществлять с использованием ряда способов, включая, без ограничения, использование мельниц, блендеров, сит, гомогенизаторов, датчиков давления или источников ультразвука. В одном аспекте, иссеченную ткань крайней плоти обрабатывают пищеварительными ферментами, обычно коллагеназой и/или трипсиназой, чтобы отсоединить клетки от инкапсулирующих структур.

Выделение фибробластов, например, можно осуществлять следующим образом: образцы свежей ткани тщательно промывают и измельчают в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS) с целью удаления сыворотки. Измельченную ткань инкубируют в течение периода времени от 1-12 часов в свежеизготовленном растворе диссоциирующего фермента, такого как трипсин. После указанной инкубации диссоциированные клетки суспендируют, осаждают центрифугированием и засевают на чашки для культивирования. Все фибробласты закрепятся прежде остальных клеток, следовательно, подходящие стромальные клетки можно избирательно выделять и выращивать. Изолированные фибробласты затем можно выращивать до получения сливного роста, извлечь из сливной культуры и инокулировать на трехмерный каркас (см. Naughton et al., 1987, J. Med. 18(3&4):219-250). Результатом инокуляции трехмерного каркаса стромальными клетками в высокой концентрации, например приблизительно от 10⁶ до 5×10⁷ клеток/мл, будет являться формирование трехмерной стромальной подложки в более короткие периоды времени.

После того как ткань переработана в суспензию отдельных клеток, суспензию можно фракционировать в субпопуляции, из которых можно получать фибробласты, и/или другие стромальные клетки, и/или элементы. Это можно осуществлять также с использованием стандартных методик сепарации клеток, включая, без ограничения, клонирование и селекцию конкретных клеточных типов, селективную деструкцию нежелательных клеток (отрицательная селекция), сепарацию на основе дифференциальной способности клеток к агглютинации в смешанной популяции, процедуры замораживания-оттаивания, дифференциальные свойства клеток в смешанной популяции, фильтрацию, традиционное и зональное центрифугирование, центробежное отстаивание (противоточное центрифугирование), гравитационное разделение, противоточное распределение, электрофорез и клеточный сортинг с активацией флюоресценции. Обзор методик клональной селекции и сепарации клеток см. в Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2-е изд., A.R. Liss, Inc., New York, 1987, гл. 11 и 12, стр. 137-168.

В одном аспекте изобретения изолированные фибробласты можно выращивать для получения банков клеток. Банки клеток создаются для того, чтобы было возможно инициировать различные количества и в нужное время серий культур, а также в упреждающем режиме тестировать клетки на контаминанты и конкретные клеточные характеристики. Фибробласты из банков клеток впоследствии выращивают для увеличения количества клеток до подходящих уровней для засевания скаффолдов. Операции, включающие в себя воздействие окружающей среды на клетки и контактирующие с клетками материалы, осуществляют в асептических условиях для уменьшения вероятности контаминации инородными материалами или нежелательными микроорганизмами.

В другом аспекте изобретения после выделения клетки можно выращивать посредством нескольких пассажей до количества, подходящего для создания базовых банков клеток. Банки клеток затем можно собирать и помещать в подходящие сосуды и сохранять в криогенных условиях. Клетки из базовых банков клеток в замороженных флаконах можно оттаивать и выращивать посредством дополнительных пассажей (обычно двух или более). Клетки затем можно использовать для получения криогенно законсервированных рабочих банков клеток.

На этапе размножения клеток используют флаконы клеток на стадии рабочего банка клеток, чтобы далее увеличить количество клеток для инокуляции в трехмерные скаффолды или подложки, такие как сетка или микроносители. Каждый пассаж представляет собой серию этапов субкультур, которые включают в себя инокуляцию поверхностей для клеточного роста, инкубацию, питание клеток и сбор клеток.

Культивирование для банков клеток и размножения клеток можно осуществлять инокуляцией культуральных сосудов, таких как культуральные флаконы, роллерные флаконы или микроносители. Стромальные клетки, такие как фибробласты, прикрепляются к нужным поверхностям для роста и растут в присутствии культуральных сред. Культуральные сосуды, такие как культуральные флаконы, роллерные флаконы или микроносители, имеют специальную конфигурацию для клеточной культуры и обычно изготавливаются из различных пластичных материалов, предназначенных для указанного использования. Микроносители обычно представляет собой микроскопические или макроскопические гранулы и обычно изготавливаются из различных пластичных материалов. Однако их можно изготавливать из других материалов, таких как различные виды стекла или твердых/полутвердых биологических материалов, таких как коллагены или другие материалы, такие как декстран, модифицированный сахарный комплекс, как обсуждалось выше.

Во время культивирования использованные среды периодически заменяют на свежие среды во время периода роста клеток, чтобы поддерживать адекватную доступность питательных веществ и удаление ингибирующих культивирование продуктов. Культуральные флаконы и роллерные флаконы обеспечивают клеткам поверхность для их роста и обычно используются для культивирования зависимых от закрепления клеток.

В одном аспекте инкубирование осуществляют в камере, нагретой до 37°С. Для конфигураций культивирования, требующих сообщения между средами и окружением камеры, используют 5% СО₂ (об./об.) с воздухом в газовом пространстве камеры, что способствует регуляции рН. Альтернативно, можно использовать сосуды, оборудованные для поддержания температуры и рН культивирования как для размножения клеток, так и для операций с продукцией ЕСМ. Температуры ниже 35°С и выше 38°С и концентрации СО₂ ниже 3% или выше 12% могут быть неподходящими.

Сбор клеток с поверхностей, на которых они закрепились, можно осуществлять посредством удаления ростовых сред и промывания клеток забуференным солевым раствором для уменьшения количества конкурирующего с ферментами белка, использования диссоциирующих ферментов, а затем - нейтрализации ферментов после открепления клеток. Суспензию собирают и жидкости, использовавшиеся для сбора клеток, отделяют центрифугированием. Из клеточных суспензий, собранных из субкультур, можно отбирать образцы для оценки количества собранных клеток и других характеристик клеток; впоследствии образцы объединяют со свежими средами и используют в качестве инокулятов. Количество пассажей, используемых для получения банков клеток и инокулятов для скаффолдов, является решающим с точки зрения достижения приемлемых характеристик ЕСМ.

После изготовления соответствующего двух- или трехмерного скаффолда его инокулируют посредством засевания полученными стромальными клетками. Инокуляцию скаффолда можно осуществлять различными способами, такими как седиментация. Сетку для культивирования ЕСМ в аэробных условиях изготавливают таким же способом, как сетку для гипоксического роста, за исключением того, что для создания гипоксических условий не используется анаэробная камера.

Например, в случае сетки для культивирования ЕСМ как в аэробных, так и в анаэробных условиях, подготовленную и стерилизованную сетку помещают в стерильные чашки Петри диаметром 150 мм и глубиной 15 мм и складывают в стопку толщиной приблизительно 10 изделий. Стопки сеток затем инокулируют посредством седиментации. Клетки добавляют в свежие среды для получения нужной концентрации клеток для инокулята. Инокулят добавляют к стопке сеток, где клетки оседают на нейлоновые волокна и закрепляются при поддержании условий инкубирования. По истечении соответствующего времени индивидуально засеянные листки сетки можно в асептических условиях отделять от стопки и помещать индивидуально в отдельные чашки Петри 150 мм × 15 мм, содержащие приблизительно 50 мл ростовых сред.

Инкубацию инокулированной культуры осуществляют в гипоксических условиях, в которых, как было установлено, продуцируется ЕСМ и окружающие среды с уникальными свойствами, по сравнению с ЕСМ, генерированным при нормальных условиях культивирования. Используемые в настоящем изобретении гипоксические условия характеризуются более низкой концентрацией кислорода по сравнению с концентрацией кислорода в атмосферном воздухе (приблизительно 15%-20% кислорода). В одном аспекте гипоксические условия характеризуются концентрацией кислорода менее приблизительно 10%. В другом аспекте гипоксические условия характеризуются концентрацией кислорода приблизительно от 1% до 10%, от 1% до 9%, от 1% до 8%, от 1% до 7%, от 1% до 6%, от 1% до 5%, от 1% до 4%, от 1% до 3% или от 1% до 2%. В определенном аспекте система поддерживает концентрацию кислорода приблизительно 1-3% внутри культурального сосуда. Гипоксические условия можно создавать и поддерживать с использованием аппарата для культивирования, который позволяет контролировать концентрации газов во внешней среде, например, в анаэробной камере.

Инкубацию клеток обычно осуществляют в нормальной атмосфере с 15-20% кислорода и 5% СО₂ для размножения и посева, после чего низкокислородные культуры переносят в воздухонепроницаемую камеру, которую заполняют 95% азотом/5% СО₂ таким образом, чтобы создать гипоксическое окружение в культуральной среде.

Например, чашки Петри с сеткой, культивированной для выработки ЕСМ в гипоксических условиях, сначала инкубируют при 37°С и 95% воздухе/5% СО₂ в течение 2-3 недель. После периода культивирования практически в атмосферных условиях чашки Петри с сетками инкубируют в камере, приспособленной для анаэробного культивирования, которую продувают газовой смесью, состоящей приблизительно из 95% азота и 5% СО₂. Использованные ростовые среды заменяют на свежие среды при атмосферном уровне кислорода в течение периода культивирования, и после замены сред чашки Петри, заполненные сетками, помещают в анаэробную камеру, которую продувают 95% азотом/5% СО₂, а затем инкубируют при 37°С. Культивированные сетки собирают, когда они достигают нужного размера или содержат желаемые биологические компоненты.

