клостридиальные нейротоксины с измененной персистентностью

Формула изобретения

1. Полипептид для лечения любого состояния, которое ассоциировано с гиперактивной холинэргической иннервацией мышцы или экзокринной железы, содержащий:

(a) НС-домен с биологической активностью нейротоксичного компонента клостридиального токсина или его фрагмент, в котором аминокислотная последовательность указанного домена НС по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности нейротоксичного компонента ботулотоксина серотипа А, В, С1, D, Е, F или G; и

(b) первый домен LC с биологической активностью нейротоксичного компонента клостридиального токсина или его фрагмент, в котором аминокислотная последовательность указанного домена LC по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности нейротоксичного компонента ботулотоксина серотипа А, В, С1, D, Е, F или G; и

(c) по меньшей мере, один дополнительный домен LC с биологической активностью нейротоксичного компонента клостридиального токсина или его фрагмент, в котором аминокислотная последовательность указанного домена LС по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности нейротоксичного компонента ботулотоксина серотипа А, В, С1, D, Е, F или G, и где первый и по меньшей мере один дополнительный домен LC могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга, и где каждый указанный фрагмент указанного первого и указанного по меньшей мере одного дополнительного домена LC проявляет протеолитическую активность, и в котором домены соединены посредством связи, пептидного линкера или комбинацией двух или более из вышеуказанного.

2. Полипептид по п.1, в котором домены соединены посредством химического линкера.

3. Полипептид по п.1, выбранный из группы, состоящей из:

LCBoNT/A-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/C-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/B-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/A-LCBoNT/C-HCBoNT/C, LCBoNT/C-LCBoNT/C-HCBoNT/C и LCBoNT/B-LCBoNT/C-HCBoNT/C.

4. Нуклеиновая кислота, кодирующая клостридиальный токсин с измененной персистентностью, представляющий собой полипептид по п.1.

5. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.4.

6. Клетка-хозяин для экспрессии полипептида по п.1, содержащая нуклеиновую кислоту по п.4.

7. Клетка-хозяин для экспрессии полипептида по п.1, содержащая вектор по п.5.

8. Способ получения полипептида по п.1, включающий в себя стадии культивирования клетки-хозяина по п.6, и продукции и очистки полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по п.4.

9. Композиция для лечения любого состояния, которое ассоциировано с гиперактивной холинэргической иннервацией мышцы или экзокринной железы, содержащая эффективное количество полипептида по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.

10. Композиция по п.9 для применения для терапевтического лечения, где указанное терапевтическое лечение включает лечение фокальной дистонии, спастичности или состояния, которое можно лечить подавлением секреции.

11. Применение полипептида по п.1 для косметической процедуры, направленной на любой признак, выбранный из морщинок, гусиных лапок, нахмуривания бровей, асимметрии лица, впадины на подбородочной мышце, морщин от нахмуренных бровей над переносицей, морщин на лбу, вертикальных морщин, идущих от уголков губ к подбородку, подтягивания жевательной мышцы и морщин курильщика.

12. Применение композиции по п.9 для косметической процедуры, направленной на любой признак, выбранный из морщинок, гусиных лапок, нахмуривания бровей, асимметрии лица, впадины на подбородочной мышце, морщин от нахмуренных бровей над переносицей, морщин на лбу, вертикальных морщин, идущих от уголков губ к подбородку, подтягивания жевательной мышцы и морщин курильщика.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к клостридиальным нейротоксинам, например ботулиническим нейротоксинам, которые изменены в отношении их белковой структуры по сравнению с соответствующими нейротоксинами дикого типа. Указанное отличие в белковой структуре приводит, среди прочего, к измененному периоду активности, например, пролонгированной активности или персистентности.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Химическая денервация относится к применению средства для предотвращения стимуляции нервом его ткани-мишени, например мышцы, железы или другого нерва. Химическую денервацию осуществляют, например, фенолом, этиловым спиртом или ботулотоксином. Химическая денервация целесообразна, например, для пациентов с локальной спастичностью в одной или в двух больших мышцах или в нескольких мелких мышцах. Ее можно использовать для снятия таких симптомов, как мышечный спазм и боль, и снижения гиперрефлексии.

Средства для химической денервации блокируют нейромышечную передачу в нервномышечном соединении, вызывая паралич или парез соответствующих скелетных мышц. Термин «парез» определяют в дальнейшем как состояние, характеризующееся частичной потерей подвижности или нарушенной моторикой. Такое действие осуществляется либо пресинаптическим воздействием посредством ингибирования синтеза или высвобождения ацетилхолина (ACh), либо постсинаптическим воздействием на рецептор ацетилхолина. Примером лекарственных средств, которые действуют пресинаптически, является ботулотоксин, тетродотоксин и столбнячный токсин.

Термин «химическая денервация» также охватывает все эффекты, которые напрямую или косвенно вызваны средством для химической денервации, следовательно, также охватывает восходящие, нисходящие или долговременные эффекты указанного средства для химической денервации. Следовательно, пресинаптические эффекты также охватывают постсинаптические эффекты, воздействия на ткань и/или непрямые воздействия через нейроны спинного мозга или афферентные нейроны.

Одно средство для химической денервации, ботулотоксин, хотя и является одним из наиболее токсичных соединений на сегодняшний день, раньше применялось для лечения большого количества состояний и нарушений, некоторые из которых описаны, например, в PCT/EP 2007/005754. Кроме того, коммерческие формы ботулотоксина типа A, основанные на белковом комплексе ботулотоксина A, доступны под торговым наименованием ботокс^® (Allergan Inc.) и под торговым наименованием диспорт (Ipsen ^® Ltd.), соответственно. Фармацевтическая композиция, основанная на препарате токсина более высокой степени очистки и содержащая нейротоксичный компонент ботулотоксина типа A, не содержащая комплексообразующие белки в выделенной форме, коммерчески доступна в Германии от фирмы Merz Pharmaceuticals GmbH под торговым наименованием ксеомин^®.

