варианты гемагглютинина и нейрамидазы вируса гриппа

Формула изобретения

1. Реассортантный вирус гриппа для производства вакцин, содержащий геномный сегмент, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18.

2. Реассортантный вирус гриппа по п.1, где полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18, кодируется полинуклеотидом SEQ ID NO:17.

3. Реассортантный вирус гриппа по п.1, содержащий геномный сегмент, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20.

4. Реассортантный вирус гриппа по п.3, где полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20, кодируется полинуклеотидом SEQ ID NO:19.

5. Реассортантный вирус гриппа по любому из пп.1-4, где вирус представляет собой реассортантный вирус 6:2, содержащий 6 внутренних геномных сегментов одного или нескольких донорных вирусов и 2 геномных сегмента, кодирующих поверхностные антигены вируса гриппа.

6. Реассортантный вирус гриппа по п.5, где один или несколько донорных вируса содержат A/Ann Arbor/6/60 или A/Puerto Rico/8/34.

7. Реассортантный вирус гриппа по п.6, где один или несколько донорных вируса имеют один или несколько фенотипических признаков, выбранных из аттенуирования, адаптации к низким температурам и термочувствительности.

8. Иммуногенная композиция для производства вакцин, содержащая иммунологически эффективное количество реассортантного вируса гриппа по любому из пп.1-7 и фармацевтически приемлемый наполнитель.

9. Живая аттенуированная противогриппозная вакцина, содержащая иммуногенную композицию по п.8.

10. Способ получения реассортантных вирусов гриппа в клеточной культуре, который включает:

i) введение множества векторов, содержащих полинуклеотиды, соответствующие геному вируса гриппа, в популяцию клеток-хозяев, способных поддерживать репликацию вируса гриппа, где множество векторов содержит полинуклеотиды, соответствующие, по меньшей мере, 6 внутренним геномным сегментам первого штамма вируса гриппа и, по меньшей мере, одному геномному сегменту второго штамма вируса гриппа, где, по меньшей мере, один геномный сегмент второго штамма вируса гриппа содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18;

ii) культивирование популяции клеток-хозяев; и

iii) выделение множества вирусов гриппа.

11. Способ по п.10, где полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18, содержит полинуклеотид SEQ ID NO:17.

12. Способ по п.10, где множество векторов содержит другой геномный сегмент второго штамма вируса гриппа, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20.

13. Способ по п.12, где полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20, кодируется полинуклеотидом SEQ ID NO:19.

14. Способ по п.10, где первый штамм вируса гриппа имеет один или несколько фенотипических признаков, выбранных из аттенуирования, адаптации к низким температурам и термочувствительности.

15. Способ по любому из пп.10-14, где множество векторов представляет собой восемь векторов.

16. Способ профилактического лечения вирусной инфекции гриппа А у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества реассортантного вируса, который содержит:

a) полинуклеотид SEQ ID NO:17; или

b) полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18.

17. Способ по п.16, где реассортантный вирус включает:

a) полинуклеотид SEQ ID NO:19; или

b) полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20.

Описание изобретения к патенту

Уровень техники изобретения

Вакцины против разных и эволюционирующих штаммов вирусов гриппа имеют важное значение с точки зрения здравоохранения и коммерции, поскольку каждый год большое число субъектов инфицируется разными штаммами и типами вируса гриппа. Риск смерти от таких инфекций особенно высок у детей младшего возраста, пожилых людей, субъектов, не получающих достаточную медицинскую помощь, и больных СПИДом. Сложность проблемы инфицирования вирусом гриппа заключается в том, что новые штаммы вируса гриппа легко эволюционируют и могут распространяться среди разных видов, что требует непрерывной разработки новых вакцин.

Многочисленные вакцины, способные обеспечивать защитный иммунный ответ, специфичный для разных вирусов/штаммов вирусов гриппа, производятся более 50 лет и включают в себя цельно-вирионные вакцины, вакцины из разрушенных вирусов, вакцины на основе поверхностного антигена и живые ослабленные вирусные вакцины. Однако, хотя подходящие композиции всех указанных типов вакцин могут генерировать системный иммунный ответ, живые ослабленные вирусные вакцины обладают преимуществом, которое заключается в способности стимулировать мукозальный иммунитет в респираторном тракте. Авторами настоящего изобретения и их коллегами была проведена большая работа по получению вирусов гриппа и их фрагментов, которые можно использовать для производства вакцин; см., например, заявку США № 60/420708, поданную 23 октября 2002 г., заявку США № 10/423828, поданную 25 апреля 2003 г., и заявку США № 60/574117, поданную 24 мая 2004 г., имеющие общий заголовок "Multi-Plasmid System for the Production Influenza Virus".

Из-за непрерывного появления (или повторного появления) разных штаммов вируса гриппа, постоянно требуются новые вакцины против гриппа. Такие вакцины обычно получают, используя антигенные фрагменты новых вирусных штаммов, следовательно, полипептиды и полинуклеотиды новых, недавно появившихся, или повторно появившихся вирусных штаммов (особенно, последовательности антигенных генов) вызывают большой интерес. Кроме того, большое внимание уделяется предпочтительным векторам, содержащим такие последовательности.

Настоящее изобретение предлагает новые и/или недавно выделенные варианты гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа, необязательно в составе предпочтительных векторов, которые можно использовать для получения разных типов вакцин, а также для исследовательских, диагностических и других целей. Многочисленные другие преимущества станут ясны из нижеследующего описания.

Сущность изобретения

В некоторых аспектах данное изобретение предлагает выделенный или рекомбинантный полипептид, выбранный из группы, включающей в себя: полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, кодируемую одной из нуклеотидных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 и 27; полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, кодируемую одной из нуклеотидных последовательностей, включающих в себя остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25, остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25; полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28; полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, включающую в себя: остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26; любой полипептид, кодируемый полинуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с практически полноразмерной полинуклеотидной последовательностью из списка последовательностей; а также фрагмент любого из вышеуказанных полипептидов, последовательность которого включает в себя полипептид гемагглютинина или нейраминидазы, или фрагмент полипептида гемагглютинина или нейраминидазы. В разных воплощениях выделенные или рекомбинантные полипептиды данного изобретения являются практически идентичными фрагменту любого из вышеуказанных полипептидов, содержащему примерно 300 смежных аминокислотных остатков. В следующих воплощениях данное изобретение предлагает выделенные или рекомбинантные полипептиды (включающие в себя гемагглютинин или нейраминидазу, или фрагменты гемагглютинина или нейраминидазы), которые содержат аминокислотную последовательность, практически идентичную, по меньшей мере, примерно 350 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 400 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 450 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 500 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 502 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 550 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 559 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 565 аминокислотам; или, по меньшей мере, примерно 566 аминокислотам, образующим непрерывную цепь, любой из последовательностей SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28. В следующих воплощениях данное изобретение предлагает выделенные или рекомбинантные полипептиды (например, включающие в себя нейраминидазу, гемагглютинин, или фрагменты нейраминидазы или гемагглютинина), которые содержат аминокислотную последовательность, практически идентичную, по меньшей мере, примерно 350 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 400 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 436 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 450 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 451 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 465 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 466 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 469 аминокислотам; или, по меньшей мере, примерно 470 аминокислотам, образующим непрерывную цепь, любой из последовательностей SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28. Разумеется, в некоторых воплощениях полипептидная последовательность (например, одна из перечисленных здесь последовательностей SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28) содержит менее 565, 559 и т.п. аминокислот. В следующих воплощениях полипептиды данного изобретения необязательно включают в себя гибридные белки, белки, содержащие лидерную последовательность, полипептиды-предшественники, белки, содержащие секреторный сигнал или сигнал локализации, или белки, содержащие маркерный эпитоп, E-маркер, His-маркерный эпитоп и др. В других воплощениях данное изобретение предлагает полипептид, последовательность которого, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 98,5%, по меньшей мере, на 99%, по меньшей мере, на 99,2%, по меньшей мере, на 99,4%, по меньшей мере, на 99,6%, по меньшей мере, на 99,8%, или, по меньшей мере, на 99,9% идентична последовательности, по меньшей мере, одного из перечисленных выше полипептидов (например, SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26). В некоторых воплощениях такие полипептиды являются иммуногенными. Последовательности HA данного изобретения могут содержать как немодифицированные, так и модифицированные многоосновные участки расщепления.

В других аспектах данное изобретение предлагает композицию, содержащую один или несколько из перечисленных выше полипептидов или их фрагментов. Изобретение также включает в себя полипептиды, которые специфически связываются поликлональной антисывороткой, полученной против, по меньшей мере, 1 антигена, содержащего, по меньшей мере, одну из описанных выше аминокислотных последовательностей (например, SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26), или ее фрагмент. Антитела, специфичные к описанным выше полипептидам, также являются признаками данного изобретения. Полипептиды данного изобретения необязательно являются иммуногенными.

Данное изобретение также охватывает иммуногенные композиции, содержащие иммунологически эффективное количество одного или нескольких из описанных выше полипептидов, а также способы стимуляции иммунной системы субъекта с индукцией защитного иммунного ответа против вируса гриппа, включающие в себя введение субъекту иммунологически эффективного количества одного или нескольких из описанных выше полипептидов (таких как полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 или 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 или остатки 363-585 SEQ ID NO:26) в физиологически приемлемом носителе. В одном воплощении иммуногенная композиция данного изобретения представляет собой трехвалентную иммуногенную композицию, содержащую три реассортантных вируса гриппа. В одном воплощении иммуногенная композиция данного изобретения представляет собой трехвалентную иммуногенную композицию, содержащую два реассортантных вируса гриппа A и реассортантный вирус гриппа B. В одном воплощении иммуногенная композиция данного изобретения представляет собой трехвалентную иммуногенную композицию, содержащую реассортантный вирус гриппа A типа H1, реассортантный вирус гриппа A типа H3 и реассортантный вирус гриппа B. В другом воплощении иммуногенная композиция данного изобретения представляет собой тетравалентную иммуногенную композицию, содержащую четыре реассортантных вируса гриппа. В одном воплощении иммуногенная композиция данного изобретения представляет собой тетравалентную иммуногенную композицию, содержащую два реассортантных вируса гриппа A и два реассортантных вируса гриппа B. В одном воплощении иммуногенная композиция данного изобретения представляет собой тетравалентную иммуногенную композицию, содержащую реассортантный вирус гриппа A типа H1, реассортантный вирус гриппа A типа H3, реассортантный вирус гриппа B линии Victoria и реассортантный вирус гриппа B линии Yamagata.

Кроме того, настоящее изобретение охватывает реассортантный вирус гриппа, который содержит сегмент генома, кодирующий один или несколько из описанных выше полипептидов (например, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 или 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 или остатки 363-585 SEQ ID NO:26), а также иммуногенные композиции, содержащие иммунологически эффективное количество такого реассортантного вируса гриппа. Способы стимуляции иммунной системы субъекта с индукцией защитного иммунного ответа против вируса гриппа, которые включают в себя введение иммунологически эффективного количества такого реассортантного вируса гриппа в физиологически приемлемом носителе, также являются частью данного изобретения. В одном воплощении реассортантный вирус гриппа данного изобретения представляет собой реассортантный вирус 6:2, который содержит 6 внутренних геномных сегментов одного или нескольких донорных вирусов (таких как A/AA/6/60, B/Ann Arbor/1/66, A/Puerto Rico/8/34, которые более широко известны как PR8, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55 или B/England/2608/76) и 2 геномных сегмента (кодирующих в основном и предпочтительно HA и NA, или их фрагменты), содержащих полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, или из нуклеотидной последовательности, подобной, как определено в данном описании, SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 и 27. Иммуногенные композиции, содержащие такой реассортантный (рекомбинантный) вирус, также являются признаками данного изобретения.

В других аспектах данное изобретение предлагает выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, выбранный из группы, включающей в себя: полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 и 27, или комплементарных им последовательностей; полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, или комплементарную ей последовательность; полинуклеотиды, кодирующие полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26, или комплементарные им нуклеотидные последовательности; полинуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с любой из вышеуказанных полинуклеотидных последовательностей практически по всей ее длине, и полинуклеотидную последовательность, содержащую полностью или частично одну из вышеуказанных полинуклеотидных последовательностей, которая кодирует полипептид гемагглютинина или нейраминидазы, или один или несколько фрагментов HA или NA. Такие полинуклеотиды могут представлять собой ДНК, РНК, кРНК, гибриды ДНК:РНК, одноцепочечные полинуклеотиды, двухцепочечные полинуклеотиды и др. Изобретение также включает в себя все вышеуказанные полинуклеотиды, которые кодируют полипептид гемагглютинина или нейраминидазы, или фрагменты гемагглютинина или нейраминидазы. Другие аспекты данного изобретения включают в себя выделенные или рекомбинантные полинуклеотиды, которые кодируют полипептид (необязательно, полипептид гемагглютинина или нейраминидазы), последовательность которого, по меньшей мере, на 95% идентична, по меньшей мере, на 96% идентична, по меньшей мере, на 97% идентична, по меньшей мере, на 98% идентична, по меньшей мере, на 98,5% идентична, по меньшей мере, на 99% идентична, по меньшей мере, на 99,2% идентична, по меньшей мере, на 99,4% идентична, по меньшей мере, на 99,6% идентична, по меньшей мере, на 99,8% идентична, или, по меньшей мере, на 99,9% идентична, по меньшей мере, одному из описанных выше полипептидов. Изобретение также включает в себя выделенные или рекомбинантные полинуклеотиды, кодирующие полипептид гемагглютинина или нейраминидазы, полученные в результате мутации или рекомбинации одной или нескольких из описанных выше полинуклеотидных последовательностей. Полинуклеотидные последовательности данного изобретения могут необязательно содержать один или несколько элементов, выбранных из группы, включающей в себя, например, лидерную последовательность, последовательность-предшественник, последовательность эпитопного маркера и т.п., и могут необязательно кодировать гибридный белок (например, последовательности, содержащие одну или несколько других нуклеотидных последовательностей). Такие полинуклеотиды данного изобретения могут необязательно кодировать иммуногенные полипептиды.

В следующих воплощениях данное изобретение предлагает представляющую интерес композицию, содержащую два или более из описанных выше полинуклеотидов или их фрагментов (например, библиотеку, содержащую, по меньшей мере, примерно 2, 5, 10, 50 или более полинуклеотидов). Такие композиции можно получить путем расщепления одного или нескольких описанных выше полинуклеотидов (например, путем механического расщепления, химического расщепления, ферментативного расщепления под действием рестрикционной эндонуклеазы/РНКазы/ДНКазы и др.). Другие композиции данного изобретения включают в себя, например, композиции, полученные путем инкубации одного или нескольких описанных выше полинуклеотидов в присутствии дезоксирибонуклеотидтрифосфатов термостабильной полимеразы. Иммуногенные композиции, содержащие иммунологически эффективное количество одного из вышеуказанных полинуклеотидов, также входят в объем настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также охватывает реассортантные вирусы гриппа, содержащие один из вышеуказанных полинуклеотидов. В одном воплощении такие реассортантные вирусы представляют собой реассортантные вирусы 6:2, которые содержат 6 внутренних геномных сегментов одного или нескольких донорных вирусов (таких как A/AA/6/60, B/AA/1/66 (иногда называемых в данном описании B/Ann Arbor/1/66), B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55, или B/England/2608/76 или A/Puerto Rico/8/34) и 2 геномных сегмента, содержащих полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25. В одном воплощении два геномных сегмента кодируют гемагглютинин и/или нейраминидазу. Иммуногенные композиции, содержащие иммунологически эффективные количества такого реассортантного/рекомбинантного вируса гриппа, также входят в объем настоящего изобретения.

Векторы, содержащие один или несколько полинуклеотидов, имеющих нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, или их фрагментов, также входят в объем настоящего изобретения. Такие векторы (например, векторы экспрессии) необязательно могут представлять собой плазмиды, космиды, фаги, вирусы, фрагменты вирусов и др. Особенно предпочтительные воплощения включают в себя плазмидные векторы, используемые в способах плазмидной помощи для получения вирусов (например, обычного реассортантного/рекомбинантного вируса для применения в вакцинах). Примеры таких плазмидных систем раскрыты, например, в заявке США № 60/420708, поданной 23 октября 2002 г., заявке США № 10/423828, поданной 25 апреля 2003 г., и заявке США № 60/574117, поданной 24 мая 2004 г., озаглавленных "Multi-Plasmid System for the Production Influenza Virus"; Hoffmann, E., 2000, PNAS, 97(11):6108-6113; опубликованной патентной заявке США № 20020164770, Hoffmann; и патенте США № 6544785, выданном 8 апреля 2003 г., Palese, et al. В объем настоящего изобретения также входят клетки, содержащие такие векторы, а также клетки, трансдуцированные, трансформированные, трансфицированные и т.п. такими векторами.

Данное изобретение также охватывает клетки, содержащие, по меньшей мере, один из описанных выше полинуклеотидов, или его расщепленный или амплифицированный фрагмент или продукт. Такие клетки могут необязательно экспрессировать полипептид, кодируемый таким полинуклеотидом. Другие воплощения данного изобретения включают в себя векторы (например, плазмиды, космиды, фаги, вирусы, фрагменты вирусов и др.), содержащие один из описанных выше полинуклеотидов. В одном воплощении такие векторы представляют собой векторы экспрессии.

Данное изобретение также охватывает вирус (например, вирус гриппа), содержащий один или несколько из описанных выше полинуклеотидов (например, полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, и необязательно кодирующий гемагглютинин и/или нейраминидазу), или один или несколько их фрагментов. В одном воплощении такие вирусы представляют собой реассортантные/рекомбинантные вирусы. Иммуногенные композиции, содержащие реассортантный/рекомбинантный вирус данного изобретения, также являются частью настоящего изобретения. В одном воплощении реассортантный вирус данного изобретения представляет собой реассортантный вирус 6:2, содержащий 6 внутренних геномных сегментов одного или нескольких донорных вирусов (таких как базовый или каркасный донорный вирус, например, A/AA/6/60, B/AA/1/66, A/Puerto Rico/8/34, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55, B/England/2608/76 и др.) и 2 геномных сегмента, содержащих полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25. В другом воплощении реассортантный вирус данного изобретения представляет собой реассортантный вирус 7:1, содержащий 6 внутренних геномных сегментов и 1 геномный сегмент, кодирующий гемагглютинин или нейраминидазу, из одного или нескольких донорных вирусов (таких как базовый или каркасный донорный вирус, например, A/AA/6/60, B/AA/1/66, A/Puerto Rico/8/34, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55, B/England/2608/76 и др.), а также 1 геномный сегмент, содержащий полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25. Реассортантные вирусы (необязательно, живые вирусы) данного изобретения могут представлять собой донорные вирусы, включающие в себя один или несколько, например, из термочувствительных (ts), адаптированных к низким температурам (ca) или аттенуированных (att) вирусов. В одном воплощении реассортантные вирусы данного изобретения содержат, по меньшей мере, один, по меньшей мере, два, по меньшей мере, три, по меньшей мере, четыре, по меньшей мере, пять или шесть внутренних геномных сегментов одного из штаммов A/Ann Arbor/6/60, B/Ann Arbor/1/66, A/Puerto Rico/8/34, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55, или B/England/2608/76. Во многих воплощениях полученные вирусы представляют собой живые вирусы (например, используемые для получения вакцин и др.). Другие воплощения включают в себя мертвые или инактивированные вирусы (например, также подходящие для получения вакцин и др.). Клетки, содержащие вирус данного изобретения, также являются предметом данного изобретения.

Способы получения реассортантного/рекомбинантного вируса гриппа посредством культивирования клетки-хозяина, несущей полинуклеотид данного изобретения, также входят в объем настоящего изобретения. В одном воплощении способ данного изобретения включает в себя:

введение совокупности векторов, содержащих полинуклеотиды, соответствующие геному вируса гриппа, в популяцию клеток-хозяев, где совокупность включает в себя, по меньшей мере, 6 внутренних геномных сегментов первого штамма вируса гриппа (например, A/AA/6/60, B/AA/1/66, A/PR/8/34, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55 или B/England/2608/76) и, по меньшей мере, один геномный сегмент, содержащий полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, и где популяция клеток-хозяев способна поддерживать репликацию вируса гриппа;

культивирование популяции клеток-хозяев; и

выделение совокупности вирусов гриппа.

В одном воплощении первый штамм вируса гриппа представляет собой адаптированный к низким температурам, и/или термочувствительный, и/или аттенуированный штамм. В одном воплощении вирус, полученный по способу данного изобретения, можно использовать для введения в составе интраназальной вакцинной композиции. В другом воплощении вирус, полученный по способу данного изобретения, можно использовать для введения в виде убитой или инактивированной вакцинной композиции, живой/аттенуированной не назальной вакцинной композиции и др. В одном воплощении вирус, полученный по способу данного изобретения, представляет собой вирус гриппа A. В одном воплощении вирус, полученный по способу данного изобретения, представляет собой вирус гриппа B. В таких способах можно использовать клетки-хозяева, включающие в себя, без ограничения, например, клетки Vera, клетки PerC6, клетки MDCK, клетки 293T, клетки COS и др. В одном воплощении способ данного изобретения не включает в себя применение вируса-помощника. В одном воплощении совокупность векторов состоит из восьми плазмидных векторов.

В других воплощениях данное изобретение предлагает иммуногенные композиции, содержащие иммунологически эффективное количество одного или нескольких из описанных выше реассортантных вирусов гриппа (например, живого вируса). Другие воплощения включают в себя способы стимуляции иммунной системы субъекта с индукцией защитного иммунного ответа против вируса гриппа, включающие в себя введение субъекту иммунологически эффективного количества одного или нескольких описанных выше реассортантных вирусов гриппа (необязательно в физиологически приемлемом носителе).

В других аспектах данное изобретение предлагает способы получения выделенного или рекомбинантного полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26, где указанные способы включают в себя культивирование клетки-хозяина, содержащей описанный выше полинуклеотид, в подходящей культуральной среде в условиях, обеспечивающих экспрессию рекомбинантного полипептида, и выделение полипептида из одной или нескольких клеток-хозяев, или из среды, в которой их выращивают.

Иммуногенные композиции также являются признаками данного изобретения. Например, иммуногенные композиции, которые содержат один или несколько полипептидов (например, полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26) и/или полинуклеотидов (например, полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25) данного изобретения и, необязательно, эксципиент, такой как фармацевтически приемлемый эксципиент, или один или несколько фармацевтически приемлемых компонентов для введения. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция данного изобретения содержит реассортантный вирус данного изобретения.

Способы получения противовирусной вакцины также входят в объем изобретения. Например, изобретение включает в себя введение совокупности векторов (например, плазмидных векторов), содержащих полинуклеотиды, соответствующие геному вируса гриппа (например, вирусу гриппа A или B), в популяцию клеток-хозяев, которые способны поддерживать репликацию такого вируса, культивирование клеток, выделение совокупности вирусов гриппа и доставку субъекту (например, нуждающемуся в таком лечении) указанного вируса вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами. Такие вирусы могут необязательно представлять собой адаптированные к низким температурам и/или термочувствительные и/или аттенуированные вирусы и предпочтительно подходят для введения в составе интраназальной вакцинной композиции. В одном воплощении совокупность векторов содержит полинуклеотиды, соответствующие 6 внутренним геномным сегментам первого штамма вируса гриппа (например, A/AA/6/60, B/AA/1/66, A/PR/8/34, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55 или B/England/2608/76) и один или два геномных сегмента, содержащих полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, где один или два геномных сегмента необязательно кодируют иммуногенный поверхностный антиген вируса гриппа второго штамма вируса гриппа. В одном воплощении способ данного изобретения включает в себя: введение совокупности векторов, содержащих полинуклеотиды, соответствующие геному вируса гриппа, в популяцию клеток-хозяев, где совокупность содержит, по меньшей мере, 6 внутренних геномных сегментов первого штамма вируса гриппа (например, A/AA/6/60, B/AA/1/66, A/PR/8/34, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55 или B/England/2608/76), и, по меньшей мере, один геномный сегмент, содержащий полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, и где популяция клеток-хозяев способна поддерживать репликацию вируса гриппа; культивирование популяция клеток-хозяев; и выделение совокупности вирусов гриппа.

Способы индуцирования иммунного ответа у субъекта, включающие в себя введение субъекту эффективного количества любого из описанных выше вирусов, также входят в объем настоящего изобретения. Кроме того, данное изобретение охватывает способы профилактики или лечения вирусной инфекции (например, вируса гриппа) у субъекта, включающие в себя введение одного или нескольких описанных выше вирусов в количестве, эффективном для получения иммунного ответа против вирусной инфекции. Субъекты, подходящие для такого лечения, могут представлять собой млекопитающих (например, людей). Такие способы также могут включать в себя введение субъекту in vivo и введение in vitro или ex vivo в одну или несколько клеток субъекта. Кроме того, такие способы могут также включать в себя введение субъекту композиции, содержащей вирус и фармацевтически приемлемый эксципиент, в количестве, эффективном для профилактики или лечения вирусной инфекции.

Настоящее изобретение также предлагает представляющие интерес композиции, содержащие одну или несколько последовательностей, выбранных из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, и выбранный базовый донорный вирус, причем выбранная последовательность и базовый донорный вирус, как правило, содержат рекомбинацию 6:2, т.е. гены HA и NA в данном изобретении рекомбинируют с другими шестью генами вируса гриппа из донорных вирусов. Такие донорные вирусы обычно представляют собой штаммы ca, att, ts. Например, в качестве донорных штаммов обычно используют, например, A/Ann Arbor/6/60, B/Ann Arbor/1/66, A/Puerto Rico/8/34, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55 или B/England/2608/76 и их варианты. Для специалистов в данной области очевидно, что донорные штаммы, как правило, могут варьировать от реассортантных до реассортантных. Следовательно, такие вариации также входят в объем настоящего изобретения. Другое воплощение данного изобретения включает в себя такие композиции, содержащие одну или несколько живых аттенуированных противогриппозных вакцин, например, имеющих последовательности, рекомбинированные в соответствии с данным изобретением в соотношении 6:2 с выбранными базовыми донорными вирусами.