Во время периода инкубирования стромальные клетки будут расти линейно вдоль и покрывать со всех сторон трехмерный каркас, прежде чем начнут прорастать в отверстия каркаса. Растущие клетки продуцируют бесчисленное количество факторов роста, регуляторных факторов и белков, некоторые из которых секретируются в окружающие среды, а другие, которые откладываются на подложке, создавая внеклеточный матрикс, более подробно обсуждаются ниже. Ростовые и регуляторные факторы можно добавлять в культуру, но это не является необходимым. Культура стромальных клеток продуцирует как нерастворимые, так и растворимые фракции. Клетки выращивают до той стадии, которая обеспечивает адекватное отложение белков внеклеточного матрикса.

Во время культивирования трехмерных тканей пролиферирующие клетки могут высвобождаться из каркаса и закрепляться на стенках культурального сосуда, где они могут продолжать пролиферировать и образовывать сливной монослой. Для минимизации указанного явления, которое может повлиять на рост клеток, высвободившиеся клетки можно удалять во время питания или переносом клеточной культуры в новый культуральный сосуд. Удаление сливного монослоя или перенос культивированной ткани в свежие среды в новый сосуд сохраняет или восстанавливает пролиферативную активность культур. В некоторых аспектах удаление или переносы можно осуществлять в культуральном сосуде, который имеет монослой культивированных клеток, превышающий 25% слияния. Альтернативно культуру в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения перемешивают, чтобы предотвратить закрепление высвободившихся клеток; в других вариантах осуществления свежие среды непрерывно вливают через систему. В некоторых аспектах два или более клеточных типов можно культивировать совместно, или в одно и то же время, или сначала один, а затем другой (например, фибробласты и гладкомышечные клетки или эндотелиальные клетки).

После инокуляции скаффолдов клеточную культуру инкубируют в подходящей питательной среде и в условиях инкубации, которые поддерживают рост клеток в трехмерные ткани. Многие имеющиеся в продаже среды, такие как модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), RPMI 1640, среда Фишера, среда Искова и среда МакКоя, могут быть подходящими для поддержания роста клеточных культур. В среду можно добавлять дополнительные соли, источники углерода, аминокислоты, сыворотку и компоненты сыворотки, витамины, минералы, восстанавливающие агенты, буферные агенты, липиды, нуклеозиды, антибиотики, факторы, способствующие прикреплению, и факторы роста. Композиции для различных типов культуральных сред описаны в различных литературных источниках, доступных специалисту (например, Methods for Preparation of Media, Supplements and Substrates for Serum Free Animal Cell Cultures, Alan R. Liss, New York (1984); Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons, Chichester, Англия (1996); Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 4-е изд., Wiley-Liss (2000)).

Ростовые или культуральные среды, используемые на любых этапах культивирования по настоящему изобретению, как при аэробных, так и при анаэробных условиях, могут включать в себя сыворотку или не содержать сыворотки. В одном аспекте среда представляет собой модифицированную по способу Дульбекко среду Игла с 4,5 г/л глюкозы, аланил-L-глутамином, экв. 2 мМ, и номинально снабженную 10% фетальной бычьей сывороткой. В другом аспекте среда не содержит сыворотки и представляет собой модифицированную по способу Дульбекко среду Игла с базовой средой 4,5 г/л глюкозы с Glutamax®, снабженную 0,5% сывороточным альбумином, 2 мкг/мл гепарином, 1 мкг/мл рекомбинантным основным FGF, 1 мкг/мл соевым ингибитором трипсина, добавкой 1×ITS (инсулин-трансферрин-селен, Sigma кат. № I3146), разбавленной добавкой 1:1000 жирных кислот (Sigma кат. № 7050) и разбавленным 1:1000 холестерином. Помимо этого, те же самые среды можно использовать как для гипоксического, так и для аэробного культивирования. В одном аспекте ростовые среды меняют со сред на основе сыворотки на не содержащие сыворотки среды после засевания и первой недели роста.

Условия инкубации будут соответствовать подходящим уровням рН, температуре и газу (например, О₂, СО₂ и т.п.) для поддержания гипоксических условий роста. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клеточную культуру можно суспендировать в среде во время периода инкубации с целью обеспечения максимальной пролиферативной активности и генерации факторов, которые облегчают желаемую биологическую активность фракций. Кроме того, культуру можно периодически «кормить» для удаления отработанный сред, депопуляции высвободившихся клеток и добавления нового источника питания. Во время инкубационного периода культивированные клетки растут линейно вдоль и покрывают со всех сторон нити скаффолда, прежде чем начнут прорастать в отверстия скаффолда.

Во время инкубации в гипоксических условиях, по сравнению с инкубацией при нормальных концентрациях атмосферного кислорода приблизительно 15-20%, дифференциально экспрессируются тысячи генов. Как было установлено, несколько генов подвергаются повышающей или понижающей регуляции в указанных композициях, наиболее заметно, определенные виды ламининов, виды коллагенов и факторы Wnt. В различных аспектах трехмерный внеклеточный матрикс можно определить характерным «отпечатком пальцев» или комплектом клеточных продуктов, произведенных клетками благодаря росту в гипоксических условиях, по сравнению с ростом в нормальных условиях. В композициях внеклеточного матрикса, конкретно приведенных в качестве примеров в настоящем документе, трехмерные ткани и окружающие среды характеризуются экспрессией и/или секрецией различных факторов.

Трехмерные ткани и композиции, описанные в настоящем документе, имеют внеклеточный матрикс, который присутствует на скаффолде или каркасе. В некоторых аспектах внеклеточный матрикс включает в себя различные типы ламинина и коллагена, благодаря росту в гипоксических условиях и отбора клеток, выращенных на подложке. Пропорции откладывающихся белков внеклеточного матрикса (ЕСМ) можно изменять или усиливать посредством отбора фибробластов, которые вырабатывают подходящий тип коллагена, а также выращивания клеток в гипоксических условиях, при которых экспрессия конкретного вида ламинина и коллагена подвергается понижающей или повышающей регуляции.

Отбор фибробластов можно осуществлять в некоторых аспектах с использованием моноклональных антител подходящего изотипа или подкласса, которые определяют конкретные типы коллагена. В других аспектах твердые субстраты, такие как магнитные гранулы, можно использовать для отбора или устранения клеток, которые связываются с антителом. Комбинацию указанных антител можно использовать для отбора (положительного или отрицательного) фибробластов, которые экспрессируют желательный тип коллагена. Альтернативно строма, использующаяся для инокуляции каркаса, может представлять собой смесь клеток, которые синтезируют желательные типы коллагена. Распределение и происхождение характерных типов коллагена показаны в таблице 1.

Таблица 1 Распределение и происхождение различных типов коллагена
Тип коллагена	Основное распределение в тканях	Клетки происхождения
I	Рыхлая и плотная обычная соединительная ткань; коллагеновые волокна	Фибробласты и ретикулярные клетки; гладкомышечные клетки
	Волокнистый хрящ
	Кость	Остеобласты
	Дентин	Одонтобласты
II	Гиалиновый и эластический хрящ	Хондроциты
	Стекловидное тело глаза	Клетки сетчатки
III	Рыхлая соединительная ткань; ретикулярные волокна	Фибробласты и ретикулярные клетки
	Сосочковый слой дермы	Гладкомышечные клетки; эндотелиальные клетки
	Кровеносные сосуды
IV	Базальные мембраны	Эпителиальные и эндотелиальные клетки
	Капсула хрусталика глаза	Волокна хрусталика
V	Плодные оболочки; плацента	Фибробласты
	Базальные мембраны
	Кость
	Гладкая мышца	Гладкомышечные клетки
IV	Базальные мембраны	Эпителиальные и эндотелиальные клетки
	Капсула хрусталика глаза	Волокна хрусталика
V	Плодные оболочки; плацента	Фибробласты
	Базальные мембраны
	Кость
	Гладкая мышца	Гладкомышечные клетки
VI	Соединительная ткань	Фибробласты
VII	Эпителиальные базальные мембраны	Фибробласты
	Якорные фибриллы	Кератиноциты
VIII	Роговица	Фибробласты роговицы
IX	Хрящ
X	Гипертрофический хрящ
XI	Хрящ
XII	Сосочковая дерма	Фибробласты
XIV (ундулин)	Ретикулярная дерма	Фибробласты
XVII	Антиген буллезного пемфигоида Р170	Кератиноциты

Дополнительные типы коллагена, которые могут быть представлены в композициях ЕСМ, показаны в таблице 2.

Как обсуждалось выше, композиции ЕСМ, описанные в настоящем документе, включают в себя различные коллагены. Как показано в таблице 3 примера 1, экспрессия нескольких видов коллагена, как было установлено, подвергается повышающей регуляции в композициях ЕСМ, полученных в гипоксических условиях. Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения композиция ЕСМ, включающая в себя один или более эмбриональных белков, имеет повышающую регуляцию видов коллагена, по сравнению с композицией, выработанной в кислородных условиях приблизительно 15-20% кислорода. В другом аспекте виды коллагена с повышающей регуляцией представляют собой типы V альфа 1; IX альфа 1; IX альфа 2; VI альфа 2; VIII альфа 1; IV альфа 5; VII альфа 1; XVIII альфа 1 и XII альфа 1.