Анаэробная, грамположительная бактерия Clostridium botulinum продуцирует мощный полипептидный нейротоксин, ботулотоксин, который вызывает нервно-паралитическое расстройство у людей и животных, называемые ботулизмом. Споры Clostridium botulinum обнаружены в почве и могут прорасти в ненадлежащим образом стерилизованных и герметично закрытых емкостях с продуктами при домашнем консервировании, что является причиной многих из случаев ботулизма. Ботулотоксин A (BoNT/A) является наиболее смертоносным природным биологическим средством, известным людям. Приблизительно 50 пикограмм ботулотоксина (очищенного комплекса нейротоксина) серотипа A является LD ₅₀ для мышей. Однако, несмотря на его токсические воздействия, комплекс ботулотоксина, а также очищенный нейротоксин использовали в качестве терапевтического средства при большом количестве заболеваний.

Ботулотоксины высвобождаются из лизированых культур Clostridium, как правило, в виде белков, ответственных за токсические свойства ботулотоксина (нейротоксичный компонент) совместно с другими бактериальными белками (нетоксичные «комплексообразующие белки» или «клостридиальные белки»), которые совместно образуют комплекс токсина, также обозначаемый как «комплекс ботулотоксина». Комплекс ботулотоксина метастабилен в природе, поскольку его стабильность, по-видимому, зависит от различных факторов, таких как, например, концентрация соли и/или величина pH.

Молекулярная масса комплекса может меняться приблизительно от 300000 до приблизительно 900000 Да, то есть от 300 кДа до приблизительно 900 кДа. Комплексообразующие белки представляют собой, например, различные гемагглютинины. Белки данного комплекса токсина сами по себе не являются токсичными, но, как полагают, придают стабильность нейротоксичному компоненту и ответственны за токсичность при пероральном воздействии при интоксикации Botulinum. Существует семь антигенно различающихся серотипов ботулотоксина, а именно ботулотоксин A_, B, C1, D, E, F и G. Везде, где упомянут ботулотоксин серотипа A, B, C1, D, E, F или G, также охвачены известные варианты серотипов, такие как серотипы A1, A2, A3, A4 и так далее.

Компонент клостридиальных токсинов, ответственный за его высокую токсичность, представляет собой нейротоксичный компонент или белок (Mw 150 кДа, точная молекулярная масса зависит от серотипа). Несколько различных серотипов отличаются по своей аминокислотной последовательности, но все обладают схожей структурой: легкая цепь (LC) приблизительно 50 кДа и тяжелая цепь (HC) приблизительно 100 кДа, которые могут быть связаны одной или несколькими дисульфидными связями (для обзора смотри, например, Simpson LL, Ann Rev Pharmacol Toxicol. 2004; 44:167-93). Нейротоксичный компонент комплекса ботулотоксина первоначально образуется в виде единичной полипептидной цепи. В случае серотипа A, например, протеолитическое преобразование полипептида приводит к появлению активированного полипептида в виде двухцепочечного полипептида, состоящего из тяжелой цепи и легкой цепи, которые связаны дисульфидной связью. У людей тяжелая цепь опосредует связывание с пресинаптическими холинэргическими нервными окончаниями и интернализацию токсина внутрь клетки. Легкая цепь, как полагают, ответственна за токсические эффекты, действуя как цинковая эндопептидаза и расщепляя специфические белки, ответственные за слияние мембран (SNARE-комплекс) (смотри, например, Montecucco C, Shiavo G., Rosetto O: The mechanism of action of tetanus and Botulinum neurotoxins. Arch Toxicol. 1996; 18 (Suppl.): 342-354)).

Термин «ботулотоксин», используемый на всем протяжении настоящей заявки, относится к нейротоксичному компоненту, лишенному любых других клостридиальных белков, но также и к «комплексу ботулотоксина». Термин «ботулотоксин», используемый в настоящем документе, необходим или желателен в случае, когда нет различий между комплексом токсина и нейротоксичным компонентом. «BoNT» или «NT» являются общепринятыми сокращениями для ботулинического нейротоксина или нейротоксина, соответственно. Нейротоксичная субъединица комплекса ботулотоксина обозначается в данном документе как «нейротоксичный компонент» или «нейротоксичный компонент, не содержащий комплексообразующие белки». Получение нейротоксичного компонента ботулотоксина типа A и B описано, например, в международной патентной заявке WO 00/74703.

Несколько серотипов отличаются по продолжительности их терапевтического эффекта: нормальный период активности лекарственных средств с ботулотоксином A при внутримышечном введении людям находится в диапазоне от 3 до 4 месяцев. В единичных случаях период может продолжаться даже более чем 12 месяцев. В ходе обработки потовых желез сообщали об активности даже 27 месяцев (Bushara K., botulinum toxin and rhinorrhea, Otolaryngol. Head. Neck. Surg., 1996; 114(3):507 и The Laryngoscope 109: 1344 1346:1999). Период активности ботулотоксина типа C1 сравним с периодом активности ботулотоксина A (Eleopra et al., 1997 & 2002). К удивлению, период действия гораздо более короткий у грызунов (например, у мышей) по сравнению с людьми: приблизительно 1-2 месяца для ботулотоксина A, 21 день для ботулотоксина B и только 4 дня для ботулотоксина E (DePaiva et al., 1999, Juradinski et al., 2001).

Foran et al. в 2003 г. анализировал период действия in vitro на нейронах мозжечка крыс и обнаружил, что период полуингибирования экзоцитоза глутамата для ботулотоксина A составляет более чем 31 день; для ботулотоксина типа C1 - более чем 25 дней; для ботулотоксина типа B - приблизительно 10 дней; для ботулотоксина типа F - приблизительно 2 дня и для ботулотоксина типа E - только 0,8 дня.

Период активности ботулотоксина типа A при лечении, например, дистонии (например, кривошея, блефароспазм) у людей находится в диапазоне от 3 до 4 месяцев. Через данный период пациент должен получать другую инъекцию содержащего ботулотоксин лекарственного средства. Было бы большой выгодой для пациента пролонгировать период действия нейротоксина. При этом сократилось бы количество необходимых инъекций в год, а также общее количество клостридиальных белков. Это, в свою очередь, уменьшило бы риск продукции антитела против чужеродного белка. Следовательно, было бы желательно появление ботулотоксина с пролонгированной персистентностью.