Другие аспекты данного изобретения включают в себя представляющие интерес композиции, содержащие полинуклеотид гемагглютинина и/или полинуклеотид нейраминидазы, рекомбинированный с одним или несколькими базовыми донорными вирусами, опять же, обычно представляющими собой ca, att, ts вирусы гриппа, где вирусный штамм, содержащий полинуклеотид, совпадает с одним или несколькими вирусными штаммами, содержащими последовательности, выбранные из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25. Такой полинуклеотид гемагглютинина и/или нейраминидазы обычно определяют как относящийся к "такому же штамму", если его титр находится в пределах четырехкратного интервала по сравнению с полинуклеотидом другого вируса (например, имеющим одну из перечисленных здесь последовательностей) по данным анализа ингибирования гемагглютинина. Однако, как описано ниже, для того, чтобы определить, относятся ли полинуклеотиды (т.е. содержащие их вирусы) к одному и тому же штамму, можно использовать и другие традиционные анализы.

Указанные и другие цели и признаки данного изобретения станут более понятны из нижеследующего подробного описания, приведенного в сочетании с прилагающимися чертежами и формулой изобретения.

Краткое описание фигур

На фиг.1 приведен список последовательностей вариантных полинуклеотидов и полипептидов гемагглютинина и нейраминидазы данного изобретения.

На фиг.2 изображена альтернативная классификация вариантных последовательностей гемагглютинина и нейраминидазы, приведенных на фиг.1.

Подробное описание

Настоящее изобретение предлагает полипептидные и полинуклеотидные последовательности гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа, а также векторы, вирусы, вакцины, композиции и т.п., содержащие такие последовательности, и способы их применения. Другие признаки данного изобретения описаны более подробно в настоящем описании.

Определения

Если не указано иначе, все технические и научные термины используются в традиционных значениях, известных рядовым специалистам в области, к которой принадлежит данное изобретение. Нижеследующие определения дополняют существующие в данной области, предназначены для применения в данной заявке, но не ограничиваются какими-либо родственными или неродственными случаями, такими как принадлежащие одному владельцу патенты или заявки. В данном документе описаны предпочтительные материалы и способы, хотя для осуществления или тестирования настоящего изобретения можно использовать любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в данном документе. Соответственно, используемая здесь терминология, предназначена только для описания конкретных воплощений, но не для ограничения. Другие термины определяются и описываются на протяжении данного документа.

Если контекст однозначно не указывает иначе, в данном описании и прилагающейся формуле изобретения формы единственного числа включают в себя множественное число. Так, например, ссылка на "вирус" включает в себя совокупность вирусов; ссылка на "клетку-хозяина" включает в себя смеси клеток-хозяев и т.п.

Термины "нуклеиновая кислота", "полинуклеотид", "полинуклеотидная последовательность" и "нуклеотидная последовательность" относятся к одноцепочечным или двухцепочечным полимерам, химерам или их аналогам, или к обозначающим их последовательностям символов, в зависимости от контекста. В данном описании термин необязательно включает в себя полимеры, состоящие из аналогов природных нуклеотидов, имеющих необходимую сущность природных нуклеотидов, заключающуюся в том, что они гибридизуются с одноцепочечными нуклеиновыми кислотами подобно природным нуклеотидам (например, пептидные нуклеиновые кислоты). Если не указано иначе, конкретная нуклеотидная последовательность данного изобретения помимо точно указанной последовательности необязательно включает в себя комплементарные последовательности. На основе любой описанной полинуклеотидной последовательности можно определить либо заданную нуклеотидную последовательность, либо комплементарную полинуклеотидную последовательность (например, комплементарную нуклеиновую кислоту).

Термин "нуклеиновая кислота" или "полинуклеотид" также охватывает любую физическую цепь мономерных элементов, которая может представлять собой цепь нуклеотидов, в том числе полимер из нуклеотидов (например, обычный полимер ДНК или РНК), ПНК, модифицированные олигонуклеотиды (например, олигонуклеотиды, содержащие основания, не типичные для биологических РНК или ДНК в растворе, такие как 2'-O-метилированные олигонуклеотиды) и т.п. Нуклеиновая кислота может быть, например, одноцепочечной или двухцепочечной.

"Субпоследовательность" представляет собой любой фрагмент целой последовательности, включающий в себя полноразмерную последовательность. Как правило, субпоследовательность меньше полноразмерной последовательности. "Уникальная субпоследовательность" представляет собой субпоследовательность, отсутствующую в ранее определенных полинуклеотидных или полипептидных последовательностях вируса гриппа. Фраза "практически идентичные" в применении к двум нуклеиновым кислотам или полипептидам (таким как молекулы ДНК, кодирующие HA или NA, или аминокислотные последовательности молекул HA или NA) относится к двум или более последовательностям или субпоследовательностям, нуклеотидная или аминокислотная идентичность которых, определенная путем сравнения и выравнивания с максимальным соответствием с использованием алгоритма сравнения последовательностей или визуального исследования, составляет, по меньшей мере, примерно 90%, предпочтительно 91%, наиболее предпочтительно 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или более.

Термин "вариант" в применении к полипептиду относится к аминокислотной последовательности, измененной по одной или нескольким аминокислотам по сравнению с базовой последовательностью. Вариант может содержать "консервативные" изменения, например, замену лейцина на изолейцин, где используемая для замены аминокислота обладает подобными структурными или химическими свойствами. Альтернативно, вариант может содержать "неконсервативные" изменения, например, замену глицина на триптофан. Аналогичные минорные изменения также могут включать в себя делецию или инсерцию аминокислоты, или и то, и другое. Для определения аминокислотных остатков, которые можно заменить, вставить или удалить без потери биологической или иммунологической активности, можно использовать компьютерные программы, хорошо известные в данной области, такие как DNASTAR. Примеры консервативных замен описаны в данном документе.

Термин "ген" широко используют для обозначения любой нуклеиновой кислоты, связанной с биологической функцией. Таким образом, гены включают в себя кодирующие последовательности и/или регуляторные последовательности, необходимые для их экспрессии. Термин "ген" относится к конкретной геномной последовательности, а также к кДНК или мРНК, кодируемым указанной геномной последовательностью.

Полипептиды "нейраминидазы" данного изобретения обладают перекрестной иммунологической реактивностью с одной или несколькими известными молекулами нейраминидазы вируса гриппа. В литературе можно найти много примеров таких известных нейраминидаз (например, в GenBank, в публикациях CDC и др.). Подобным образом, полипептиды "гемагглютинина" данного изобретения обладают перекрестной иммунологической реактивностью с одной или несколькими известными молекулами гемагглютинина вируса гриппа. Опять же, в литературе можно найти много примеров таких известных молекул гемагглютинина.

Гены также содержат неэкспрессируемые сегменты нуклеиновой кислоты, которые, например, образуют последовательности, распознаваемые другими белками. Неэкспрессируемые регуляторные последовательности включают в себя "промоторы" и "энхансеры", с которыми связываются регуляторные белки, такие как факторы транскрипции, инициируя транскрипцию соседних или близлежащих последовательностей. "Тканеспецифический" промотор или энхансер регулирует транскрипцию в ткани или клетке определенного типа, или определенных типов.

"Экспрессия гена" или "экспрессия нуклеиновой кислоты", как правило, представляет собой транскрипцию ДНК в РНК (необязательно, с модификацией РНК, такой как сплайсинг) или транскрипцию РНК в мРНК, трансляцию РНК в полипептид (возможно, с последующей модификацией полипептида, такой как посттрансляционная модификация), или и транскрипцию, и трансляцию, в зависимости от контекста.

"Открытая рамка считывания" или "ORF" представляет собой возможную трансляционную рамку считывания ДНК или РНК (например, гена), которая может транслироваться в полипептид. То есть, рамка считывания не прерывается стоп-кодонами. Однако следует отметить, что термин ORF не означает, что в действительности полинуклеотид обязательно транслируется в полипептид.

Термин "вектор" относится к средствам, которые обеспечивают размножение и/или перенос нуклеиновой кислоты между организмами, клетками или клеточными компонентами. Векторы включают в себя плазмиды, вирусы, бактериофаги, провирусы, фагемиды, транспозоны, искусственные хромосомы и т.п., которые способны реплицироваться автономно или могут интегрироваться в хромосомы клетки-хозяина. Вектор может представлять собой голый полинуклеотид РНК, голый полинуклеотид ДНК, полинуклеотид, содержащий ДНК и РНК в одной цепи, ДНК или РНК, конъюгированную с полилизином, ДНК или РНК, конъюгированную с пептидом, ДНК, конъюгированную с липосомой, и т.п., не способные к автономной репликации. Во многих, но не во всех, обычных воплощениях векторы настоящего изобретения представляют собой плазмиды.

"Вектор экспрессии" представляет собой вектор, такой как плазмида, который способен инициировать экспрессию, а также репликацию содержащейся в нем нуклеиновой кислоты. Как правило, подлежащая экспрессии нуклеиновая кислота "функционально связана" с промотором и/или энхансером, которые регулируют ее транскрипцию.

"Двусторонний вектор экспрессии" содержит два альтернативных промотора, ориентированных в противоположных направлениях относительно нуклеиновой кислоты, расположенной между двумя промоторами, которые могут инициировать экспрессию в обоих направлениях, что приводит, например, к транскрипции как положительной (+), или смысловой цепи, так и отрицательной (-), или антисмысловой цепи РНК.

"Аминокислотная последовательность" представляет собой полимер из аминокислотных остатков (белок, полипептид и т.п.) или последовательность символов, обозначающую аминокислотный полимер, в зависимости от контекста.

"Полипептид" представляет собой полимер, содержащий два или более аминокислотных остатков (например, пептид или белок). Полимер необязательно может содержать модификации, такие как гликозилирование и т.п. Аминокислотные остатки полипептида могут быть природными или неприродными, незамещенными, немодифицированными, замещенными или модифицированными.

В контексте данного изобретения термин "выделенный" относится к биологическому материалу, такому как вирус, нуклеиновая кислота или белок, который практически не содержит компонентов, которые обычно сопутствуют ему, или взаимодействуют с ним в природной среде. Выделенный биологический материал необязательно содержит другой материал, который не сопутствует биологическому материалу в природной среде, такой как клетка или вирус дикого типа. Например, если материал находится в природной среде, такой как клетка, он может быть помещен в участок клетки (например, геном или генетический элемент), в котором данный материал отсутствует в природе. Например, природная нуклеиновая кислота (например, кодирующая последовательность, промотор, энхансер и др.) считается выделенной, если ее вводят посредством неприродных способов в локус генома (например, вектор, такой как плазмидный или вирусный вектор, или ампликон), в котором данная нуклеиновая кислота не встречается в природе. Такие нуклеиновые кислоты также называют "гетерологичными" нуклеиновыми кислотами. Выделенный вирус, например, находится в среде (такой как система культивирования клеток, или он может быть выделен из клеточной культуры), отличной от природного окружения вируса дикого типа (такого как носоглотка инфицированного субъекта).

Термин "химерный" или "химера" в применении к вирусу означает, что вирус содержит генетические и/или полипептидные компоненты, полученные более чем из одного базового вирусного штамма или источника. Подобным образом, термин "химерный" или "химера" в применении к вирусному белку означает, что белок содержит полипептидные компоненты (т.е. аминокислотные субпоследовательности), полученные более чем из одного базового вирусного штамма или источника. Как станет ясно из данного описания, такие химерные вирусы обычно представляют собой реассортантные/рекомбинантный вирусы. Так, в некоторых воплощениях химера может необязательно содержать, например, последовательность (например, HA и/или NA) вируса гриппа А, помещенную в скелет, состоящий, или конструированный/полученный из вируса гриппа B (например, B/AA/1/66 и т.п.), или последовательность вируса гриппа B, помещенную в скелет вируса гриппа А (т.е. донорного вируса), такого как, например, A/AA/6/60 и др.

Термин "рекомбинантный" означает, что материал (например, нуклеиновая кислота или белок) был искусственно или синтетически (неприродным способом) изменен посредством вмешательства человека. Изменению можно подвергнуть материал, находящийся в природной среде, или в природном состоянии, или удаленный из природной среды. А именно, например, вирус гриппа является рекомбинантным, если его получают путем экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты. Например, "рекомбинантная нуклеиновая кислота" представляет собой нуклеиновую кислоту, полученную путем рекомбинации нуклеиновых кислот, например, в результате клонирования, перетасовки ДНК или других процедур, или в результате химического или иного мутагенеза; "рекомбинантный полипептид" или "рекомбинантный белок" представляет собой полипептид или белок, который получают путем экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты; и "рекомбинантный вирус", например, рекомбинантный вирус гриппа, получают путем экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты.

Термин "реассортантные" в применении к вирусу (в данном документе, как правило, к вирусу гриппа) означает, что вирус содержит генетические и/или полипептидные компоненты, полученные из нескольких базовых вирусных штаммов или источников. Например, реассортантный вирус 7:1 содержит 7 вирусных геномных сегментов (или сегментов генов), полученных из первого базового вируса, и один комплементарный вирусный геномный сегмент, например, кодирующий гемагглютинин или нейраминидазу, и имеющий одну из последовательностей, приведенных в данном описании в таблицах SEQ ID (например, SEQ ID NO:1-28). Реассортантный вирус 6:2 содержит 6 геномных сегментов, чаще всего 6 внутренних геномных сегментов первого базового вируса, и два комплементарных сегмента, например, геномные сегменты, кодирующие гемагглютинин и нейраминидазу, из одного или нескольких разных базовых вирусов. В зависимости от контекста, реассортантные вирусы также можно называть "химерные" и/или "рекомбинантные".

Термин "введенный" в применении к гетерологичной или выделенной нуклеиновой кислоте означает, что нуклеиновая кислота введена в эукариотическую или прокариотическую клетку, где нуклеиновая кислота может внедряться в геном клетки (например, в хромосому, плазмиду, пластиду или митохондриальную ДНК), превращаться в автономный репликон или транзиторно экспрессироваться (например, в случае трансфицированной мРНК). Термин включает в себя такие способы, как "инфицирование", "трансфекция", "трансформация" и "трансдукция". В контексте данного изобретения введение нуклеиновых кислот в клетки можно осуществлять с помощью разных способов, включающих в себя электропорацию, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию, опосредованную липидами (липофекцию) и др.

Термин "клетка-хозяин" относится к клетке, которая содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, такую как вектор или вирус, и обеспечивает репликацию и/или экспрессию нуклеиновой кислоты. В качестве клеток-хозяев можно использовать прокариотические клетки, такие как E. coli, или эукариотические клетки, такие как дрожжевые клетки, клетки насекомых, клетки амфибий, птичьи клетки или клетки млекопитающих, в том числе человеческие клетки. Примеры клеток-хозяев могут включать в себя, например, клетки Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки), клетки BHK (клетки почки новорожденного хомяка), первичные культуры клеток почки цыплят (PCK), клетки Мадин-Дарби почек собак (MDCK), клетки Мадин-Дарби почек коров (MDBK), клетки 293 (например, клетки 293T) и клетки COS (например, клетки COS1, COS7) и др. В других воплощениях клетки-хозяева могут необязательно включать в себя яйцеклетки (например, куриные яйца, куриные яйца с зародышем и др.).

"Иммунологически эффективное количество" вируса гриппа представляет собой количество, достаточное для усиления собственного иммунного ответа субъекта (например, человека) при последующем воздействии вируса гриппа. Уровень индуцированного иммунного ответа можно определить, например, путем измерения количества нейтрализующих секреторных и/или сывороточных антител, например, с помощью реакции подавления бляшкообразования, фиксации комплемента, иммуноферментного твердофазного анализа, или микронейтрализации.

Термин "защитный иммунный ответ" против вируса гриппа относится к иммунному ответу субъекта (например, человека), который защищает субъекта от заболевания при последующем воздействии вируса гриппа дикого типа и/или инфицировании таким вирусом. В некоторых случаях вирус гриппа дикого типа (например, циркулирующий естественным образом) еще может приводить к инфицированию, однако такое инфицирование не вызывает серьезного или угрожающего жизни состояния. Как правило, защитный иммунный ответ приводит к образованию у хозяина детектируемых уровней сывороточных и секреторных антител, способных нейтрализовать вирус такого же штамма и/или такой же подгруппы (а иногда и другого, не имеющего отношения к вакцине, штамма и/или другой подгруппы) in vitro и in vivo.

В данном описании термин "антитело" относится к белку, содержащему один или несколько полипептидов, которые практически полностью или частично кодируются генами иммуноглобулинов или фрагментами генов иммуноглобулинов. Известные гены иммуноглобулинов включают в себя гены константных участков каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю, а также бесчисленное множество генов вариабельных участков иммуноглобулинов. Легкие цепи подразделяют на каппа и лямбда. Тяжелые цепи подразделяют на гамма, мю, альфа, дельта и эпсилон, которые, в свою очередь, определяют классы иммуноглобулинов, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. Типичным структурным элементом иммуноглобулина (антитела) является тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух одинаковых пар полипептидных цепей, где каждая пара содержит одну "легкую" (примерно 25 кДа) и одну "тяжелую" (примерно 50-70 кДа) цепь. На N-конце каждой цепи находится вариабельный участок размером примерно от 100 до 110 или более аминокислот, на который приходится основная ответственность за распознавание антигена. Термины «вариабельный участок легкой цепи (VL)» и «вариабельный участок тяжелой цепи (VH)» относятся к указанным участкам легких и тяжелых цепей, соответственно. Антитела существуют в виде интактных иммуноглобулинов, или в виде ряда хорошо охарактеризованных фрагментов, которые образуются в результате расщепления под действием разных пептидаз. Так, например, пепсин расщепляет антитело ниже дисульфидных связей в шарнирном участке с получением F(ab)'₂, димера Fab, который представляет собой легкую цепь, соединенную с VH-CH1 дисульфидной связью. F(ab)'₂ можно восстановить в мягких условиях с разрушением дисульфидной связи в шарнирном участке и превращением димера (Fab')₂ в мономер Fab'. Мономер Fab' по существу представляет собой Fab, содержащий часть шарнирного участка (более подробное описание других фрагментов антител можно найти в Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999)). Хотя разные фрагменты антител определяют на основании расщепления интактного антитела, специалистам в данной области известно, что такие фрагменты Fab' можно синтезировать de novo химически или с помощью технологий рекомбинантных ДНК. Таким образом, термин антитело в данном описании включает в себя антитела или их фрагменты, полученные путем модификации целых антител, или путем синтеза de novo с помощью технологий рекомбинантных ДНК. Антитела включают в себя, например, поликлональные антитела, моноклональные антитела, многоцепочечные или одноцепочечные антитела, в том числе одноцепочечные антитела Fv (sFv или scFv), в которых вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи соединены (непосредственно или через пептидный линкер) с получением непрерывного полипептида, гуманизированные или химерные антитела.

Вирус гриппа

Полипептиды и полинуклеотиды данного изобретения являются вариантами последовательностей HA и/или NA вируса гриппа. См., например, список последовательностей на приведенных ниже фиг.1 и 2. Как правило, вирусы гриппа состоят из внутреннего рибонуклеопротеинового ядра, содержащего геном из сегментированной одноцепочечной РНК, и внешней липопротеиновой оболочки с выстилкой из матриксного белка. Геном вирусов гриппа содержит восемь сегментов линейной (-)-цепочечной рибонуклеиновой кислоты (RNA), кодирующей иммуногенные белки гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA), и шесть полипептидов внутреннего ядра: нуклеокапсидный нуклеопротеин (NP); матриксные белки (M); неструктурные белки (NS); и 3 РНК-полимеразы (PA, PB1, PB2). В процессе репликации геномная вирусная РНК транскрибируется в (+)-цепочечную матричную РНК и (-)-цепочечную геномную кРНК в ядре клетки-хозяина. Каждый из восьми геномных сегментов входит в состав рибонуклеинового комплекса, который помимо РНК содержит NP и полимеразный комплекс (PB1, PB2 и PA). Молекула гемагглютинина представляет собой поверхностный гликопротеин, который действует, связываясь с N-ацетилнейраминовой кислотой (NeuNAc), также известной как сиаловая кислота, на поверхностных рецепторах клетки-хозяина. В некоторых воплощениях полипептиды данного изобретения (и полипептиды, кодируемые полинуклеотидами данного изобретения) могут действовать, связываясь с NeuNAc in vitro или in vivo. Такое действие в некоторых воплощениях может осуществляться фрагментами гемагглютинина, которые сохраняют активность гемагглютинина. Гемагглютинин состоит из двух субъединиц, HA1 и HA2, всего содержит примерно 550 аминокислот в длину и имеет размер примерно 220 кДа. Молекулы нейраминидазы отщепляют концевые остатки сиаловой кислоты с клеточных поверхностных рецепторов, агрегированных с вирусом гриппа, высвобождая вирионы из инфицированных клеток. Нейраминидаза также удаляет сиаловую кислоту из новообразованных молекул гемагглютинина и нейраминидазы. В некоторых воплощениях полипептиды данного изобретения (и полипептиды, кодируемые полинуклеотидами данного изобретения) могут действовать, отщепляя остатки сиаловой кислоты in vitro или in vivo. Такое действие в некоторых воплощениях может осуществляться фрагментами нейраминидазы, которые сохраняют активность нейраминидазы. Полипептиды нейраминидазы данного изобретения обладают перекрестной иммунологической реактивностью с одной или несколькими известными молекулами нейраминидазы вируса гриппа. В литературе можно найти много примеров таких известных нейраминидаз (например, в GenBank, в публикациях CDC и др.). Подобным образом, полипептиды "гемагглютинина" данного изобретения обладают перекрестной иммунологической реактивностью с одной или несколькими известными молекулами гемагглютинина вируса гриппа. Опять же, в литературе можно найти много примеров таких известных молекул гемагглютинина.

Вирусы гриппа, как правило, подразделяют на классы A и B, а также обычно менее значимый класс C. Каждый из вирусов гриппа A и B содержит восемь сегментов одноцепочечной РНК с отрицательной полярностью. Геном вируса гриппа A кодирует одиннадцать полипептидов. Сегменты 1-3 кодируют три полипептида, составляющих РНК-зависимую РНК-полимеразу. Сегмент 1 кодирует белок полимеразного комплекса PB2. Остальные полимеразные белки PB1 и PA кодируются сегментами 2 и 3, соответственно. Кроме того, сегмент 1 некоторых штаммов вируса гриппа кодирует маленький белок, PB1-F2, продуцируемый альтернативной рамкой считывания, находящейся в кодирующем участке PB1. Сегмент 4 кодирует поверхностный гликопротеин гемагглютинин (HA), участвующий в присоединении к клетке и проникновению в нее в процессе инфицирования. Сегмент 5 кодирует полипептид нуклеопротеина нуклеокапсида (NP), основного структурного компонента вирусной РНК. Сегмент 6 кодирует нейраминидазу (NA), гликопротеин оболочки. Сегмент 7 кодирует два матриксных белка, обозначаемых M1 и M2, которые транслируются с мРНК, сплайсированных разными способами. Сегмент 8 кодирует NS1 и NS2, два неструктурных белка, которые транслируются с альтернативно сплайсированных вариантов мРНК. Восемь геномных сегментов вируса гриппа B кодируют 11 белков. Три наиболее крупных гена кодируют компоненты РНК-полимеразы, PB1, PB2 и PA. Сегмент 4 кодирует белок HA. Сегмент 5 кодирует NP. Сегмент 6 кодирует белок NA и белок NB. Оба белка, NB и NA, транслируются с перекрывающихся рамок считывания бицистронной мРНК. Сегмент 7 вируса гриппа B также кодирует два белка: M1 и BM2. Самый маленький сегмент кодирует два продукта: NS1, который транслируется с полноразмерной РНК, и NS2, который транслируется со сплайсированного варианта мРНК.

Вирусы гриппа типа A и B обычно связаны с эпидемией гриппа в человеческих популяциях. Однако вирус гриппа типа A может инфицировать другие виды, такие как птицы, свиньи и другие животные. Вирусы типа A подразделяют на подтипы в зависимости от различий в поверхностных гликопротеиновых антигенах гемагглютинине и нейраминидазе. Известно 16 подтипов гемагглютинина вирусов типа А и 9 подтипов нейраминидазы. У людей в настоящее время известно примерно только 4 разных подтипа гемагглютинина и 2 разных подтипа нейраминидазы, например, H1, H2, H3, H5, N1 и N2. В частности, два основных подтипа вируса гриппа A, обладающие активностью у людей, представляют собой H1N1 и H3N2. Однако в последнее время большое внимание уделяется H1N2. Вирусы гриппа B не подразделяют на подтипы в зависимости от белков гемагглютинина и нейраминидазы. Далее станет понятно, что приведенный на фиг.1 список последовательностей содержит последовательности, относящиеся к нескольким разным подтипам вируса гриппа. Так, например, в списке последовательностей ca A/Uruguay/716/07 и ca A/Wisconsin/67/05 являются примерами штаммов A-H3N2. ca A/South Dakota/6/07 и ca A/Solomon Islands/3/06 являются примерами штаммов A-H1N1, а ca B/Florida/6/04, ca B/Malaysia/2506/04 и ca B/Brisbane/60/2008_DET представляют штамм B-HANA.

Разные штаммы вируса гриппа можно классифицировать, например, по их способности вызывать агглютинацию красных кровяных клеток (RBC или эритроциты). Антитела, специфичные к конкретным штаммам вируса гриппа, могут связываться с вирусом и, следовательно, предотвращать такую агглютинацию. Анализы, проводимые для определения типов штаммов на основе такого ингибирования, обычно называют анализами ингибирования гемагглютинации (анализы HI или HAI), они являются стандартными и хорошо известными способами характеристики штаммов вируса гриппа. Разумеется, специалистам в данной области хорошо известны и другие анализы, такие как ELISA, непрямая реакция флюоресцирующих антител, иммуногистохимия, вестерн-блоттинг и др., которые можно использовать для характеристики штаммов вируса гриппа, следовательно, применение и обсуждение в настоящем описании анализов HI не следует истолковывать как ограничение.

