способ получения форм картофеля in vitro, устойчивых к возбудителям фитофтороза и альтернариоза

Формула изобретения

Способ получения форм картофеля in vitro, устойчивых к возбудителям фитофтороза и альтернариоза, заключающийся в том, что листовые экспланты исходных сортов, вычлененные из тридцатидневных асептических растений исходных сортов, выращенных в сосудах 1 л, помещают в чашки Петри с жидкой средой следующего состава:

Макросоли по Мурасиге-Скугу (МС)	50,0 мл/л,
Микросоли по МС	1,0 мл/л,
CaCl 2	348,5 мг/л
Fe-хеллат по МС	5,0 мл/л
Тиамин	1,0 мг/л
Пиридоксин	1,0 мг/л
Глюкоза	16,0 г/л
Гидролизат козеина	1,0 г/л
Мезоинозит	100,0 мг/л
Нафтилуксусная кислота (НУК)	5,0 мг/л
Бензиламинопурин	0,2 мг/л
рН	5,8
Дистиллированная вода	до 1 л среды

и прединкубируют в течение 18-24 часов и температуре 22-24°C, затем вносят пипеткой 300 мкл на одну чашку ночной суспензионной культуры агробактерии, несущей плазмиду с геном антимикробного пептида proSmAMP-1 из звездчатки средней (мокрица) - (Stellaria media L.), кокультивируют с агробактериальной суспензией в течение 15-30 минут при периодическом встряхивании, обсушивают между листами стерильной фильтровальной бумаги и помещают на другие чашки Петри с аналогичной средой и посткокультивируют в течение 18-24 часов при температуре 22-24°C на рассеянном свету, затем экспланты таким же образом обсушивают и переносят в чашки Петри с аналогичной средой с добавлением 7 г/л агара и 800 мг/л цефотаксима и инкубируют в течение 5-7 суток на рассеянном свету при 22-24°C, затем переносят на регенерационные среды состава:

Макросоли по МС	50,0 мл/л,
Микросоли по МС	1,0 мл/л,
CaCl2	348,5 мг/л
Fe-хеллат по МС	5,0 мл/л
Тиамин	1,0 мг/л
Пиридоксин	1,0 мг/л
Глюкоза	16,0 г/л
Гидролизат козеина	1,0 г/л
Мезоинозит	100,0 мг/л
Биотин	1,0 мг/л
Кальций пантетонат	5,0 мг/л
Аденинсульфат	40,0 мг/л
НУК	0,1 мг/л
Зеатин (добавлять после
автоклавирования (холодной
стерилизации))	2,0 мг/л
Цефотаксим (добавлять после
автоклавирования (холодной
стерилизации))	800,0 мг/л
Агар	7,0 г/л
pH	5,8
Дистиллированная вода	до 1 л среды

и культивируют в течение 10-14 суток при 22-25°C и освещенности 6000-10000 лк, затем культивируют на аналогичной среде с цефотаксимом 500 мг/л и канамицин сульфатом 15 мг/л 3 пассажа по 21 дню, затем 1 пассаж без канамицина сульфата и снова 3 пассажа с канамицином, при появлении регенерантов размером не менее 10 мм их срезают и переносят на среду состава:

Макросоли по МС	50,0 мл/л,
Микросоли по МС	1,0 мл/л,
CaCl2	348,5 мг/л
Fe-хеллат по МС	5,0 мл/л
Тиамин	1,0 мг/л
Пиридоксин	1,0 мг/л
Сахароза	20,0 г/л
Канамицин сульфат (добавлять после
автоклавирования (холодной
стерилизации))	50,0 мг/л
Цефотаксим (добавлять после
автоклавирования (холодной
стерилизации))	200,0 мг/л
Агар	7,0 г/л
pH	5,8
Дистиллированная вода	до 1 л среды,

затем проводят первый этап отбора форм, устойчивых к возбудителям фитофтороза и альтернариоза, путем культивирования срезанных регенерантов на среде МС с 50 мл/л канамицина сульфата в течение 30-45 дней при 22-25°C и освещенности 6000-10000 лк при 16-часовом фотопериоде с последующим отбором укоренившихся регенерантов картофеля с зелеными листьями и стеблями, потом проводят второй этап отбора форм, устойчивых к возбудителям фитофтороза и альтернариоза, включающий проверку укоренившихся растений методом ПЦР на наличие целевой ДНК и размножение регенерантов с подтвержденной ПЦР вставкой целевой ДНК микрочеренкованием.