Тем не менее продолжительная парализация не всегда желательна. Например, при определенных косметических процедурах иногда требуются только временные «тонкие корректировки». Для достижения уменьшения персистентности врач ограничивался способами предшествующего уровня техники: либо уменьшением объема, либо заменой серотипа. Данные методики, как оказалось, приводили к неудовлетворяющим результатам и требовали глубокого знания как кинетики активности, так антигенных свойств различных серотипов нейротоксина. Следовательно, появление нейротоксина со «встроенной» регулировкой персистентности было бы основным усовершенствованием.

В US 2003/0219462, EP1849801 и WO 02/08268 описаны модифицированные ботулотоксины с добавленными к природному нейротоксину мотивами на основе лейцина или тирозина.

Идея для таких изменений основана на наблюдении, что определенные мотивы на основе лейцина или тирозина способны ограничивать легкую цепь нейротоксичного компонента определенных подтипов внутренней мембраной клетки-мишени. Данный механизм, как предполагается, изменял персистентность определенных легких цепей. До сих пор тем не менее авторы были не в состоянии предоставить какие-либо свидетельства для такого действия и из более новых экспериментов предполагают, что гипотеза в целом неточна.

Более того, даже если в определенных случаях добавление мотивов приводило бы к ограничению мембраной, такой подход неприменим к модификации ботулотоксина A. Это от того, что природная легкая цепь ботулотоксина типа A уже ограничена внутренней клеточной мембраной, следовательно, дополнительное ограничение мембраной не обеспечило бы никакого дополнительного благоприятного действия.

Следовательно, настоящее изобретение следовало по различным направлениям. Как описано в данной заявке, было обнаружено, что добавление второй легкой цепи к нейротоксину, которая по-прежнему сохраняет свою протеолитическую активность, приводит к изменению периода активности. В зависимости от комбинации используемых серотипов период времени можно продлить, позволяя получать изготовленные для определенных целей нейротоксины. Предусматривается предоставить врачу ряд нейротоксинов, персистентность которых не зависит от их серотипа, позволяя проводить более стандартизованное лечение.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к клостридиальным нейротоксинам, в одном из вариантов осуществления к ботулотоксинам, с увеличенной или пролонгированной активностью, то есть персистентностью. Таким образом, в первом аспекте настоящая заявка относится к полипептиду, содержащему:

(a) HC-домен нейротоксичного компонента клостридиального токсина или его фрагмент; и

(b) первый домен LC нейротоксичного компонента клостридиального токсина или его фрагмент; и

(c) по меньшей мере, один дополнительный домен LC нейротоксичного компонента клостридиального токсина или его фрагмент, где первый и, по меньшей мере, один дополнительный домен LC могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга и где каждый из указанных фрагментов указанного первого и указанного, по меньшей мере, одного дополнительного домена LC по-прежнему проявляет протеолитическую активность.

В одном из вариантов осуществления элементы и/или домены соединены связью, пептидным линкером, химическим линкером, дисульфидной связью или посредством комбинации двух или более из указанного выше.

В одном из вариантов осуществления аминокислотная последовательность указанного домена LC и/или HC обладает, по меньшей мере, 50% идентичностью с аминокислотной последовательностью нейротоксичного компонента ботулотоксина серотипа A, B, C _, D, E, F или G.

В другом варианте осуществления аминокислотная последовательность указанного домена LC и/или HC обладает, по меньшей мере, 50% идентичностью с аминокислотной последовательностью столбнячного токсина (тетаноспазмина).

В одном из вариантов осуществления первый и/или второй домен LC и/или домен HC содержит, по меньшей мере, одну модификацию.

В одном из вариантов осуществления модификация представляет собой мутацию, в другом варианте осуществления - делецию, в еще одном варианте осуществления - инсерцию, в еще одном варианте осуществления - добавление или в еще одном варианте осуществления - аминокислотную замену, или в дополнительном варианте осуществления комбинацию двух или более из указанного выше.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к полипептиду, где связывающий ганглиозид домен и/или связывающий белковый рецептор домен нейротоксина модифицирован так, чтобы увеличить связывающую способность по сравнению с нейротоксином дикого типа, из которого происходит домен HC.

В одном из вариантов осуществления полипептид выбран из группы, состоящей из:

LCBoNT/A-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/C-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/B-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/A-LCBoNT/C-HCBoNT/C, LCBoNT/C-LCBoNT/C-HCBoNT/C, LCBoNT/B-LCBoNT/C-HCBoNT/C и LCTeNT-LCBoNT/A-HCBoNT/A.

В очередном варианте осуществления модификация представляет собой химическую модификацию, где химическую модификацию можно выбрать из группы, состоящей из фосфорилирования, пегилирования, гликозилирования, фосфорилирования, сульфатирования, метилирования, ацетилирования, липидизации, гидроксилирования, амидирования или, в дополнительном варианте осуществления, комбинации двух или более из указанного выше. В дополнительном варианте осуществления липидизация может представлять собой миристиолирование, пальмитоилирование, изопренилирование или связывание с глюкозилфосфатидилинозитолом или, в дополнительном варианте осуществления, комбинацию двух или более из указанного выше.

В изобретении также описано антитело, специфичное для любого из упомянутых выше полипептидов.

В изобретении также описана нуклеиновая кислота, кодирующая любой из описанных выше полипептидов. В изобретении, кроме того, описан вектор, содержащий указанную нуклеиновую кислоту или ее фрагмент. Клетка-хозяин, содержащая указанную нуклеиновую кислоту или указанный вектор, также описана в настоящем документе.

В изобретении также описан способ получения полипептида, включающий в себя стадии культивирования клетки-хозяина, как упоминалось выше, получения и очистки указанного полипептида, кодируемого указанной нуклеиновой кислотой или вектором и, необязательно, составление смеси указанного полипептида в фармацевтической композиции.