Помимо различных коллагенов композиция ЕСМ, описанная в настоящем документе, включает в себя различные ламинины. Ламинины представляют собой семейство гликопротеиновых гетеротримеров, состоящих из субъединиц альфа-, бета- и гамма-цепей, соединенных вместе через биспиральный домен. К настоящему времени идентифицированы ламининовые цепи 5 альфа, 4 бета и 3 гамма, которые могут комбинироваться с образованием 15 различных изоформ. Внутри указанной структуры существуют идентифицируемые домены, которые обладают связывающей активностью в отношении другого ламинина и молекул базальной пластинки и связанных с мембраной рецепторов. Домены VI, IVb и IVa образуют глобулярные структуры, а домены V, IIIb и IIIa (которые содержат EGF-подобные элементы с высоким содержанием цистеина) образуют стержнеобразные структуры. Домены I и II указанных трех цепей участвуют в образовании трехцепочечной биспиральной структуры (длинное плечо).

Ламининовые цепи имеют общие и уникальные функции и экспрессируются со специфичными временными (связанными с развитием) и пространственными (тканевоспецифичными) паттернами. Считается, что ламининовые альфа-цепи представляют собой функционально важную часть гетеротримеров, поскольку они демонстрируют тканевоспецифичные паттерны распределения и содержат главные сайты клеточных взаимодействий. Известно, что эндотелий сосудов экспрессирует две изоформы ламинина с изменяющейся экспрессией в зависимости от стадии развития, типа сосуда и активированного состояния эндотелия.

Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения композиция ЕСМ, включающая в себя один или более эмбриональных белков, имеет повышающую регуляцию различных видов ламинина, по сравнению с композицией, выработанной в кислородных условиях приблизительно 15-20% кислорода.

Ламинин 8 состоит из ламининовых цепей альфа-4, бета-1 и гамма-1. Ламининовая цепь альфа-4 широко распространена как во взрослых, так и в развивающихся организмах. У взрослых ее можно идентифицировать в базальной мембране, окружающей сердечные, поперечно-полосатые и гладкомышечные волокна, а в легких - в альвеолярных перегородках. Известно также, что она существует в эндотелиальной базальной мембране как в капиллярах, так и в более крупных сосудах, и в периневральной базальной мембране периферических нервов, а также в интерсинусоидальных пространствах, больших артериях и более мелких артериолах костного мозга. Ламинин 8 представляет собой главную изоформу ламинина в эндотелии сосудов, который экспрессируется и прикрепляется к тромбоцитам и синтезируется в адипоцитах 3T3-L1; установлено, что уровень его синтеза повышается после адипозной трансформации клеток. Ламинин 8, как полагают, представляет собой изоформу ламинина, обычно экспрессирующуюся в мезенхимальных клеточных линиях, индуцирующую микрососуды в соединительной ткани. Ламинин 8 также был идентифицирован в первичных клеточных культурах костного мозга мышей, стенках артерий и интерсинусоидальных пространствах, где он представляет собой главную изоформу ламинина в развивающемся костном мозге. В силу своей локализации в костном мозге взрослых организмов, прилегающей к гематопоэтическим клеткам, изоформы ламинина, содержащие цепь альфа-4, вероятно, имеют биологически релевантные взаимодействия с развивающимися гематопоэтическими клетками.

Соответственно, в другом аспекте настоящего изобретения ЕСМ имеет повышающую регуляцию видов ламинина, такого как ламинин 8. В другом аспекте ламинины, выработанные трехмерными тканями по настоящему изобретению, включают в себя по меньшей мере ламинин 8, который определяет характеристику или подпись ламининовых белков, присутствующих в композиции.

Композиции ЕСМ, описанные в настоящем документе, включают в себя различные факторы Wnt. Семейство факторов Wnt представляет собой сигнальные молекулы, играющие роль в огромном количестве клеточных путей и процессов межклеточного взаимодействия. Сигналинг Wnt участвует в онкогенезе, раннем мезенхимальной паттернинге в эмбрионе, морфогенезе в головном мозге и почках, регуляции пролиферации молочной железы и болезни Альцгеймера. Как показано в таблице 4 примера 1, экспрессия нескольких видов белков Wnt, как было установлено, подвергается повышающей регуляции в культивированных в гипоксических условиях композициях ЕСМ. Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения композиция ЕСМ, включающая в себя один или более эмбриональных белков, имеет повышающую регуляцию видов Wnt, по сравнению с композицией, выработанной в кислородных условиях приблизительно 15-20% кислорода. В другом аспекте выработанные в результате повышающей регуляции виды Wnt представляют собой wnt 7a и wnt 11. В другом аспекте, факторы Wnt, выработанные трехмерными тканями по настоящему изобретению, включают в себя по меньшей мере wnt 7a и wnt 11, которые определяют характеристику или подпись белков Wnt, присутствующих в композиции.

Обсуждаемые все это время композиции ЕСМ по настоящему изобретению включают в себя как растворимые, так и нерастворимые фракции или любые их части. Следует понимать, что композиции по настоящему изобретению могут включать в себя одну из указанных фракций или обе фракции, а также любые их комбинации. Помимо этого отдельные компоненты могут быть выделены из фракций для использования в отдельности или в комбинации с другими изолятами или известными композициями.

Соответственно, в различных аспектах композиции внеклеточного матрикса, выработанные с использованием способов по настоящему изобретению, можно использовать непосредственно или после обработки различными способами, которые могут применяться как в отношении нерастворимых, так и растворимых фракций. Растворимая фракция, включая не содержащие клеток надосадочные жидкости и среды, может подвергаться лиофилизации для консервации и/или концентрации факторов. Различные биологически совместимые консерванты, криопротекторы и стабилизаторы можно использовать для сохранения активности, когда это требуется. Примеры биологически совместимых агентов включают в себя, среди прочих, глицерин диметилсульфоксид и трегалозу. Лиофилизат может также содержать один или более наполнителей, таких как буферы, агенты, придающие объем, и модификаторы тоничности. Высушенные замораживанием среды можно повторно растворять добавлением подходящего раствора или фармацевтического разбавителя, как будет описано далее.

В других аспектах растворимую фракцию подвергают диализу. Диализ представляет собой одну из наиболее широко применяющихся методик для разделения компонентов образца на основе селективной диффузии через пористую мембрану. Размер пор определяет отсекающую величину молекулярной массы (MWCO) мембраны, которая характеризуется молекулярной массой, при которой 90% растворенного вещества задерживается мембраной. В определенных аспектах предполагаются мембраны с любым размером пор, в зависимости от желаемой отсекающей величины. Типичными отсекающими величинами являются 5000 дальтон, 10 000 дальтон, 30 000 дальтон и 100 000 дальтон, однако рассматриваются все размеры.

В некоторых аспектах растворимую фракцию можно обрабатывать осаждением активных компонентов (например, факторов роста) в средах. Для осаждения можно использовать различные процедуры, такие как высаливание сульфатом аммония или использование гидрофильных полимеров, например полиэтиленгликоля.

В других аспектах растворимую фракцию подвергают фильтрованию с использованием различных селективных фильтров. Обработка растворимой фракции фильтрованием является пригодной для концентрации факторов, присутствующих во фракции, а также для удаления малых молекул и растворенных веществ, используемых в растворимой фракции. Фильтры с селективностью в отношении конкретных молекулярных масс включают в себя <5000 дальтон, <10 000 дальтон и <15 000 дальтон. Можно использовать другие фильтры и обработанные среды, исследованные на предмет терапевтической активности, как описано в настоящем документе. Типичные фильтры и концентрирующая система включают в себя системы, основанные, среди прочих, на фильтрах из полых волокон, фильтровальных дисках и фильтровальных зондах (см., например, Amicon Stirred Ultrafiltration Cells).

В еще одних аспектах растворимую фракцию подвергают хроматографии для удаления солей, примесей или для фракционирования компонентов среды. Можно использовать различные хроматографические методики, такие как хроматография с молекулярным просеиванием, ионообменная хроматография, хроматография с обращенной фазой и аффинная хроматография. Для обработки кондиционированной среды без значительной потери биологической активности можно использовать мягкие хроматографические среды. Неограничивающие примеры включают в себя, среди прочих, декстран, агарозу, сепарационные среды на основе полиакриламида (например, имеющиеся в продаже под различными торговыми наименованиями, такими как Sephadex, Sepharose и Sephacryl).

В еще одних аспектах кондиционированные среды изготавливают в форме липосом. Факторы роста можно вводить или инкапсулировать в просвет липосом для доставки и увеличения продолжительности жизни активных факторов. Как известно специалистам, липосомы можно классифицировать на различные типы: мультиламеллярные (MLV), стабильные плюриламеллярные (SPLV), малые униламеллярные (SUV) или большие униламеллярные (LUV) пузырьки. Липосомы можно изготавливать из различных липидных соединений, которые могут быть как синтетическими, так и натуральными, включая фосфатидиловые эфиры и сложные эфиры, такие как фосфатидилсерин, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозит, димиристоилфосфатидилхолин; стероиды, такие как холестерин; цереброзиды; сфингомиелин; глицеролипиды и другие липиды (см., например, патент США № 5 833 948).