Описание изобретения к патенту

Область применения

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии, в частности к способам получения трансгенных форм картофеля in vitro, устойчивых к возбудителям фитофтороза и альтернариоза, и может быть использовано для создания новых трансгенных форм картофеля, способных давать стабильный урожай в разных почвенно-климатических зонах.

Уровень техники

Известен способ получения форм картофеля, устойчивых к возбудителям фитофтороза и альтернариоза, традиционными методами половой гибридизации с дикими формами картофеля, которые являются донорами R-генов устойчивости ["Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 b MaR9 is conferred by multiple stacked R genes", Hoyoun-Joung Kim; Heung-Ryul Lee; Kwang-Ryong J.O.; Sm Mahdi Mortazavian; Dirk Jan Huigen; Bert Evenhuis; Greert Kessel; Richard G.F. Visser; Evert Jacobsen; Jack H/Vossen. Theor.Appl.Genet.,2012, March,124(5),923-935].

Недостатком этого способа является то, что R-гены устойчивости из диких форм картофеля часто наследуются сцепленно с повышенным содержанием гликоалкалоидов и некоторыми другими признаками, снижающими качество урожая, а именно низкий урожай клубней, пониженное содержание крахмала. Очень трудно получить формы картофеля, сочетающие повышенную устойчивость как к фитофторозу, так и к альтернариозу методом традиционной селекции. Кроме того, метод традиционной селекции трудоемок и ведет к большим затратам времени (10-15 лет).

Задача изобретения

Задачей изобретения является создание нового способа получения форм картофеля in vitro, устойчивых к возбудителям фитофтороза и альтернариоза, преодолевающим недостатки традиционной селекции, что приведет к получению форм картофеля с повышенной устойчивостью как к возбудителю фитофтороза, так и альтернариоза при сохранении сортовых признаков.

Решение задачи

Поставленная задача решается созданием нового способа получения форм картофеля in vitro, устойчивых к возбудителям фитофтороза и альтернариоза, заключающегося в том, что листовые экспланты, вычлененные из тридцатидневных асептических растений исходных сортов, выращенных в сосудах 1 л, помещают в чашки Петри с жидкой средой следующего состава:

Макросоли по Мурасиге - Скугу (МС)	50,0 мл/л,
Микросоли по МС	1,0 мл/л,
CaCl 2	348,5 мг/л
Fe-хеллат по МС	5,0 мл/л
Тиамин	1,0 мг/л
Пиридоксин	1,0 мг/л
Глюкоза	16,0 г/л
Гидролизат козеина	1,0 г/л
Мезоинозит	100,0 мг/л
Нафтилуксусная кислота (НУК)	5,0 мг/л
Бензиламинопурин	0,2 мг/л
рН	5,8
Дистиллированная вода	до 1 л среды

и прединкубируют в течение 18-24 часов и температуре 22-24°C, затем вносят пипеткой 300 мкл на одну чашку ночной суспензионной культуры агробактерии, несущей плазмиду с геном антимикробного пептида proSmAMP-1 из звездчатки средней (мокрицы) -(Stellaria media L.), кокультивируют с агробактериальной суспензией в течение 15-30 мин при периодическом встряхивании, обсушивают между листами стерильной фильтровальной бумаги и помещают в другие чашки Петри с аналогичной средой и посткокультивируют в течение 18-24 часов при температуре 22-24°C на рассеянном свету, затем экспланты таким же образом обсушивают и переносят в чашки Петри с аналогичной средой с добавлением 7 г/л агара и 800 мг/л цефотаксима и инкубируют в течение 5-7 суток на рассеянном свету при 22-24°C, затем переносят на регенерационные среды состава:

Макросоли по МС	50,0 мл/л,
Микросоли по МС	1,0 мл/л,
CaCl2	348,5 мг/л
Fe-хеллат по МС	5,0 мл/л
Тиамин	1,0 мг/л
Пиридоксин	1,0 мг/л
Глюкоза	16,0 г/л
Гидролизат козеина	1,0 г/л
Мезоинозит	100,0 мг/л
Биотин	1,0 мг/л
Кальций пантетонат	5,0 мг/л
Аденинсульфат	40,0 мг/л
НУК	0,1 мг/л
Зеатин	2,0 мг/л*
Цефотаксим	800,0 мг/л*
Агар	7,0 г/л
рН	5,8
Дистиллированная вода	до 1 л среды