Изобретение, кроме того, описывает композицию, содержащую упомянутый выше полипептид или полипептид, получаемый упомянутым выше способом. В изобретении также описана указанная композиция, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления композиция дополнительно содержит буфер pH, эксципиент, криозащитное средство, консервант, обезболивающее средство, стабилизатор или любое их сочетание. В одном из вариантов осуществления композиция предлагается в виде лиофилизата. В другом осуществлении предлагается композиция в виде раствора.

В изобретении также описаны композиции для применения при терапевтическом лечении.

В изобретении также описано применение указанных композиций для промышленного производства лекарственных препаратов для терапевтического лечения.

В одном из вариантов осуществления указанное терапевтическое лечение включает лечение фокальной дистонии, спастичности или состояния, которое можно лечить, подавляя секрецию.

В изобретении также описано применение указанной композиции для косметической процедуры. При такой косметической процедуре может быть очень хорошо, что лечение получают, в особенности, млекопитающие, которые психологически страдают от состояния, например от морщинок или глубоких морщин от нахмуренных бровей над переносицей, которое необходимо вылечить.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к:

полипептиду, содержащему:

(a) домен HC нейротоксичного компонента или его фрагмент клостридиального токсина; и

(b) первый домен LC или его фрагмент, и

(c) по меньшей мере, один дополнительный домен LC или его фрагмент, где первый и второй домен LC могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга.

В частности, изобретение относится к полипептиду, содержащему:

(a) HC-домен или его фрагмент нейротоксичного компонента клостридиального токсина; и

(b) первый домен LC или его фрагмент нейротоксичного компонента клостридиального токсина; и

(c) по меньшей мере, один дополнительный домен LC или его фрагмент нейротоксичного компонента клостридиального токсина, где первый и, по меньшей мере, один дополнительный домен LC могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга, и где каждый из указанных фрагментов указанного первого и указанного, по меньшей мере, одного дополнительного домена LC по-прежнему проявляет протеолитическую активность.

К удивлению, было обнаружено, что добавление одной или нескольких (дополнительных) легких цепей (LC) к полипептиду, содержащему, по меньшей мере, одну тяжелую цепь (HC) и, по меньшей мере, одну легкую цепь (LC) нейротоксичного компонента клостридиальных нейротоксинов, как определено выше, приводит к появлению полипептида с увеличенной, то есть пролонгированной персистентностью активности токсина по сравнению с токсином дикого типа.

Не привязываясь к теории, предполагают, что после связывания с поверхностью клетки обе легкие цепи перемещаются внутрь клетки, увеличивая концентрацию протеолитически активных белков в клетке, тем самым увеличивая как активность, так и персистентность нейротоксина.

А именно, если требуется продолжительная персистентность полипептида по изобретению, специалист в данной области, как инструктируют, применяет определенные комбинации доменов HC и LC, например домены LC, полученные из серотипов с продолжительной персистентностью. В других вариантах осуществления более короткую персистентность обеспечивают, комбинируя определенные другие домены LC или фрагменты, например, такие домены, происходящие из серотипов с более короткой персистентностью.

Термин «персистентность», как применяют в настоящем документе, описывает период действия нейротоксичного компонента. В основном, он представляет собой период до тех пор, пока активное средство проявляет хотя бы половину своей активности по сравнению с его первоначальной активностью. Следовательно, термин «персистентность» можно использовать синонимично с термином «полупериод активности» или термином «полупериод метаболической стабильности», который определяет момент времени, когда только одна половина от исходной концентрации белка активна вследствие метаболических процессов, то есть время полужизни, пока белок не метаболизируется. Поскольку время полужизни белка коррелирует с продолжительностью терапевтического эффекта, термин «персистентность» также косвенно охватывает продолжительность воздействия или влияния, вызванного нейротоксичным компонентом, на клеточную функцию.

Специалисту известны различные анализы для определения персистентности. Согласно идее по настоящему изобретению персистентность можно определить в анализе подвижности мыши (Keller JE., 2006, Neuroscience. 139(2):629-37). Данный анализ позволяет определить корреляцию персистентности с двигательной активностью. Альтернативно, персистентность можно определить при анализе расщепления SNAP-25, который позволяет определить корреляцию протеолитической активности с персистентностью. Эффект увеличенной персистентности имеет место, если увеличение персистентности можно определить в одном из описанных выше анализов, где анализ расщепления SNAP-25 является предпочтительным.

Термин увеличенная персистентность и пролонгированная персистентность применяется в настоящем документе взаимозаменяемо.

Для определения влияния дополнительной цепи LC или фрагмента цепи LC на полипептид по изобретению в отношении персистентности полипептид по изобретению сравнивают с соответствующим полипептидом, не имеющим указанную добавленную (дополнительную) цепь LC. Он может представлять собой, например, полипептид по изобретению, у которого удалили дополнительную цепь LC. Любой из анализов персистентности, известных специалисту в данной области, можно использовать для определения персистентности. В одном из вариантов осуществления персистентность определяют, как описано в настоящем документе выше или в примерах, иллюстрирующих изобретение.

В другом варианте осуществления предусмотрена пролонгация персистентности короткодействующих серотипов нейротоксина. Например, персистентность серотипа E можно пролонгировать, добавляя легкие цепи серотипов с более длительной активностью, например серотипа A, тем самым получая нейротоксин с похожей персистентностью, как и ботулотоксин A дикого типа. Поскольку большинство антигенных эпитопов нейротоксина расположены на субъединице тяжелой цепи, данную модификацию можно использовать для того, чтобы применять нейротоксин у пациентов, у которых развился иммунный ответ в отношении определенного серотипа. Таким образом, комбинируя благоприятные эффекты получения другого серотипа, сохраняют предшествующий период активности

Как указано выше, термины « C-домен» и «LC-домен» относятся, соответственно, к тяжелой цепи и легкой цепи нейротоксичного компонента нейротоксина, либо дикого типа, либо рекомбинантного происхождения. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления домены HC и/или LC происходят из различных серотипов и/или различных токсинов. Данным определением также охватываются фрагменты легкая цепь и тяжелая цепь. HC- и LC-домен можно дополнительно далее разделить на субдомены.