Растворимую фракцию можно использовать непосредственно, без дополнительных добавок, или изготавливать в виде фармацевтической композиции с различными фармацевтически приемлемыми наполнителями, средами или носителями. «Фармацевтическая композиция» относится к форме растворимой и/или нерастворимой фракции и по меньшей мере к одному фармацевтически приемлемому носителю, среде или наполнителю. Для внутрикожного, подкожного или внутримышечного введения композиции можно изготавливать в виде стерильной суспензии, растворов или эмульсий внеклеточного матрикса в водных или масляных носителях. Композиции также могут содержать вспомогательные агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие или диспергирующие агенты. Композиции для инъекций могут представлять собой дозированные лекарственные формы, ампулы в контейнерах, содержащих множество доз, с консервантами или без консервантов. Альтернативно композиции могут быть представлены в порошкообразной форме для повторного растворения в подходящей среде, включая, например, без ограничения, стерильную апирогенную воду, физиологический раствор, буфер или раствор декстрозы.

В других аспектах трехмерные ткани представляют собой криоконсервированные препараты, которые оттаивают перед использованием. Фармацевтически приемлемые криоконсерванты включают в себя, среди прочих, глицерин, сахариды, полиолы, метилцеллюлозу и диметилсульфоксид. Сахаридные агенты включают в себя моносахариды, дисахариды и другие олигосахариды с температурой стеклования максимально концентрированного замораживанием лиофилизацией раствора (Tg), которая составляет по меньшей мере -60, -50, -40, -30, -20, -10 или 0°С. Типичным сахаридом для использования для криоконсервации является трегалоза.

В некоторых аспектах трехмерные ткани обрабатывают, чтобы убить клетки перед использованием. В некоторых аспектах внеклеточный матрикс, отложенный на скаффолдах, можно собирать и обрабатывать для последующего введения (см. патенты США № № 5 830 708 и 6 280 284, включенные в настоящий документ в качестве ссылок).D

В других вариантах осуществления настоящего изобретения трехмерную ткань можно концентрировать и промывать фармацевтически приемлемой средой для последующего введения. Различные методики концентрирования композиций доступны специалистам, такие как центрифугирование или фильтрование. Примеры включают в себя седиментацию с использованием декстрана и дифференциальное центрифугирование. Изготовление композиций трехмерных тканей также может включать в себя доведение ионной силы суспензии до изотоничности (т.е., приблизительно от 0,1 до 0,2) и до физиологической величины рН (т.е., рН от 6,8 до 7,5). Композиция также может включать в себя смазывающие агенты или другие наполнители, помогающие введению или способствующие стабильности клеточной суспензии. Последние включают в себя, среди прочих, сахариды (например, мальтозу) и органические полимеры, такие как полиэтиленгликоль и гиалуроновая кислота. Дополнительные подробности изготовления различных композиций описаны в патентной публикации США № 2002/0038152, включенной в настоящий документ в качестве ссылки.

Как обсуждалось выше, композиции ЕСМ по настоящему изобретению можно обрабатывать с использованием ряда способов в зависимости от предполагаемого применения и подходящего способа доставки или введения композиций ЕСМ. Например, композиции можно доставлять в форме трехмерных скаффолдов или имплантатов или композиции можно изготавливать в лекарственной форме для инъекций, как описано выше. Термин «введение» включает в себя акт доставки соединения или фармацевтической композиции по настоящему изобретению в организм субъекта, нуждающегося в лечении. Фразы «парентеральное введение» и «введенный парентерально», используемые в настоящем документе, означают способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно посредством инъекции, и включают в себя, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, интраартериальную, интратекальную, интракапсулярную, интраорбитальную, интракардиальную, внутрикожную, интраперитонеальную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную и интрастернальную инъекцию и инфузию. Фразы «системное введение», «введенный системно», «периферическое введение» и «введенный периферически», используемый в настоящем документе, означают введение соединения, лекарственного средства или другого материала, отличное от непосредственного введения в центральную нервную систему, таким образом, что оно проникает в систему субъекта и, таким образом, подвергается метаболизму и другим подобным процессам, например, подкожное введение.

Термин «субъект», используемый в настоящем документе, относится к любому лицу или пациенту, к которому применяют способ по настоящему изобретению. Обычно субъектом является человек, хотя специалистам будет понятно, что субъектом может быть и животное. Так, другие животные, включая млекопитающих, таких как грызуны (включая мышей, крыс, хомячков и морских свинок), кошки, собаки, кролики, сельскохозяйственные животные (включая коров, лошадей, коз, овец, свиней и т.п.) и приматы (включая обезьян, шимпанзе, орангутангов и горилл), включены в определение «субъекта».

Композиции внеклеточного матрикса по настоящему изобретению могут иметь ряд различных применений, включая, без ограничения, ускорение восстановления и/или регенерации поврежденных клеток или тканей, применение в накладках для ускорения регенерации ткани, применение в системах тканевых культур для культивирования клеток, таких как стволовые клетки, применение в поверхностных покрытиях, используемых в сочетании с имплантируемыми устройствами (например, водителями ритма, стентами, стентовыми трансплантатами, сосудистыми протезами, сердечными клапанами, шунтами, портами или катетерами для доставки лекарственных средств), стимуляцию восстановления мягких тканей, наращивание и/или улучшение поверхности кожи, такой как морщины, применение в качестве биологического антиадгезионного агента или в качестве биологического носителя для доставки или поддержания клеток в месте доставки.

Помимо этого композиции ЕСМ, полученные из культивированных клеток, как описано в способах в настоящем документе, можно использовать для любого применения или способа по настоящему изобретению. Например, можно использовать композиции ЕСМ, генерированные культивированием клеток с использованием системы тканевой культуры по настоящему изобретению, например, для восстановления и/или регенерации клеток, применять в накладках для ускорения регенерации ткани, применять в системах тканевых культур для культивирования клеток, таких как стволовые клетки, применять в поверхностных покрытиях, используемых в сочетании с имплантируемыми устройствами (например, водителями ритма, стентами, стентовыми трансплантатами, сосудистыми протезами, сердечными клапанами, шунтами, портами или катетерами для доставки лекарственных средств), применять для стимулирования восстановления мягких тканей, наращивания и/или улучшения поверхности кожи, такой как морщины, применять в качестве биологического антиадгезионного агента или в качестве биологического носителя для доставки или поддержания клеток в месте доставки.

В различных вариантах осуществления настоящее изобретение включает в себя способы восстановления и/или регенерации клеток или ткани и стимулирования восстановления мягких тканей. Один вариант осуществления настоящего изобретения включает в себя способ восстановления и/или регенерации клеток посредством контактирования клеток, подлежащих восстановлению или регенерации, с композициями внеклеточного матрикса по настоящему изобретению. Способ можно использовать для восстановления и/или регенерации различных клеток, как обсуждалось в настоящем документе, включая остеохондральные клетки.

В одном аспекте способ предполагает восстановление костно-хрящевых дефектов. Используемый в настоящем документе термин «остеохондральные клетки» относится к клеткам, которые принадлежат к хондрогенной или остеогенной линии или которые могут претерпевать дифференцировку в хондрогенную или остеогенную линию, в зависимости от сигналов из их окружения. Указанный потенциал может быть испытан in vitro или in vivo с использованием известных методик. Так, в одном аспекте композиции ЕСМ по настоящему изобретению используют для восстановления и/или регенерации хондрогенных клеток, например клеток, которые способны продуцировать хрящ, или клеток, которые сами дифференцируются в хондроциты (например, клеток-предшественников хондроцитов). Так, в другом аспекте композиции ЕСМ по настоящему изобретению являются пригодными для восстановления и/или регенерации соединительной ткани. Используемый в настоящем документе термин «соединительная ткань» относится к любому количеству структурных тканей организма млекопитающего, включая, без ограничения, кость, хрящ, связку, сухожилие, мениск, дерму, гиподерму, мышцу, жировую ткань, капсулу сустава.

Композиции ЕСМ по настоящему изобретению можно использовать для лечения костно-хрящевых дефектов, истинного сустава, такого как колено, голеностопного сустава, локоть, бедро, запястье, сустава пальца руки или ноги или височно-нижнечелюстной сустав. Указанные костно-хрящевые дефекты могут быть результатом травматического повреждения (например, спортивной травмы или избыточной нагрузки) или заболевания, такого как остеоартрит. Особый аспект относится к применению матрикса по настоящему изобретению для лечения или профилактики поверхностных повреждений остеоартритного хряща. Кроме того, настоящее изобретение пригодно для лечения или профилактики костно-хрящевых дефектов, возникающих в результате старения или как следствие родов. Следует понимать также, что костно-хрящевые дефекты в контексте настоящего изобретения включают в себя те состояния, при которых требуется восстановление хряща и/или кости в контексте хирургии, такой как, без ограничения, пластические операции (например, носа, уха). Таким образом, указанные дефекты могут иметь место в любой части тела, где нарушено образование хряща или кости, или где хрящ или кость повреждены или не существуют в силу генетического дефекта.