* Добавлять после автоклавирования (холодной стерилизации)

и культивируют в течение 10-14 суток при 22-25°C и освещенности 6000-10000 лк, затем культивируют на аналогичной среде с цефотаксимом 500 мг/л и канамицин сульфатом (Km) 15 мг/л 3 пассажа по 21 дню, затем культивируют 1 пассаж без канамицина сульфата и снова 3 пассажа с канамицином, при появлении регенерантов размером не менее 10 мм их срезают и переносят на среду состава:

Макросоли по МС	50,0 мл/л,
Микросоли по МС	1,0 мл/л,
CaCl2 -	348,5 мг/л
Fe-хеллат по МС	5,0 мл/л
Тиамин	1,0 мг/л
Пиридоксин	1,0 мг/л
Сахароза	20,0 г/л
Канамицин сульфат	50,0 мг/л*
Цефотаксим	200,0 мг/л*
Агар	7,0 г/л
рН	5,8
Дистиллированная вода	до 1 л среды

*Добавлять после автоклавирования (холодной стерилизации);

затем проводят первый этап отбора: срезанные регенеранты культивируют на среде МС с 50 мл/л Km в течение 30-45 дней при 22-25°C и освещенности 6000-10000 лк при 16-часовом фотопериоде, далее отбирают укоренившиеся регенеранты картофеля с зелеными листьями и стеблями, потом проводят второй этап отбора: укоренившиеся растения проверяют методом ПЦР (Метод создания конструкций, метод ПЦР-анализа: «Генная инженерия растений», лабораторное руководство, Москва, «Мир», 1991 под редакцией Дж. Дрейпера, Р. Скотта, Ф. Армитиджа, Р. Уолдена, стр.304-383.) на наличие целевой ДНК и регенеранты с подтвержденной ПЦР вставкой целевой ДНК размножают микрочеренкованием для проведения дальнейших исследований.

Сущность изобретения

Сущность изобретения заключается в том, что встройка плазмиды с вектором экспрессии, содержащим ген антимикробного пептида proSmAMP-1 из звездчатки средней (мокрица) -(Stellaria media L.), обеспечивает повышение устойчивости картофеля одновременно к двум признакам: возбудителям фитофтороза и альтернариоза.

Новизна изобретения

Новизной изобретения является вся совокупность заявляемых признаков. При получении трансгенных форм картофеля заявляемым способом происходит повышение общего адаптационного потенциала растения картофеля.

Выход за заявленные пределы интервалов

При прединкубации эксплантов менее 18 часов не накапливается достаточного числа клеток на нужной стадии клеточного цикла, способных акцептировать целевую ДНК. Увеличение длительности прединкубации более 24 часов ведет к гибели эксплантов. Температура прединкубации ниже 22°C и выше 24°C ведет к уменьшению числа клеток, способных акцептировать целевую ДНК.

При кокультивации с агробактериальной суспензией менее 15 минут частота встройки целевой ДНК очень низка. При кокультивации свыше 30 минут происходит гибель эксплантов вследствие избыточного заражения агробактерией.

При посткокультивации менее 18 часов частота встроек низка, а более 24 часов приводит к гибели эксплантов вследствие избыточного заражения агробактерией, что приводит к загниванию тканей. При посткокультивации при температуре менее 22°C уменьшается число клеточных делений и частота встроек низка. Посткокультивация при температуре выше 24°C приводит к гибели эксплантов вследствие избыточного заражения агробактерией. Добавление цефотаксима необходимо для того, чтобы подавить рост агробактерии, чтобы предотвратить гибель эксплантов.