Термин «дополнительный домен LC или его фрагмент», как применяют в настоящем документе, относится к одному или нескольким, например двум доменам LC. Согласно идее по настоящему изобретению полипептид по изобретению может содержать также дополнительные добавочные домены LC или его фрагменты. Например, полипептид по изобретению может содержать домен HC нейротоксичного компонента клостридиального токсина и первый домен LC или его фрагмент, и второй домен LC или его фрагмент и третий домен LC или его фрагмент.

В одном из вариантов осуществления указанный фрагмент указанного первого и указанного дополнительного домена LC проявляет протеолитическую активность LC дикого типа.

Для получения эффекта увеличенной персистентности никакой мотив на основе лейцина или тирозина (как описано в US 2003/0219462, EP1849801 и WO 02/08268) не является необходимым или не является желательным. Следовательно, в одном из вариантов осуществления дополнительная легкая цепь не содержит никакого из указанных мотивов.

В одном из вариантов осуществления модифицированный нейротоксин не содержит мотив на основе лейцина, содержащий семь аминокислот, где первые пять аминокислот, начинающиеся на амино-конце мотива на основе лейцина, образуют «квинтет аминокислот» и следующие две аминокислоты образуют «дублет аминокислот», и где квинтет аминокислот содержит, по меньшей мере, одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из глутамата и аспартата; и дуплет аминокислот содержит, по меньшей мере, аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из изолейцина и лейцина.

В другом варианте осуществления модифицированный нейротоксин не содержит никакой из последовательностей FEFYKLL, EEKRAIL, EEKMAIL, SERDVLL, VDTQVLL, AEVQALL, SDKQNLL, SDRQNLI, ADTQVLM, SDKQTLL, SQIKRLL, ADTQALL и NEQSPLL.

Термин «одинаковый», используемый в настоящем документе, относится к домену LC с идентичной аминокислотной последовательностью, то есть со 100% идентичностью аминокислотных последовательностей. Следовательно, например, второй домен LC, как применяют в настоящем документе, который «одинаков», обозначает, что он идентичен по аминокислотной последовательности указанному домену LC. С другой стороны, второй домен LC, который «отличается», относится ко второму домену LC, который обладает идентичностью последовательности менее чем 100%, то есть, например, 99,95% или менее по сравнению с первым доменом LC. «Отличающийся домен LC» представляет собой домен LC другого серотипа или домен LC с аминокислотной последовательностью, которая отличается от первого домена LC, например, заменой аминокислоты. Другой пример отличающегося домена LC представляет собой домен LC с укороченным N- или C-концом или с внутренней делецией. Еще одним примером отличающегося домена LC является домен LC с химической модификацией. «Отличающийся домен LC» может, следовательно, происходить из того же самого или другого серотипа, соответственно, по сравнению с первым доменом LC. Указанное выше также применимо к «третьему» или любому другому дополнительному домену LC.

В одном из вариантов осуществления серотипы всех доменов HC и LC происходят из ботулотоксина типа A_, в другом варианте осуществления вторая легкая цепь происходит из C1. Тем не менее специалисту в данной области очевидно, что все возможные комбинации серотипов A, B, C1, D, E, F и G охвачены данной заявкой, и специалист способен выбрать подходящую комбинацию на основе опубликованной персистентности различных серотипов. Ни комбинация серотипов, ни количество используемых тяжелых и легких цепей не ограничены данным изобретением. Следовательно, в другом варианте осуществления охвачены более длинные слитые белки, то есть слитый белок с более чем тремя субъединицами, например белок-конкатемер, содержащий три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять доменов LC.

Домены HC и LC, например, нейротоксина A C. botulinum содержат различные субдомены. Домен HC, например, содержит три субдомена, то есть аминоконцевой субдомен транслокации HC_N размером 50 кДа с последующим HC_CN-субдоменом размером 25 кДа и HC_CC-субдоменом размером 25 кДа, расположенным на карбоксильном конце. Взятые вместе, HC_N-, HC_CN - и HC_CC-домены обозначаются как HC-домен.

Соответствующие диапазоны аминокислот соответствующих доменов показаны для различных серотипов BoNT/A и их вариаций в таблице 1.

Термин «фрагмент домена LC», как применяют в настоящем документе, относится к фрагменту домена LC с биологической активностью. Как применяют в настоящем документе, фрагмент с биологической активностью представляет собой фрагмент, который (по-прежнему) проявляет протеолитическую активность, предпочтительно, LC дикого типа, то есть, который способен расщеплять полипептид SNARE-комплекса, такой как, например, синтаксин, SNAP-25 или синаптобревин. Таким образом, биологическую активность можно проверить, например, анализом протеазы SNAP-25, LD₅₀ -анализом, HDA-анализом, и тому подобным. Следовательно, любой LC-домен, который проявляет протеолитическую активность более чем 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и вплоть до 100% протеолитической активности соответствующего LC-домена дикого типа в анализе с SNAP-25 считают «биологически активным» или «проявляющим биологическую активность» в объеме данного изобретения.

Подходящий анализ с SNAP-25 представляет собой, например, «анализ по высвобождению флуоресцентной метки GFP-SNAP25» (WO/2006/020748) или «усовершенствованный эндопептидазный иммуноанализ SNAP25»(Jones et al., Journal of Immunological Methods, Volume 329, Issues 1-2, 1 January 2008, Pages 92-101).

«Фрагмент домена HC», как применяют в настоящем документе, относится к фрагменту домена HC с биологической активностью. Точнее говоря, он представляет собой фрагмент, который по-прежнему способен связываться с природным рецептором домена HC, из которого он происходит. Кроме того, указанный фрагмент также является фрагментом, способным перемещать присоединенный к нему домен LC.

Фрагменты, следовательно, представляют собой, например, полипептиды, из которых 1, 2, 3, 5 или вплоть до 10, 50 или 100 аминокислот были удалены. При этом делеция может представлять собой укорочение с C- или N-конца или внутреннюю делецию.

