способ прогнозирования наступления беременности у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в программе экстракорпорального оплодотворения

Формула изобретения

Способ прогнозирования наступления беременности у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием путем исследования биоптатов эндометрия, полученных в лютеиновую фазу менструального цикла перед программой ЭКО, отличающийся тем, что определяют относительное содержание CD95+ макрофагов в лейкоцитарном инфильтрате эндометрия и при значении, равном 48,8% или более, прогнозируют наступление беременности, а при значении менее 48,8% - отсутствие наступления беременности.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования наступления беременности у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в результате лечения методом экстракорпорального оплодотворения.

Актуальность предлагаемого способа определяется тем, что трубно-перитонеальный фактор занимает ведущее место в структуре бесплодного брака (35-60%) и в значительной степени препятствует восстановлению репродуктивной функции (Кулаков В.И., Корнеева И.Е. Практическая гинекология. - М.: 2002). Общепризнанным, перспективным способом преодоления бесплодия у женщин с трубно-перитонеальным фактором является метод экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Тем не менее, эффективность данного метода остается низкой: частота наступления беременности в расчете на один перенос составляет 32,4%, по данным European IVF-Monitoring Program, 2006. В связи с этим, особую актуальность приобретает поиск методов, позволяющих прогнозировать наступление беременности после ЭКО. Широкое внедрение этих способов в практическое здравоохранение поможет существенно повысить эффективность этого метода лечения. Однако в настоящее время надежные прогностические критерии наступления беременности у пациенток с трубно-перитонеальным фактором немногочисленны.

Известен способ прогнозирования наступления беременности, заключающийся в том, что в фолликулярной жидкости определяют свободнорадикальную активность и при показателях общей антиоксидантной активности 0,05 и выше прогнозируют наступление беременности с вероятностью более 50% (патент RU № 2357673. Способ прогнозирования результатов лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения / Потехина Ю.П., Щербатюк Т.Г., Хрулева Н.В. - Изобретения. Полезные модели. - 2009. - № 16).

Однако этот способ имеет ряд недостатков:

1. Способ имеет высокий риск возникновения осложнений, так как забор фолликулярной жидкости возможен только при проведении трансвагинальной пункции фолликулов под общим обезболиванием и может осложниться кровотечением.

2. Использование способа происходит во время протокола ЭКО - пункции фолликулов, т.е. на том этапе, когда уже невозможно изменить тактику стимуляции суперовуляции яичников пациентки (наиболее затратный этап ЭКО).

3. Предложенный способ имеет низкую точность - 50%.

В качестве параметра, позволяющего прогнозировать наступление беременности у женщин с трубным фактором бесплодия, у которых отсутствует гидросальпинкс, предлагают использовать показатель уровня жидкости в полости матки, определяемый с помощью ультразвукового исследования в день забора ооцитов, и при значениях этого показателя в передне-заднем размере, равном или больше 3,5 мм, прогнозируют неблагоприятный исход программы ЭКО и ПЭ (Не R.H., Gao H.J., Li Y.Q., Zhu Х.М. The associated factors to endometrial cavity fluid and the relevant impact on the IVF-ET outcome// Reprod. Biol. Endocrinol.- 2010. - Vol.14, № 8. - P.46).

Однако этот способ имеет ряд недостатков:

1. Использование способа происходит во время протокола ЭКО - пункции фолликулов, т.е. на том этапе, когда уже невозможно изменить тактику стимуляции суперовуляции яичников пациентки (наиболее затратный этап ЭКО).

2. Данный способ применим лишь у женщин с трубным фактором бесплодия, которые не имеют даже признаков гидросальпинкса.

3. Отсутствуют данные о точности способа.