Как обсуждалось выше, факторы роста или другие биологические агенты, которые индуцируют или стимулируют рост конкретных клеток, можно включать в состав композиций ЕСМ по настоящему изобретению. Тип факторов роста будет зависеть от типа клеток и применения, для которого предназначается композиция. Например, в случае остеохондральных клеток, могут присутствовать дополнительные биологически активные агенты, такие как факторы роста клеток (например, TGF- ), вещества, которые стимулируют хондрогенез (например, ВМР, которые стимулируют образование хряща, такие как ВМР-2, ВМР-12 и ВМР-13), факторы, которые стимулируют миграцию стромальных клеток в скаффолд, факторы, которые стимулируют отложение матрикса, противовоспалительные агенты (например, нестероидные противовоспалительные агенты), иммунодепрессанты (например, циклоспорины). Другие белки также могут быть включены в состав, такие как другие факторы роста, такие как факторы роста, полученные из тромбоцитов (PDGF), инсулиноподобные факторы роста (IGF), факторы роста фибробластов (FGF), эпидермальный фактор роста (EGF), человеческий эндотелиальный фактор роста (ECGF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), морфогенетический белок, полученный из хряща (CDMP), другие костные морфогенетические белки, такие как ОР-1, ОР-2, ВМР3, ВМР4, ВМР9, ВМР11, ВМР14, DPP, Vg-1, 60A и Vgr-1, коллагены, эластические волокна, ретикулярные волокна, гликопротеины или гликозаминогликаны, такие как гепаринсульфат, хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматансульфат, кератинсульфат и т.п. Например, факторы роста, такие как TGF- , с аскорбатом, как было установлено служат триггером дифференцировки хондроцитов и образования хряща хондроцитами. Помимо этого, гиалуроновая кислота является хорошим субстратом для прикрепления хондроцитов и других стромальных клеток и может быть включена в виде части скаффолда или нанесена на скаффолд в качестве покрытия.

Помимо этого, можно использовать также другие факторы, которые влияют на рост и/или активность конкретных клеток. Например, в случае хондроцитов, такой фактор как хондроитиназа, которая стимулирует выработку хряща хондроцитами, можно добавлять в матрикс с целью поддержания хондроцитов в гипертрофическом состоянии, как описано в патентной заявке США № 2002/0122790, включенной в настоящий документ в качестве ссылки. В другом аспекте способы по настоящему изобретению включают в себя присутствие полисульфатированных альгинатов или других полисульфатированных полисахаридов, таких как полисульфатированный циклодекстрин и/или полисульфатированный инулин, или других компонентов, способных стимулировать выработку внеклеточного матрикса соединительнотканных клеток, как описано в международной патентной публикации WO 2005/054446, включенной в настоящий документ в качестве ссылки.

Клетка или ткань, подлежащая восстановления и/или регенерации, может контактировать in vivo или in vitro с использованием любых способов, описанных в настоящем документе, например, композиции ЕСМ можно инъецировать или имплантировать (например, через ЕСМ ткань, накладку или устройство с покрытием по настоящему изобретению) субъекту. В другом аспекте ткань или клетки, подлежащие восстановлению и/или регенерации, можно брать у субъекта и культивировать in vitro и впоследствии имплантировать или вводить субъекту с использованием известных хирургических методик.

Как обсуждалось выше, композиции ЕСМ по настоящему изобретению можно обрабатывать различными способами. Соответственно в одном варианте осуществления настоящее изобретение включает в себя тканевую культуральную систему. В различных аспектах, культуральная система состоит из композиций внеклеточного матрикса, описанных в настоящем документе. Композиции ЕСМ по настоящему изобретению можно инкорпорировать в тканевую культуральную систему различными способами. Например, композиции можно инкорпорировать в качестве покрытий путем импрегнирования материалов трехмерных скаффолдов, как описано в настоящем документе, или в качестве добавок к средам для культивирования клеток. Соответственно, в одном аспекте культуральная система может включать в себя трехмерные поддерживающие материалы, импрегнированные любой композицией внеклеточного матрикса, описанной в настоящем документе, такой как факторы роста или эмбриональные белки.

Композиции внеклеточного матрикса, описанные в настоящем документе, могут служить в качестве подложки или трехмерной подложки для роста различных клеточных типов. Рассматривается любой клеточный тип, способный образовывать клеточную культуру. В одном аспекте культуральную систему можно использовать для поддержания роста стволовых клеток. В другом аспекте стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки или нейрональные стволовые клетки.

Тканевая культуральная система может использоваться для генерации дополнительных композиций ЕСМ, таких как имплантируемая ткань. Соответственно, культивирование клеток с использованием тканевой культуральной системы по настоящему изобретению можно осуществлять in vivo или in vitro. Например, тканевую культуральную систему по настоящему изобретению можно использовать для генерации композиций ЕСМ для инъекции или имплантации субъекту. Композиции ЕСМ, генерированные тканевой культуральной системой, можно обрабатывать и использовать в любом способе, описанном в настоящем документе.

Композиции ЕСМ по настоящему изобретению можно использовать в качестве биологического носителя для доставки клеток. Как описано в настоящем документе, композиции ЕСМ могут включать в себя растворимые и/или нерастворимые фракции. В качестве такового в другом варианте осуществления настоящего изобретения описан биологический носитель для доставки или поддержания клеток в месте доставки, включающий композиции внеклеточного матрикса по настоящему изобретению. Композиции ЕСМ по настоящему изобретению, включающие в себя клетки и трехмерные тканевые композиции, можно использовать для ускорения и/или поддержания роста клеток in vivo. Носитель можно использовать для любого подходящего применения, на для поддерживающих инъекций клеток, таких как стволовые клетки, в поврежденную сердечную мышцу, или для восстановления сухожилия или связки, как описано выше.

Подходящие клеточные композиции (например, изолированные ЕСМ клетки по настоящему изобретению и/или дополнительные биологические агенты) можно вводить до, после или во время имплантации или введения композиций ЕСМ. Например, клетки можно засевать в место введения, дефекта и/или имплантации до имплантации субъекту культуральной системы или носителя для биологической доставки. Альтернативно, подходящие клеточные композиции можно вводить после (например, инъекцией в участок). Клетки действуют в нем, индуцируя регенерацию ткани и/или восстановление клеток. Клетки можно засевать любыми способами, которые позволяют вводить клетки в участок дефекта, например, путем инъекции. Инъекции клеток можно осуществлять любыми средствами, которые поддерживают жизнеспособность клеток, такими как шприц или артроскоп.

Были описаны композиции внеклеточного матрикса для стимуляции ангиогенеза в органах и тканях посредством введения указанных композиций для ускорения эндотелизации и васкуляризации в сердце и связанных с ним тканях. Соответственно, в еще одном варианте осуществления настоящее изобретение включает в себя поверхностное покрытие, используемое в сочетании с имплантацией устройства субъекту, включающее композиции внеклеточного матрикса, описанные в настоящем документе. Покрытие можно наносить на любое устройство, используемое для имплантации или проникновения в субъект, такое как водитель ритма, стент, стентовый трансплантат, сосудистый протез, сердечный клапан, шунт, порт или катетер для доставки лекарственных средств. В определенных аспектах покрытие можно использовать для модификации заживления ран, модификации воспаления, модификации образования фиброзной капсулы, модификации врастания или модификации врастания клеток. В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает в себя лечение поврежденной ткани, такой как сердце, кишечная, инфарктная или ишемизированная ткань. Ниже представлены примеры, обсуждающие генерацию композиций внеклеточного матрикса, предполагаемые для указанного применения. Изготовление и применение композиций внеклеточного матрикса, выращенных при нормальных кислородных условиях, описано в патентной заявке США № 2004/0219134, включенной в настоящем документе в качестве ссылки.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает в себя накладку для регенерации тканей, включающую в себя композиции внеклеточного матрикса, описанные в настоящем документе. В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает в себя способ улучшения поверхности кожи у субъекта, включающий в себя введение субъекту в участок морщины композиций внеклеточного матрикса, описанных в настоящем документе. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение включает в себя способ восстановления или наращивания мягкой ткани у субъекта, включающий в себя введение субъекту в участок морщины композиций внеклеточного матрикса, описанных в настоящем документе. Изготовление и применение композиций внеклеточного матрикса, созданных при нормальных кислородных условиях культивирования, для восстановления и/или регенерации клеток, улучшения поверхностей кожи и восстановления мягких тканей описано в патенте США № 5 830 708, патенте США № 6 284 284, патентной заявке США № 2002/0019339 и патентной заявке США № 2002/0038152, включенных в настоящий документ в качестве ссылок.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает в себя биологический антиадгезионный агент, включающий в себя композиции внеклеточного матрикса, описанные в настоящем документе. Агент можно использовать для указанных применений в форме антиадгезионных накладок, используемых для создания кишечных или сосудистых анастомозов.

Композиции или активные агенты, используемые в настоящем документе, в типичных случаях будут использоваться в количестве, эффективном для лечения или профилактики конкретного заболевания, по поводу которого проводится лечение. Композиции можно вводить в терапевтических целях для достижения терапевтического эффекта или профилактически для достижения профилактического эффекта. Под терапевтическим эффектом подразумевается ликвидация или улучшение основного состояния или заболевания, по поводу которого осуществляется лечение. Терапевтический эффект также включает в себя остановку или замедление прогрессирования заболевания, независимо от наступления улучшения.

Количество введенной композиции будет зависеть от ряда факторов, включая, например, тип композиции, конкретные показания к проведению лечения, способа введения, является ли желаемый эффект профилактическим или терапевтическим, тяжести состояния, по поводу которого проводится лечение, а также возраста и массы тела пациента и эффективности лекарственной формы. Определение эффективной дозы находится в компетенции специалистов.

Первоначальные дозы могут быть определены сначала по результатам исследований in vitro. Первоначальные дозы также могут быть определены по данным in vivo, таким как экспериментальные животные. Экспериментальные животные, подходящие для испытаний эффективности композиций для усиления роста волос, включают в себя, среди прочих, грызунов, приматов и других млекопитающих. Опытный специалист может определить дозы, подходящие для введения человеку, путем экстраполяции данных in vivo и с использованием экспериментальных животных.