В некоторых вариантах осуществления домены HC и/или LC дополнительно модифицированы, например, мутацией, делецией, инсерцией, добавлением или заменой аминокислоты. В дополнительных вариантах осуществления HC и/или LC дополнительно химически модифицированы, например, фосфорилированием, пегилированием, гликозилированием, фосфорилированием, сульфатированием, метилированием, ацетилированием, липидизацией (миристиолированием, пальмитоилированием, изопренилированием, связыванием и глюкозилфосфатидилинозитолом), гидроксилированием, амидированием или любой другой подходящей модификацией. Дополнительно связывающий гангиозид домен и/или связывающий домен нейротоксина в одном из вариантов осуществления модифицирован так, чтобы увеличить связывающую способность по сравнению с нейротоксином дикого типа, из которого происходит домен HC. В некоторых вариантах осуществления HC и/или LC содержит маркерную последовательность, то есть другую аминокислотную последовательность, которая позволяет упростить процедуру очистки.

Термин «способ очистки» охватывает все известные в данной области способы для очистки белка. Примерами для способов очистки нейротоксинов являются публикации DasGupta & Sathyamoorthy и WO2000074703, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки. Для дополнительных методических принципов способов очистки, применимых для очистки рекомбинантных нейротоксичных компонентов, представлена ссылка на документы Walker et al., 2002; Harris et al., 1989 и Scopes et al., 1994, которые процитированы ниже в разделе «Литература».

Термин «получение полипептида» охватывает все стадии, необходимые для получения полипептида, то есть, например, конструирование кодирующей нуклеиновой кислоты, встраивание указанной нуклеиновой кислоты в вектор, экспрессия полипептида in vitro и/или в клетке-хозяине, модификации полипептида in vivo и/или in vivo, очистка полипептида и/или получение композиции, содержащей указанный полипептид. Тем самым термин «экспрессия» или «экспрессия гена» определяют в настоящем документе как процесс, посредством которого наследуемая информация в гене, таком как последовательность ДНК, преобразуется в функциональный продукт гена, такой как белок или РНК.

В одном из вариантов осуществления предусматривают, что встраивание в полипептид по настоящему изобретению дополнительных сайтов связывания с рецептором обеспечивает получение нейротоксина, который обладает, помимо увеличенной персистентности, дополнительными характеристиками, создавая возможность для новых заявок, например, нейротоксин со специфичными для клеток сайтами связывания, подходящими, например, для лечения аллергий или боли (WO 2007/13839). Альтернативно, природный сайт связывания, расположенный в домене HC, можно изменить для того, чтобы нацелить полипептид по настоящему изобретению на специфичные типы клеток. В более конкретном примере домен HC по настоящему изобретению.

В одном из вариантов осуществления вторая легкая цепь соединена с N-концом первой легкой цепи. Такое соединение может осуществлять либо напрямую посредством связи или косвенно через линкер. В основном связывание между доменами можно осуществить посредством любой структуры, подходящей для удерживания различных субъединиц вместе, включая, помимо других, непосредственное связывание или связывание через пептидный линкер, через химический линкер или через дисульфидную связь. Указанная связь может представлять собой расщепляемую или нерасщепляемую связь. Расщепляемая связь представляет собой связь, которая расщепляется, например, специфичной для последовательности протеазой. Нерасщепляемая связь представляет собой связь, которая стабильна после клеточного захвата, другими словами, несколько доменов LC, соединенных нерасщепляемой связью, остаются связанными друг с другом даже после перемещения в цитоплазму.

Термины «связь», «связи» или «связывание» описывают любую возможность соединения различных полипептидных цепей друг с другом. В одном осуществлении указанная связь представляет собой химическую связь, например ковалентную связь (например дисульфидную связь), полярную ковалентную связь, ионную связь, координационную ковалентную связь, изогнутые связи, связи 3c-2e и 3c-4e, одно- и трехэлектронные связи, ароматическую связь, металлическую связь, межмолекулярное связывание, связывание постоянного диполя с постоянным диполем, водородную связь, связывание мгновенного диполя с индуцированным диполем (Ван-дер-Ваальса) и/или катион-пи-взаимодействие. Как указано выше, данное определение охватывает непосредственные связи, а также непрямые связи через химические линкеры.

«Химический линкер» определяют в настоящем документе как молекулярную структуру, получаемую химическими способами, которая подходит для соединения различных субъединиц полипептида по настоящему изобретению. Такое химическое связывание можно осуществить, например, при помощи бифункциональных агентов, известных в данной области. В другом варианте осуществления химическое связывание осуществляют при помощи дисульфидных связей, похожих на соединение между тяжелой и легкой цепью в диком типе. В очередном варианте осуществления введение дисульфидной связи осуществляют встраиванием содержащей цистеин последовательности тяжелой цепи (например, аминокислоты 449-459 BoNT/A) в легкую цепь. Дополнительные неограничивающие примеры для таких химических линкеров представляют собой карбоновые кислоты, этоксилированный многоатомный спирт, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и так далее.

«Пептидный линкер» определяют в настоящем документе как пептид длиной 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 или вплоть до 100 аминокислот, который соединяет различные субъединицы полипептида по настоящему изобретению друг с другом. В одном из вариантов осуществления указанный пептидный линкер содержит, по меньшей мере, два цистеина. В другом варианте осуществления линкер содержит один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или вплоть до 20 гистидинов, в другом варианте осуществления линкер представляет собой участок расщепления протеазой. В дополнительном варианте осуществления линкер позволяет получить полный слитый белок рекомбинантными способами.

В другом варианте осуществления участок расщепления протеазой можно встроить между первой и второй легкой цепью, например, участок, которой можно разрезать протеазой E.coli, как они перечислены, например, в DE102005002978, но не ограничивая данные протеазы. В другом варианте осуществления участок расщепления протеазой представляет собой любой из участков распознавания для любой сериновой протеазы (например, химотрипсин, трипсин, эластаза, субтилизин), треониновой протеазы, цистеиновой протеазы (например, папаин, катепсин, каспаза, кальпаин), протеазы аспарагиновой кислоты (например, ВИЧ-протеаза, химозин, ренин, катепсин, пепсин, плазмепсин), металлопротеазы или протеазы глутаминовой кислоты или любого их сочетания.