Наиболее близким по техническому решению к заявляемому способу является способ прогнозирования наступления беременности в программе ЭКО у женщин, в том числе с трубно-перитонеальным бесплодием, по определению экспрессии в ткани эндометрия фактора, ингибирующего лейкемию (leukemia inhibitory factor, LIF). Метод заключается в том, что у женщины проводят биопсию эндометрия в лютеиновую фазу менструального цикла, предшествующего началу протокола овариальной гиперстимуляции, оценивают уровень экспрессии LIF методом иммуногистохимического окрашивания и при наличии интенсивного окрашивания срезов на LIF прогнозируют наступление беременности (Serafini P., Rocha A.M., Osorio СТ., da Silva I., Motta E.L., Baracat E.C. Endometrial leukemia inhibitory factor as a predictor of pregnancy after in vitro fertilization// Int. J. Gynaecol. Obstet- 2008. - Vol.102, № 1. -P.23-27).

Данный способ был выбран нами в качестве прототипа. Однако он имеет ряд недостатков:

1. При проведении иммуногистохимического окрашивания нередко отмечается плохая воспроизводимость результатов в связи с погрешностями при приготовлении срезов, неоднородным по интенсивности окрашиванием тканей, особенностями микроскопии (Иммунологические методы / Под ред. Х.Фримеля. - М.: Мир, 1979. - 518 с).

2. Высокие трудозатраты и длительное время проведения иммуногистохимического окрашивания срезов (5-6 часов).

3. Известно, что LIF является индикатором рецептивности эндометрия у фертильных женщин, однако у женщин с бесплодием данные о характере экспрессии LIF в эндометрии противоречивы и некоторые авторы считают, что для оценки имплантационного потенциала эндометрия недостаточно определять только экспрессию LIF (Aghajanova L. Update on the role of leukemia inhibitory factor in assisted reproduction// Curr Opin Obstet Gynecol. - 2010. - Vol.22, № 3. -P.213-219.).

4. Отсутствуют данные о точности, чувствительности и специфичности способа.

Указанные недостатки предлагается устранить в заявляемом способе.

Техническим результатом является повышение точности, чувствительности и специфичности способа прогнозирования наступления беременности у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в программе ЭКО.

Заявленный технический результат достигается тем, что у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием, перед программой ЭКО определяют относительное содержание CD95+макрофагов в лейкоцитарном инфильтрате эндометрия, полученным путем биопсии в лютеиновую фазу менструального цикла. При значении относительного содержания CD95+макрофагов, равного 48,8% или более, прогнозируют наступление беременности, а при значении менее 48,8% - отсутствие наступления беременности, с точностью 80%).

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается прогнозировать наступление беременности при проведении ЭКО у женщин с бесплодием, обусловленным трубно-перитонеальным фактором, по определению относительного содержания CD95+ макрофагов в лейкоцитарном инфильтрате эндометрия.

Ранее было показано, что уровень CD95+ макрофагов значительно повышен в перитонеальной жидкости больных с почечной недостаточностью, находящихся на перитонеальном диализе и имеющих осложнения в виде перитонита (Chen C.Y., Wu C.Y., Tsai Т.С., Lin W.T., Lee W.J., Su C.C., Chen H.C., Chiang HC. Fas expression on peritoneal macrophages during continuous ambulatory peritoneal dialysis peritonitis// Ren Fail. - 2008. - Vol.30, № 3. - P. 297-301). Кроме того, есть данные о том, что экспрессия CD95+молекул значительно усиливается на поверхности резидентных альвеолярных макрофагов в случаях острого повреждения легкого (Janssen W.J., Barthel L., Muldrow A., Oberley-Deegan R.E., Kearns M.T., Jakubzick C, Henson P.M. Fas determines differential fates of resident and recruited macrophages during resolution of acute lung injury// Am J Respir Crit Care Med. - 2011. - Vol.184, № 5. - P. 547-560). Было также установлено, что в лейкоцитарном инфильтрате децидуальной оболочки зрелых плацент, полученных от женщин с синдромом задержки развития плода, также повышен уровень СБ95-позитивных макрофагов (Роль иммунной системы в формировании задержки внутриутробного развития плода/ А.В. Кудряшова, Н.Ю. Сотникова, Л.В. Посисеева и др. - Иваново: ЮАО Издательство «Иваново», 2009. - 240 с.). Для прогнозирования наступления беременности у женщин с трубным фактором бесплодия в программе ЭКО этот показатель ранее не применяли.