Говоря вкратце, в типичных анализах HI сыворотку, как правило, хорьков, используемую для определения типов или классификации, добавляют к образцам эритроцитов в разных разведениях, таких как 2-кратное и т.д. Затем оптически определяют, образуют ли эритроциты ассоциаты (т.е. агглютинируют), или находятся в суспендированном состоянии (т.е. неагглютинированном). Если клетки не образуют ассоциаты, агглютинация не происходит вследствие ингибирования под действием антител, присутствующих в сыворотке, специфичной к данному вирусу гриппа. Следовательно, исследуемый вирус гриппа принадлежит к тому же штамму. В некоторых случаях один штамм описывают как "подобный" другому, например, штамм x является "y-подобным" штаммом и т.п. Например, если значения титров двух образцов по данным анализа HI различаются не более чем в четыре раза, можно сделать вывод, что такие образцы относятся к одному штамму (например, оба они принадлежат штамму "New Caledonia", или штаммам "Moscow-like", и др.). Другими словами, штаммы обычно классифицируют в зависимости от их иммунологического или антигенного профиля. Титр HAI обычно определяют как максимальное разведение сыворотки, которое полностью ингибирует гемагглютинацию. См., например, Schild, et al, Bull. Wld Hlth Org., 1973, 48:269-278, и др. Опять же, специалистам хорошо известны классификация вирусов гриппа и их подразделение на штаммы, а также способы определения такого подразделения.

Из вышесказанного можно сделать вывод, что настоящее изобретение включает в себя не только конкретные последовательности, перечисленные в данном описании, но и такие последовательности, входящие в состав разных векторов (например, векторов, используемых для плазмидной рекомбинации и помощи, см. ниже), а также последовательности гемагглютинина и нейраминидазы, относящиеся к тем же штаммам, что и перечисленные в данном описании последовательности. Кроме того, настоящее изобретение охватывает штаммы, аналогичные штаммам, входящим в состав разных векторов (например, штаммы, обычно используемые для плазмидной рекомбинации и помощи, такие как A/Ann Arbor/6/60 или B/Ann Arbor/1/66, A/Puerto Rico/8/34, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55 или B/England/2608/76 и др.).

В данном описании термин "подобный штамм" означает, что первый вирус гриппа относится к такому же штамму, что и второй вирус гриппа, или к родственному штамму. В типичных воплощениях такое родство обычно определяют с помощью анализа HAI. Так, штаммы вирусов гриппа, значения титров которых по данным анализа HAI различаются не более чем в четыре раза, считаются "подобными штаммами". Однако специалистам в данной области известны и другие анализы, с помощью которых можно определять подобие штаммов, например, FRID, реакция нейтрализации и др. Настоящее изобретение также включает в себя такие подобные штаммы (т.е. подобные штаммам, присутствующим в списке последовательностей, приведенном в данном описании) в составе разных плазмид, векторов, вирусов, способов и др., описанных в данном документе. Таким образом, если контекст однозначно не указывает иначе, приведенные здесь описания конкретных последовательностей (например, в списке последовательностей) или их фрагментов также включают в себя последовательности штаммов, подобных указанным (т.е. подобных штаммам, содержащим последовательности, присутствующие в указанных плазмидах, векторах, вирусах и др., описанных в данном документе). Таким образом, далее станет ясно, что полипептиды NA и HA из таких подобных штаммов, представляют собой "подобные полипептиды", если сравнение проводят среди "подобных штаммов".

Противогриппозные вакцины

Описанные здесь последовательности, композиции и способы, в первую очередь, но не только, имеют отношение к получению вирусов гриппа для производства вакцин. Исторически противогриппозные вакцины получают, в основном, в оплодотворенных куриных яйцах с использованием вирусных штаммов, выбранных на основе эмпирических прогнозов относительно релевантных штаммов. В последнее время были получены реассортантные вирусы, которые содержат гемагглютининовые и/или нейраминидазные антигены, выбранные применительно к улучшенному аттенуированному, термочувствительному базовому штамму. После культивирования вируса с несколькими пассажами в куриных яйцах, вирусы гриппа извлекают и необязательно инактивируют, например, формальдегидом и/или -пропиолактоном (или альтернативно используют в качестве живой аттенуированной вакцины). Таким образом, можно заключить, что последовательности HA и NA (описанные в настоящем изобретении) можно с успехом использовать для получения противогриппозных вакцин.

Получению рекомбинантных и реассортантных вакцин в клеточной культуре препятствует неспособность некоторых штаммов, усовершенствованных с точки зрения получения вакцин, интенсивно расти в стандартных условиях культивирования клеток. Однако предварительное исследование, предпринятое авторами настоящего изобретения и их коллегами, позволило разработать векторную систему и способы получения рекомбинантных и реассортантных вирусов в культуре, делающие возможным быстрое получение вакцин против одного или нескольких выбранных антигеных штаммов вируса, например, штаммов A или B, разных подтипов, субштаммов и т.п., например, содержащих описанные здесь последовательности HA и NA. См. заявку США № 60/420708, поданную 23 октября 2002 г., заявку США № 10/423828, поданную 25 апреля 2003 г., и заявку США № 60/574117, поданную 24 мая 2004 г., имеющие общий заголовок "Multi-Plasmid System for the Production Influenza Virus". Культуры обычно держат в системе, такой как инкубатор для клеточных культур, позволяющей контролировать влажность и содержание CO ₂, при постоянной температуре, поддерживаемой терморегулятором, таким как термостат, на уровне, не превышающем 35°C. Реассортантные вирусы гриппа можно легко получить путем введения поднабора векторов, соответствующих геномным сегментам базового вируса гриппа, в сочетании с комплементарными сегментами, полученными из представляющих интерес штаммов (например, описанными здесь антигенными вариантами HA и NA). Как правило, базовые штаммы выбирают на основе свойств, желательных с точки зрения введения вакцины. Например, для получения вакцины, такой как живая аттенуированная вакцина, базовые донорные вирусные штаммы можно выбрать по аттенуированному фенотипу, способности адаптироваться к пониженным температурам и/или термочувствительности. Как описано в данном документе и, например, в патентной заявке США 10/423828 и др., в разных воплощениях настоящего изобретения штаммы вирусов гриппа A/Ann Arbor (AA)/6/60 или B/Ann Arbor/1/66 или A/Puerto Rico/8/34, или B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55 или B/England/2608/76 используют в качестве "каркаса", в который добавляют гены HA и/или NA (например, такие как перечисленные в данном описании последовательности и др.) с получением целевых реассортантных вирусов. Так, например, реассортантный штамм 6:2 может содержать 2 гена (т.е. NA и HA) из штаммов вируса гриппа, против которых желательно индуцировать иммуногенную реакцию, и 6 генов из штамма Ann Arbor, или другого базового штамма, и др. Применение вируса Ann Arbor обусловлено такими его свойствами, как способность адаптироваться к пониженным температурам, аттенуированный фенотип и термочувствительность. Конечно, следует понимать, что описанные здесь последовательности HA и NA, способны рекомбинироваться с генами ряда других вирусов или типов вирусов (например, с рядом разных "каркасных" штаммов, таких как A/Puerto Rico/8/34 и др., содержащих другие гены вируса гриппа, присутствующие в реассортантных штаммах, а именно, гены, отличные от HA и NA). В Соединенных Штатах недавно выдана лицензия на живые, аттенуированные вакцины на основе вируса гриппа A против человеческих вирусов гриппа. См. выше. Такие вакцины представляют собой реассортантные вирусы H1N1 и H1N2, которые содержат гены внутренних белков штамма A/Ann Arbor (AA)/6/60 (H2N2) адаптированного к пониженным температурам (ca) вируса, передающие фенотипы адаптированного к пониженным температурам, аттенуированного и термочувствительного вирусного штамма AA ca реассортантным вирусам (т.е. вирусам, содержащим гены гемагглютинина и нейраминидазы из штамма, отличного от Ann Arbor). В некоторых воплощениях настоящего изобретения реассортантные штаммы могут содержать рекомбинацию 7:1. Другими словами, только HA или NA не относится к каркасному штамму, или штамму MDV. Предварительное исследование проводят с использованием подходящих штаммов каркасных донорных вирусов, которые необязательно входят в объем разных воплощений настоящего изобретения. См., например, заявку США № 60/420708, поданную 23 октября 2002 г., заявку США № 10/423828, поданную 25 апреля 2003 г., и заявку США № 60/574117, поданную 25 мая 2004 г., имеющие общих заголовок "Multi-Plasmid System for the Production Influenza Virus"; Maassab et al, J. of Inf. Dis., 1982, 146:780-790; Cox, et al, Virology, 1988, 167:554-567; Wareing et al., Vaccine, 2001, 19:3320-3330; Clements, et al., J Infect Dis., 1990, 161(5):869-77, и т.п.

В некоторых воплощениях описанные здесь последовательности могут необязательно содержать удаления специфических участков (нуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность, или и та, и другая). Например, из молекул могут быть необязательно удалены многоосновные участки расщепления. В некоторых воплощениях настоящего изобретения такие участки расщепления имеют, например, последовательности, модифицированные или измененные по сравнению с последовательностями дикого типа, из которых получены такие последовательности (например, чтобы сделать невозможным или уменьшить расщепление по указанным участкам и др.). Такие модификации/изменения могут различаться у разных штаммов или последовательностей вследствие того, что участки расщепления в базовых последовательностях имеют разные последовательности. Например, в некоторых последовательностях HA удалены 4 многоосновных остатка (RRKK) (по сравнению с диким типом). В разных воплощениях такие многоосновные участки расщепления можно модифицировать разными способами (все они входят в объем данного изобретения). Например, в многоосновном участке расщепления можно удалить одну аминокислоту за один раз (например, удалить один R, удалить два R, удалить RRK, или удалить RRKK). Кроме того, аминокислотный остаток, находящийся выше по ходу считывания сразу за участком расщепления, также можно удалить или изменить (например, заменить R на T и т.п.); можно модифицировать и нуклеотиды, кодирующие аминокислотный остаток, находящийся сразу за участком расщепления. Специалистам в данной области известны разные способы удаления таких специфических участков. Полученные укороченные последовательности также входят в объем настоящего изобретения. См., например, Li et al., J. of Infectious Diseases, 179:1132-8, 1999.

Термины "термочувствительный", "адаптированный к пониженной температуре" и "аттенуированный" в применении к вирусам (обычно используемым в качестве вакцин или для получения вакцин), которые необязательно включают в себя последовательности настоящего изобретения, хорошо известны в данной области. Например, термин "термочувствительный" (ts) означает, что в случае штаммов вируса гриппа A титр вируса при 39°С в 100 или более раз ниже, чем при 33°C, а в случае штаммов вируса гриппа B титр вируса при 37°С в 100 или более раз ниже, чем при 33°C. Термин "адаптированный к пониженной температуре" (ca) означает, что рост вируса при 25°C примерно в 100 раз меньше, чем его рост при 33°C, тогда как термин "аттенуированный" (att) означает, что вирус реплицируется в верхних дыхательных путях хорьков, но не детектируется в тканях их легких и не вызывает гриппоподобное заболевание у животного. Следует понимать, что вирусы с промежуточными фенотипами, т.е. вирусы, уменьшение титра которых происходит менее чем в 100 раз при 39°C (в случае штаммов вирусов A) или при 37°C (в случае штаммов вирусов B), или вирусы, рост которых при 25°C снижается по сравнению с ростом при 33°C более чем в 100 раз (например, в 200 раз, 500 раз, 1000 раз, 10000 раз меньше), и/или вирусы, рост которых в легких хорьков меньше, чем в верхних дыхательных путях (т.е. частично аттенуированные), и/или которые вызывают гриппоподобное заболевание у животного, также находят применение и могут использоваться в сочетании с последовательностями HA и NA настоящего изобретения.

Таким образом, настоящее изобретение может включать в себя рост, например, в подходящих условиях культивирования, вирусных штаммов (как штаммов A, так и штаммов B вирусов гриппа) со свойствами, желательными для вакцин (такими как аттенуированная патогенность или аттенуированный фенотип, адаптация к пониженным температурам, термочувствительность и др.) in vitro в культивируемых клетках. Вирусы гриппа можно получить путем введения совокупности векторов, содержащих клонированные геномные сегменты вирусов, в клетки-хозяева и культивирование клеток при температуре, не превышающей 35°C. После трансфицирования векторов, содержащих геном вируса гриппа, рекомбинантные вирусы, подходящие для применения в качестве вакцин, можно выделить с помощью стандартных методов очистки. С использованием векторных систем и способов данного изобретения можно обеспечить быстрое и эффективное продуцирование клеточной культурой реассортантных вирусов, содержащих шесть внутренних генных сегментов штамма, обладающего свойствами, желательными с точки зрения получения вакцин, и иммуногенные сегменты HA и NA из выбранного, например, патогенного штамма, такие как приведенные в данном описании последовательности. Таким образом, описанные здесь системы и способы можно использовать для быстрого получения в клеточной культуре рекомбинантных и реассортантных вирусов гриппа A и B, в том числе вирусов, подходящих для применения в качестве вакцин, включающих в себя живые аттенуированные вакцины, такие как вакцины, подходящие для интраназального введения.

В таких воплощениях, как правило, выбирают один базовый штамм донорного вируса (MDV) для каждого из подтипов A и B. В случае живой аттенуированной вакцины, базовый штамм донорного вируса обычно выбирают по свойствам, благоприятным с точки зрения получения вакцин, таким как термочувствительность, адаптация к пониженным температурам и/или ослабление вирулентности. Примеры базовых донорных штаммов включают в себя такие термочувствительные, аттенуированные и адаптированные к пониженной температуре штаммы A/Ann Arbor/6/60 и B/Ann Arbor/1/66, соответственно, а также другие, упомянутые в данном описании.

Например, выбранный базовый донорный вирус типа А (MDV-A) или базовый донорный вирус типа B (MDV-B) получают из совокупности клонированных вирусных кДНК, составляющих вирусный геном. В некоторых воплощениях рекомбинантные вирусы получают из восьми клонированных вирусных кДНК. Восемь вирусных кДНК, представляющих собой любые последовательности, выбранные из последовательностей PB2, PB1, PA, NP, HA, NA, M и NS MDV-A или MDV-B, необязательно клонируют в реверсивном векторе экспрессии, таком как плазмида (например, pAD3000), обеспечивающем транскрипцию одной цепи вирусной геномной РНК с использованием промотора РНК-полимеразы I (pol I), и синтез вирусных мРНК на другой цепи с использованием промотора РНК-полимеразы II (pol II). Необязательно, любой генный сегмент, в том числе сегмент HA, можно модифицировать (например, путем удаления мультиосновного участка расщепления (также известного как многоосновный участок расщепления)).

Затем инфекционный рекомбинантный вирус MDV-A или MDV-B можно выделить с последующей трансфекцией плазмид, несущих восемь вирусных кДНК, в подходящие клетки-хозяева, например, клетки Vera, совместно культивируемые клетки MDCK/293T или MDCK/COS7. С использованием плазмид и способов, описанных в данном документе и, например, в заявке США № 60/420708, поданной 23 октября 2002 г., заявке США № 10/423828, поданной 25 апреля 2003 г., и заявке США № 60/574117, поданной 24 мая 2004 г., имеющих общий заголовок "Multi-Plasmid System for the Production Influenza Virus"; Hoffmann, E., 2000, PNAS, 97(11):6108-6113; опубликованной патентной заявке США № 20020164770, Hoffmann; и в патенте США № 6544785, выданном 8 апреля 2003 г., Palese, et al, настоящее изобретение можно использовать, например, для получения реассортантных противогриппозных вакцин 6:2 путем совместной трансфекции 6 внутренних генов (PB1, PB2, PA, NP, M и NS) выбранного вируса (например, MDV-A, MDV-B) и генов HA и NA, полученных из другого соответствующего типа (A или B) вирусов гриппа, например, приведенных в списке последовательностей данного описания. Например, сегмент HA предпочтительно выбирают из патогенных штаммов H1, H3 или B, в соответствии с обычной практикой получения вакцин. Подобным образом, сегмент HA можно выбрать из штаммов, которые начинают себя проявлять как патогенные, например, приведенные в списке последовательностей данного документа. Кроме того, можно получить реассортантные штаммы, содержащие семь геномных сегментов MDV и один из генов HA и NA выбранного штамма (реассортантные штаммы 7:1). Следует понимать, что, как детально описано в данном документе, молекулы данного изобретения необязательно можно использовать совместно в любом желательном сочетании. Например, описанные здесь последовательности HA и/или NA можно поместить, например, в реассортантный каркас, такой как A/AA/6/60, B/AA/1/66, A/Puerto Rico/8/34 (т.е. PR8) и др., с получением реассортантных штаммов 6:2, 7:1 и др. Таким образом, как более подробно описано ниже, может присутствовать 6 внутренних геномных сегментов из донорных вирусов (опять же, например, A/AA/6/60 и др.) и 2 геномных сегмента из второго штамма (например, штамма дикого типа, не относящегося к донорным вирусам). Такие 2 геномных сегмента предпочтительно представляют собой гены HA и NA. Подобная ситуация наблюдается и в случае реассортантных штаммов 7:1, в которых, однако, присутствуют 7 геномных сегментов из донорных вирусов и 1 геномный сегмент (один из HA и NA) из другого вируса (как правило, вируса дикого типа или вируса, к которому нужно индуцировать иммунный ответ). Кроме того, следует понимать, что в разных воплощениях описанные здесь последовательности (например, перечисленные в списке последовательностей на фиг.1 и др.) можно объединять разными способами. Так, одна из описанных здесь последовательностей может присутствовать в реассортантном штамме 7:1 (т.е. последовательность данного изобретения присутствует вместе с 7 геномными сегментами донорных вирусов) и/или она может присутствовать вместе с другой последовательностью данного изобретения в реассортантном штамме 6:2. В таких реассортантных штаммах 6:2 одна из последовательностей данного изобретения необязательно может присутствовать в сочетании с любой другой последовательностью данного изобретения. Однако типичные и предпочтительные воплощения содержат HA и NA из одинаковых исходных штаммов дикого типа (или из модифицированных штаммов дикого типа, например, содержащих модифицированные многоосновные участки расщепления). Например, типичные воплощения могут включать в себя реассортантные штаммы 6:2, содержащие 6 внутренних геномных сегментов из донорных вирусов, таких как A/AA/6/60, и геномные сегменты HA и NA из одного штамма, такого как ca A/Uruguay/716/07, ca A/South Dakota/6/07, ca A/Wisconsin/67/05 или ca A/Solomon Islands/3/06. В другом воплощении описанный здесь реассортантный штамм 6:2 может содержать 6 внутренних геномных сегментов из донорных вирусов, таких как B/Ann Arbor/1/66, и геномные сегменты HA и NA из одного штамма, такого как ca B/Florida/6/04, ca B/Malaysia/2506/04 или ca B/Brisbane/60/2008_DET. Разумеется, следует понимать, что изобретение также включает в себя реассортантные вирусы, которые содержат геномные сегменты HA и NA, полученные из подобных штаммов (т.е. из штаммов, подобных штаммам вирусов гриппа, содержащим последовательности, выбранные из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25. Вышеуказанные ссылки специально включены в данное описание во всей полноте для любых целей, особенно, вследствие содержащихся в них разъяснений относительно плазмид, плазмидной помощи для вируса (вируса гриппа), мультиплазмидных систем для вирусной помощи/получения вирусов и др.

Опять же, последовательности HA и NA настоящего изобретения можно необязательно использовать для получения таких плазмидных рекомбинантных вакцин (и/или других вирусов и вакцин ts, cs, ca, и/или att). Однако следует отметить, что последовательности HA, NA и др. данного изобретения не ограничиваются конкретными вакцинными композициями или способами получения, и, следовательно, могут использоваться для получения вакцины практически любого типа, или в способе получения вакцин, в котором используют штаммоспецифические антигены HA и NA (такие как последовательности данного изобретения).

FLUMIST^TM

Как указано выше, существуют многочисленные примеры и типы противогриппозных вакцин. Примером противогриппозной вакцины является FluMist^TM (MedImmune vaccines Inc., Mt. View, CA), которая представляет собой живую, аттенуированную вакцину, защищающую детей и взрослых от заболевания гриппом (Belshe et al. (1998) The efficacy of live attenuated, cold adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children, N Engl J Med. 338:1405-12; Nichol et al. (1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282: 137-44). В типичных и предпочтительных воплощениях способы и композиции настоящего изобретения адаптированы/используются для получения вакцины FluMist^TM. Однако специалистам в данной области должно быть понятно, что описанные здесь последовательности, способы, композиции и др. также можно адаптировать для получения подобных или даже других противовирусных вакцин.

Штаммы вакцины FluMist^TM содержат, например, генные сегменты HA и NA, полученные из штаммов дикого типа, против которых направлена вакцина (или, в некоторых случаях, из родственных им штаммов), а также шесть генных сегментов, PB1, PB2, PA, NP, M и NS, из обычных базовых донорных вирусов (MDV). Следовательно, описанные здесь последовательности HA и NA необязательно входят в состав разных композиций FluMist^TM. MDV для штаммов вирусов гриппа A FluMist^TM (MDV-A) получают путем серийных пассажей штамма дикого типа A/Ann Arbor/6/60 (A/AA/6/60) в первичной культуре ткани почек цыплят при последовательно снижающихся значениях температуры (Maassab (1967) Adaptation and growth characteristics influenza virus at 25 degrees C, Nature 213:612-4). MDV-A эффективно реплицируется при 25°C (ca, адаптированный к пониженной температуре), однако его рост ограничен при 38 и 39°C (ts, термочувствительный). Кроме того, данный вирус не реплицируется в легких инфицированных хорьков (att, аттенуированный). Полагают, что фенотип ts вносит вклад в ослабление вакцины у людей путем ограничения ее репликации во всех, кроме самых холодных участков респираторного тракта. Стабильность данного свойства показана на животных моделях и в клинических испытаниях. В отличие от фенотипа ts штаммов вирусов гриппа, полученных путем химического мутагенеза, свойство ts MDV-A не возвращается к прежнему состоянию после пассажей на инфицированных хомяках или в выделяемых изолятах цыплят (последний обзор можно найти в Murphy & Coelingh (2002) Principles underlying the development and use of live attenuated cold-adapted influenza A and B virus vaccines, Viral Immunol. 15:295-323).

Клинические исследования, проведенные более чем на 20000 взрослых и детей с использованием 12 отдельных реассортантных штаммов 6:2, демонстрируют, что эти вакцины являются аттенуированными, безопасными и эффективными (Belshe et al. (1998) The efficacy of live attenuated, cold adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccines in children, N Engl J Med 338:1405-12; Boyce et al. (2000) Safety and immunogenicity of adjuvanted and unadjuvanted subunit influenza vaccines administered intranasally to healthy adults, vaccine 19:217-26; Edwards et al. (1994) A randomized controlled trial of cold adapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza A disease J Infect Dis 169:68-76; Nichol et al. (1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccines in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282:137-44). Реассортантные штаммы, несущие шесть внутренних генов MDV-A и два генных сегмента HA и NA вируса дикого типа (т.е. реассортантные штаммы 6:2) устойчиво поддерживают фенотипы ca, ts и att (Maassab et al. (1982) Evaluation of a cold-recombinant influenza virus vaccine in ferrets, J. Infect. Dis. 146:780-900).

Из штаммов вирусов гриппа В такие реассортантные вирусы получить труднее, однако в последних исследованиях (см., например, заявку США № 60/420708, поданную 23 октября 2002 г., заявку США № 10/423828, поданную 25 апреля 2003 г., и заявку США № 60/574117, поданную 24 мая 2004 г., имеющие общий заголовок "Multi-Plasmid System for the Production Influenza Virus") разработано восемь плазмидных систем для получения вируса гриппа B полностью из клонированной кДНК. Также описаны способы получения аттенуированных живых вирусов гриппа A и B, подходящих для вакцинных композиций, таких как живые вирусные вакцинные композиции, пригодные для интраназального введения.

Описанные выше системы и способы можно использовать для быстрого получения в клеточной культуре рекомбинантных и реассортантных вирусов гриппа A и B, в том числе вирусов, подходящих для применения в качестве вакцин, включающих в себя живые аттенуированные вакцины, такие как вакцины, подходящие для интраназального введения. Чтобы получить вирусы, подходящие для производства вакцин, последовательности, способы и другие продукты настоящего изобретения необязательно используют совместно или в сочетании с полученными ранее продуктами, включающими в себя, например, рекомбинированные вирусы гриппа для производства вакцин.

Способы и композиции, используемые для профилактического введения вакцин

Как указано выше, альтернативно, или помимо применения в производстве вакцины FluMist^TM, настоящее изобретение можно использовать для получения других вакцинных композиций. Как правило, рекомбинантные и реассортантные вирусы данного изобретения (например, включающие в себя полинуклеотиды SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, или полипептиды SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10, остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26, или штаммы, подобные последовательностям вирусов SEQ ID NO:1-28, или фрагменты перечисленных выше последовательностей) можно вводить профилактически в иммунологически эффективном количестве в подходящем носителе или эксципиенте с целью стимуляции специфичного иммунного ответа против одного или нескольких штаммов вируса гриппа, определяемого последовательностями HA и/или NA. Обычно используют фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент, такой как стерильная вода, водный физиологический раствор, водные забуференные физиологические растворы, водные растворы декстрозы, водные растворы глицерина, этанол, аллантоисная жидкость из неинфицированных куриных яиц (т.е. нормальная аллантоисная жидкость или NAF) или их сочетания. Такие растворы, обладающие стерильностью, нужным значением pH, изотоничностью и стабильностью, получают с помощью известных в данной области способов. Обычно выбирают носитель или эскципиент, минимизирующий аллергические и другие нежелательные эффекты и подходящий для конкретного способа введения, такого как подкожное, внутримышечное, интраназальное введение и др.