Специалист в данной области поймет, что данное изобретение подходит не только для применения тяжелой и легкой цепи(ей) дикого типа, но что данным изобретением также охвачены рекомбинантные пептиды и/или гибридные нейротоксичные компоненты. Следовательно, в одном из вариантов осуществления предусмотрен слитый белок из, по меньшей мере, одной тяжелой цепи, по меньшей мере, одной легкой цепи и, по меньшей мере, второй легкой цепи, в котором, по меньшей мере, один, несколько или все из используемых доменов получают рекомбинантно, в другом варианте осуществления применяют гибридный пептид, то есть пептид состоит из субдоменов из разных серотипов (например, тяжелая цепь, содержащая домен связывания и транслокации из различных серотипов или даже различных токсинов, например, столбнячного токсина, холерного энтеротоксина или коклюшный токсин).

В другом варианте осуществления можно использовать легкую цепь(и) других клостридиальных токсинов, например, Clostridium bifermentans, Clostridium botulinum различных серотипов, Clostridium difficile, Clostridium histolyticum, Clostridium kluyveri, Clostridium novyi, Clostridium oedematiens, Clostridium perfringens, Clostridium ramosum, Clostridium sporogenes, Clostridium tetani, Clostridium tertium или Clostridium welchii, например, в одном из вариантов осуществления применяют столбнячный токсин (также называемый тетаноспазмин или спазмогенный токсин), также как любые вариации и серотипы различных токсинов. Кроме того, связывающуюся с клеткой часть тяжелой цепи можно заменить на полипептидную последовательность, которая обеспечит появление слитого белка с направленным на другую мишень доменом, то есть другой клеточной специфичностью (например, WO 2007/13839). Кроме того, в очередном варианте осуществления изобретения используют тяжелые и легкие цепи, которые изменили молекулярными или биохимическими способами, более предпочтительно, делециями, вставками, аминокислотной заменой или удлинением.

В одном из вариантов осуществления серотип субдомена транслокации HC (то есть, N-концевая часть тяжелой цепи) представляет собой тот же самый серотип, что и субдомен первой LC.

В одном из вариантов осуществления способность LC-домена к расщеплению SNARE-комплекса представляет основной интерес. Следовательно, в одном из вариантов осуществления один из LC- доменов слитого белка заменяют на протеазу IGA из Neisseria gonorrhoeae, которая также обладает способностью к расщеплению SNARE-комплекса.

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к нейротоксинам, которые химически модифицированы, например, пегилированием, гликозилированием, сульфатированием, фосфорилированием или любой другой модификацией, в особенности по одной или нескольким поверхностной или доступной для растворителя аминокислоте(ам).

Более того, в другом варианте осуществления нейротоксин содержит маркерную последовательность, чтобы обеспечить осуществление упрощенных способов очистки. В таких известных способах включения меток применяют низкомолекулярные соединения или пептиды, например биотин, стрептавидин, гистидиновую метку, антигены, фрагменты антител и так далее, которые ковалентно или нековалентно связаны с полипептидом по настоящему изобретению и обеспечивают проведение очистки посредством аффинной хроматографии, шариков или других способов разделения.

Как указано выше, в некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит рекомбинантные домены или полностью получен рекомбинантными способами. Последовательности ДНК всех тяжелых и легких цепей всех серотипов ботулотоксина доступны в базах данных общего пользования. Следовательно, предусмотрено конструирование векторов, несущих требуемые гены для тяжелых и легких цепей, основываясь на информации из этих баз данных. Вектор затем экспрессируют, например, в E.coli для продукции слитого белка. В другом варианте осуществления вектор можно экспрессировать в других экспрессирующих системах, таких как, например, дрожжи, клетки насекомых или клетки CHO. В другом варианте осуществления домены белка получают отдельно и затем соединяют позже химическими способами. Полученный белок затем выделяют известными способами очистки белков, затем, если необходимо, дополнительно подвергают преобразованиям (например, расщепление, химическое связывание или обработка) и применяют в качестве активного средства в фармацевтическом препарате.

В одном из вариантов осуществления модифицированный нейротоксин дополнительно модифицируют для того, чтобы изменить (то есть, увеличить и уменьшить) его аффинность связывания с его рецептором. Аффинность связывания можно определять в сравнении с природным нейротоксином, то есть нейротоксином, полученным из C. botulinum и обладающим аминокислотной последовательностью дикого типа. Альтернативно, анализ связывания можно выполнить с использованием фрагмента указанного нейротоксина. Предпочтительно, указанный нейротоксин получают из C. botulinum. Увеличенная аффинность обозначает, что нейротоксин по изобретению обладает меньшей константой диссоциации по сравнению с немодифицированным нейротоксином. Предпочтительно, природный нейротоксин представляет собой ботулинический нейротоксин серотипа A, включающего в себя подтипы A, которые подробно определены ниже. Получаемый рекомбинантно ботулинический нейротоксин серотипа A, чья аминокислотная последовательность идентична ботулиническому нейротоксину, получаемому из C. botulinum, действует фармакологически идентично или схожим образом относительно природного ботулинического нейротоксина, получаемого из C. botulinum. Такой рекомбинантный нейротоксин можно получить, например, в E. coli, и он общепринято обозначается как «рекомбинантный ботулинический нейротоксин». Анализ связывания можно выполнить с использованием нейротоксина, выделенного из C. botulinum или нейротоксина, получаемого при экспрессии рекомбинантного белка. Предпочтительно, полипептид, активный фрагмент или производное по настоящему изобретению связывается специфически с плазматической мембраной соответствующих молекул, трансмембранными белками, белками синаптических везикул, белком семейства синаптотагминов или гликопротеинами 2 синаптических везикул (SV2), предпочтительно синаптотагмином I и/или синаптотагмином II и/или SV2A, SV2B или SV2C, особенно предпочтительно с синаптотагмином I человека и/или синаптотагмином II человека и/или SV2A, SV2B или SV2C человека. Связывание предпочтительно определяют in vitro. Специалисту известны различные тесты для определения аффинности связывания между первым белком (нейротоксином) и вторым белком (рецептором). Любой такой анализ можно применять для определения влияния мутации на связывание с рецептором. Один такой анализ представляет собой анализ преципитации с GST, который предпочтителен в соответствии с идеей по настоящему изобретению. Данный анализ описан в примерах настоящего изобретения. Поверхностный плазмонный резонанс также можно использовать для исследования аффинности связывания. Экспериментальные условия, следовательно, описаны, например, в Yowler et al., Biochemistry 43 (2004), 9725-9731. Кроме того, аффинность связывания можно оценить, используя изотермическую микрокалориметрию. В одном из вариантов осуществления связывающий ганлиозид домен и/или связывающий белковый рецептор домен нейротоксина модифицируют так, чтобы увеличить связывающую способность по сравнению с нейротоксином дикого типа, из которого получен домен HC. Об этом упоминается в WO2006/027207 A1, WO 2006/114308 A1 и PCT/EP2008/006151 (EP 07014785.5), которые полностью включены в данный документ в качестве ссылки.