При инкубировании на рассеянном свету менее 5 суток не удается получить достаточное число клеток, готовых к морфогенезу. Инкубирование более 7 суток приводит к обильному каллусообразованию, что, в свою очередь, приводит к повышению самоклональной вариабельности, что затрудняет выявление форм картофеля с целевой ДНК. Температура 22-24°C оптимальна для клеточных делений. При культивировании менее 10 суток не все клетки со встройкой успевают перейти к регенерации, что удлиняет процесс получения регенерантов. Удлинение же этого периода более 14 суток приводит к снижению уровня цитокинина (зеатина) в среде и гибели эксплантов. Данный температурный 22-25°C и световой режим - освещенность 6000-10000 лкс и 16-часовой фотопериод - является оптимальным для регенерации растений картофеля. Культивирование на регенерационной среде с цефотаксимом менее 500 мг/л приводит к обильному росту агробактерии и гибели эксплантов, а более высокие концентрации цефотаксима токсичны для регенерирующих тканей. Концентрация канамицин сульфата 15 мг/л ниже 1/3 летальной дозы для растений. При культивировании в более 3 пассажей накапливается предельное содержание канамицин сульфата в тканях, которое может привести к гибели эксплантов, а культивирование в менее 1 пассажа без канамицина сульфата в течение 21 дня приводит к снижению его концентрации в тканях и позволяет культуре дальше регенерировать. При срезании и перенесении регенерантов размером менее 10 мм на среду для укоренения с канамицин сульфатом происходит замедление укоренения, роста и гибель побега.

Все полученные растения проверяют методом ПЦР на наличие вставки целевой ДНК (Метод создания конструкций, метод ПЦР-анализа: «Генная инженерия растений», лабораторное руководство, Москва, «Мир», 1991 под редакцией Дж. Дрейпера, Р. Скотта, Ф. Армитиджа, Р.Уолдена, стр.304-383).

Результаты изобретения

Результаты исследования полученных растений представлены в таблицах 1,2,3,4,5. Таблица результатов заражения клубней трансгенных растений с геном proSmAMP - 1 возбудителем альтернариоза не приводится, так как заражение клубней не приводит к значительным потерям при хранении

Как показывают результаты таблицы 1, эффективность трансформации повышается при использовании в качестве исходных эксплантов листьев тридцатидневных асептических растений картофеля шириной 8-10 мм,

выращенных в сосудах 1 л для сорта Удача с 3,57 до 6, 67%, для сорта Скороплодный -29 с 36 до 90%, а для сорта Скороплодный -7 с 3,03 до 33,3%.

Из таблицы 2 следует, что использование заявленного способа позволяет повысить устойчивость листьев трансгенных растений с геном proSmAMP-1 к возбудителю фитофтороза. (%) трансгенных линий, превосходящих по устойчивости листьев к фитифторозу исходный сорт, для сорта Скороплодный-7 составляет 41,38%; для сорта Скороплодный -29 - 45,45%; для сорта Удача - 100%; для сорта Жуковский ранний - 77,42%.

Из таблицы 3 следует, что встройка гена proSmAMP - 1 приводит к снижению индекса поражения у трансгенных растений, что означает повышение устойчивости к альтернариозу. (%) трансгенных линий, превосходящих по устойчивости к альтернариозу исходный сорт для сорта Скороплодный-7, составляет 68,42%; для сорта Скороплодный -29 - 66,67%; для сорта Удача - 100%; для сорта Жуковский ранний - 83,33%. Из таблицы 4 следует, что использование заявленного способа позволяет повысить устойчивость клубней трансгенных растений с геном proSmAMP-1 к возбудителю фитофтороза. % трансгенных линий, превосходящих по устойчивости клубней к фитифторозу исходный сорт, для сорта Скороплодный - 7 составляет 89,47%; для сорта Скороплодный-29 - 71,43%; для сорта Удача - 75%; для сорта Жуковский ранний - 78,95%.

Из таблицы 5 следует, что использование заявленного способа позволяет повысить устойчивость трансгенных растений с геном proSmAMP-1 к возбудителю фитофтороза и альтернариоза одновременно. (%) трансгенных линий, сочетающих устойчивость к обоим патогенам, для сорта Скороплодный-7 составляет 39,1%; для сорта Скороплодный - 29-33,3%; для сорта Удача - 25,0%; для сорта Жуковский ранний - 45,0%.