Родственный аспект данного изобретения предлагает способы стимуляции иммунной системы субъекта с индукцией защитного иммунного ответа против вируса гриппа. В указанных способах иммунологически эффективное количество рекомбинантного вируса гриппа (например, молекулы HA и/или NA данного изобретения), иммунологически эффективное количество полипептида данного изобретения, и/или иммунологически эффективное количество нуклеиновой кислоты данного изобретения вводят субъекту в физиологически приемлемом носителе.

Как правило, вирусы гриппа данного изобретения вводят в количестве, достаточном для стимуляции специфичного иммунного ответа против одного или нескольких штаммов вируса гриппа (т.е. против штаммов HA и/или NA данного изобретения). Предпочтительно, введение вирусов гриппа вызывает защитный иммунный ответ против вводимых штаммов. Дозы и способы индуцирования защитного иммунного ответа против одного или нескольких штаммов вируса гриппа известны специалистам в данной области. См., например, патент США № 5922326; Wright et al, Infect. Immun. 37:397-400 (1982); Kim et al., Pediatrics 52:56-63 (1973); и Wright et al., J. Pediatr. 88:931-936 (1976). Например, доза вируса гриппа находится в интервале примерно 1-1000 HID₅₀ (инфицирующая доза для человека), т.е. составляет примерно 10⁵-10⁸ БОЕ (бляшкообразующих единиц) на прием. Как правило, дозу устанавливают в пределах указанного интервала в зависимости от, например, возраста, физического состояния, массы тела, пола, рациона, времени введения и других клинических факторов. Профилактическую вакцинную композицию вводят системно, например, путем подкожной или внутримышечной инъекции с помощью иглы и шприца или безыгольного инъектора. Альтернативно, вакцинную композицию вводят интраназально в виде капель, крупнодисперсного аэрозоля (с размером частиц более чем примерно 10 микрон) или распыления в верхние дыхательные пути. Хотя все вышеуказанные способы доставки приводят к индукции защитного системного иммунного ответа, интраназальное введение имеет дополнительное преимущество, заключающееся в стимуляции мукозального иммунитета в участке поступления вируса гриппа. Для интраназального введения часто предпочитают аттенуированные живые вирусные вакцины, такие как аттенуированные, адаптированные к пониженной температуре и/или термочувствительные рекомбинантные или реассортантные вирусы гриппа. См. выше. Хотя для стимуляции защитного иммунного ответа предпочтительно используют одну дозу, для достижения желательного профилактического эффекта можно ввести дополнительные дозы таким же или другим способом.

Как правило, аттенуированный рекомбинантный вирус гриппа данного изобретения, используемый в составе вакцины, ослаблен в степени, достаточной для того, чтобы симптомы инфекции, или, по меньшей мере, симптомы тяжелой инфекции не наблюдались у большинства субъектов, иммунизированных (или иным образом инфицированных) аттенуированным вирусом гриппа. В некоторых случаях аттенуированный вирус гриппа может вызывать симптомы легкого заболевания (например, легкого заболевания верхних дыхательных путей) и/или распространяться среди невакцинированных субъектов. Однако его вирулентность снижена в степени, достаточной для того, чтобы у вакцинированных или случайных хозяев отсутствовали тяжелые инфекции нижних дыхательных путей.

Альтернативно, иммунный ответ можно стимулировать путем воздействия вирусов гриппа, содержащих описанные здесь последовательности, на дендритные клетки ex vivo или in vivo. Например, пролиферирующие дендритные клетки подвергают воздействию вирусов в достаточном количестве и в течение достаточного времени, чтобы обеспечить улавливание антигенов вируса гриппа дендритными клетками. Затем клетки пересаживают субъекту, подлежащему вакцинации, с помощью стандартных способов внутривенной трансплантации.

Хотя для стимуляции защитного иммунного ответа предпочтительно используют одну дозу, для достижения желательного профилактического эффекта можно ввести дополнительные дозы таким же или другим способом. Чтобы индуцировать достаточный иммунный ответ у новорожденных и детей может потребоваться несколько введений. Если нужно поддерживать достаточный уровень защиты против вируса гриппа дикого типа, введение можно продолжать с перерывами на протяжении всего детского возраста. Подобным образом, для взрослых, обладающих повышенной восприимчивостью к повторным или тяжелым инфекциям вируса гриппа, таких как, например, патронажные медицинские работники, специалисты по уходу за детьми, члены семьи младшего возраста, пожилые люди и субъекты с нарушенной сердечно-легочной функцией, может потребоваться несколько иммунизаций, чтобы индуцировать и/или поддерживать защитные иммунные ответы. Уровень индуцированного иммунного ответа можно определить, например, путем измерения количества нейтрализующих секреторных и/или сывороточных антител, и, при необходимости, для достижения и поддержания желательного уровня защиты можно проводить коррекцию дозы и повторные вакцинации.

Кроме того, композиция для профилактического введения вирусов гриппа может необязательно содержать один или несколько адъювантов, усиливающих иммунный ответ на антигены гриппа. Подходящие адъюванты включают в себя: полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, сапонин, минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюрониловые полиолы, полианионы, пептиды, масла или углеводородные эмульсии, бацилла Calmette-Guerin (BCG), Corynebacterium parvum и синтетические адъюванты QS-21 и MF59.

При желании профилактическое введение вакцины можно осуществлять в сочетании с введением одной или нескольких иммуностимулирующих молекул. Иммуностимулирующие молекулы включают в себя разные цитокины, лимфокины и хемокины, обладающие иммуностимулирующей, иммунопотенциирующей и провоспалительной активностью, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); факторы роста (например, гранулоцитарно-моноцитарный (GM) колониестимулирующий фактор (CSF)); и другие иммуностимулирующие молекулы, такие как макрофагальный фактор воспаления, лиганд Flt3, B7.1; B7.2 и др. Иммуностимулирующие молекулы можно вводить в составе той же композиции, что и вирусы гриппа, или отдельно. Иммуностимулирующий эффект можно достичь путем введения белка (например, полипептида HA и/или NA данного изобретения) или вектора экспрессии, кодирующего такой белок.

Описанные выше способы можно использовать для лечения и/или профилактики заболевания или нарушения, как правило, гриппа, путем введения вектора данного изобретения, содержащего гетерологичный полинуклеотид, кодирующий терапевтически или профилактически эффективный полипептид (или пептид) HA и/или NA, или РНК HA и/или NA (например, антисмысловую РНК или рибозим) в популяцию клеток-мишеней in vitro, ex vivo или in vivo. Обычно представляющие интерес полинуклеотид, кодирующий полипептид (или пептид), или РНК, функционально связаны с подходящими регуляторными последовательностями, например, как описано в данном документе. Один вектор или вирус может необязательно содержать несколько гетерологичных кодирующих последовательностей. Например, кроме полинуклеотида, кодирующего терапевтически или профилактически активные полипептид или РНК HA и/или NA, вектор также может содержать последовательности, кодирующие другие терапевтические или профилактические полипептиды, такие как антигены, костимулирующие молекулы, цитокины, антитела и др., и/или маркеры и т.п.

Хотя вакцинация субъекта аттенуированным вирусом гриппа конкретного штамма определенной подгруппы может индуцировать перекрестный иммунитет против вирусов гриппа других штаммов и/или подгрупп, при желании перекрестный иммунитет можно усилить путем вакцинации субъекта аттенуированными вирусами гриппа, относящимися, по меньшей мере, к двум, по меньшей мере, к трем, или, по меньшей мере, к четырем штаммам или подштаммам, например, по меньшей мере, два из которых относятся к другой подгруппе. Например, вакцинация субъекта, по меньшей мере, четырьмя штаммами или подштаммами аттенуированного вируса гриппа может включать в себя вакцинацию субъекта, по меньшей мере, двумя штаммами или подштаммами вируса гриппа A и, по меньшей мере, двумя штаммами или подштаммами вируса гриппа B. Вакцинация субъекта, по меньшей мере, четырьмя штаммами или подштаммами аттенуированного вируса гриппа может включать в себя вакцинацию субъекта, по меньшей мере, тремя штаммами или подштаммами вируса гриппа A и, по меньшей мере, одним штаммом или подштаммом вируса гриппа B. Вакцинация субъекта, по меньшей мере, четырьмя штаммами или подштаммами аттенуированного вируса гриппа может включать в себя введение одной тетравалентной вакцины, которая содержит все из, по меньшей мере, четырех штаммов или подштаммов аттенуированного вируса гриппа. Альтернативно, вакцинация может включать в себя введение нескольких вакцин, каждая из которых содержит один, два или три штамма или подштамма аттенуированного вируса гриппа. Кроме того, сочетания вакцин могут необязательно включать в себя смеси пандемических вакцин и непандемических штаммов. В смесях вакцин (или при проведении нескольких вакцинаций) можно использовать компоненты человеческих и/или нечеловеческих штаммов вирусов гриппа (например, обезьяньих и человеческих и т.п.). Подобным образом, аттенуированные противогриппозные вакцины данного изобретения можно необязательно объединять с вакцинами, которые индуцируют защитные иммунные ответы против других инфекционных агентов. В одном воплощении вакцина данного изобретения представляет собой трехвалентную вакцину, содержащую три реассортантных вируса гриппа. В одном воплощении вакцина данного изобретения представляет собой трехвалентную вакцину, содержащую два реассортантных вируса гриппа A и реассортантный вирус гриппа B. В одном воплощении вакцина данного изобретения представляет собой трехвалентную вакцину, содержащую реассортантный вирус гриппа A типа H1, реассортантный вирус гриппа A типа H3 и реассортантный вирус гриппа B. В другом воплощении вакцина данного изобретения представляет собой четырехвалентную вакцину, содержащую четыре реассортантных вируса гриппа. В одном воплощении вакцина данного изобретения представляет собой четырехвалентную вакцину, содержащую два реассортантных вируса гриппа A и два реассортантных вируса гриппа B. В одном воплощении вакцина данного изобретения представляет собой четырехвалентную вакцину, содержащую реассортантный вирус гриппа A типа H1, реассортантный вирус гриппа A типа H3, реассортантный вирус гриппа B линии Victoria и реассортантный вирус гриппа B линии Yamagata.

Полинуклеотиды настоящего изобретения

Зонды

Полинуклеотиды HA и NA данного изобретения, например, имеющие описанную в данном документе последовательность, такую как SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, а также их фрагменты, необязательно используют для ряда других целей, альтернативных применению описанных выше вакцин, или в дополнение к такому применению. Примеры других применений описаны в данном документе с целью иллюстрации, но не для ограничения фактического диапазона применений и др. В данном документе также описаны разные способы получения, очистки и характеристики нуклеотидных последовательностей данного изобретения.

В некоторых воплощениях нуклеиновые кислоты, содержащие одну или несколько полинуклеотидных последовательностей данного изобретения, успешно используют в качестве зондов для детекции соответствующих или родственных нуклеиновых кислот в разных ситуациях, таких как эксперименты по гибридизации нуклеиновых кислот, например, с целью обнаружения и/или характеристики гомологичных вариантов вируса гриппа (например, гомологов описанных здесь последовательностей и др.), инфицирование других видов, вспышки эпидемий разных вирусов гриппа и др. Зонды могут представлять собой как молекулы ДНК, так и молекулы РНК, такие как фрагменты рестрикции геномных или клонированных ДНК, кДНК, продукты амплификации ПЦР, транскрипты и олигонуклеотиды, длина которых может варьировать от олигонуклеотидов размером примерно 10 нуклеотидов до полноразмерных последовательностей или кДНК размером 1 т.о. или более. Например, в некоторых воплощениях зонд данного изобретения представляет собой полинуклеотидную последовательность или субпоследовательность, выбранную, например, из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, или комплементарные им последовательности. Альтернативно, в качестве зондов можно использовать полинуклеотидные последовательности, являющиеся вариантами одной из указанных выше последовательностей. Чаще всего такие варианты содержат изменения одного или нескольких консервативных нуклеотидов. Например, можно выбрать пары (или наборы) олигонуклеотидов, в которых две (или более) полинуклеотидные последовательности являются консервативными вариациями по отношению друг к другу, где одна полинуклеотидная последовательность точно соответствует первому варианту и/или другая (другие) последовательность точно соответствует другим вариантам. Такие пары олигонуклеотидных зондов, в частности, можно использовать, например, для проведения специфической гибридизации с целью детекции полиморфных нуклеотидов или, например, вариантов HA и NA вирусов гриппа, например, гомологичных последовательностям HA и NA настоящего изобретения, инфицирующих другие виды, или присутствующих во время разных эпидемий гриппа (например, возникающих в разное время и/или в разных географических регионах). Для других применений выбирают зонды с большей дивергентностью, то есть зонды, идентичность которых составляет, по меньшей мере, примерно 91% (или примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 98,5%, примерно 98,7%, примерно 99%, примерно 99,1%, примерно 99,2%, примерно 99,3%, примерно 99,4%, примерно 99,5%, или примерно 99,6% или более, примерно 99,7%, примерно 99,8%, примерно 99,9% или более).

Зонды данного изобретения, примерами которых являются последовательности, полученные из описанных здесь последовательностей, также можно использовать для идентификации других полезных полинуклеотидных последовательностей с помощью способов, традиционно используемых в данной области. В ряде воплощений один или несколько из описанных выше зондов используют для скрининга библиотек продуктов экспрессии или хромосомальных сегментов (например, экспрессионных библиотек или геномных библиотек) с целью идентификации клонов, которые содержат последовательности, идентичные, или обладающие высокой степенью подобия, например, одному или нескольким зондам, выбранным из группы, включающей в себя, например, SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, т.е. варианты, гомологи и др. Следует понимать, что для идентификации родственных полинуклеотидных последовательностей помимо физических способов, таких как скрининг библиотек, используют компьютерные биоинформационные технологии, такие как BLAST и другие алгоритмы определения гомологии последовательностей. Идентифицированные таким способом полинуклеотидные последовательности также являются признаком данного изобретения.

Олигонуклеотидные зонды необязательно получают с помощью ряда способов, хорошо известных специалистам в данной области. Чаще всего их получают путем хорошо известных синтетических способов, таких как твердофазный способ с применением триэфира фосфорамидита, описанный Beaucage and Caruthers (1981), Tetrahedron Letts 22(20):1859-1862, например, с использованием автоматического синтезатора, или как описано в Needham-Van Devanter et al. (1984) Nucl Acids Res, 12:6159-6168. Олигонуклеотиды также могут изготовляться по индивидуальному заказу рядом коммерческих фирм, известных специалистам в данной области. Очистку олигонуклеотидов, если она необходима, обычно проводят либо методом простого электрофореза в акриламидном геле, либо методом анионообменной ВЭЖХ, описанным Pearson and Regnier (1983), J Chrom 255:137-149. Последовательность синтетических олигонуклеотидов можно подтвердить методом химической деградации Maxam and Gilbert (1980), описанным в Grossman and Moldave (eds.) Academic Press, New York, Methods in Enzymology 65:499-560. Индивидуальные олигонуклеотиды можно легко заказать в ряде коммерческих фирм, известных специалистам в данной области.

В других обстоятельствах, например, связанных с характерными особенностями клеток или организмов, экспрессирующих полинуклеотиды и полипептиды данного изобретения (например, несущих вирус, который содержит последовательности данного изобретения), предпочтительно используют зонды, представляющие собой полипептиды, пептиды или антитела. Например, выделенные или рекомбинантные полипептиды, полипептидные и пептидные фрагменты, полученные из любой аминокислотной последовательности данного изобретения, и/или кодируемые полинуклеотидной последовательностью данного изобретения, например, выбранной из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, предпочтительно используют для идентификации и выделения антитела, например, из библиотек фаговых дисплеев, комбинаторных библиотек, поликлональной сыворотки и т.п.

Антитела, специфичные к любой полипептидной последовательности или субпоследовательности, такой как SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26, и/или кодируемой полинуклеотидной последовательностью данного изобретения, например, выбранной из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, также можно использовать в качестве зондов для оценки уровня экспрессии продуктов, например, в клетках или тканях. Кроме того, антитела особенно полезны для определения экспрессии белков, содержащих аминокислотные субпоследовательности, например, полученные из описанных в данном документе последовательностей, или кодируемые полинуклеотидными последовательностями данного изобретения, например, выбранными из описанных в данном документе, in situ, в тканевом массиве, в клетке, ткани или организме, например, в организме, инфицированном неидентифицированным вирусом гриппа, и т.п. Антитела можно метить непосредственно детектируемым реагентом, или косвенно путем мечения вторичного антитела, специфичного к константному участку тяжелой цепи (т.е. к изотипу) конкретного антитела. С помощью антител против описанных в данном документе конкретных аминокислотных последовательностей (таких как SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26) также можно определить, относятся ли вирусы гриппа к тому же штамму, что и последовательности настоящего изобретения (например, посредством анализа HI и др.). Дополнительные детали, касающиеся получения специфических антител, описаны ниже.

Диагностические анализы

Нуклеотидные последовательности настоящего изобретения можно использовать в диагностических анализах, проводимых для детекции вируса гриппа (и/или гемагглютинина и/или нейраминидазы) в образце, которые позволяют определить гемагглютинин-подобные и/или нейраминидаза-подобные последовательности и различия штаммов в клинических изолятах вирусов гриппа, с использованием либо синтезированных химическими способами, либо рекомбинантных полинуклеотидных фрагментов, например, выбранных из описанных здесь последовательностей. Например, фрагменты последовательностей гемагглютинина и/или нейраминидазы, содержащие, по меньшей мере, от 10 до 20 нуклеотидов, можно использовать в качестве праймеров для амплификации нуклеиновых кислот методами полимеразной цепной реакции (ПЦР), хорошо известными в данной области (например, методом ПЦР с обратной транскрипцией), и в качестве зондов в анализах гибридизации нуклеиновых кислот, позволяющих детектировать целевой генетический материал, такой как РНК вируса гриппа, в клинических образцах.

Зонды данного изобретения, примерами которых являются уникальные субпоследовательности, выбранные из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, также можно использовать для идентификации других полезных полинуклеотидных последовательностей (например, для характеристики других штаммов гриппа) в соответствии со способами, традиционно используемыми в данной области. В ряде предпочтительных воплощений один или несколько описанных выше зондов используют для скрининга библиотек продуктов экспрессии или клонированных вирусных нуклеиновых кислот (т.е. экспрессионных библиотек или геномных библиотек) с целью идентификации клонов, которые содержат последовательности, идентичные, или в значительной степени идентичные описанным здесь последовательностям. В свою очередь, каждую из таких идентифицированных последовательностей можно использовать для получения зондов, включающих в себя описанные выше пары или наборы вариантных зондов. Следует понимать, что для идентификации родственных полинуклеотидных последовательностей помимо физических способов, таких как скрининг библиотек, используют компьютерные биоинформационные технологии, такие как BLAST и другие алгоритмы определения гомологии последовательностей.

В частности, зонды данного изобретения можно использовать для детекции присутствия и определения идентичности нуклеиновых кислот вируса гриппа в клетках, тканях или других биологических образцах (таких как носовые или бронхиальные смывы). Например, зонды данного изобретения предпочтительно используют для того, чтобы определить, действительно ли биологический образец, такой как биологический образец субъекта (например, человека) или модельная система (такая как образец культивируемых клеток), подвергся воздействию вирусов гриппа, или инфицированию вирусами гриппа или конкретным штаммом (штаммами) вируса гриппа. Детекция гибридизации выбранного зонда с нуклеиновыми кислотами, полученными из (например, выделенными из) биологического образца или модельной системы, указывает на воздействие вируса, или инфицирование вирусом, из которого получен полинуклеотид выбранного зонда (или родственным вирусом).

Следует понимать, что структура зонда зависит от предполагаемого применения. Например, если в одном анализе нужно детектировать несколько аллель-специфичных взаимодействий зонд-мишень, например, на одном ДНК-чипе, желательно, чтобы температуры плавления всех зондов были примерно одинаковыми. Соответственно, длины зондов корректируют так, чтобы температуры плавления всех зондов на матрице были почти одинаковыми (следует понимать, что для достижения определенной Т_пл для разных зондов может потребоваться разная длина, если разные зонды имеют разное содержание GC). Хотя температура плавления является основным фактором, влияющим на конструкцию зонда, другие факторы необязательно могут привести к дополнительной коррекции конструкции зонда, такие как селекция против самокомплементарности праймеров и т.п.

Векторы, промоторы и системы экспрессии

Настоящее изобретение включает в себя рекомбинантные конструкции, содержащие одну или несколько описанных в данном документе нуклеотидных последовательностей. Такие конструкции необязательно содержат вектор, такой как плазмида, космида, фаг, вирус, бактериальная искусственная хромосома (BAC), дрожжевая искусственная хромосома (YAC) и др., в который вставлены одна или несколько из полинуклеотидных последовательностей данного изобретения, например, выбранные из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, или их субпоследовательности и др., в прямой или обратной ориентации. Например, вставленная нуклеиновая кислота может содержать вирусную хромосомальную последовательность или кДНК, включающую в себя полностью или частично, по меньшей мере, одну полинуклеотидную последовательность данного изобретения. В одном воплощении конструкция дополнительно содержит регуляторные последовательности, включающие в себя, например, промотор, функционально связанный с последовательностью. Специалистам в данной области известно большое число коммерчески доступных подходящих векторов и промоторов.

Полинуклеотиды настоящего изобретения можно вставить в любой из ряда векторов, подходящих для получения смысловой или антисмысловой РНК и, необязательно, полипептидных (или пептидных) продуктов экспрессии (таких как молекулы гемагглютинина и/или нейраминидазы данного изобретения, или фрагменты гемагглютинина или нейраминидазы). Такие векторы включают в себя хромосомальные последовательности, нехромосомальные последовательности и синтетические последовательности ДНК, например, полученные из SV40; бактериальные плазмиды; фаговую ДНК; бакуловирус; дрожжевые плазмиды; векторы, представляющие собой сочетания плазмид и фаговых ДНК, ДНК вирусов, таких как вирус коровьей оспы, аденовирус, вирус оспы птиц, вирус ложного бешенства, аденовирус, адено-ассоциированный вирус, ретровирусы и многие другие (например, pCDL). Можно использовать любой вектор, способный вводить генетический материал в клетку, и, если желательна его репликация, способный реплицироваться в подходящем хозяине.

Представляющую интерес полинуклеотидную последовательность HA и/или NA физически располагают в векторе экспрессии в соответствующей близости и ориентации по отношению к подходящей последовательности, регулирующей транскрипцию (такой как промотор и, необязательно, один или несколько энхансеров), так, чтобы обеспечить контроль за синтезом мРНК. То есть, представляющая интерес полинуклеотидная последовательность находится в функциональной связи с подходящей последовательностью, регулирующей транскрипцию. Примеры таких промоторов включают в себя: промотор LTR или SV40, промотор E. coli lac или trp, промотор фага лямбда PL, а также другие промоторы, которые, как известно, регулируют экспрессию генов в прокариотических или эукариотических клетках или их вирусах.

В векторах экспрессии можно использовать разные промоторы, регулирующие транскрипцию геномных сегментов вируса гриппа. В некоторых воплощениях используют промотор ДНК-зависимой РНК-полимеразы II (Pol II) цитомегаловируса (CMV). При желании, например, для регуляции зависимой от условий экспрессии, можно использовать другие промоторы, которые индуцируют транскрипцию РНК в определенных условиях, или в определенных тканях или клетках. Многочисленные промоторы вирусов и млекопитающих, например, человеческие промоторы, являются доступными, или их можно выделить в соответствии с конкретным предполагаемым применением. Например, альтернативные промоторы, полученные из геномов вирусов животных и человека, включают в себя промоторы аденовируса (такого как аденовирус 2), папилломавируса, вируса гепатита B, полиомавируса и вируса обезьян 40 (SV40), а также разных ретровирусов. Промоторы млекопитающих включают в себя, в числе многих других, промотор актина, промоторы иммуноглобулинов, промоторы белков теплового шока и т.п.

Разные воплощения настоящего изобретения могут включать в себя ряд разных векторных конструкций. Такие конструкции обычно и предпочтительно используют в системах плазмидной помощи для получения вирусов, используемых в производстве вакцин (таких как живые аттенуированные вакцины, убитые или инактивированные вакцины и др.). Так, данное изобретение включает в себя рекомбинантные молекулы ДНК, содержащие элементы, регулирующие транскрипцию, которые связываются с ДНК-зависимой РНК-полимеразой, функционально связанные с последовательностью ДНК, кодирующей молекулу РНК, где молекула РНК содержит специфический участок связывания РНК-зависимой РНК-полимеразы из отрицательной цепи РНК-вируса, функционально связанный с последовательностью РНК, содержащей обратную цепь, комплементарную мРНК, кодирующей последовательность отрицательной цепи РНК-вируса. Кроме того, данное изобретение включает в себя рекомбинантную молекулу ДНК, которая после транскрипции дает РНК-матрицу, которая содержит последовательность РНК, включающую в себя обратную последовательность, комплементарную мРНК, кодирующей последовательность отрицательной цепи РНК-вируса и терминальные последовательности вРНК. Изобретение также включает в себя рекомбинантную молекулу ДНК, которая после транскрипции дает реплицируемую РНК-матрицу, содержащую обратную последовательность, комплементарную мРНК, кодирующей последовательность отрицательной цепи РНК-вируса. В приведенном выше определении рекомбинантных молекул ДНК отрицательная цепь, как правило, относится к РНК-вирусу гриппа (такому как вирус гриппа A или B и др.). Кроме того, молекула РНК в таких воплощениях обычно представляет собой геномный сегмент вируса гриппа и РНК-матрица обычно представляет собой геномный сегмент вируса гриппа. В приведенном выше определении рекомбинантных молекул ДНК, как правило, РНК-матрица является реплицируемой, отрицательная цепь относится к РНК-вирусу гриппа, и РНК-матрица представляет собой геномный сегмент вируса гриппа. Так, сегменты нуклеиновых кислот вируса гриппа обычно содержат гены HA и/или NA (соответствующие нуклеотидные последовательности которых приведены, например, на фиг.1, или входят в состав штаммов, подобным штаммам, имеющим нуклеотидные последовательности, приведенные, например, на фиг.1.