Размеры дозы будут зависеть, среди прочих факторов, от активности кондиционированных сред, способа введения, состояния, по поводу которого проводится лечение, и различных факторов, обсуждавшихся выше. Размеры дозы и интервалы между ними можно подбирать индивидуально для обеспечения уровней, достаточных для поддержания терапевтического или профилактического эффекта.

В одном варианте осуществления способы по настоящему изобретению включают в себя введение ЕСМ в комбинации с противовоспалительным агентом, антигистаминными агентами, химиотерапевтическим агентом, иммуномодулятором, терапевтическим антителом или ингибитором протеинкиназы, в ткань, клетку или субъекту, нуждающемуся в указанном лечении. Без ограничения, химиотерапевтические агенты включают в себя антиметаболиты, такие как метотрексат, агенты, осуществляющие поперечную сшивку ДНК, такие как цисплатин/карбоплатин; алкилирующие агенты, такие как канбусил; ингибиторы топоизомеразы I, такие как дактиномицин; ингибиторы микротрубочек, такие как таксол (паклитаксол) и т.п. Другие химиотерапевтические агенты включают в себя, например, алкалоиды винки, антибиотик типа митомицина, антибиотик типа блеомицина, антифолат, колхицин, демеколин, этопозид, таксан, антрациклиновый антибиотик, доксорубицин, даунорубицин, карминомицин, эпирубицин, идарубицин, митоксантрон, 4-диметоксидауномицин, 11-дезоксидаунорубицин, 13-дезоксидаунорубицин, адриамицин-14-бензоат, адриамицин-14-октаноат, адриамицин-14-нафталинацетат, амсакрин, кармустин, циклофосфамид, цитарабин, этопозид, ловастатин, мелфалан, топетекан, оксалаплатин, хлорамбуцил, метотрексат, ломустин, тиогуанин, аспарагиназу, чинбластин, виндезин, тамоксифен или мехлоретамин. Без ограничения, терапевтические антитела включают в себя антитела, направленные против белка HER2, такие как трастузумаб; антитела, направленные против факторов роста или рецепторов факторов роста, такие как бевацизумаб, который нацелен на сосудистый эндотелиальный фактор роста, и OSI-774, который нацелен на эпидермальный фактор роста; антитела, направленные против интегриновых рецепторов, такие как витаксин (также известный как MEDI-522), и т.п. Классы противораковых агентов для использования в композициях и способах по настоящему изобретению включают в себя, без ограничения: 1) алкалоиды, включая ингибиторы микротрубочек (например, винкристин, винбластин, виндезин и т.п.), стабилизаторы микротрубочек (например, паклитаксел [таксол], доцетаксел, таксотере и т.п.) и ингибиторы функции хроматина, включая ингибиторы топоизомеразы, такие как эпиподофиллотоксины (например, этопозид [VP-16] и тенипозид [VM-26] и т.п.) и агенты, которые направлены против топоизомеразы I (например, камптотецин и изиринотекан [CPT-11] и т.п.); 2) агенты, связывающие ДНК ковалентной связью [алкилирующие агенты], включая азотные аналоги горчичного газа (например, мехлоретамин, хлорамбуцил, циклофосфамид, ифосфамид и бусульфан [милеран] и т.п.), нитрозомочевины (например, кармустин, ломустин, семустин и т.п.) и другие алкилирующие агенты (например, дакарбазин, гидроксиметилмеламин, тиотепа, митоцицин и т.п.); 3) агенты, связывающие ДНК нековалентной связью [противоопухолевые антибиотики], включая ингибиторы нуклеиновых кислот (например, дактиномицин {актиномицин D] и т.п.), антрациклины (например, даунорубицин [дауномицин и церубидин], доксорубицин [адриамицин] и идарубицин [идамицин] и т.п.), антраценедионы (например, аналоги антрациклины, такие как [митоксантрон] и т.п.), блеомицины (бленоксан) и т.п., и пликамицин (митрамицин) и т.п.; 4) антиметаболиты, включая антифолаты (например, метотрексат, фолекс, мексат и т.п.), пуриновые антиметаболиты (например, 6-меркаптопурин [6-MP. Пуринетол], 6-тиогуанин [6-TG], азатиоприн, ацикловир, гапцикловир, хлордезоксиаденозин, 2-хлордезоксиаденозин [CdA], 2'-дезоксикоформицин [пентостатин] и т.п.), антагонисты пиримидина (например, фторпиримидины [например, 5-фторурацил (адруцил), 5-фтордезоксиуридин (FdUrd) (флоксуридин)] и т.п.) и цитозиновые арабинозиды (например, цитозар [ара-С], флударабин и т.п.); 5) ферменты, включая L-аспарагиназу; 6) гормоны, включая глюкокортикоиды, такие как антиэстрогены (например, тамоксифен и т.п.), нестероидные антиандрогены (например, флутамид и т.п.) и ингибиторы ароматазы (например, анастрозол [аримидекс] и т.п.); 7) соединения платины (например, цисплатин и карбоплатин и т.п.); 8) моноклональные антитела, конъюгированные с противораковыми лекарственными средствами, токсинами/или радионуклидами и т.п.; 9) модификаторы биологического ответа (например, интерфероны [например, IFN-альфа и т.п.] и интерлейкины [например, IL-2 и т.п.] и т.п.); 10) адоптивная иммунотерапия; 11) гематопоэтические факторы роста; 12) агенты, которые индуцируют дифференцировку опухолевых клеток (например, all-транс-ретиноевая кислота и т.п.); 13) методики генной терапии; 140 методики антисмысловой терапии; 15) опухолевые вакцины; 16) лекарственные средства, направленные против метастазов опухоли (например, батимистат и т.п.) и 17) ингибиторы ангиогенеза.

Фармацевтическая композиция и способ по настоящему изобретению могут дополнительно включать в себя другие терапевтически активные соединения, как отмечалось в настоящем документе, которые обычно используются для лечения упомянутых выше патологических состояний. Примеры других терапевтических агентов включают в себя следующие агенты: циклоспорины (например, циклоспорин А), CTLA4-Ig, антитела, такие как ICAM-3, анти-IL-2 рецептор (анти-Тас), анти-CD45RB, анти-CD2, анти-CD3 (OKT-3), анти-CD4, анти-CD80, анти-CD86, агенты, блокирующие взаимодействия между CD40 и gp39, такие как антитела, специфичные в отношении CD40 и/или gp39 (т.е., CD154), слитые белки, построенные из CD40 и gp39 (CD40Ig и CD8 gp39), ингибиторы, такие как ингибиторы нуклеарной транслокации, функции NF-каппа В, такие как дезоксиспергуалин (DSG), ингибиторы биосинтеза холестерина, такие как ингибиторы HMG CoA редуктазы (ловастатин и симвастатин), нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (НПВС), такие как ибупрофен и ингибиторы циклооксигеназы, такие как рофекоксиб, стероиды, такие как преднизон или дексаметазон, соединения золота, антипролиферативные агенты, такие как метотрексат, FK506 (такролимус, програф), микофенолат мофетила, цитотоксические лекарственные средства, такие как азатиоприн и циклофосфамид, ингибиторы TNF- , такие как тенидап, анти-TNF антитела или растворимый рецептор TNF, и рапамицин (сиролимус или рапамун) или их производные.

Другие агенты, которые можно вводить в комбинации с композициями и способами по настоящему изобретению, включают в себя белковые терапевтические агенты, такие как цитокины, иммуномодулирующие агенты и антитела. Используемый в настоящем документе термин «цитокин» включает в себя цитокины, интерлейкины, лимфокины, монокины, колониестимулирующие факторы и связанные с рецепторами белки, а также их функциональные фрагменты. Используемый в настоящем документе термин «функциональный фрагмент» относится к полипептиду или пептиду, который обладает биологической функцией или активностью, которая идентифицируется посредством определенного функционального исследования.

Цитокины включают в себя эндотелиальный пептид, активирующий моноциты II (EMAP-II), CSF гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF), CSF гранулоцитов (G-CSF), CSF макрофагов (M-CSF), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12 и IL-13, интерфероны и т.п., и которые связаны с определенными биологическими, морфологическими или фенотипическими изменениями в клетке или в клеточном механизме.

В случае, когда другие терапевтические агенты используются в комбинации с композициями или способами по настоящему изобретению, их можно использовать, например, в количествах, которые упомянуты в Physician Desk Reference (PDR), или как-либо иначе определены специалистом. Ниже представлены примеры, обсуждающие генерацию композиций внеклеточного матрикса, предполагающихся для обсуждавшегося применения. Следующие примеры представлены для дополнительной иллюстрации вариантов осуществления настоящего изобретения, но не предназначены для ограничения объема изобретения. В то время как указанные примеры являются типичными среди тех, которые можно использовать, альтернативно можно использовать другие процедуры, методики или технологии, известные специалистам.

ПРИМЕР 1

ДИФФРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ В КОМПОЗИЦИЯХ ЕСМ, ВЫРАЩЕННЫХ В ГИПОКСИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ

Первичные человеческие неонатальные фибробласты крайней плоти культивировали в виде стандартных монослоев во флаконах для культур тканей и сравнивали с трехмерными культурами фибробластов, в отложенном естественным образом, ЕСМ, подобном фетальному ЕСМ. Для оценки дифференциальной экспрессии генов образцы общей РНК были выполнены с использованием микроматриц Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays® на предмет глобальной экспрессии генов (включая менее 40 000 генов) согласно протоколу производителя.