Известно, что наличие мембранной экспрессии молекулы CD95+(или Fas) свидетельствует либо о готовности Fas-позитивной клетки к вступлению в апоптоз, либо является показателем повышенной активации клетки (Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза. - М.: Эдиториал УРСС, 2002. - 320 с.). Есть данные о том, что макрофаги эндометрия играют важную роль в регуляции процессов имплантации и последующего развития тканей плаценты, в частности они активно взаимодействуют с клетками трофобласта, препятствуя их неограниченной инвазии, способствуют тканевому ремодулированию, и секретируют большое количество цитокинов (Мог G., Abrahams V. Potential role of macrophages as immunomodulators of

pregnancy//Reprod.Biol.Endocrinol. - 2003. - Vol I. - P. 119). По-видимому, высокое содержание CD95+ макрофагов в лейкоцитарном инфильтрате эндометрия пациенток с трубным фактором бесплодия отражает адекватную активацию макрофагов, которая является необходимым условием имплантации и дальнейшего развития беременности после программы ЭКО.

Способ осуществляется по стандартной методике следующим образом:

1. Перед программой ЭКО из биоптатов эндометрия, полученных в лютеиновую фазу менструального цикла путем пайпель-биопсии, выделяют клетки мононуклеарного инфильтрата стандартным механическим способом (Chernyshov V.P., Slukvin I.I., Bondarenko G.I. Phenotypic characterization of CD7+, CD3+, and CD8+lymphocytes from first trimester human decidua using two-color flow cytometry// Am.J.Reprod.Immunol. - 993. - Vol.29, № 1. - P. 5-16). Для этого ткань эндометрия макроскопически измельчают и фильтруют через стальное сито. Полученную суспензию эндометриальных клеток осаждают центрифугированием в течение 10 мин в Среде 199, а затем проводят выделение обогащенной популяции мононуклеарных клеток эндометрия стандартным методом скоростного центрифугирования в двойном градиенте плотности фиколл-верографина (d=l,06 и d=l,078) в течение 30 мин при 1500 об/мин (Boum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood and bone marrow// Scand. J. Clin. Invest. - 1968. - Vol.21, № 97. - P.77).

2. Суспензию мононуклеарных клеток дважды отмывают физраствором, доводят концентрацию клеток до 1х106кл/мл. К 0,1 мл полученной суспензии одновременно добавляют 20 мкл моноклональных антител анти-С095, коньюгированных с флюоресцеинизотионатом (ООО «Сорбент», Москва). Клетки инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте, отмывают в 1 мл физраствора. 3. Определяют относительное (процентное) количество CD95+ клеток в макрофагальном гейте на проточном цитометре.

Использование предлагаемого способа позволяет с высокой точностью 80% прогнозировать наступление беременности у женщин с трубно-перитонеальным фактором бесплодия, участвующих в программе эко.

Отличительными признаками способа являются: установлен прогностический параметр относительного содержания CD95+ макрофагов в лейкоцитарном инфильтрате эндометрия при значении которого, равном 48,8% или более, прогнозируют наступление беременности, а при значении менее 48,8% - отсутствие наступления беременности.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами.

Пример 1. Больная Б., 33 года, впервые обратилась в отделение ВРТ Центра планирования семьи и репродукции в январе 2011 года с диагнозом: вторичное бесплодие, трубно-перитонеальный фактор, состояние после двухсторонней тубэктомии. Длительность бесплодия 6 лет. При обследовании гормонального статуса патологии не выявлено. При ультразвуковом исследовании органов малого таза констатирован нормальный фолликулярный резерв. Спермограмма мужа: нормозооспермия. На 25-й день менструального цикла перед программой ЭКО взята пайпель биопсия эндометрия, для определения уровня экспрессии CD95+макрофагов. По данным иммунологического обследования по заявляемому способу установлено, что содержание в лейкоцитарном инфильтрате эндометрия CD95+ макрофагов составило 59,3%, что выше заявленного параметра (48,8%). Дан благоприятный прогноз. Стимуляция суперовуляции проводилась по короткому протоколу с использованием диферелина, менопура и гонала. В результате трансвагинальной пункции получено 6 ооцитов. На 3-и сутки произведен перенос двух эмбрионов высокого качества. В результате программы ЭКО наступила одноплодная беременность. Прогноз по заявляемому способу подтвердился.