Изобретение также охватывает способы получения молекулы РНК, включающие в себя транскрипцию рекомбинантной молекулы ДНК под действием ДНК-зависимой РНК-полимеразы, где молекула ДНК содержит элемент, регулирующий транскрипцию, который связывается с ДНК-зависимой РНК-полимеразой и находится в функциональной связи с последовательностью ДНК, кодирующей молекулу РНК, где молекула РНК содержит специфический участок связывания РНК-зависимой РНК-полимеразы отрицательной цепи РНК-вируса, функционально связанный с последовательностью РНК, содержащей обратную последовательность, комплементарную мРНК, кодирующей последовательность отрицательной цепи РНК-вируса. Изобретение также охватывает способ получения молекулы РНК, включающий в себя транскрипцию рекомбинантной молекулы ДНК под действием ДНК-зависимой РНК-полимеразы, где рекомбинантная молекула ДНК после транскрипции дает молекулу РНК, которая содержит последовательность РНК, содержащую обратную последовательность, комплементарную мРНК, кодирующей последовательность отрицательной цепи РНК-вируса и терминальные последовательности вРНК. Кроме того, изобретение охватывает способ получения молекулы РНК, включающий в себя транскрипцию рекомбинантной молекулы ДНК под действием ДНК-зависимой РНК-полимеразы, где рекомбинантная молекула ДНК после транскрипции дает реплицируемую молекулу РНК, содержащую обратную последовательность, комплементарную мРНК, кодирующей последовательность отрицательной цепи РНК-вируса. В приведенном выше описании способов, как правило, отрицательная цепь относится к РНК-вирусу гриппа, а молекула РНК представляет собой геномный сегмент вируса гриппа. В описанных способах в качестве ДНК-зависимой РНК-полимеразы предпочтительно используют pol I, pol II, полимеразу T7, полимеразу T3 или полимеразу Sp6. И, опять же, как указано на протяжении данного описания, сегменты нуклеиновой кислоты вируса гриппа обычно содержат гены HA и/или NA.

К другим способам данного изобретения относятся способы конструирования молекулы ДНК, включающие в себя транскрипцию под контролем элемента, который связывается с ДНК-зависимой РНК-полимеразой и находится в функциональной связи с последовательностью ДНК, которая кодирует молекулу РНК, где молекула РНК содержит специфический участок связывания РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса гриппа, функционально связанный с последовательностью РНК, содержащую обратную последовательность, комплементарную мРНК, кодирующую последовательность вируса гриппа, где последовательность ДНК содержит одну или несколько последовательностей, выбранных из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, или их фрагменты, или одну или несколько нуклеотидных последовательностей подобного штамма (например, штамма, подобного штаммам, имеющим последовательности, приведенные на фиг.1, и др.). Кроме того, данное изобретение предлагает способ конструирования молекулы ДНК, содержащей последовательность ДНК, которая после транскрипции дает РНК-матрицу, в состав которой входит последовательность РНК, содержащая обратную последовательность, комплементарную мРНК, кодирующую последовательность вируса гриппа и терминальные последовательности вРНК, где последовательность ДНК содержит одну или несколько последовательностей, выбранных из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25 или их фрагменты, или одну или несколько нуклеотидных последовательностей подобного штамма (например, штамма, подобного штаммам, имеющим последовательности, приведенные на фиг.1, и др.). В приведенном выше описании способов, как правило, РНК-матрица является реплицируемой. К другим способам данного изобретения относятся способы конструирования молекулы ДНК, содержащей последовательность ДНК, которая после транскрипции дает реплицируемую РНК-матрицу, содержащую обратную последовательность, комплементарную мРНК, кодирующей последовательность вируса гриппа. В описанных способах данного изобретения, как правило, молекула РНК представляет собой геномный сегмент вируса гриппа, а в качестве ДНК-зависимой РНК-полимеразы используют pol I, pol II, полимеразу T7, полимеразу T3 или полимеразу Sp6.

Для повышения уровня транскрипции в состав вектора необязательно включают энхансерную последовательность. Энхансеры обычно представляют собой короткие, например, размером 10-500 п.о., действующие в цис-положении элементы ДНК, которые функционируют в сочетании с промотором, повышая уровень транскрипции. Многие энхансерные последовательности были выделены из генов млекопитающих (таких как гены гемоглобина, эластазы, альбумина, альфа-фетопротеина и инсулина) и вирусов эукариотических клеток. Энхансер можно вставить в вектор по 5'- или 3'-концу гетерологичной кодирующей последовательности, однако обычно его вставляют в 5'-участок по направлению к промотору. Как правило, промотор и, при необходимости, дополнительные последовательности, повышающие уровень транскрипции, выбирают так, чтобы оптимизировать экспрессию в клетках-хозяевах, в которые вводят гетерологичную ДНК (Scharf et al. (1994) Heat stress promotors and transcription factors, Results Probl Cell Differ 20:125-62; Kriegler et al. (1990) Assembly of enhancers, promotors, and splice signals to control expression of transferred genes, Methods in Enzymol 185:512-27). Необязательно ампликон может дополнительно содержать участок связывания рибосомы, или участок внутренней посадки рибосомы (IRES), обеспечивающий инициацию трансляции.

Векторы данного изобретения также предпочтительно содержат последовательности, необходимые для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК, такие как участок полиаденилирования или терминирующая последовательность. Такие последовательности обычно находятся на 5'-конце, иногда на 3'-конце нетранслируемых участков эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. В одном воплощении последовательности сигнала полиаденилирования SV40 могут обеспечивать реверсивный участок полиаденилирования, который отделяет транскрипцию (+)-цепи молекулы мРНК от инициируемой под действием промотора PolI репликации (-)-цепи вирусного генома.

Кроме того, как описано выше, помимо перечисленных ранее генов векторы экспрессии необязательно содержат один или несколько генов селектируемых маркеров, которые отвечают за фенотипический признак, используемый для селекции трансформированных клеток-хозяев, например, для селекции в культуре эукариотических клеток можно использовать такие маркеры, как гены дигидрофолатредуктазы или устойчивости к неомицину.

Вектор, содержащий подходящую нуклеотидную последовательность, как описано выше, а также подходящую промоторную или регулирующую последовательность, можно использовать для трансформации клетки-хозяина, способной обеспечить экспрессию белка. Хотя векторы данного изобретения могут реплицироваться в бактериальных клетках, чаще всего с целью экспрессии их вводят в клетки млекопитающих, такие как клетки Vero, клетки BHK, клетки MDCK, клетки 293, клетки COS и т.п.

Как описано в данном документе, последовательности HA и NA настоящего изобретения в разных воплощениях могут входить в состав плазмид, участвующих в рекомбинации по механизму плазмидной помощи. См., например, заявку США № 60/420708, поданную 23 октября 2002 г., заявку США № 10/423828, поданную 25 апреля 2003 г., и заявку США № 60/574117, поданную 24 мая 2004 г., имеющие общий заголовок "Multi-Plasmid System for the Production Influenza Virus"; Hoffmann, E., 2000, PNAS, 97(11):6108-6113; опубликованная патентная заявка США № 20020164770, Hoffmann; и патент США № 6544785, выданный 8 апреля 2003 г., Palese, et al. Полученные реассортантные штаммы могут содержать гены HA и NA в сочетании с 6 другими генами вируса гриппа донорного штамма A/Ann Arbor/6/60, донорного штамма B/Ann Arbor/1/66 (и/или производных и модифицированных штаммов), донорного штамма A/Puerto Rico/8/34 и др.

Дополнительные элементы экспрессии

Чаще всего геномный сегмент, кодирующий белок HA и/или NA вируса гриппа, включает в себя несколько дополнительных последовательностей, необходимых для его экспрессии, включающей в себя трансляцию в функциональный вирусный белок. В других случаях используют миниген, или другую искусственную конструкцию, кодирующую вирусные белки, такие как белок HA и/или NA. При этом опять же, зачастую желательно использовать специфические сигналы инициации, которые способствуют эффективной трансляции гетерологичной кодирующей последовательности. Указанные сигналы могут включать в себя, например, кодон инициации ATG и примыкающие последовательности. Чтобы гарантировать трансляцию целой вставки, кодон инициации вставляют в правильную рамку считывания вирусного белка. Экзогенные элементы, регулирующие транскрипцию, и кодоны инициации могут иметь разное происхождение и могут являться как природными, так и синтетическими. Эффективность экспрессии можно повысить путем включения энхансеров, подходящих для используемой клеточной системы.

При желании, полинуклеотидные последовательности, кодирующие дополнительные элементы экспрессии, такие как сигнальные последовательности, последовательности секреции или локализации и т.п., можно вставить в вектор, обычно в одну рамку считывания с представляющей интерес полинуклеотидной последовательностью, например, чтобы обеспечить экспрессию полипептида в желательном клеточном компартменте, мембране или органелле, или чтобы направить секрецию полипептида в периплазматическое пространство или в культуральную среду. Такие последовательности известны специалистам в данной области и включают в себя лидерные секреторные пептиды, последовательности, направляющие в органеллы (например, последовательности ядерной локализации, сигналы удерживания в ER, последовательности митохондриальной транспортировки), последовательности мембранной локализации/мембранного якоря (например, последовательности, останавливающие перенос, якорные GPI последовательности) и т.п.

Если желательно провести трансляцию полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью данного изобретения, дополнительные специфические сигналы инициации трансляции могут улучшить эффективность трансляции. Указанные сигналы могут включать в себя, например, кодон инициации ATG и примыкающие последовательности, участок IRES и др. В случае, например, полноразмерных молекул кДНК или хромосомальных сегментов, включающих в себя кодирующую последовательность, содержащую, например, полинуклеотидную последовательность данного изобретения (например, из приведенных здесь последовательностей), кодон инициации трансляции и ассоциированные с ним элементы последовательности вставляют в подходящий вектор экспрессии одновременно с представляющей интерес полинуклеотидной последовательностью. В таких случаях дополнительные сигналы, регулирующие трансляцию, обычно не требуются. Однако если вектор содержит только последовательность, кодирующую полипептид, или ее фрагмент, для экспрессии целевой последовательности часто требуются экзогенные сигналы, регулирующие трансляцию, в том числе, например, кодон инициации ATG. Кодон инициации помещают в правильную рамку считывания, чтобы гарантировать транскрипцию представляющей интерес полинуклеотидной последовательности. Экзогенные элементы, регулирующие транскрипцию, и кодоны инициации могут иметь разное происхождение и могут являться как природными, так и синтетическими. Эффективность экспрессии можно повысить путем включения энхансеров, подходящих для используемой клеточной системы (см., например, Scharf D. et al. (1994), Results Probl Cell Differ 20:125-62; Bittner et al. (1987), Methods in Enzymol. 153:516-544).

Получение рекомбинантного вируса

Отрицательные цепи РНК-вирусов можно получить и выделить с помощью рекомбинантных способов обратной генетики (USPN 5166057, Palese et al.). Такие способы, которые изначально применялись для получения рекомбинантных геномов вируса гриппа (Luytjes et al. (1989), Cell 59:1107-1113; Enami et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567), можно успешно использовать в применении к широкому ряду сегментированных и несегментированных отрицательных цепей РНК-вирусов, таких как вирус бешенства (Schnell et al. (1994), EMBO J. 13:4195-4203); VSV (Lawson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481); вирус кори (Radecke et al.(1995), EMBO J. 14:5773-5784); вирус чумы крупного рогатого скота (Baron & Barrett (1997), J. Virol. 71:1265-1271); человеческий паравирус гриппа (Hoffman & Banerjee (1997) J. Virol. 71:3272-3277; Dubin et al. (1997), Virology 235:323-332); SV5 (He et al. (1997), Virology 237:249-260); вирус собачьей чумы (Gassen et al. (2000), J. Virol. 74:10737-44); и вирус Сендай (Park et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5537-5541; Kato et al. (1996), Genes to Cells 1:569-579). Специалистам в данной области хорошо знакомы указанные и подобные им способы получения вируса гриппа, содержащего последовательности HA и NA данного изобретения. Рекомбинантные вирусы гриппа, полученные с помощью таких способов, также являются признаком данного изобретения, как и рекомбинантный вирус гриппа, содержащий одну или несколько нуклеиновых кислот и/или полипептидов данного изобретения. Как известно специалистам в данной области, вирусы гриппа в целом (а также вирусы гриппа данного изобретения) представляют собой РНК-вирусы с отрицательными цепями. Следовательно, если настоящее изобретение описывает вирусы гриппа, как содержащие, например, последовательности, приведенные на фиг.1, и др., следует понимать, что подразумеваются, как правило, соответствующие отрицательноцепочечные РНК-версии указанных последовательностей. Нуклеотидные последовательности, приведенные на фиг.1, включают в себя ДНК-версии (например, кодирующие, смысловые и др.) генов (наряду с некоторыми нетранслируемыми участками нуклеотидных последовательностей). Специалисты в данной области могут легко осуществить взаимопревращение последовательностей РНК и ДНК (например, путем изменения U на T и т.п.), а также комплементарных нуклеотидных последовательностей (либо РНК, либо ДНК) и др. Так, например, специалисты в данной области могут легко конвертировать нуклеотидную последовательность (например, приведенную на фиг.1, такую как SEQ ID NO:1) в соответствующую аминокислотную последовательность, или в соответствующую комплементарную последовательность (либо РНК, либо ДНК) и др. Кроме того, очевидно, что, если такие последовательности HA и/или NA входят в состав ДНК-векторов, таких как плазмиды и др., как правило, подразумеваются ДНК-версии последовательностей. Опять же, нуклеиновые кислоты данного изобретения включают в себя прямые последовательности, приведенные в списках последовательностей данного описания, а также комплементарные им последовательности (как РНК, так и ДНК), двухцепочечные формы последовательностей, приведенных в списках последовательностей, соответствующие РНК-формы последовательностей, приведенных в списках последовательностей (такие как РНК, комплементарная прямой последовательности из списка последовательностей, или РНК-версия последовательности из списка последовательностей, например, имеющая такую же ориентацию, но содержащая РНК, полученная в результате замены U на T и др.). Таким образом, в зависимости от контекста настоящего описания, нуклеотидные последовательности данного изобретения могут содержать РНК-версии последовательностей, выбранных из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25 (с положительным или отрицательным направлением цепей).

Клеточные культуры и экспрессирующие хозяева

Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, в которые введены векторы данного изобретения (или которые трансдуцированы, трансформированы или трансфицированы векторами данного изобретения), и к получению полипептидов данного изобретения с помощью рекомбинантных методов. Клетки-хозяева подвергают рекомбинации (т.е. трансдукции, трансформации или трансфекции вектором, таким как вектор экспрессии данного изобретения. Как описано выше, вектор может находиться в виде плазмиды, вирусной частицы, фага и др. Примеры подходящих экспрессирующих хозяев включают в себя: клетки бактерий, таких как E. coli, Streptomyces и Salmonella typhimurium; клетки грибков, таких как Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris и Neurospora crassa; или клетки насекомых, такие как Drosophila и Spodoptera frugiperda.

Чаще всего для получения молекул HA и NA данного изобретения используют клетки млекопитающих. Клетки-хозяева, подходящие для репликации вируса гриппа (например, содержащего описанные здесь последовательности HA и/или NA), включают в себя, например, клетки Vero, клетки BHK, клетки MDCK, клетки 293 и клетки COS, в том числе клетки 293T, клетки COS7 и т.п. Чтобы повысить эффективность репликации, как правило, используют совместные культуры, содержащие две из вышеперечисленных клеточных линий, например, клетки MDCK и клетки 293T или COS, в соотношении, например, 1:1. Как правило, клетки культивируют в стандартной коммерческой питательной среде, такой как модифицированная по Дульбекко среда Игла, содержащая сыворотку (например, 10% фетальной бычьей сыворотки), или бессывороточная среда, при контролируемой влажности и концентрации CO₂ , подходящей для поддержания нейтрального pH буфера (например, pH от 7,0 до 7,2). Необязательно среда содержит антибиотики для предотвращения роста бактерий, такие как пенициллин, стрептомицин и др., и/или дополнительные питательные вещества, такие как L-глутамин, пируват натрия, неэссенциальные аминокислоты, другие добавки, обеспечивающие благоприятные характеристики роста, например, трипсин, -меркаптоэтанол и т.п.

Рекомбинантные клетки-хозяева можно культивировать в традиционной питательной среде, модифицированной так, чтобы обеспечить активацию промоторов, выбор трансформантов или амплификацию вставленной полинуклеотидной последовательности, например, на протяжении процесса получения вирусов. Условия культивирования, такие как температура, pH и т.п., обычно представляют собой условия, используемые ранее для конкретных клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, они известны специалистам в данной области и описаны в цитирующихся здесь ссылках, таких как, например, Freshney (1994) Culture of Animal cells, a Manual of Basic Technique, 3^rd edition, Wiley-Liss, New York, а также в ссылках, цитирующихся в указанных документах. Другие полезные ссылки включают в себя, например, Paul (1975) Cell and Tissue Culture, 5th ed., Livingston, Edinburgh; Adams (1980) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists, Work and Burdon (eds.) Elsevier, Amsterdam. Другие детали, касающиеся способов культивирования тканей, и представляющие особый интерес для получения вирусов гриппа in vitro, описаны, например, в Merten et al. (1996) Production Influenza Virus in cell cultures for vaccine preparation, in Cohen and Shafferman (eds.) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines, которые включены в данное описание во всей полноте для любых целей. Кроме того, вариации таких способов с целью адаптации к настоящему изобретению можно легко осуществить посредством рутинного экспериментирования, как известно специалистам в данной области.

Клетки для получения вируса гриппа (например, содержащего последовательности HA и/или NA данного изобретения) можно культивировать в содержащей сыворотку или бессывороточной среде. В некоторых случаях, например, для получения очищенных вирусов, как правило, желательно выращивать клетки-хозяева в бессывороточных условиях. Клетки можно культивировать в мелком масштабе, например, в объеме среды менее 25 мл, в пробирках или колбах для культивирования, или в больших колбах при встряхивании, во вращающихся бутылях, или на гранулах микроносителя (такого как гранулы микроносителя DEAE-Dextran, например, Dormacell, Pfeifer & Langen; Superbead, Flow Laboratories; гранулы сополимера стирола и триметиламина, например, Hillex, SoloHill, Ann Arbor) в колбах, бутылях или реакторных культурах. Гранулы микроносителя представляют собой маленькие шарики (с диаметром в интервале 100-200 микрон), которые имеют большую площадь поверхности для роста прилипающих клеток на единицу объема клеточной культуры. Например, один литр среды может содержать более 20 миллионов гранул микроносителя, предоставляющих поверхность роста более 8000 квадратных сантиметров. В случае коммерческого получения вирусов, например, для производства вакцин, зачастую желательно культивировать клетки в биореакторе или ферментере. Доступные биореакторы имеют объем от менее 1 литра до более 100 литров и включают в себя, например, биореактор Cyto3 (Osmonics, Minnetonka, MN); биореакторы NBS (New Brunswick Scientific, Edison, NJ); лабораторные и коммерческие биореакторы от B. Braun Biotech International (B. Braun Biotech, Melsungen, Germany).

Независимо от объема культуры, во многих желательных аспектах настоящего изобретения важно поддерживать культуры при подходящей температуре, чтобы обеспечить эффективное извлечение рекомбинантного и/или реассортантного вируса гриппа с использованием температурно-зависимых мультиплазмидных систем (см., например, заявку США № 60/420708, поданную 23 октября 2002 г., заявку США № 10/423828, поданную 25 апреля 2003 г., и заявку США № 60/574117, поданную 24 мая 2004 г., имеющие общий заголовок "Multi-Plasmid System for the Production Influenza Virus"), нагреванием растворов вируса для фильтрации и др. Чтобы поддерживать температуру на нужном уровне в течение соответствующего периода (например, в течение репликации вируса и др.), как правило, используют регулятор, такой как термостат, или другое устройство для измерения и поддержания температуры в системе для культивирования клеток и/или в другом растворе.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения (например, в которых реассортантные вирусы получают из сегментов на векторах) векторы, содержащие геномные сегменты вируса гриппа, вводят (например, трансфицируют) в клетки-хозяева с помощью способов, широко используемых в данной области для введения гетерологичных нуклеиновых кислот в эукариотические клетки, таких как, например, совместное осаждение фосфатом кальция, электропорация, микроинъекция, липофекция и трансфекция с использованием полиаминовых реагентов. Чтобы получить реассортантные вирусы и др., например, векторы, такие как плазмиды, можно трансфицировать в клетки-хозяева, такие как клетки COS, клетки 293T или сочетания клеток COS или 293T и клеток MDCK, с использованием полиаминового реагента для трансфекции TransIT-LT1 (Minis) в соответствии с инструкциями производителя. Так, в одном примере приблизительно 1 мкг каждого вектора вводят в популяцию клеток-хозяев, используя примерно 2 мкл TransIT-LT1, разбавленного 160 мкл среды, предпочтительно бессывороточной среды, в общем объеме 200 мкл. Смеси ДНК:реагент для трансфекции инкубируют при комнатной температуре в течение 45 минут и затем добавляют 800 мкл среды. Смесь для трансфекции добавляют к клеткам-хозяевам, после чего клетки культивируют, используя способы, хорошо известные специалистам в данной области. Соответственно, чтобы получить рекомбинантные или реассортантные вирусы в клеточной культуре, векторы, содержащие каждый из 8 геномных сегментов (PB2, PB1, PA, NP, M, NS, HA и NA, например, данного изобретения), смешивают примерно с 20 мкл TransIT-LT1 и трансфицируют в клетки-хозяева. Необязательно, содержащую сыворотку среду заменяют перед трансфекцией бессывороточной средой, такой как Opti-MEM I, и инкубируют в течение 4-6 часов.

Альтернативно, введение таких векторов, содержащих геномные сегменты вируса гриппа, в клетки-хозяева можно проводить с использованием электропорации. Например, плазмидные векторы, содержащие вирус гриппа A или вирус гриппа B, предпочтительно вводят в клетки Vero методом электропорации в соответствии с описанным ниже способом. Коротко говоря, примерно 5×10⁶ клеток Vero, например, выращенных в модифицированной среде Игла (MEM), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), ресуспендируют в 0,4 мл OptiMEM и помещают в кювету для электропорации. Двадцать микрограмм ДНК в объеме до 25 мкл добавляют к клеткам в кювете и затем осторожно перемешивают путем постукивания. Электропорацию проводят в соответствии с инструкциями производителя (например, с использованием импульсного генератора BioRad Gene II, соединенного с Capacitance Extender Plus) при 300 Вольт, 950 микроФарад с временной константой в диапазоне 28-33 мсек. Клетки снова перемешивают путем осторожного постукивания и примерно через 1-2 минуты после электропорации в кювету добавляют 0,7 мл MEM, содержащей 10% FBS. Затем клетки переносят в две лунки стандартной 6-луночной чашки для культивирования тканей, содержащие 2 мл MEM, 10% FBS. Кювету промывают, чтобы извлечь оставшиеся клетки и смывочную суспензию делят между двумя лунками. Конечный объем составляет примерно 3,5 мл. Затем клетки инкубируют в условиях, подходящих для роста вируса, например, приблизительно при 33°C в случае адаптированных к пониженной температуре штаммов.

В клетках-хозяевах млекопитающих можно использовать ряд систем экспрессии, таких как вирусные системы. При использовании аденовируса в качестве вектора экспрессии кодирующую последовательность необязательно лигируют в транскрипционный/трансляционный комплекс аденовируса, содержащий поздний промотор и тройную лидерную последовательность. Вставка неэссенциального участка E1 или E3 вирусного генома приводит к получению жизнеспособного вируса, обеспечивающего экспрессию представляющих интерес полипептидов в инфицированных клетках-хозяевах (Logan and Shenk (1984), Proc Natl. Acad. Sci 81:3655-3659). Кроме того, для повышения уровня экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих можно использовать энхансеры транскрипции, такие как энхансер вируса саркомы Рауса (RSV).

Штамм клеток-хозяев необязательно выбирают по способности модулировать экспрессию вставленной последовательности или осуществлять желательные модификации экспрессируемого белка. Такие модификации белка включают в себя ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидирование и ацилирование. Посттрансляционный процессинг, который заключается в расщеплении формы-предшественника с образованием зрелой формы белка, иногда имеет важное значение для правильной вставки, укладки и/или функции. Кроме того, важное значение имеет надлежащее расположение в клетке-хозяине (например, на поверхности клетки). Разные клетки-хозяева, такие как COS, CHO, BHK, MDCK, 293, 293T, COS7 и др., имеют специфический клеточный аппарат и характерные механизмы, обеспечивающие такую посттрансляционную активность, и их правильный выбор гарантирует корректные модификацию и процессинг введенного чужеродного белка.

Для длительной высокоэффективной продукции рекомбинантных белков, кодируемых полинуклеотидами данного изобретения, или содержащих субпоследовательности, кодируемые полинуклеотидами данного изобретения, необязательно используют системы стабильной экспрессии. Например, клеточные линии, стабильно экспрессирующие полипептид данного изобретения, трансфицируют векторами экспрессии, которые содержат вирусные точки начала репликации или эндогенные элементы экспрессии и ген селектируемого маркера. Например, после введения вектора клеткам дают расти в течение 1-2 дней в обогащенной среде, которую затем меняют на селективную среду. Значение селектируемого маркера заключается в придании устойчивости к фактору селекции, присутствие данного маркера позволяет расти клеткам, успешно экспрессирующим введенные последовательности, и облегчает выделение таких клеток. Таким образом, устойчивые кластеры стабильно трансформированных клеток, например, полученные из клеток одного типа, можно подвергнуть пролиферации с использованием методов культивирования тканей, подходящих для данного типа клеток.

Клетки-хозяева, трансформированные нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид данного изобретения, необязательно культивируют в условиях, подходящих для экспрессии и выделения кодируемого белка из клеточной культуры. Клетки, экспрессирующие указанный белок, можно подвергнуть сортингу, выделению и/или очистке. Белок, или его фрагмент, продуцируемый рекомбинантной клеткой, может представлять собой секретируемый, мембраносвязанный или внутриклеточный белок, в зависимости от его последовательности (например, в зависимости от состава гибридных белков, содержащих сигнал удержания в мембране и т.п.) и/или используемого вектора.