В результате сравнения было установлено, что фибробласты регулируют экспрессию генов коллагена и ЕСМ в трехмерных культурах в культивированном в гипоксических условиях естественно секретированном ЕСМ.

Повышающая и понижающая регуляция экспрессии различных генов коллагена и ЕСМ очевидна из таблицы 3.

В результате сравнения было установлено, что фибробласты регулируют экспрессию генов путей Wnt в гипоксических культивированном естественно секретированном ЕСМ. Повышающая и понижающая регуляция экспрессии различных генов путей Wnt очевидна из таблицы 4.

В результате сравнения было установлено, что фибробласты регулируют экспрессию генов путей костного морфогенетического белка (ВМР) в трехмерных культурах в культивированном в гипоксических условиях естественно секретированном ЕСМ. Повышающая и понижающая регуляция экспрессии различных генов путей ВМР очевидна из таблицы 5.

В результате сравнения было установлено, что фибробласты регулируют экспрессию дополнительных генов в гипоксических культивированном естественно секретированном ЕСМ. Повышающая и понижающая регуляция экспрессии дополнительных генов очевидна из таблицы 6.

ПРИМЕР 2

ПРОДУКЦИЯ ГИПОКСИЧЕСКОГО ЕСМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЕРВИЧНЫХ ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ НЕОНАТАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ КРАЙНЕЙ ПЛОТИ

Приведены два примера гипоксической культуры ЕСМ с использованием первичных человеческих неонатальных фибробластов крайней плоти.

Первичные человеческие неонатальные фибробласты крайней плоти размножали в колбах для культур тканей в присутствии 10% фетальной бычьей сыворотки, 90% DMEM с высоким содержанием глюкозы с 2 мМ L-глутамином (10% FBS/DMEM). Клетки подвергали субкультивированию с использованием раствора 0,05% трипсин/EDTA до 3-го пассажа, при котором клетки засевали на декстрановые гранулы Cytodex в количестве 0,04 мг сухих гранул/мл среды (5е⁶ клеток/10 мг гранул в 125 вращающейся колбе, наполненной 100-120 мл) или на нейлоновую сетку (25е⁶ клеток/6 × 100 см ² нейлона). Все культуры поддерживали при нормальной атмосфере и 5% СО₂ для роста и посева, после чего низкокислородные культуры переносили в воздухонепроницаемую камеру, которую заполняли 95% азотом/5% СО₂ таким образом, чтобы создать гипоксическое окружение внутри культуральной среды. Указанная система поддерживания содержания кислорода внутри культурального сосуда приблизительно 1-5%. Клетки тщательно перемешивали в минимальной объеме, необходимом для покрытия нейлона или гранул для осуществления засевания, а затем перемешивали один раз спустя 30 минут, затем позволяли им оседать в течение ночи в термостате с увлажненной атмосферой при 37°С. Культуры питали 10% FBS/DMEM в течение 2-4 недель с заменой 50-70% сред каждые 2-3 дня, в то время как клетки пролиферировали, а затем начинали откладывать ЕСМ. Культуры питали в течение еще 4-6 недель с использованием 10% бычьей телячьей сыворотки с добавлением железа и 20 мкг/мл аскорбиновой кислоты вместо FBS. Вращающиеся колбы перемешивали сначала на 15-25 об/мин в течение приблизительно 2-4 недель, после чего скорость перемешивания увеличивали до 45 об/мин и впоследствии поддерживали указанную скорость. Культуры на гранулах образовывали большие аморфные структуры, содержащие ЕСМ до 0,5-1,0 см в ширине и диаметре через 4 недели, и указанные культуры были, следовательно, гипоксическими в силу диффузии газов и высоких метаболических потребностей.

В дополнительном примере первичные человеческие неонатальные фибробласты крайней плоти размножали в колбах для монослойных культур, а затем культивировали на скаффолдах из нейлоновой сетки для поддержания развития внеклеточного матрикса (ЕСМ) in vitro. Фибробласты размножали в DMEM с высоким содержанием глюкозы, 2 мМ L-глутамина и 10% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки. В культуры также добавляли 20 мкг/мл аскорбиновой кислоты. Спустя 3 недели в атмосферном кислороде (приблизительно 16-20% кислорода) дублированные содержания ЕСМ культуры переключали на гипоксические условия культивирования (1%-5% кислорода) в герметичной камере с экстенсивной прокачкой 95% азотом/5% диоксидом углерода (кат. № МС-101, Billups-Rothenberg, Inc., Del Mar, CA). Для того чтобы гарантировать удаление кислорода из культуральной среды, 2-3 часа спустя атмосферу заменяли, чтобы гарантировать содержание кислорода в среде около 1-3%. Обе серии содержащих ЕСМ культур выращивали с использованием питания два раза в неделю в течение еще 4 недель, а затем культуры подготавливали для выделения РНК. Общую клеточную РНК выделяли с использованием коммерчески доступного набора согласно инструкциям производителя (кат. № Z3100, Promega, Inc.). Образцы очищенной РНК хранили при -80°С вплоть до их обработки для микроматричного анализа экспрессии генов с использованием микроматриц Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays®.

При анализе результатов выявили приблизительно 5 500 дифференциально экспрессируемых транскриптов из проб, полученных при атмосферном кислороде, по сравнению с пробами из низкокислородных культур, с использованием микроматриц Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays®. Среди них около половины (2500) демонстрировали более чем в 2,0 раза повышение при низком кислороде и около половины (2500) демонстрировали более чем в 2,0 раза понижение при низком кислороде. Это показывает, что низкое содержание кислорода приводит к значительным изменениям экспрессии генов in vitro. Особый интерес представляет то, что транскрипты для белков ЕСМ, особенно ряда генов коллагена, претерпевали повышающую регуляцию, в то время как ряд генов разлагающих матрикс ферментов претерпевал понижающую регуляцию.

ПРИМЕР 3

ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ЭМБРИОНАЛЬНЫЙ ВНЕКЛЕТОЧНЫЙ МАТРИКС, ПОЛУЧЕННЫЙ СПОСОБОМ ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ, ДЛЯ ТЕРПЕВТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

Эмбриональный внеклеточный матрикс (ЕСМ) создает окружение, обеспечивающее быструю пролиферацию клеток и заживление без образования рубцов или спаек. Была выдвинута гипотеза о том, что рост человеческих неонатальных фибробластов в трех измерениях, в условиях, которые имитируют раннее эмбриональное окружение до ангиогенеза (гипоксию и пониженные гравитационные силы) должны генерировать ЕСМ, обладающий фетальными свойствами. Анализ с использованием генных чипов показал дифференциальную экспрессии свыше 5000 генов при гипоксических условиях культивирования тканей по сравнению с традиционными условиями. Выработанный ЕСМ имел сходство с фетальной мезенхимальной тканью в том, что он содержит относительно большое количество коллагенов типа III, IV и V и гликопротеинов, таких как фибронектин, SPARC, тромбоспондин и гиалуроновая кислота. Поскольку ЕСМ также играет важную регуляторную роль в связывании и презентации факторов роста в предполагаемых нишах, которые поддерживают регенеративные популяции стволовых клеток с помощью ключевых факторов роста, заявители оценивали влияние гипоксии на экспрессию факторов роста во время развития ЕСМ, подобного фетальному ЕСМ, в культуре. Гипоксия также может усиливать экспрессию факторов, которые регулируют заживление ран и органогенез, таких как VEGF, FGF-7 и TGF- , а также многочисленных Wnt, включая wnt 2b, 4, 7a и 11. Эмбриональный человеческий ЕСМ также стимулировал увеличение метаболической активности в человеческих фибробластах in vitro, что измеряется повышенной ферментативной активностью при использовании анализа МТТ. Помимо этого, заявители выявили увеличение количества клеток в результате воздействия человеческого ЕСМ. Указанный человеческий ЕСМ можно использовать как биологическое покрытие поверхностей, а также филлер для тканей для различных видов терапевтического применения, при которых требуется рост тканей и заживление тканей без образования рубцов или спаек.

ПРИМЕР 4

ПОЛУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ НАТУРАЛЬНО РАСТВОРИМОГО WNT ДЛЯ ЦЕЛЕЙ РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ

Стволовые клетки или клетки-предшественники, которые могут регенерировать ткани взрослого организма, такие как кожа или кровь, до некоторой степени повторяют эмбриональное развитие, для осуществления указанной регенерации. Все возрастающее количество исследований показало, что ключевые регуляторы плюрипотентности стволовых клеток и линейно-специфичной дифференцировки, активные во время эмбриогенеза, реэкспрессируются у взрослых организмов при определенных обстоятельствах. Семейство WNT секретируемых морфогенетических факторов роста и связанными с развитием факторов относится к факторам роста, которые потенциально могут предоставить ценные исследовательские инструменты и, в конечном итоге, терапевтические средства для клинической практики. Однако, было доказано, что в настоящее Wnt не поддаются стандартным методикам рекомбинантной экспрессии и очистки в коммерческих масштабах, и отсутствуют сообщения о получении белков WNT в больших объемах, что сделало бы возможным клиническую разработку продуктов на основе WNT. Были разработаны методики выращивания ЕСМ, подобного фетальному ЕСМ, в культуре с использованием неонатальных человеческих фибробластов на различных скаффолдах, для получения трехмерных тканевых эквивалентов. В указанном процессе было установлено, что указанные культуры могут обеспечить в коммерческих масштабах источник биологически активных WNT, содержащихся в среде, использованной для продукции ЕСМ, не содержащей сыворотки. В настоящем документе заявители представляют данные по указанному продукту-кандидату WNT.