Пример 2. Больная Л., 28 лет, проходила обследование и лечение в отделении ВРТ Центра планирования семьи и репродукции с диагнозом: вторичное бесплодие, трубно-перитонеальный фактор, состояние после двухсторонней тубэктомии. Длительность бесплодия 5 лет. При гормональном обследовании отклонений не выявлено. При ультразвуковом исследовании органов малого таза констатирован нормальный фолликулярный резерв. Спермограмма мужа: нормозооспермия. На 22-й день менструального цикла перед программой ЭКО взята пайпель биопсия эндометрия для определения уровня экспрессии CD95+ макрофагов. По данным иммунологического обследования по заявляемому способу установлено, что содержание в эндометрии CD95+ макрофагов составило 45,1%, что ниже заявленного параметра (48,8%). Дан неблагоприятный прогноз. Стимуляция суперовуляции проводилась по длинному протоколу с использованием диферелина, менопура и гонала. В результате трансвагинальной пункции получено 5 ооцитов. На 3-и сутки произведен перенос одного эмбриона высокого качества, и на 5-е сутки произведен селективный перенос одной ранней бластоцисты. Несмотря на хорошие показатели качества эмбрионов, спермограммы, в результате программы ЭКО беременность не наступила. Прогноз по заявляемому способу подтвердился.

Пример 3. Больная К., 31 год, проходила обследование и лечение в отделении экстракорпорального оплодотворения Центра планирования семьи и репродукции с диагнозом: бесплодие вторичное, трубно-перитонеальный фактор, состояние после тубэктомии справа, окклюзия маточной трубы слева. Длительность бесплодия 7 лет. При гормональном обследовании отклонений не выявлено. При ультразвуковом исследовании органов малого таза констатирован нормальный фолликулярный резерв. Спермограмма мужа: нормозооспермия. На 21-й день менструального цикла, за цикл до программы ЭКО взята пайпель биопсия эндометрия для определения уровня экспрессии CD95+ макрофагов. По данным иммунологического обследования по заявляемому способу установлено, что содержание в эндометрии CD95 макрофагов составило 48,8%, что сопоставимо с заявленным параметром (48,8%). Дан благоприятный прогноз. Стимуляция суперовуляции проводилась по длинному протоколу с использованием диферелина, менопура и гонала. В результате трансвагинальной пункции получено 10 ооцитов. На 3-и сутки произведен перенос двух эмбрионов высокого качества. В результате программы ЭКО наступила беременность. Прогноз по заявляемому способу подтвердился.

Указанным способом обследовано 25 женщин с бесплодием, обусловленным трубно-перитонеальным фактором. Данные исследований приведены в таблице 1.

Таблица 1
Показатель	Количество обследованных женщин
Всего женщин	25
истинно-положительный результат	8
ложно-положительный результат	3
истинно-отрицательный результат	12
ложно-отрицательный результат	2
Итого: точность заявляемого способа - 80%,
чувствительность заявляемого способа -80%,
специфичность заявляемого способа - 80%.

Преимущества заявляемого способа:

1. Высокая точность - 80%, чувствительность - 80%, специфичность - 80%.

2. Хорошая воспроизводимость методики и небольшие временные трудозатраты (1,5 часа).

3. Применение способа позволит до начала проведения программы ЭКО прогнозировать неудачу наступления беременности и своевременно назначить, при необходимости, проведение дополнительных лечебных мероприятий.