Продукты экспрессии, соответствующие нуклеиновым кислотам данного изобретения, можно получить в клетках, отличных от клеток животных, таких как клетки растений, дрожжей, грибков, бактерий и т.п. Помимо приведенных ниже публикаций Sambrook, Berger и Ausubel, детали, касающиеся культивирования клеток, можно найти в Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) и Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.

В бактериальных системах можно использовать ряд векторов экспрессии, которые выбирают в зависимости от предполагаемого применения продукта экспрессии. Например, если требуются большие количества полипептида или его фрагментов, необходимые для получения антител, предпочтительно использовать векторы, обеспечивающие высокий уровень экспрессии гибридных белков, которые можно легко очистить. Такие векторы включают в себя, без ограничения, многофункциональные векторы клонирования и экспрессии E. coli, такие как BLUESCRIPT (Stratagene), который содержит представляющую интерес кодирующую последовательность, например, последовательность, описанную в данном документе, и др., в одной рамке считывания с последовательностью, инициирующей аминоконцевую трансляцию, содержащей метионин и последующие 7 остатков бета-галактозидазы, и продуцирует гибридный белок с каталитической активностью бета-галактозидазы; векторы pIN (Van Heeke & Schuster (1989) J Biol. Chem. 264:5503-5509); векторы pET (Novagen, Madison WI); и т.п. Подобным образом, для получения целевых продуктов экспрессии в дрожжах Saccharomyces cerevisiae можно использовать ряд векторов, содержащих конститутивные или индуцируемые промоторы, такие как промоторы альфа-фактора, алкогольоксидазы и PGH. Обзоры опубликованы Ausubel, ниже, и Grant et al., (1987); Methods in Enzymology 153:516-544.

Гибридизация нуклеиновых кислот

Сравнительную гибридизацию можно использовать для идентификации нуклеиновых кислот данного изобретения, в том числе консервативных вариаций нуклеиновых кислот данного изобретения. Указанный способ сравнительной гибридизации является предпочтительным способом распознавания нуклеиновых кислот данного изобретения. Кроме того, нуклеиновые кислоты-мишени, которые гибридизуются с нуклеиновыми кислотами, имеющими такие последовательности, как, например, SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, в условиях высокой, сверхвысокой и крайне высокой жесткости, являются признаками данного изобретения. Примеры таких нуклеиновых кислот включают в себя нуклеиновые кислоты, содержащие одну или несколько молчащих или консервативных нуклеотидных замен по сравнению с исходной нуклеотидной последовательностью.

Говорят, что тестируемая нуклеиновая кислота-мишень специфически гибридизуется с нуклеотидным зондом, если степень ее гибридизации составляет, по меньшей мере, половину от степени гибридизации зонда с идеально совпадающей комплементарной мишенью, т.е., если отношение сигнала к шуму составляет, по меньшей мере, половину от значения, наблюдающегося при гибридизации зонда с мишенью в условиях, в которых идеально совпадающий зонд связывается с идеально совпадающей комплементарной мишенью с отношением сигнала к шуму, превышающим, по меньшей мере, примерно в 5-10 раз значение, наблюдающееся при гибридизации с любой из несовпадающих нуклеиновых кислот-мишеней.

Нуклеиновые кислоты "гибридизуются", если происходит их соединение, как правило, в растворе. Гибридизация нуклеиновых кислот обусловлена рядом хорошо изученных физико-химических факторов, таких как образование водородных связей, вытеснение растворителя, межплоскостное взаимодействие оснований и т.п. В данной области известно много способов гибридизации нуклеиновых кислот. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," (Elsevier, New York), а также в Ausubel, Sambrook, и Berger and Kimmel, приведенных ниже. Hames and Higgins (1995) Gene Probes 1 IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England, (Hames and Higgins 1) и Hames and Higgins (1995) Gene Probes 2 IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England (Hames and Higgins 2) подробно описывают синтез, мечение, детекцию и количественное определение ДНК и РНК, в том числе олигонуклеотидов.

Примером жестких условий гибридизации комплементарных нуклеиновых кислот, содержащих более 100 комплементарных остатков, на фильтре в саузерн- или нозерн-блоттинге является проведение гибридизации с использованием 50% раствора формалина, содержащего 1 мг гепарина, при 42°C в течение ночи. Примером жестких условий промывания является промывание 0,2x SSC при 65°C в течение 15 минут (описание буфера SSC можно найти в Sambrook, ниже). Часто перед промыванием в условиях высокой жесткости проводят промывание в условиях низкой жесткости, чтобы удалить фоновый сигнал зонда. Примером промывания в условиях низкой жесткости является промывание 2x SSC при 40°C в течение 15 минут. Как правило, отношение сигнала к шуму, в 5 раз (или больше) превышающее отношение сигнала к шуму, наблюдаемое для неродственного зонда в отдельных анализах гибридизации, свидетельствует о детекции специфической гибридизации.

После гибридизации негибридизованные нуклеиновые кислоты можно удалить путем серии промываний, жесткость которых можно варьировать в зависимости от желаемых результатов. Промывание в условиях низкой жесткости (например, с использованием повышенной концентрации солей и пониженной температуры) повышает чувствительность, но может приводить к генерированию сигналов неспецифической гибридизации и высокому уровню фоновых сигналов. Условия повышенной жесткости (например, применение более низкой концентрации солей и более высокой температуры, приближающейся к Т_пл) снижают уровень фонового сигнала, оставляя в основном специфический сигнал. См., также Rapley, R. and Walker, J.M. eds., Molecular Biomethods Handbook (Humana Press, Inc. 1998).

"Жесткие условия промывания при гибридизации" применительно к экспериментам с использованием гибридизации нуклеиновых кислот, таким как саузерн- и нозерн-гибридизации, являются последовательность-зависимыми и варьируют в зависимости от параметров окружающей среды. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в Tijssen (1993), выше, и в Hames and Higgins, 1 и 2. Жесткие условия гибридизации и промывания можно легко установить эмпирически для любой тестируемой нуклеиновой кислоты. Например, чтобы определить условия высокой жесткости для гибридизации и промывания, жесткость условий гибридизации и промывания постепенно повышают (например, путем увеличения температуры, уменьшения концентрации солей, повышения концентрации детергента и/или увеличения концентрации органических растворителей, таких как формалин, в растворах, используемых для гибридизации или промывания), до достижения выбранного набора условий. Например, жесткость условий гибридизации и промывания постепенно увеличивают, пока зонд не начнет связываться с идеально совпадающей комплементарной мишенью с отношением сигнала к шуму, по меньшей мере, в 5 раз превышающим значение, наблюдаемое при гибридизации зонда с несовпадающей мишенью.

Как правило, отношение сигнала к шуму, по меньшей мере, в 2 раза (или больше, например, по меньшей мере, в 5, 10, 20, 50, 100 или более раз) превышающее значение, наблюдаемое для неродственного зонда в конкретном анализе гибридизации, свидетельствует о детекции специфической гибридизации. Детекция, по меньшей мере, жесткой гибридизации двух последовательностей в применении к настоящему изобретению свидетельствует об относительно высокой степени структурного подобия, например, нуклеиновым кислотам настоящего изобретения, приведенным в списке последовательностей данного описания.

"Очень жесткие" условия соответствуют температуре плавления (T_пл) конкретного зонда. T_пл представляет собой температуру (при определенных значениях ионной силы и pH), при которой 50% тестируемых последовательностей гибридизуется с идеально совпадающим зондом. В целях настоящего изобретения, как правило, условия "высокой жесткости" для гибридизации и промывания включают в себя температуру примерно на 5°C ниже, чем T_пл конкретной последовательности при определенных значениях ионной силы и pH (как указано ниже, условия высокой жесткости также могут определяться в сравнительных терминах). Последовательности-мишени, которые являются близкородственными или идентичными представляющей интерес нуклеотидной последовательности (например, "зонду") можно идентифицировать в жестких или очень жестких условиях. Условия более низкой жесткости подходят для последовательностей с меньшей степенью комплементарности.

Условия "очень высокой жесткости" для гибридизации и промывания определяют путем повышения жесткости условий гибридизации и промывания до достижения отношения сигнала к шуму при связывании зонда с идеально совпадающей комплементарной нуклеиновой кислотой-мишенью, которое, по меньшей мере, в 10 раз превышает значение, наблюдаемое при гибридизации с любыми несовпадающими нуклеиновыми кислотами. Считается, что нуклеиновая кислота-мишень, которая гибридизуется с зондом в таких условиях с отношением сигнала к шуму, составляющим, по меньшей мере, половину от значения, наблюдающегося при гибридизации идеально совпадающей комплементарной нуклеиновой кислоты-мишени, связывается с зондом в условиях очень высокой жесткости.

При определении жестких или очень жестких условий гибридизации (или даже более жестких условий гибридизации) и промывания, жесткость условий гибридизации и промывания постепенно повышают (например, путем увеличения температуры, уменьшения концентрации солей, повышения концентрации детергента и/или увеличения концентрации органических растворителей, таких как формалин, в растворах, используемых для гибридизации или промывания), до достижения выбранного набора условий. Например, жесткость условий гибридизации и промывания постепенно увеличивают, пока зонд, содержащий одну или несколько полинуклеотидных последовательностей данного изобретения, таких как последовательности или уникальные субпоследовательности, выбранные из приведенных в данном описании и/или комплементарных им полинуклеотидных последовательностей, не начнет связываться с идеально совпадающей комплементарной мишенью (опять же, представляющей собой нуклеиновую кислоту, содержащую одну или несколько нуклеотидных последовательностей или субпоследовательностей, выбранных из приведенных в данном описании и/или комплементарных им полинуклеотидных последовательностей), с отношением сигнала к шуму, по меньшей мере, в 2 раза (и, необязательно, в 5, 10, 100 или более раз) превышающим значение, наблюдаемое при гибридизации зонда с несовпадающей мишенью (такой как полинуклеотидная последовательность, содержащая одну или несколько последовательностей или субпоследовательностей, выбранных из известных последовательностей вирусов гриппа, присутствующих в базах данных общего пользования, таких как GenBank, во время запроса, и/или комплементарных им полинуклеотидных последовательностей), если это желательно.

С использованием полинуклеотидов данного изобретения, или их субпоследовательностей, можно получить новые нуклеиновые кислоты-мишени; такие нуклеиновые кислоты-мишени также являются признаком данного изобретения. Например, такие нуклеиновые кислоты-мишени включают в себя последовательности, которые гибридизуются в жестких условиях с уникальным олигонуклеотидным зондом, соответствующим одному из полинуклеотидов данного изобретения.

Подобным образом, можно установить еще более высокие уровни жесткости путем постепенного повышения жесткости условий гибридизации и/или промывания в соответствующем анализе гибридизации. Например, жесткость условий гибридизации и/или промывания можно увеличивать до тех пор, пока отношение сигнала к шуму при связывании зонда с идеально совпадающей комплементарной нуклеиновой кислотой-мишенью не превысит, по меньшей мере, в 10, 20, 50, 100, 500 или более раз значение, наблюдаемое при гибридизации с любыми несовпадающими нуклеиновыми кислотами-мишенями. Конкретный сигнал зависит от метки, используемой в соответствующем анализе, такой как флуоресцентная метка, колориметрическая метка, радиоактивная метка и т.п. Считается, что нуклеиновая кислота-мишень, которая гибридизуется с зондом в таких условиях с отношением сигнала к шуму, составляющим, по меньшей мере, половину от значения, наблюдающегося при гибридизации идеально совпадающей комплементарной нуклеиновой кислоты-мишени, связывается с зондом в условиях крайне высокой жесткости.

Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизуются друг с другом в жестких условиях, все же считаются практически идентичными, если они кодируют практически идентичные полипептиды. Это может происходить, например, в том случае, если копия нуклеиновой кислоты создается с использованием максимальной вырожденности кодонов, допускаемой генетическим кодом.

Клонирование, мутагенез и экспрессия представляющих интерес биомолекул

Общие руководства, в которых описаны методы молекулярной биологии, используемые в настоящем изобретении, такие как клонирование, мутагенез, культивирование клеток и т.п., включают в себя Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2000 ("Sambrook") и Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, совместное предприятие Greene Publishing Associates, Inc. и John Wiley & Sons, Inc., (возобновленное в течение 2002) ("Ausubel")). В указанных руководствах описаны способы мутагенеза, применение векторов, промоторов, а также многие другие относящиеся к данному вопросу предметы, связанные, например, с получением молекул HA и/или NA и др.

Разные типы мутагенеза необязательно используют в настоящем изобретении, например, для получения и/или выделения, например, новых или недавно выделенных молекул HA и/или NA, и/или для дополнительной модификации/изменения полипептидов (например, молекул HA и NA) данного изобретения. Указанные типы мутагенеза включают в себя, без ограничения, сайт-направленный мутагенез, случайный мутагенез, гомологичную рекомбинацию (перетасовку ДНК), мутагенез с использованием урацил-содержащих матриц, олигонуклеотид-направленный мутагенез, мутагенез путем модификации ДНК под действием фосфоротиоата, мутагенез с использованием двойной спирали ДНК, содержащей пробелы, и т.п. Другие подходящие способы включают в себя репарацию ошибочно спаренных оснований, мутагенез с использованием штаммов-хозяев с дефицитом репарации, системы рестрикции-селекции и рестрикции-очистки, делеционный мутагенез, мутагенез путем полного синтеза гена, репарация двухнитевого разрыва и т.п. Мутагенез, например, включающий в себя химерные конструкции, также входит в объем настоящего изобретения. В одном воплощении мутагенез можно проводить с использованием известной информации по природной молекуле, или измененной или мутантной природной молекуле, включающей в себя информацию о последовательности, сравнении последовательностей, физических свойствах, кристаллической структуре и т.п.

Указанные способы описаны в упомянутых выше руководствах и примерах, приведенных в данном документе, а также в следующих публикациях (и в цитирующихся в них ссылках): Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001); Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem 254(2):157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol 57:369-374 (1996); I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res 23, 3067-8 (1995); W. P. С. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl Acids Res 16:6987-6999 (1988); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl Acids Res 16: 7207 (1988); Sakamar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl Acids Res 14:6361-6372 (1988); Sayers et al., Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl Acids Res 16:791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl Acids Res 16:803-814; Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors. Methods in Enzymol 154:382-403 (1987); Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol 154:350-367 (1987); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J, eds., Springer Verlag, Berlin)) (1987); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem J 237:1-7 (1986); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl Acids Res 14:5115 (1986); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 83:7177-7181 (1986); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl Acids Res 14:9679-9698 (1986); Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil Trans R Soc Lond A 317:415-423 (1986); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201(1985); Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl Acids Res 13:4431-4443 (1985); Grundström et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, Nucl Acids Res 13:3305-3316 (1985); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:488-492 (1985); Smith, In vitro mutagenesis, Ann Rev Genet 19:423-462(1985); Taylor et al., The use of phosphorothioate-modifie dDNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl Acids Res 13:8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl Acids Res 13:8765-8787 (1985); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl Acids Res 12:9441-9456 (1984); Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887 (1984); Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223:1299-1301 (1984); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol 100:468-500 (1983); и Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucl Acids Res 10:6487-6500 (1982). Дополнительные детали по многим из вышеуказанных способов можно найти в Methods in Enzymol, Volume 154, где также описаны контроли, которые можно использовать для поиска неисправностей при проведении разных типов мутагенеза, выделения генов, экспрессии и других способов.

Олигонуклеотиды, например, используемые в мутагенезе настоящего изобретения, таком как мутации библиотек молекул HA и/или NA данного изобретения, или изменения таких библиотек, обычно синтезируют химически с помощью твердофазного способа, проводимого с использованием триэфира фосфорамидита, описанного Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts 22(20):1859-1862, (1981), например, с применением автоматического синтезатора, как описано в Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res, 12:6159-6168 (1984).

Кроме того, практически любая нуклеиновая кислота может быть изготовлена по индивидуальному или стандартному заказу рядом коммерческих фирм, включающих в себя The Midland Certified Reagent Company (mcrc@oligos.com), The Great American Gene Company (www.genco.com), ExpressGen Inc. (www.expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) и многие другие. Пептиды и антитела также могут быть получены по индивидуальному заказу из ряда источников, включающих в себя PeptidoGenic (pkim@ccnet.com), HTI Bio-products, Inc. (www.htibio.com), BMA Biomedicals Ltd. (U.K.), Bio. Synthesis, Inc., и многие другие.

Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам и организмам, содержащим молекулу HA и/или NA или другой полипептид, и/или нуклеиновую кислоту данного изобретения, или такие последовательности HA и/или NA, или другие, в составе разных векторов, таких как реассортантные вирусы гриппа 6:2, плазмиды в системах плазмидной помощи и др. Клетки-хозяева подвергают рекомбинации (например, трансформации, трансдукции или трансфекции) векторами данного изобретения, которые могут представлять собой, например, векторы клонирования или векторы экспрессии. Вектор может находиться, например, в виде плазмиды, бактерии, вируса, "голый" полинуклеотид, или конъюгированный полинуклеотид. Векторы вводят в клетки и/или микроорганизмы стандартными способами, которые включают в себя электропорацию (см., From et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 82, 5824 (1985)), инфицирование вирусными векторами, высокоскоростную бомбардировку маленькими частицами, содержащими нуклеиновую кислоту, которая находится либо в матриксе маленьких гранул или частиц, либо на их поверхности (Klein et al, Nature 327, 70-73 (1987)). Berger, Sambrook, and Ausubel предлагают ряд подходящих способов трансформации. См. выше.

Существует несколько хорошо известных способов введения целевых нуклеиновых кислот в бактериальные клетки, любой из которых можно использовать в настоящем изобретении. Такие способы включают в себя: слияние реципиентных клеток с бактериальными протопластами, содержащими ДНК, электропорацию, бомбардировку микрочастицами, инфицирование вирусными векторами и др. Для амплификации ряда плазмид, содержащих конструкции ДНК данного изобретения, можно использовать бактериальные клетки. Бактерии выращивают до лог-фазы, после чего присутствующие в бактериях плазмиды можно выделить с помощью ряда способов, известных в данной области (см., например, Sambrook). Кроме того, плазмиды можно выделить из бактерий с помощью многочисленных коммерчески доступных наборов (таких как, например, EasyPrep^TM и FlexiPrep^TM от Pharmacia Biotech; StrataClean^TM от Stratagene; и QIAprep ^TM от Qiagen). Затем выделенные и очищенные плазмиды подвергают дальнейшим манипуляциям с получением других плазмид, которые используют для трансфекции клеток, или вставляют в родственные векторы для инфицирования организмов. Типичные векторы содержат терминаторы транскрипции и трансляции, последовательности, инициирующие транскрипцию и трансляцию, а также промоторы, используемые для регуляции экспрессии конкретной целевой нуклеиновой кислоты. Векторы необязательно содержат характерные для определенного типа кассеты экспрессии, включающие в себя, по меньшей мере, одну независимую терминаторную последовательность, последовательности, обеспечивающие репликацию кассеты в эукариотах или прокариотах, или и в тех, и в других (например, челночные векторы), и маркеры селекции для прокариотических и эукариотических систем. Векторы можно использовать для репликации и интеграции в прокариотах, эукариотах, или, предпочтительно, и в тех, и в других. См., Giliman & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al, Nature, 328:731 (1987); Schneider, B., et al., Protein Expr Purif 6435:10 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (выше). Каталог бактерий и бактериофагов, используемых для клонирования, предлагает, например, ATCC, такой как Каталог бактерий и бактериофагов ATCC (1992) Gherna et al. (eds.), опубликованный ATCC. Описание других базовых процедур секвенирования, клонирования, а также других аспектов молекулярной биологии и лежащих в их основе теоретических соображений можно найти в Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY. См. выше.

Получение и выделение полипептидов

В некоторых воплощениях после трансдукции подходящих линий или штаммов клеток-хозяев и выращивания клеток-хозяев до подходящей плотности, выбранный промотор индуцируют соответствующими способами (например, путем температурного сдвига или воздействия химического реагента) и клетки культивируют в течение дополнительного периода времени. Затем в некоторых воплощениях секретируемый полипептидный продукт, например, полипептид HA и/или NA, входящий в состав секретируемого гибридного белка и др., выделяют из культуральной среды. В других воплощениях клетки продуцируют вирусную частицу, содержащую один или несколько полипептидов HA и/или NA данного изобретения. Альтернативно, клетки можно собрать центрифугированием, разрушить физическими или химическими способами, после чего полученный неочищенный экстракт можно подвергнуть дальнейшей очистке. Эукариотические или микробные клетки, используемые для экспрессии белков можно разрушить любым традиционным способом, таким как чередование замораживания и оттаивания, обработка ультразвуком, механическое разрушение или применение средств, лизирующих клетки, а также с помощью других способов, хорошо известных специалистам в данной области. Кроме того, клетки, экспрессирующие полипептидный продукт HA и/или NA данного изобретения, можно использовать, не выделяя полипептид из клеток. Это можно делать в тех случаях, когда полипептид данного изобретения необязательно экспрессируется на клеточной поверхности и, следовательно, можно анализировать (например, с использованием молекул HA и/или NA, или их фрагментов, например, входящих в состав гибридных белков и т.п.) связывание антител на поверхности клеток и др. Такие клетки также являются признаками данного изобретения.

Эксперссированные полипептиды можно выделить из культуры рекомбинантных клеток и очистить с помощью ряда способов, хорошо известных в данной области, таких как осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстрагирование кислотой, анионо- или катионообменная хроматография, хроматография на фосфоцеллюлозе, хроматография с гидрофобным взаимодействием, аффинная хроматография (например, с использованием любой из систем мечения, известных специалистам в данной области), хроматография на гидроксилапатите и хроматография с использованием лектинов. При желании можно провести стадии рефолдинга белка, обеспечивающие получение конечной конфигурации зрелого белка. Кроме того, на конечных стадиях очистки можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). В добавление к указанным здесь ссылкам ряд способов очистки описан, например, в Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; и Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2^nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3^rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY; и Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ.

Если экспрессируемые полипептиды данного изобретения продуцируются вирусами, данные вирусы обычно выделяют из культуральной среды, в которой выращивают инфицированные (трансфицированные) клетки. Как правило, неочищенную среду осветляют перед концентрированием вирусов гриппа. Наиболее часто используемые способы включают в себя ультрафильтрацию, адсорбцию на сульфате бария с последующим элюированием и центрифугирование. Например, неочищенную среду инфицированных культур вначале осветляют центрифугированием, например, при 1000-2000 g в течение времени, достаточного для удаления клеточного детрита и других крупнодисперсных веществ, например, в течение промежутка времени от 10 до 30 минут. Затем супернатант осветленной среды необязательно, центрифугируют, чтобы осадить вирусы гриппа, например, при 15000 g в течение примерно 3-5 часов. После ресуспендирования вирусного осадка в подходящем буфере, таком как STE (0,01 M Tris-HCl; 0,15 M NaCl; 0,0001 M EDTA) или забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), pH 7,4, вирус концентрируют путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (60%-12%) или тартрата калия (50%-10%). Используют либо непрерывный, либо ступенчатый градиент, например, градиент сахарозы от 12% до 60% можно разделить на четыре 12% стадии. Скорость и время центрифугирования в градиенте плотности должны быть достаточными для концентрирования вирусов с получением видимой полосы, которую можно выделить. Альтернативно и в большинстве крупномасштабных коммерческих применений вирус декантируют с градиентов плотности, используя ротор зональной центрифуги, действующей в непрерывном режиме. Дополнительные детали, достаточные для того, чтобы специалист в данной области смог осуществить получение вирусов гриппа из тканевых культур, описаны, например, в Furminger. Vaccine Production, in Nicholson et al. (eds.) Textbook of Influenza pp.324-332; Merten et al. (1996) Production Influenza Virus in cell cultures for vaccine preparation, in Cohen & Shafferman (eds.) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp.141-151, и патенте США № 5690937. При необходимости выделенные вирусы можно хранить при -80°C в присутствии сахарозы-фосфата-глутамата (SPG) в качестве стабилизатора.

Альтернативно, бесклеточные системы транскрипции/трансляции можно использовать для получения полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность, или субпоследовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26, или кодируемую полинуклеотидными последовательностями данного изобретения. Ряд подходящих систем транскрипции и трансляции in vitro является коммерчески доступным. Общее руководство по способам транскрипции и трансляции in vitro можно найти в Tymms (1995) In vitro Transcription and Translation Protocols: Methods in Molecular Biology Volume 37, Garland Publishing, NY.

Кроме того, полипептиды или их субпоследовательности, например, субпоследовательности, содержащие антигенные пептиды, можно получить вручную или с помощью автоматизированной системы, путем прямого пептидного синтеза с использованием твердофазных методов (см., Stewart et al. (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco; Merrifield J (1963), J Am Chem Soc 85:2149-2154). Примеры автоматизированных систем включают в себя синтезатор пептидов Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer, Foster City, CA). При желании, субпоследовательности можно синтезировать отдельно с помощью химических способов и затем объединить их химическими способами с остальной частью полипептида с получением полноразмерной молекулы.

Модифицированные аминокислоты

Экспрессируемые полипептиды данного изобретения могут содержать одну или несколько модифицированных аминокислот. Присутствие модифицированных аминокислот может обуславливать такие преимущества, как, например, (a) увеличение периода полужизни полипептида в сыворотке, (b) уменьшение/повышение антигенности полипептида, (c) повышение стабильности полипептида при хранении и др. Аминокислоту (аминокислоты) модифицируют, например, в процессе получения рекомбинантного продукта во время трансляции или после трансляции (например, путем N-гликозилирования по мотиву N-X-S/T в процессе экспрессии в клетках млекопитающих), или посредством синтетических способов (например, путем пэгилирования).

Неограничивающие примеры модифицированной аминокислоты включают в себя гликозилированную аминокислоту, сульфатированную аминокислоту, пренилированную (например, фарнесилированную, геранилгеранилированную) аминокислоту, ацетилированную аминокислоту, ацилированную аминокислоту, пэгилированную аминокислоту, биотинилированную аминокислоту, карбоксилированную аминокислоту, фосфорилированную аминокислоту и т.п, а также аминокислоту, модифицированную путем конъюгации, например, с липидными фрагментами или другими органическими дериватизирующими агентами. В литературе изобилуют ссылки, которые специалисты в данной области могут использовать в качестве руководства при проведении модификаций аминокислот. Примеры методик можно найти в Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Human Press, Towata, N.J.