Анализ экспрессии генов в клетках показал, что экспрессировались по меньшей мере три гена WNT (wnt 5a, wnt 7a и wnt 1), а также экспрессировалось небольшое количество генов, связанных с сигналингом wnt; однако их функция ясна не полностью. Данные по экспрессии генов были распространены на биологическое исследование in vitro на предмет сигналинга wnt (ядерная транслокация -катенина в первичных человеческих эпидермальных кератиноцитах) и оценивалась активность wnt в отношении стволовых клеток крови. Оба исследования показали активность, согласующуюся с канонической активностью wnt. Кроме того, кондиционированные среды из указанных культур показали активность wnt, после того, как их инъецировали в кожу мышей, что индуцировало вхождение стволовых клеток волосяного фолликула в стадию анагена, вызывая, таким образом, рост волос. Это показывает, что стабилизированная активность WNT в определенной и не содержащей сыворотки кондиционированной среде не требует очистки. Указанный продукт можно использовать для регенерации волосяных фолликулов и в качестве ценного исследовательского инструмента для культивирования различных стволовых клеток человека.

ПРИМЕР 5

ГИПОКСИЧЕСКИЕ ФИБРОБЛАСТЫ ДЕМОНСТРИРУЮТ УНИКАЛЬНУЮ ВЫРАБОТКУ ЕСМ И ЭКСПРЕССИЮ ФАКТОРОВ РОСТА

Человеческие неонатальные фибробласты кожи вырабатывают ЕСМ при культивировании in vitro, которые практически точно имитируют кожу и которые могут заменять поврежденную кожу при использовании в регенеративной медицине, такой как заживление ран. Поскольку процесс заживления ран также повторяет эмбриональное развитие, заявители предположили, что при имитации эмбрионального окружения выработанный ЕСМ будет обеспечивать усиленный ЕСМ для использования для регенерации тканей. Таким образом, ЕСМ, полученный при использовании человеческих неонатальных фибробластов, выращивали в культуре в гипоксических условиях, для имитации гипоксии, которая имеет место в эмбрионе на ранних стадиях развития, до ангиогенеза. Целью было получение ЕСМ, обладающего фетальными свойствами, с использованием гипоксических условий во время развития тканей в культуре.

ЕСМ, выработанный в указанных гипоксических условиях, был подобен фетальной мезенхимальной ткани в том, что он содержит относительно много коллагенов типа III, IV и V и гликопротеинов, таких как фибронектин, SPARC, тромбоспондин и гиалуроновая кислота. Поскольку ЕСМ также играет важную регуляторную роль в связывании и презентации факторов роста в предполагаемых нишах, которые поддерживают регенеративные популяции стволовых клеток с помощью ключевых факторов роста, заявители оценивали влияние гипоксии на экспрессию факторов роста во время развития ЕСМ, подобного фетальному ЕСМ, в культуре. Было показано, что гипоксия также может усиливать экспрессию факторов, которые регулируют заживление ран и органогенез, таких как VEGF, FGF-7 и TGF- .

Человеческий ЕСМ также стимулировал увеличение метаболической активности в человеческих фибробластах in vitro, что измеряется повышенной ферментативной активностью при использовании анализа МТТ. Помимо этого, было установлено увеличение количества клеток в результате воздействия человеческого ЕСМ. Указанные результаты подтверждают тот факт, что использование указанного человеческого ЕСМ в качестве биологического покрытия/скаффолда в эмбриональных клеточных культурах и в качестве биологического покрытия/филлера для различных видов терапевтического применения или медицинских устройств.

ПРИМЕР 6

КОМПОЗИЦИИ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА ПРИ МЕЛАНОМЕ, ГЛИОМЕ И РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Опухолевый рост клеток В16 (меланомная клеточная линия), С6 (глиомная клеточная линия) и MDA 435 (клеточная линия рака молочной железы) в присутствии или отсутствии ЕСМ и в присутствии или отсутствии цисплатина изучали на хорионаллантоисной мембране (САМ) в исследовании на оплодотворенных куриных яйцах. Кратко, яйца проверяли на свет на предмет жизнеспособности. Воздушный мешок смешали, создавая пузырь между скорлупой и хорионаллантоисными мембранами на экваторе яйца. В скорлупе прорезали окно для получения доступа к САМ. Клетки добавляли к САМ следующим образом: клетки В16, 5 миллионов на яйцо; клетки С6, 5 миллионов на яйцо; и клетки MD435, 5 миллионов на яйцо. В группе яиц, обработанных ЕСМ, ЕСМ (~100 мкг на обработку) и клетки добавляли в яйца одновременно. В группе яиц, обработанных цисплатином, цисплатин (250 мкл 1 мг/мл раствора цисплатина) добавляли местно на следующий день. Яйца инкубировали в течение 10 дней, после чего опухоли удаляли и взвешивали.

Масса опухолей достоверно уменьшалась в присутствии ЕСМ. Фигуры 1 и 2 показывают, что масса опухолей, образованных клетками В16, уменьшалась в присутствии ЕСМ по сравнению с отсутствием ЕСМ. Масса опухолей также уменьшалась как в случае, когда опухолевые клетки смешивали с ЕСМ, так и в случае, когда опухолевые клетки выращивали на ЕСМ (фигура 3). Фигуры 4 и 5 показывают, что масса опухолей, образованных клетками С6, уменьшалась в присутствии ЕСМ по сравнению с отсутствием обработки. Кроме того, масса опухолей дополнительно уменьшалась в присутствии ЕСМ с цисплатином. Фигура 7 показывает, что масса опухолей, образованных клетками рака молочной железы MDA 435, уменьшалась в присутствии ЕСМ по сравнению с отсутствием обработки и дополнительно уменьшалась ЕСМ с цисплатином.

В другом исследовании САМ клетки В16 инъецировали в яйца (2-3 миллиона клеток на яйцо) с 100 мкл дозой BioNeusis (10 мг/мл). BioNeusis представляет собой среду, кондиционированную фибробластами в биореакторе, использованную для генерации ЕСМ, и является очень сходной с ЕСМ только в жидкой форме. Фигура 16 показывает, что рост опухолей в исследовании САМ уменьшался в присутствии BioNeusis по сравнению с отсутствием обработки. В еще одном исследовании клетки В16 выращивали в присутствии возрастающих концентраций жидкого ЕСМ; при этом рост уменьшался при всех концентрациях ЕСМ (фигура 17). В другом исследовании клетки В16 выращивали в жидком ЕСМ во фракциях с различной молекулярной массой по сравнению с клетками В16, выращенными в нефракционированном жидком ЕСМ в исследовании САМ. Все фракции с различными молекулярными массами, кроме фракции >100 000 дальтон, показали увеличение процентного уменьшения массы опухолей по сравнению с нефракционированным ЕСМ (фигура 18).

Рост опухолей клеток В16, клеток С6 или клеток MDA435 в присутствии или отсутствии ЕСМ, и в присутствии или отсутствии цисплатина изучали на бестимусных мышах. Клетки, ЕСМ и цисплатин инъецировали одновременно подкожно в нижнюю заднюю часть тела бестимусной мыши. Рост опухоли отслеживали с течением времени с использованием фотографии, измерений длины и ширины, затем, в конечном итоге, измерения массы. Фигуры 8 и 9 показывают рост опухолей из клеток С6 у бестимусных мышей в присутствии (фигура 9) и отсутствии (фигура 8) ЕСМ на день 14 после инъекции. Фигуры 10 и 11 показывают рост опухолей из клеток С6 у бестимусных мышей в присутствии ЕСМ с цисплатином (фигура 10) и в присутствии цисплатина без ЕСМ (фигура 11) на день 14 после инъекции. Клеточный рост с ЕСМ показал уменьшение или отсутствие роста опухолей по сравнению с контролем (без обработки), который действительно формировал пальпируемые опухоли. Фигура 12 показывает диаграмму роста опухолей за 18 дней, на которой мыши, леченные ЕСМ, показали уменьшение роста опухолей по сравнению с нелеченным контролем, а мыши, леченные цисплатином, с ЕСМ или без него, не показали роста. В аналогичном исследовании клетки MDA435, выращенные с ЕСМ (фигура 13В), с ЕСМ плюс цисплатин (фигура 13С) или только с цисплатином (фигура 13В) показали уменьшение или отсутствие роста опухолей по сравнению с нелеченным контролем (фигура 13А), который действительно формировал пальпируемые опухоли. Фигура 14 показывает диаграмму роста опухолей за 25 дней, на которой мыши, леченные ЕСМ, показали уменьшение роста опухолей по сравнению с нелеченным контролем. Мыши, леченные цисплатином, с ЕСМ или без него, показали уменьшение массы опухолей до нуля. Фигура 15 показывает результаты клеток В16, выращенных у бестимусных мышей, с ЕСМ (правая сторона) или без ЕСМ (левая сторона), у которых рост опухолей был подавлен в присутствии ЕСМ.

Несмотря на то, что изобретение было описано с использованием приведенных выше примеров и файлового приложения 1, полное содержание которого включено в настоящем документе в качестве ссылки, следует понимать, что модификации и вариации охватываются идеей и объемом изобретения. Соответственно, изобретение ограничивается только следующей формулой изобретения.