Таблица 1.
Эффективность агробактериальной трансформации листовых эксплантов картофеля геном proSmaAMP-1 из звездчатки средней (Stellaria media L.).
Исходный сорт	Количество исходных эксплантов, шт.	Ширина листа, мм	Количество выживших эксплантов, шт	% выжив ших эксплантов	Количество регенерантов, укоренившихся на Km 50 мг/л	Количество трансгенных линий (по ПЦР)	% трансгенных линий
Удача	28	5	3	10,71	1	1	3,57
	15	9	12	80	5	1	6,67
	20	10	15	75	4	1	5
Скороплодный-29	25	9	19	68,42	13	9	36
	20	8	17	85	19	18	90
Скороплодный-7	12	9	10	83,33	5	4	33,33
	33	5	12	36,36	1	1	3,03

Таблица 2.
Результаты оценки устойчивости листьев трансгенных растений картофеля с геном proSmAMP-1 к возбудителю фитофтороза*.
Исходный сорт	Показатели устойчивости исходного сорта, балл	Количество оцененных трансгенных линий, шт.	Показатели устойчивости трансгенных линий, балл	% трансгенных линий, превосходящих по устойчивости исходный сорт
Скороплодный-7	5,10-5,33	58	5,5-7,5	41,38
Скороплодный-29	3,30-4,83	11	5,3-8,8	45,45
Удача	4,0-5,56	4	6,0-6,6	100
Жуковский ранний (восприимчи вый стандарт)	3,89-4,33	31	4,8-5,7	77,42
Никулинский (устойчивый стандарт)	7,56-9,0
* «Методические указания по оценке селекционного материала картофеля на устойчивость к фитофторозу, ризоктониозу, бактериальным болезням и механическим повреждениям.» Шнейдер Ю.И., Яшина И.М., Ерохина С.А., Филина Н.И., Воловик А.С., Захарова - Кукушкинас Л.Н., РАСХН, 1980, с.46

Таблица 3.
Результаты оценки устойчивости листьев с геном proSmAMP-1 трансгенных растений картофеля с геном proSmAMP-1 к возбудителю альтернариоза по показателю индекса поражения.
Исходный сорт	Индекс поражения исходного сорта, %	Количество оце ненных транс генных линий, шт.	Индекс поражения трансгенных линий, %	% трансгенных линий, превосходящих по устойчивости исходный сорт
Скороплодный-7	35,8 -47,39	38	3,77-29,9	68,42
Скороплодный-29	21,55-21,92	9	2,56-19,33	66,67
Жуковский ранний	31,76-31,96	18	7,69-23,02	83,33
Удача	41,06-48,46	4	14,4-26,54	100
Никулинский (устойчивый стандарт)	0,2-3,35

Методика оценки устойчивости растений картофеля к возбудителю альтернариоза (Козловский Б.Е., Квасенюк И.Я. «Стимуляция спороношения Macrosporium solani Ell. Et. Mart. На питательной среде с помощью экстракта листьев картофеля», 1984, Микология и фитопатология, т.18, вып.2, стр.139-140).

Таблица 4
Результаты заражения клубней трансгенных растений с геном proSmAMP-1 зооспорами возбудителя фитофтороза*.
Исходный сорт	Устойчивость клубней исходного сорта, балл	Количество изученных трансгенных линий, шт.	Показатели устойчивости трансгенных линий, балл	% линий с показателем устойчивости выше, чем у исходного сорта
Скороплодный-7	6,1	19	6,3-9	89,47
Скороплодный-29	5,9	7	7,0-8,1	71,43
Удача	7,1	4	9,0	75,00
Жуковский ранний (восприимчи вый стандарт)	4,8	18	6,1-9,0	78,95
Никулинский (устойчивый стандарт)	9,0
* «Методические указания по оценке селекционного материала картофеля на устойчивость к фитофторозу, ризоктониозу, бактериальным болезням и механическим повреждениям.» Шнейдер Ю.И., Яшина И.М., Ерохина С.А., Филина Н.И., Воловик А.С., Захарова - Кукушкинас Л.Н., РАСХН, 1980, с.47

Таблица 5.
Результаты оценки устойчивости листьев трансгенных растений картофеля с геном proSmAMP-1 к возбудителю альтернариоза и фитофтороза.
Исходный сорт	Количество	Количество	% трансгенных
	изученных	трансгенных линий,	линий, устойчивых к
	трансгенных линий,	устойчивых к обоим	обоим патогенам
	шт.	патогенам, шт.
Скороплодный-7	23	9	39,1
Скороплодный-29	9	3	33,3
Удача	4	1	25,0
Жуковский ранний	20	9	45,0