Гибридные белки

Настоящее изобретение также предлагает гибридные белки, содержащие последовательности данного изобретения (например, кодирующие полипептиды HA и/или NA) или их фрагменты и, например, иммуноглобулины (или их фрагменты), последовательности, кодирующие, например, GFP (зеленый флуоресцентный белок), или другие подобные ему маркеры, и др. Нуклеотидные последовательности, кодирующие такие гибридные белки, относятся к другому аспекту данного изобретения. Гибридные белки данного изобретения необязательно используют, например, для таких же применений (включающих в себя, например, терапевтические, профилактические, диагностические, экспериментальные и др. применения, описанные в данном документе) как и негибридные белки данного изобретения. Помимо иммуноглобулиновых и маркерных последовательностей, белки данного изобретения можно гибридизовать, например, с последовательностями, которые обеспечивают сортинг гибридных белков и/или направляют гибридные белки к конкретным типам клеток, участкам и др.

Антитела

Полипептиды данного изобретения можно использовать для получения антител, специфичных к полипептидам, описанным в данном документе, и/или полипептидам, кодируемым полинуклеотидами данного изобретения, например, описанными в данном документе, и к их консервативным вариантам. Антитела, специфичные к вышеуказанным полипептидам, можно использовать, например, для диагностических и терапевтических целей, например, связанных с активностью, распределением и экспрессией полипептидов-мишеней. Например, такие антитела необязательно можно использовать для определения других вирусов в том же штамме (штаммах), что и последовательности HA/NA данного изобретения.

Антитела, специфичные к полипептидам данного изобретения, можно получить с помощью известных в данной области способов. Такие антитела могут включать в себя, без ограничения, поликлональные, моноклональные, химерные, гуманизированные, одноцепочечные, фрагменты Fab и фрагменты, полученные с использованием экспрессионной библиотеки Fab.

Полипептиды, используемые для получения антител, не должны обладать биологической активностью (например, для этой цели не требуется применение полноразмерных функциональных гемагглютинина или нейраминидазы). Однако полипептид или олигопептид должен быть антигенным. Пептиды, используемые для получения специфических антител, обычно имеют аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, примерно 4 аминокислоты, зачастую, по меньшей мере, 5 или 10 аминокислот. Короткие участки полипептида можно гибридизовать с другим белком, таким как гемоцианин лимфы улитки, с получением антитела против химерной молекулы.

Многочисленные способы получения поликлональных и моноклональных антител, известные специалистам в данной области, можно адаптировать для получения антител, специфичных к полипептидам данного изобретения, и/или кодируемым полинуклеотидными последовательностями данного изобретения, и др. См., например, Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; Paul (ed.) (1998) Fundamental Immunology, Fourth Edition, Lippincott-Raven, Lippincott Williams & Wilkins; Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY; Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, а также приведенные в них ссылки; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York, NY; и Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497. Другие подходящие способы получения антител включают в себя селекцию библиотек рекомбинантных антител в фагах или подобных векторах. См. Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; и Ward, et al. (1989) Nature 341:544-546. Специфические моноклональные и поликлональные антитела и антисыворотки обычно имеют K_D, составляющую, например, по меньшей мере, примерно 0,1 мкМ, по меньшей мере, примерно 0,01 мкМ или менее, и, зачастую, по меньшей мере, примерно 0,001 мкМ или менее.

В некоторых терапевтических применениях желательно использовать гуманизированные антитела. Подробное описание способов получения химерных (гуманизированных) антител можно найти в патенте США 5482856. Дополнительные подробности, касающиеся получения гуманизированных и других антител и рекомбинантных методов, описаны в Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, 2^nd Edition Freeman and Company, NY (Borrebaeck); McCafferty et al. (1996) Antibody Engineering, A Practical Approach IRL at Oxford Press, Oxford, England (McCafferty), и Paul (1995) Antibody Engineering Protocols Humana Press, Towata, NJ (Paul). Дополнительные подробности, касающиеся конкретных методов, можно найти, например, в Ostberg et al. (1983), Hybridoma 2:361-367, Ostberg, патенте США № 4634664 и Engelman et al., патенте США № 4634666.

Определение иммунореактивности полипептидов

Из полипептидов данного изобретения можно получить ряд новых полипептидных последовательностей (например, содержащих молекулы HA и NA), несущих новые структурные признаки, которые можно детектировать с помощью, например, иммунологических анализов. Антисыворотка, которая специфически связывается с полипептидами данного изобретения, а также полипептиды, которые связываются с такой сывороткой, являются признаками данного изобретения.

Например, данное изобретение включает в себя полипептиды (например, молекулы HA и NA), которые специфически связываются, или которые способны к специфическому иммунному взаимодействию с антителами или антисыворотками, полученными против иммуногена, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из одной или нескольких приведенных в данном описании последовательностей, таких как SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26, остатки 363-585 SEQ ID NO:26 и др. Чтобы исключить перекрестные реакции с другими гомологами, антитела или антисыворотку истощают молекулами HA и/или NA, присутствующими в общедоступных базах данных на момент подачи, такими как "контрольный" полипептид (полипептиды). Если другая контрольная последовательность представляет собой нуклеиновую кислоту, получают полипептид, кодируемый такой нуклеиновой кислотой, и используют его для истощения антител/антисыворотки.

В типичном иммуноанализе используют поликлональную антисыворотку, полученную против одного или нескольких полипептидов, содержащих одну или несколько последовательностей, соответствующих последовательностям данного изобретения, и др., или их субпоследовательностей значительного размера (т.е. составляющих, по меньшей мере, примерно 30% от полноразмерной последовательности). Совокупность потенциальных полипептидных иммуногенов, полученных из последовательностей настоящего изобретения, далее называют "иммуногенные полипептиды." Выбранная антисыворотка необязательно обладает низкой способностью к перекрестному взаимодействию с контрольными гомологами гемагглютинина и/или нейраминидазы, причем перед применением поликлональной антисыворотки в иммуноанализе любую присутствующую перекрестную реактивность удаляют, например, путем иммуноабсорбции с использованием одного или нескольких контрольных гомологов гемагглютинина и нейраминидазы.

Чтобы получить антисыворотку, которую можно использовать в иммуноанализе, один или несколько иммуногенных полипептидов получают и очищают с помощью описанных здесь способов. Например, рекомбинантный белок можно получить в рекомбинантной клетке. Инбредный штамм мышей (используемый в данном анализе вследствие того, что он позволяет получать более воспроизводимые результаты благодаря фактической генетической идентичности мышей) иммунизируют иммуногенным белком (иммуногенными белками) в сочетании со стандартным адъювантом, таким как адъювант Фрейнда, и с использованием стандартного способа иммунизации мышей (стандартное описание получения антител, форматов иммуноанализов и условий, используемых для определения специфической иммунореактивности, можно найти, например, в Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York). Другие ссылки и описания антитела, приведенные в данном документе, также можно использовать для описанной здесь характеристики полипептидов по иммунореактивности. Альтернативно, один или несколько синтетических или рекомбинантных полипептидов, полученных из раскрытых здесь последовательностей, конъюгируют с белком-носителем и используют в качестве иммуногена.

Поликлональную антисыворотку собирают и титруют против иммуногенного полипептида с помощью иммуноанализа, такого как твердофазный иммуноанализ, проводимый с использованием одного или нескольких иммуногенных белков, иммобилизованных на твердом носителе. Поликлональную антисыворотку с титром 10⁶ или выше собирают, объединяют и истощают по контрольному полипептиду (контрольным полипептидам) гемагглютинина и/или нейраминидазы с получением истощенной объединенной титрованной поликлональной антисыворотки.

Истощенную объединенную титрованную поликлональную антисыворотку тестируют на перекрестную реактивность в отношении контрольного гомолога (контрольных гомологов) с помощью сравнительного иммуноанализа. В таком сравнительном анализе определяют условия селективного связывания, которые обуславливают, по меньшей мере, примерно 5-10-кратное повышение отношения сигнала к шуму при связывании антисыворотки с иммуногенными полипептидами по сравнению со связыванием контрольных гомологов. Точность реакции связывания также корректируют путем добавления неспецифических конкурентных веществ, таких как альбумин или обезжиренное сухое молоко, и/или путем регуляции содержания солей, температуры и/или др. Указанные условия связывания используют в последующих анализах, для определения, действительно ли тестируемый полипептид (полипептид, сравниваемый с иммуногенными полипептидами и/или контрольными полипептидами) специфически связывается с объединенной истощенной поликлональной антисывороткой. В частности, тестируемые полипептиды, у которых отношение сигнала к шуму в условиях селективного связывания в 2-5 раз выше, чем у контрольных рецепторных гомологов, и, составляет, по меньшей мере, примерно ½ от отношения сигнала к шуму, наблюдающегося у иммуногенных полипептидов, обладают существенным структурным подобием по отношению к иммуногенному полипептиду, при сравнении с известным рецептором и др., и, следовательно, представляют собой полипептиды данного изобретения.

В другом примере для детекции тестируемого полипептида используют иммуноанализы с применением конкурентного связывания. Например, как указано выше, антитела, вступающие в перекрестные реакции, удаляют из объединенной антисывороточной смеси путем иммуноабсорбции контрольными полипептидами. Затем иммуногенный полипептид (полипептиды) иммобилизуют на твердом носителе и подвергают воздействию истощенной объединенной антисыворотки. К аналитической смеси добавляют тестируемые белки, конкурирующие за связывание с объединенной истощенной антисывороткой. Способность тестируемого белка (белков) конкурировать с иммобилизованным белком (белками) за связывание с объединенной истощенной антисывороткой сравнивают со способностью иммуногенного полипептида (полипептидов), добавленного в аналитическую смесь, конкурировать за связывание (иммуногенные полипептиды эффективно конкурируют с иммобилизованными иммуногенными полипептидами за связывание с объединенной антисывороткой). С помощью стандартных методов рассчитывают перекрестную реактивность в отношении тестируемых белков.

В параллельном анализе необязательно определяют способность контрольного белка (белков) конкурировать за связывание с объединенной истощенной антисывороткой в сравнении со способностью иммуногенного полипептида (полипептидов) конкурировать за связывание с антисывороткой. Опять же, процент перекрестной реактивности в отношении контрольного полипептида (полипептидов) рассчитывают с помощью стандартных методов. Если процент перекрестной реактивности в отношении тестируемых полипептидов, по меньшей мере, в 5-10 раз выше, чем в отношении контрольного полипептида (полипептидов), и/или если связывание тестируемых полипептидов примерно попадает в диапазон связывания иммуногенных полипептидов, считают, что тестируемые полипептиды специфически связываются с объединенной истощенной антисывороткой.

Как правило, после иммуноадсорбции объединенную антисыворотку можно использовать в конкурентном иммуноанализе связывания, описанном в данном документе, для сравнения тестируемого полипептида с иммуногенным и/или контрольным полипептидом (полипептидами). Чтобы провести такое сравнение, все иммуногенные, тестируемые и контрольные полипептиды анализируют в широком диапазоне концентраций и с помощью стандартных методов определяют количество каждого полипептида, необходимое для 50% ингибирования связывания истощенной сыворотки, например, с иммобилизованным контролем, тестируемым или иммуногенным белком. Если количество тестируемого полипептида, необходимое для связывания в конкурентном анализе, меньше чем в два раза превосходит требуемое количество иммуногенного полипептида, считают, что тестируемый полипептид специфически связывается с иммуногенным белком, при условии, что такое количество, по меньшей мере, примерно в 5-10 раз превосходит количество контрольного полипептида.

Для дополнительного определения специфичности объединенную антисыворотку необязательно подвергают полной иммуноадсорбции иммуногенным полипептидом (полипептидами) (в большей степени, чем контрольным полипептидом (полипептидами)), пока связывание полученной истощенной по иммуногенным полипептидам объединенной антисыворотки с иммуногенным полипептидом (полипептидами), используемым для иммуноадсорбции, не перестанет детектироваться, или пока его значение не станет минимальным. Затем указанную полностью иммуносорбированную антисыворотку анализируют на способность взаимодействовать с тестируемым полипептидом. Если взаимодействие находится на незначительном уровне или отсутствует (т.е. если его отношение сигнала к шуму не более чем в 2 раза превышает отношение сигнала к шуму, наблюдаемое при связывании полностью иммуносорбированной антисыворотки с иммуногенным полипептидом), считается, что тестируемый полипептид специфически связывается с антисывороткой, полученной в результате иммунизации иммуногенным белком.

Варианты нуклеотидных и полипептидных последовательностей

Как описано в данном документе, изобретение предлагает полинуклеотидные последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности полипептидов, например, последовательности гемагглютинина и нейраминидазы, а также, например, композиции и способы, включающие в себя применение указанных последовательностей. Примеры таких последовательностей раскрыты в данном описании. Однако для специалиста в данной области должно быть ясно, что настоящее изобретение не ограничивается строго раскрытыми здесь последовательностями, и что настоящее изобретение также предлагает многие родственные и не родственные последовательности, обладающие описанными здесь функциями, например, последовательности, кодирующие молекулы HA и/или NA.

Специалистам в данной области также следует понимать, что многие варианты раскрытых последовательностей входят в объем настоящего изобретения. Например, в объем настоящего изобретения входят консервативные изменения раскрытых последовательностей, которые дают функционально идентичные последовательности. Варианты полинуклеотидных последовательностей нуклеиновых кислот, которые гибридизуются, по меньшей мере, с одной из раскрытых последовательностей, входят в объем данного изобретения. Уникальные субпоследовательности раскрытых здесь последовательностей, определенные, например, с помощью стандартных методов сравнения последовательностей, также входят в объем данного изобретения.

Молчащие изменения

Вследствие вырожденности генетического кода необязательно получают ряд нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептиды и/или вирусы данного изобретения, среди которых могут присутствовать последовательности с более низким уровнем идентичности по отношению к описанным здесь нуклеотидным и полипептидным последовательностям HA и NA. Ниже приведена таблица типичных кодонов, определяющих генетический код, которые можно найти во многих биологических и биохимических руководствах.

Таблица кодонов демонстрирует, что многие аминокислоты кодируются несколькими кодонами. Например, кодоны AGA, AGG, CGA, CGC, CGG и CGU кодируют аминокислоту аргинин. Таким образом, по каждому положению нуклеиновой кислоты данного изобретения, которое относится к кодону, кодирующему аргинин, кодон можно изменить на соответствующие описанные выше кодоны, не изменяя при этом кодируемый полипептид. Следует понимать, что U в последовательности РНК соответствует T в последовательности ДНК.

Такие "молчащие изменения" являются разновидностью описанных ниже "консервативных изменений". Специалисту в данной области известно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением ATG, который обычно является единственным кодоном, кодирующим метионин, и TTG, который обычно является единственным кодоном, кодирующим триптофан) можно модифицировать стандартными методами с получением последовательности, кодирующей функционально идентичный полипептид. Соответственно, подразумевается, что все описанные последовательности включают в себя молчащие изменения нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды. Следовательно, данное изобретение в явной форме включает в себя каждую и все возможные изменения нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид данного изобретения, которые могут быть получены путем селекции сочетаний на основе выбора возможных кодонов. Указанные сочетания получают в соответствии со стандартным триплетным генетическим кодом (например, описанным в таблице 1, или широко известным в данной области) в применении к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид гемагглютинина или нейраминидазы данного изобретения. Все такие изменения каждой нуклеиновой кислоты настоящего изобретения специально предлагаются и описываются с учетом последовательности в сочетании с генетическим кодом. Специалист в данной области может получить указанные молчащие замены с помощью описанных здесь способов.

Консервативные изменения

По причине вырожденности генетического кода "молчащие замены" (т.е. замены в нуклеотидной последовательности, которые не приводят к изменению кодируемого полипептида) являются подразумеваемым признаком каждой нуклеотидной последовательности данного изобретения, кодирующей аминокислоту. Подобным образом "консервативные аминокислотные замены", представляющие собой замены одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности на другие аминокислоты, обладающие подобными свойствами, также можно легко идентифицировать как приводящие к образованию структуры, обладающей высокой степенью подобия по отношению к структурам, раскрытым в данном документе. Такие консервативные изменения каждой раскрываемой последовательности являются признаком настоящего изобретения.

"Консервативное изменение" конкретной нуклеотидной последовательности относится к нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или практически идентичные аминокислотные последовательности, или, если нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, к практически идентичной последовательности, см. таблицу 2, приведенную ниже. Специалисту в данной области известно, что отдельные замены, делеции или добавления, приводящие к изменению, добавлению или удалению одной аминокислоты или небольшого процента аминокислот (как правило, менее 5%, обычно менее 4%, 3%, 2% или 1%) в кодируемой последовательности, представляют собой "консервативные изменения", то есть изменения, которые приводят к делеции аминокислоты, добавлению аминокислоты или замене аминокислоты на химически подобную аминокислоту. Таким образом, "консервативные изменения" описанных полипептидных последовательностей настоящего изобретения включают в себя замены небольшой части, как правило, менее 5%, обычно менее 4%, 3%, 2% или 1%, аминокислот полипептидной последовательности, на консервативные аминокислоты из одной группы консервативных замен. Наконец, добавление последовательности, которая не изменяет кодирующую активность молекулы нуклеиновой кислоты, такое как добавление не функциональной последовательности, представляет собой консервативное изменение основной нуклеиновой кислоты.

Таблица 2 Группы консервативных замен
1	Аланин (А)	Серин (S)	Треонин (Т)
2	Аспарагиновая кислота (D)	Глутаминовая кислота (E)
3	Аспарагин (N)	Глутамин (Q)
4	Аргинин (R)	Лизин (K)
5	Изолейцин (I)	Лейцин (L)	Метионин (M)	Валин (V)
6	Фенилаланин (F)	Тирозин (Y)	Триптофан (W)

Уникальные полипептидные и полинуклеотидные субпоследовательности

В одном аспекте изобретение предлагает нуклеиновую кислоту, которая содержит уникальную субпоследовательность нуклеиновой кислоты, выбранной из раскрытых здесь последовательностей молекул HA и NA (таких как SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25). Уникальная субпоследовательность является уникальной по сравнению с такими нуклеиновыми кислотами, как, например, нуклеиновые кислоты, присутствующие в GenBank или других подобных общедоступных базах данных на момент подачи (например, другие известные или охарактеризованные молекулы нуклеиновых кислот гемагглютинина и/или нейраминидазы). Выравнивание можно проводить, например, с помощью BLAST, используя параметры по умолчанию. Уникальную субпоследовательность можно использовать, например, в качестве зонда для идентификации нуклеиновых кислот данного изобретения. См. выше.

Подобным образом, данное изобретение предлагает полипептид (например, выбранный из группы, включающей в себя SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26), который содержит уникальную субпоследовательность полипептида, выбранного из раскрытых здесь последовательностей молекул HA и NA. В соответствии с данным документом, уникальная субпоследовательность является уникальной по сравнению с полипептидом, соответствующим полинуклеотидной последовательности, присутствующей, например, в GenBank или других подобных общедоступных базах данных на момент подачи.

Данное изобретение также предлагает нуклеиновые кислоты-мишени, которые гибридизуются в жестких условиях с уникальным олигонуклеотидом, который кодирует уникальную субпоследовательность, входящую в состав полипептида, выбранного из последовательностей молекул HA и NA данного изобретения, где уникальная субпоследовательность является уникальной по сравнению с полипептидом, соответствующим одному из контрольных полипептидов (последовательностей, например, нуклеиновых кислот, присутствующих, например, в GenBank или других подобных общедоступных базах данных на момент подачи). Уникальные последовательности определяют, как указано выше. Полинуклеотиды данного изобретения также включают в себя РНК-версии (как положительные цепи, так и отрицательные) перечисленных здесь последовательностей. См. выше.

Сравнение, идентичность и гомология последовательностей

Термины "идентичный" или процент "идентичности" в применении к двум или более нуклеотидным или полипептидным последовательностям означает, что две или более последовательности или субпоследовательности являются одинаковыми, или содержат определенный процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов, определяемый путем сравнения и выравнивания с максимальным соответствием с использованием одного из описанных ниже алгоритмов сравнения последовательностей (или других алгоритмов, доступных специалистам в данной области) или визуального анализа.

Фраза "практически идентичный" в применении к двум нуклеиновым кислотам или полипептидам (таким как ДНК и/или РНК, кодирующие молекулы HA или NA, или аминокислотные последовательности молекул HA или NA) означает, что две или более последовательности или субпоследовательности содержат, по меньшей мере, примерно 90%, предпочтительно 91%, наиболее предпочтительно 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или более идентичных нуклеотидных или аминокислотных остатков, определяемых путем сравнения и выравнивания с максимальным соответствием с использованием алгоритма сравнения последовательностей или визуального анализа. Такие "практически идентичные" последовательности обычно считаются "гомологичными" независимо от реального происхождения. Предпочтительно, "практическая идентичность" существует на участке аминокислотной последовательности, длина которого составляет, по меньшей мере, примерно 200 остатков, более предпочтительно, на участке, длина которого составляет, по меньшей мере, примерно 250 остатков, и наиболее предпочтительно, последовательности являются практически идентичными на участке, длина которого составляет, по меньшей мере, примерно 300 остатков, 350 остатков, 400 остатков, 425 остатков, 450 остатков, 475 остатков, 480 остатков, 490 остатков, 495 остатков, 499 остатков, 500 остатков, 502 остатка, 559 остатков, 565 остатков или 566 остатков, или по всей длине двух сравниваемых последовательностей, если аминокислотные последовательности представляют собой гемагглютинин или фрагменты гемагглютинина, или последовательности являются практически идентичными на участке, длина которого составляет, по меньшей мере, примерно 350 аминокислот; по меньшей мере, примерно 400 аминокислот; по меньшей мере, примерно 436 аминокислот, по меньшей мере, примерно 450 аминокислот; по меньшей мере, примерно 451 аминокислоту; по меньшей мере, примерно 465 аминокислот; по меньшей мере, примерно 466 аминокислот; по меньшей мере, примерно 469 аминокислот; по меньшей мере, примерно 470 аминокислот; или, по меньшей мере, примерно 566 аминокислот, образующих непрерывную цепь, если аминокислотная последовательность представляет собой нейраминидазу или фрагмент нейраминидазы.

При сравнении последовательностей и определении гомологии, как правило, одну последовательность используют в качестве стандартной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и стандартную последовательности вводят в компьютер, при необходимости определяют координаты субпоследовательности и устанавливают параметры программы для анализа последовательностей. Затем с помощью алгоритма сравнения последовательностей рассчитывают процент идентичности тестируемой последовательности (последовательностей) и стандартной последовательности, используя установленные параметры программы.

Оптимальное для сравнения выравнивание последовательностей можно проводить, например, с помощью алгоритма локальной гомологии Smith & Waterman, Adv Appl Math 2:482 (1981), алгоритма гомологичного выравнивания Needleman & Wunsch, J Mol. Biol. 48:443 (1970), путем анализа подобия Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:2444 (1988), путем компьютеризованной реализации алгоритма, такой как GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA, в пакете программ Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, или путем визуального анализа (общее описание можно найти в Ausubel et al., выше).

Примером алгоритма, подходящего для определения процента идентичности последовательностей и подобия последовательностей, является алгоритм BLAST, описанный в Altschul et al., J Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Программа для проведения анализов BLAST является широко доступной и может быть получена из Национального центра биотехнологической информации (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Данный алгоритм включает в себя вначале идентификацию пар последовательностей с высоким числом баллов (HSP) путем определения в исследуемой последовательности коротких слов длиной W, которые либо совпадают, либо удовлетворяют определенному числу баллов положительного порога T при выравнивании со словом такой же длины из базы данных последовательностей. T называют порогом значения соседнего слова (см. Altschul et al., выше). Указанные начальные совпадения соседних слов используют в качестве затравок для инициации поиска содержащих их более длинных HSP. Затем совпадающие слова расширяют в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до увеличения суммарных баллов выравнивания. Суммарные баллы для нуклеотидных последовательностей рассчитывают, используя параметры M (премиальный балл за пару совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафной балл за несовпадающие остатки; всегда <0). В случае аминокислотных последовательностей для вычисления суммарного балла используют матрицу баллов. Расширение совпадающих слов в каждом направлении останавливают, если: происходит уменьшение суммарного балла выравнивания, обусловленное величиной X, по сравнению с его максимальным значением; суммарный балл близок к нулю или ниже нуля, вследствие накопления отрицательных баллов выравнивания для одного или нескольких остатков; или достигнут конец одной из последовательностей. Параметры W, T и X алгоритма BLAST чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) в качестве параметров по умолчанию используют длину слова (W) 11, ожидание (E) 10, отсечение 100, M=5, N=-4, а также сравнение обоих цепей. Сравнение аминокислотных последовательностей проводят с помощью программы BLASTP, в которой в качестве параметров по умолчанию используют длину слова (W) 3, ожидание (E) 10, и матрицу баллов BLOSUM62 (см. Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:10915).

Помимо расчета процента идентичности последовательностей алгоритм BLAST также выполняет статистический анализ подобия двух последовательностей (см., например, Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:5873-5787 (1993)). Мерой подобия, предоставляемой алгоритмом BLAST, является наименьшая сумма возможностей (P(N)), которая определяет частоту встречаемости возможности совпадения двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей. Например, нуклеиновая кислота считается подобной стандартной последовательности, если наименьшая сумма возможностей при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты со стандартной нуклеиновой кислотой составляет менее чем примерно 0,1, более предпочтительно, менее чем примерно 0,01, и наиболее предпочтительно, менее чем примерно 0,001.

Другим примером подходящего алгоритма выравнивания последовательностей является PILEUP. PILEUP проводит выравнивание нескольких последовательностей из группы родственных последовательностей с помощью прогрессирующих попарных выравниваний. Он также строит схему в виде дерева, демонстрирующую кластерные взаимоотношения, используемые для проведения выравнивания. В PILEUP используется упрощение способа прогрессирующего выравнивания Feng & Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360. Используемый способ подобен способу, описанному Higgins & Sharp (1989) CABIOS5: 151-153. С помощью данной программы можно выравнивать, например, до 300 последовательностей с максимальной длиной 5000 букв. Процедуру множественного выравнивания начинают с попарного выравнивания двух наиболее подобных последовательностей с получением кластера из двух выровненных последовательностей. Затем данный кластер выравнивают со следующей наиболее близкородственной последовательностью или с наиболее близкородственным кластером выровненных последовательностей. Два кластера последовательностей можно выравнивать путем простого расширения попарного выравнивания двух индивидуальных последовательностей. Конечное выравнивание достигают путем серии прогрессирующих попарных выравниваний. Данную программу также можно использовать для построения дендрограммы или древовидной схемы, демонстрирующей кластерные взаимоотношения. Программу запускают путем указания специфических последовательностей и координат их аминокислотных или нуклеотидных участков, используемых при сравнении последовательностей.

Другим примером алгоритма, подходящего для выравнивания нескольких нуклеотидных или аминокислотных последовательностей, является программа CLUSTALW (Thompson, J. D. et al. (1994) Nucl. Acids. Res. 22:4673-4680). CLUSTALW проводит несколько попарных сравнений среди групп последовательностей и их сборку в множественном выравнивании на основе гомологии. Штрафы за открытие гэпа и расширение гэпа Gap могут составлять, например, 10 и 0,05, соответственно. При выравнивании аминокислот алгоритм BLOSUM можно использовать в качестве весовой матрицы. См., например, Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919.

Цифровые системы

Настоящее изобретение предлагает цифровые системы, например, компьютеры, компьютерные программоносители и интегрированные системы, содержащие последовательности символов, соответствующие приведенной в данном документе информации о последовательностях нуклеиновых кислот и выделенных или рекомбинантных полипептидах настоящего изобретения, включающие в себя, например, показанные здесь последовательности, а также такие последовательности, содержащие разные молчащие замены и консервативные замены. Интегрированные системы могут дополнительно содержать, например, оборудование для синтеза генов, позволяющее получать гены в соответствии с указанной последовательностью символов.

Разные способы, известные в данной области, можно использовать для определения гомологии или подобия разных последовательностей символов (см. выше), или их можно использовать для выполнения других желательных функций, таких как проверка файлов выходных данных, получение основы для презентаций информации, включающей в себя последовательности и т.п. Примеры включают в себя BLAST, описанный выше. Компьютерные системы данного изобретения могут включать в себя такие программы, например, в сочетании с одним или несколькими файлами данных или базами данных, содержащими указанные здесь последовательности.

Таким образом, с помощью интегрированных систем данного изобретения можно детектировать и распознавать разные типы гомологии и подобия с разной точностью и длиной среди разных типов последовательностей HA или NA, или их фрагментов и др. Например, разработано много способов определения гомологии, позволяющих проводить сравнительный анализ последовательностей биополимеров, проверку букв при анализе слов и извлечение данных из разных баз данных. Модели, полученные с учетом попарных комплементарных взаимодействий четырех основных нуклеотидных оснований в двойной цепи природных полинуклеотидов, которые воспроизводят отжиг комплементарных гомологичных полинуклеотидных цепей, также можно использовать в качестве основы для выравнивания последовательностей или других операций, обычно проводимых на последовательностях символов, соответствующих последовательностям настоящего изобретения (таких как манипуляции с анализами слов, получение фигур, содержащих последовательности или субпоследовательности символов, таблиц выходных данных и др.).

Таким образом, стандартные настольные приложения, такие как программные средства анализа слов (например, Microsoft Word^TM или Corel WordPerfect ^TM) и программные средства баз данных (например, программное обеспечение динамических таблиц, такое как Microsoft Excel ^TM, Corel Quattro Pro^TM, или программы баз данных, такие как Microsoft Access^TM, Paradox^TM , Gene Works^TM или MacVector^TM или другие подобные программы) можно адаптировать к настоящему изобретению путем введения последовательностей символов, соответствующих одному или нескольким полинуклеотидам и полипептидам данного изобретения (или нуклеиновым кислотам, или белкам, или и тем и другим). Например, система данного изобретения может включать в себя упомянутые выше программные средства, содержащие соответствующую информацию о последовательности символов, например, в сочетании с пользовательским интерфейсом (таким как GUI в стандартной операционной системе, такой как система Windows, Macintosh или LINUX), позволяющим манипулировать с последовательностями символов, соответствующих описанным здесь последовательностям. Как указано выше, специализированные программы для выравнивания, такие как BLAST, также могут быть включены в системы данного изобретения, предназначенные для выравнивания нуклеиновых кислот или белков (или соответствующих последовательностей символов).

Системы настоящего изобретения обычно включают в себя цифровой компьютер, содержащий наборы данных, вводимых в систему программного обеспечения, содержащие одну из описанных здесь последовательностей. Компьютер может представлять собой, например, ПК (Intel x86 или Pentium chip-compatible DOS ^TM, OS2^TM, WINDOWS^TM, WINDOWSNT ^TM, WINDOWS95^TM, WINDOWS2000^TM, WINDOWS98 ^TM, компьютер на основе LINUX, MACINTOSH^TM, Power PC, или компьютер на основе UNIX (такой как рабочая станция SUN^TM)) или другой коммерчески доступный компьютер, известный специалистам в данной области. Программные средства для выравнивания или иных манипуляций с последовательностями являются доступными, или их может легко разработать специалист в данной области с помощью стандартного языка программирования, такого как Visualbasic, PERL, Fortran, Basic, Java и т.п.

Любой контроллер или компьютер необязательно включает в себя монитор, который обычно представляет собой дисплей на электронно-лучевой трубке ("ЭЛТ"), плоскопанельный дисплей (например, жидкокристаллический дисплей на активной матрице, жидкокристаллический дисплей) и др. Компьютерный блок обычно помещают в корпус, который включает в себя многочисленные интегрированные чипы интегральной схемы, такие как микропроцессор, запоминающее устройство, схема интерфейса и другие. Корпус также необязательно содержит дисковод для жестких дисков, дисковод для гибких дисков, дисковод для съемных дисков высокой емкости, такой как CD-ROM с возможностью записи, а также другие традиционные периферические элементы. Необязательно предоставляются устройства ввода, такие как клавиатура или мышь, позволяющие пользователю по его выбору вводить последовательности, подлежащие сравнению или иным манипуляциям с помощью соответствующей компьютерной системы.

Компьютер обычно содержит программное обеспечение, предоставляющее пользователю инструкции, либо в виде допуска пользователя в поле установки параметров, например, в GUI, либо в виде предварительно запрограммированных инструкций, например, предварительно запрограммированных для ряда разных конкретных операций. Затем программное обеспечение превращает указанные инструкции в язык, подходящий для инструктажа по поводу операции, например, соответствующих механизмов или транспортных контроллеров, обеспечивающих проведение желательной операции. Программное обеспечение также может включать в себя выходные элементы, контролирующие синтез нуклеиновой кислоты (например, на основе последовательности или выравнивания последовательностей, описанных в данном документе), сравнение образцов с экспрессией разных генов или другие операции.

Наборы и реагенты

Настоящее изобретение необязательно предлагает пользователю набор. Например, набор данного изобретения содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, полипептидов, антител или клеточных линий, описанных в данном документе (например, содержащих молекулу HA и/или NA данного изобретения). Набор может содержать диагностические нуклеиновые кислоты или полипептиды, такие как антитела, набор зондов, например, микроматрицу кДНК, упакованную в подходящий контейнер, или другие нуклеиновые кислоты, такие как один или несколько векторов экспрессии. Как правило, набор дополнительно содержит один или несколько других реагентов, таких как субстраты, метки, праймеры для мечения продуктов экспрессии, пробирки и/или другие аксессуары, реагенты для сбора образцов, буферы, камеры для гибридизации, покровные стекла и др. Набор также необязательно содержит ряд инструкций, или подробных инструкций по осуществлению предпочтительных способов применения компонентов набора для исследования, или по применению диагностических наборов и др.

В соответствии с инструкциями, набор можно использовать, например, для определения стадии или состояния заболевания, для анализа эффектов фармацевтического средства или другого терапевтического вмешательства в развитие стадии или состояния заболевания на уровне клетки или организма, или для применения в качестве вакцины и др.

В другом аспекте настоящее изобретение предлагает системные наборы, включающие в себя способы, композиции, системы и аппараты, описанные в данном документе. Системные наборы данного изобретения необязательно содержат один или несколько из следующих компонентов: (1) аппарат, система, системный компонент или компонент аппарата; (2) инструкции по проведению описанных здесь способов, и/или по применению описанных здесь аппаратов или компонентов аппаратов, и/или по применению описанных здесь композиций. В другом аспекте настоящее изобретение предлагает применение любого из описанных здесь аппаратов, компонентов аппаратов, композиций или наборов для осуществления любого из описанных здесь способов или анализов, и/или применение любого из описанных здесь аппаратов или наборов для осуществления любого из описанных здесь анализов или способов.

Кроме того, наборы могут содержать одну или несколько указанных выше систем трансляции (таких как клетка) наряду с подходящим упаковочным материалом, контейнеры, содержащие компоненты набора, инструкции по осуществлению описанных здесь способов и т.п. Подобным образом, продукты систем трансляции (например, белки, такие как молекулы HA и/или NA) могут быть предоставлены в виде набора, например, вместе с контейнерами, содержащими компоненты набора, инструкции по осуществлению описанных здесь способов и т.п. Кроме того, наборы могут содержать разные вакцины (например, полученные с помощью способов плазмидной помощи), такие как живая аттенуированная вакцина (например, FluMist^TM), содержащая описанные здесь последовательности HA и/или NA.

С целью облегчения применения способов и композиций данного изобретения все компоненты вакцин и/или вакцинные композиции, такие как реассортантный вирус в аллантоисной жидкости и др., а также другие компоненты, такие как, буфер, клетки, культуральная среда, используемые для упаковки и инфицирования вирусов гриппа в экспериментальных или терапевтических целях, могут быть предоставлены в виде набора. Обычно набор содержит, помимо вышеуказанных компонентов, другие вещества, которые могут включать в себя, например, инструкции для проведения способов данного изобретения, упаковочный материал и контейнер.

Конкретные воплощения

1. Выделенный или рекомбинантный полипептид, выбранный из группы, включающей в себя:

a) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 и 27;

b) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей в себя остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25;

c) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28;

d) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26; и

e) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26, в которой один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных остатков замещены, вставлены или удалены.

2. Выделенный или рекомбинантный полипептид, содержащий гемагглютинин или его фрагмент и имеющий аминокислотную последовательность, которая является практически идентичной, по меньшей мере, примерно 350 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 400 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 450 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 500 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 502 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 550 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 559 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 565 аминокислотам; или, по меньшей мере, примерно 566 аминокислотам, образующих непрерывную цепь, одного или нескольких полипептидов, где полипептид выбран из группы, включающей в себя:

a) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 5, 9, 13, 17, 21 и 25; и

b) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:2, 6, 10, 14, 18, 22 и 26.

3. Выделенный или рекомбинантный полипептид, содержащий нейраминидазу или ее фрагмент и имеющий аминокислотную последовательность, которая является практически идентичной, по меньшей мере, примерно 350 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 400 аминокислотам; по меньшей мере, примерно по меньшей мере, примерно 436 аминокислотам, по меньшей мере, примерно 450 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 451 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 465 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 466 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 469 аминокислотам; или, по меньшей мере, примерно 470 аминокислотам; образующих непрерывную цепь, одного или нескольких полипептидов, где полипептид выбран из группы, включающей в себя:

a) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей в себя SEQ ID NO:3, 7, 11, 15, 19, 23 и 27; и

b) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:4, 8, 12, 16, 20, 24 и 28.

4. Полипептид, содержащий последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 98,5%, по меньшей мере, на 99%, по меньшей мере, на 99,2%, по меньшей мере, на 99,4%, по меньшей мере, на 99,6%, по меньшей мере, на 99,8% или, по меньшей мере, на 99,9% последовательности, по меньшей мере, одного полипептида, выбранного из группы, включающей в себя:

a) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 и 27;

b) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей в себя остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25;

c) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28; и

d) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26.

5. Полипептид, содержащий последовательность, которая, по меньшей мере, на 95% идентична последовательности, по меньшей мере, одного полипептида, выбранного из группы, включающей в себя:

a) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 и 27;

b) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей в себя остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25;

c) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28; и

d) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26.

6. Полипептид воплощения 1, где полипептид является иммуногенным.

7. Композиция, содержащая один или несколько полипептидов воплощения 1, или их фрагменты.

8. Полипептид, который специфически связывается поликлональной антисывороткой, полученной против, по меньшей мере, одного антигена, где антиген содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную последовательность воплощения 1, или ее фрагмент.

9. Антитело, специфичное к полипептиду воплощения 1.

10. Иммуногенная композиция, содержащая иммунологически эффективное количество полипептида воплощения 1.

11. Реассортантный вирус гриппа, содержащий полинуклеотид, кодирующий полипептид воплощения 1.

12. Вирус воплощения 11, где вирус представляет собой реассортантный вирус 6:2, содержащий 6 внутренних геномных сегментов одного или нескольких донорных вирусов и 2 геномных сегмента, кодирующих поверхностные антигены вируса гриппа, где, по меньшей мере, один из 2 геномных сегментов содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, или ее фрагмент.

13. Вирус воплощения 12, где донорный вирус представляет собой A/Ann Arbor/6/60, B/Ann Arbor/1/66, или A/Puerto Rico/8/34.

14. Иммуногенная композиция, содержащая иммунологически эффективное количество реассортантного вируса гриппа воплощения 13.

15. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, выбранный из группы, включающей в себя:

a) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 и 27, или комплементарные им последовательности;

b) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25

c) полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28, или комплементарная ей полинуклеотидная последовательность;

d) полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26; и

e) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, в которой один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать нуклеотидных остатков замещены, вставлены или удалены, или комплементарную ей последовательность.

16. Полинуклеотид воплощения 15, где полинуклеотид представляет собой ДНК.

17. Полинуклеотид воплощения 15, где полинуклеотид представляет собой РНК.

18. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид воплощения 2.

19. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид воплощения 3.

20. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид гемагглютинина или полипептид нейраминидазы, где нуклеотидная последовательность, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 98,5%, по меньшей мере, на 99%, по меньшей мере, на 99,2%, по меньшей мере, на 99,4%, по меньшей мере, на 99,6%, по меньшей мере, на 99,8% или, по меньшей мере, на 99,9% идентична последовательности, по меньшей мере, одного полинуклеотида, выбранного из группы, включающей в себя:

a) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, или комплементарную ей последовательность;

b) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25

c) полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28, или комплементарная ей полинуклеотидная последовательность; и

d) полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26.

21. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, где нуклеотидная последовательность, по меньшей мере, на 95% идентична последовательности, по меньшей мере, одного полинуклеотида, выбранного из группы, включающей в себя:

a) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, или комплементарную ей последовательность;

b) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25;

c) полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28, или комплементарная ей полинуклеотидная последовательность; и

d) полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26.

22. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, где полипептид содержит полипептид гемагглютинина или полипептид нейраминидазы, полученный путем изменения или рекомбинации одной или нескольких полинуклеотидных последовательностей воплощения 15.

23. Полинуклеотид воплощения 15, где полинуклеотид кодирует иммуногенный полипептид.

24. Композиция, содержащая один или несколько полинуклеотидов воплощения 15, или их фрагменты.

25. Иммуногенная композиция, содержащая иммунологически эффективное количество полинуклеотида воплощения 15.

26. Реассортантный вирус гриппа, содержащий полинуклеотид воплощения 15.

27. Вирус воплощения 26, где вирус представляет собой реассортантный вирус 6:2, содержащий 6 внутренних геномных сегментов одного или нескольких донорных вирусов и 2 геномных сегмента, кодирующих поверхностные антигены вируса гриппа, где, по меньшей мере, один из 2 геномных сегментов содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, или ее фрагмент.

28. Вирус воплощения 27, где донорный вирус представляет собой A/Ann Arbor/6/60, B/Ann Arbor/1/66, или A/Puerto Rico/8/34.

29. Иммуногенная композиция, содержащая иммунологически эффективное количество рекомбинантного вируса гриппа воплощения 27.

30. Вектор, содержащий полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, или ее фрагмент.

31. Вектор воплощения 30, где вектор представляет собой плазмиду, космиду, фаг, вирус или фрагмент вируса.

32. Вектор воплощения 30, где вектор представляет собой вектор экспрессии.

33. Вектор воплощения 30, где вектор представляет собой компонент мультиплазмидной системы, используемой в способе плазмидной помощи для получения одного или нескольких реассортантных вирусов.

34. Клетка, трансдуцированная вектором воплощения 30.

35. Вирус, содержащий полинуклеотид, который содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, или ее фрагмент.

36. Вирус воплощения 35, где вирус представляет собой вирус гриппа.

37. Вирус воплощения 36, где полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гемагглютинин и/или нейраминидазу, или их фрагменты.

38. Вирус воплощения 36, где вирус представляет собой реассортантный вирус.

39. Вирус воплощения 36, где вирус представляет собой реассортантный вирус 6:2, содержащий 6 внутренних геномных сегментов одного или нескольких донорных вирусов и 2 геномных сегмента, кодирующих поверхностные антигены вируса гриппа, где, по меньшей мере, один из 2 геномных сегментов содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, или ее фрагмент.

40. Вирус воплощения 39, где, по меньшей мере, один из 2 геномных сегментов кодирует гемагглютинин или нейраминидазу, или их фрагменты.

41. Вирус воплощения 36, где вирус представляет собой реассортантный вирус 7:1, содержащий 6 внутренних геномных сегментов и первый геномный сегмент, кодирующий первый поверхностный антиген вируса гриппа из одного или нескольких донорных вирусов, и второй геномный сегмент, кодирующий второй поверхностный антиген вируса гриппа, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, или ее фрагмент.

42. Вирус воплощения 41, где второй геномный сегмент кодирует гемагглютинин или нейраминидазу, или их фрагменты.

43. Вирус воплощения 39, где донорный вирус представляет собой термочувствительный вирус, адаптированный к низким температурам вирус, или аттенуированный вирус.

44. Вирус воплощения 39 или 41, где донорный вирус содержит A/Ann Arbor/6/60, B/Ann Arbor/1/66, или A/Puerto Rico/8/34.

45. Вирус воплощения 39 или 41, где вирус представляет собой живой вирус.

46. Клетка, содержащая вирус воплощения 45.

47. Способ получения реассортантных вирусов гриппа в клеточной культуре, который включает в себя:

введение совокупности векторов, содержащих полинуклеотиды, соответствующие геному вируса гриппа, в популяцию клеток-хозяев, где совокупность векторов содержит полинуклеотиды, соответствующие, по меньшей мере, 6 внутренним геномным сегментам первого штамма вируса гриппа, и, по меньшей мере, одному геномному сегменту второго штамма вируса гриппа, где, по меньшей мере, один геномный сегмент второго штамма вируса гриппа содержит полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, или ее фрагмент, и где популяция клеток-хозяев способна поддерживать репликацию вируса гриппа;

культивирование популяции клеток-хозяев; и

выделение совокупности вирусов гриппа.

48. Способ воплощения 47, где первый штамм вируса гриппа представляет собой аттенуированный штамм вируса гриппа, адаптированный к низким температурам штамм вируса гриппа, или термочувствительный штамм вируса гриппа.

49. Способ воплощения 47, где вирусы гриппа можно использовать для введения в составе интраназальной вакцинной композиции.

50. Способ воплощения 47, где геном вируса гриппа представляет собой геном вируса гриппа B.

51. Способ воплощения 47, где геном вируса гриппа представляет собой геном вируса гриппа A.

52. Способ воплощения 47, где первый штамм вируса гриппа представляет собой A/Ann Arbor/6/60, B/Ann Arbor/1/66, или A/Puerto Rico/8/34.

53. Способ воплощения 47, где совокупность векторов представляет собой совокупность плазмидных векторов.

54. Способ воплощения 47, где популяция клеток-хозяев включает в себя одну или несколько из таких популяций, как: клетки Vero, клетки PerC6, клетки MDCK, клетки 293T и клетки COS.

55. Способ воплощения 47, включающий в себя выделение реассортантных вирусов гриппа.

56. Способ воплощения 47, где способ не включает в себя применение хелперного вируса.

57. Способ воплощения 47, где совокупность векторов содержит восемь векторов.

58. Способ воплощения 47, где, по меньшей мере, один геномный сегмент кодирует иммуногенный поверхностный антиген вируса гриппа второго штамма вируса гриппа.

59. Иммуногенная композиция, содержащая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26.

60. Иммуногенная композиция, содержащая полинуклеотид, который содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25.

61. Композиция воплощения 59 или 60, дополнительно содержащая эксципиент.

62. Композиция воплощения 61, где эксципиент представляет собой фармацевтически приемлемый эксципиент.

63. Иммуногенная композиция, содержащая реассортантный вирус, который содержит полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25.

64. Композиция воплощения 63, где реассортантный вирус представляет собой реассортантный вирус 6:2, который содержит 6 внутренних геномных сегментов из одного или нескольких донорных вирусов и 2 геномных сегмента, кодирующих поверхностные антигены вируса гриппа, где, по меньшей мере, один из 2 геномных сегментов содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25.

65. Композиция воплощения 64, где донорный штамм вируса гриппа представляет собой адаптированный к пониженной температуре, аттенуированный и/или термочувствительный штамм вируса гриппа.

66. Композиция воплощения 65, где донорный штамм вируса гриппа представляет собой A/Ann Arbor/6/60, B/Ann Arbor/1/66, или A/Puerto Rico/8/34.

67. Живая аттенуированная противогриппозная вакцина, содержащая иммуногенную композицию воплощения 63.

68. Композиция воплощения 63, дополнительно содержащая один или несколько фармацевтически приемлемых эскципиентов.

69. Способ получения вакцины против вируса гриппа, который включает в себя:

введение совокупности векторов, содержащих полинуклеотиды, соответствующие геному вируса гриппа, в популяцию клеток-хозяев, где совокупность векторов содержит полинуклеотиды, соответствующие, по меньшей мере, 6 внутренним геномным сегментам первого штамма вируса гриппа, и, по меньшей мере, один геномный сегмент второго штамма вируса гриппа, где, по меньшей мере, один геномный сегмент второго штамма вируса гриппа содержит полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, или ее фрагмент, и где популяция клеток-хозяев способна поддерживать репликацию вируса гриппа;

культивирование популяции клеток-хозяев;

выделение совокупности вирусов гриппа; и

предоставление одного или нескольких фармацевтически приемлемых эксципиентов.

70. Способ воплощения 69, где первый штамм вируса гриппа представляет собой аттенуированный вирус гриппа, адаптированный к низким температурам вирус гриппа, или термочувствительный вирус гриппа.

71. Способ воплощения 69, где полученные вирусы можно использовать для введения в составе интраназальной вакцинной композиции.

72. Способ воплощения 69, где геном вируса гриппа представляет собой геном вируса гриппа B или геном вируса гриппа A.

73. Способ воплощения 69, где, по меньшей мере, один геномный сегмент кодирует иммуногенный поверхностный антиген вируса гриппа второго штамма вируса гриппа.

74. Способ профилактики или лечения вирусной инфекции у субъекта, который включает в себя: введение субъекту реассортантного вируса, содержащего полинуклеотид, который содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, или ее фрагмент, в количестве, эффективном для получения иммунного ответа против вирусной инфекции.

75. Способ воплощения 74, где субъект представляет собой млекопитающее.

76. Способ воплощения 74, где млекопитающее представляет собой человека.

77. Способ воплощения 74, где вирусная инфекция включает в себя инфекцию вируса гриппа.

78. Способ воплощения 74, где вирус вводят in vivo субъекту, или in vitro или ex vivo в одну или несколько клеток субъекта.

79. Способ воплощения 74, где композицию, содержащую реассортантный вирус и фармацевтически приемлемый эксципиент, вводят субъекту в количестве, достаточном для профилактики или лечения вирусной инфекции.

80. Молекула ДНК, содержащая элемент, регулирующий транскрипцию, который связывается с ДНК-зависимой РНК-полимеразой и находится в функциональной связи с последовательностью ДНК, которая кодирует молекулу РНК, где молекула РНК содержит участок связывания, специфичный к РНК-зависимой РНК-полимеразе вируса гриппа, функционально связанный с последовательностью РНК, содержащей обратную последовательность, комплементарную мРНК, кодирующей последовательность вируса гриппа, где последовательность ДНК содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, выбранных из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, или их фрагменты.

81. Молекула ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, которая после транскрипции дает РНК-матрицу, включающую в себя последовательность РНК, содержащую обратную последовательность, комплементарную мРНК, кодирующей последовательность вируса гриппа и терминальные последовательности вРНК, где нуклеотидная последовательность содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, выбранных из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, или их фрагменты.

82. Молекула ДНК воплощения 81, где РНК-матрица способна к репликации.

Хотя вышеизложенное изобретение описано с некоторыми подробностями в целях внесения ясности и облегчения понимания, после прочтения настоящего описания специалисту в данной области должно быть понятно, что разные изменения формы и деталей можно осуществить без отступления от объема данного изобретения. Например, все описанные выше способы и устройства можно использовать в разных сочетаниях. Все публикации, патенты, патентные заявки или другие документы, цитирующиеся в данной заявке, включены в настоящее описание в качестве ссылки во всей полноте для применения в любых целях в такой степени, как если бы было указано, что все индивидуальные публикации, патенты, патентные заявки или другие документы отдельно включены в качестве ссылки для применения в любых целях. В частности, следующие патентные заявки включены в качестве ссылки во всей полноте для применения в любых целях: предварительные патентные заявки США № № 61/079894, поданная 11 июля 2008 г., 61/110702 поданная 3 ноября 2008 г., и 61/178592, поданная 15 мая 2009 г.