В другом варианте осуществления также охвачены изоформы, гомологи, ортологи и паралоги ботулотоксина, для которых показана, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90% и вплоть до 60%, вплоть до 70%, вплоть до 80%, вплоть до 90%, вплоть до 100% идентичности последовательности. Идентичность последовательности можно вычислить при помощи любого алгоритма, подходящего для получения достоверных результатов, например, используя алгоритм FASTA (W.R. Pearson & D.J. Lipman PNAS (1988) 85:2444-2448). Идентичность последовательности можно вычислить, сравнивая два полипептида или два домена, таких как два домена LC или их фрагменты.

В одном из вариантов осуществления полипептид по изобретению представляет собой один из следующих ниже: LCBoNT/A-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/C-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/B-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/A-LCBoNT/C-HCBoNTVC, LCBoNT/C-LCBoNT/C-HCBoNT/C, LCBoNT/B-LCBoNT/C-HCBoNT/C и LCTeNT-LCBoNT/A-HCBoNT/A.

Из данных упомянутых выше нейротоксинов следует особо упомянуть конструкции с дополнительной легкой цепью типа A, вследствие ее превосходной протеолитической активности и стабильности.

Изобретение также относится к антителу, способному специфически связываться с полипептидом по настоящему изобретению.

Термин «антитело» используют в настоящем документе для любого белка или полипептида, который способен специфически связываться с полипептидом по изобретению (например, аминокислоты, элементы первичной, вторичной или третичной структуры, эпитопы, фрагменты и так далее). Примеры для антител представляют собой гамма-глобулины IgA, IgD, IgE_, IgG и IgM, их фрагменты, их модифицированные версии и так далее; также любые генные продукты генов V, D_, J, T-клеточные рецепторы, B-клеточные рецепторы и так далее. Одноцепочечные антитела или модифицированные антитела, такие как гуманизированные антитела, также включены. Поскольку антигены определяются только по их способности связываться с антителом, они представляют собой очень гетерогенную группу. Примеры «антигенов» представляют собой белки; олигопептиды; сахара, липиды, липополисахариды, клеточные, вирусные или бактериальные поверхностные молекулы; макромолекулы и так далее. Термин «специфический» описывает аффинность связывания, достаточно высокую для того, чтобы отличить различные структурные модели, то есть различия между аффинностью для антигена должны быть, по меньшей мере, в 10 раз, 20 раз, 10² раз, 10³ раз, 10⁴ раз, 10 ⁵ раз, 10⁶ раз, 10⁷ раз, 10⁸ раз, вплоть до 10⁹ раз выше, чем аффинность структуры сравнения, которая не является антигеном или эпитопом. В одном из вариантов осуществления указанная структура сравнения не является нейротоксином серотипов от A до G. Антитело по настоящему изобретению специфично для полипептида по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления оно не связывается с нейротоксинами дикого типа (то есть, серотипами от A до G) и/или другими нейротоксинами и/или фрагментами нейротоксинов, известных в данной области, в другом варианте осуществления указанное антитело связывается с гораздо меньшей аффинностью с нейротоксинами дикого типа и/или другими нейротоксинами, известными в данной области, при этом различие в аффинности достаточно велико, чтобы антитело все еще подходило бы для очистки, инактивации токсина и/или для способов определения. Примерами антител по данному изобретению являются такие антитела, которые распознают дополнительный LC-домен(ы) и/или модификации дополнительного LC-домена(ов).

Такие антитела можно получать известными в данной области способами. Кроме того, известно несколько способов как положительно и отрицательно выбрать антитела, которые распознают полипептид по изобретению, а не (или в гораздо меньшей степени) известные нейротоксины и/или фрагменты. Ссылка в качестве примера сделана на документы WO2005/063817, WO2003/029458 и WO2002/086096, которые полностью включены ниже.

Указанное антитело в одном из вариантов осуществления подходит для очистки инактивации токсина и/или для способов определения. Примерами для применения таких антител являются, например, HDA (анализ купола диафрагмы), иммунопреципитация, аффинная хроматография, вестерн-блоттинг и так далее.

Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептид по изобретению. В одном из вариантов осуществления указанная нуклеиновая кислота содержит дополнительные последовательности, известные в данной области, такие как, например, промоторы, энхансеры, бактериальные элементы, IRES-области, концевые кэппирующие структуры и так далее. Данная молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой гяРНК, мРНК, РНК_, ДНК, PNA, LNA и/или молекулы модифицированной нуклеиновой кислотой и так далее. Нуклеиновая кислота может быть кольцевой, линейной или встроенной в геном. Также охвачены ДНК-конкатемеры, кодирующие слитые белки, содержащие три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять доменов LC.

Изобретение также относится к вектору, подходящему для экспрессии in vitro и/или in vivo полипептида по настоящему изобретению. При этом in vivo вектор может быть экспрессирован транзиторно и/или стабильно. В одном из вариантов осуществления вектор, более того, содержит регуляторные элементы и/или маркеры селекции. Указанный вектор в одном из вариантов осуществления основан на вирусном происхождении, в другом варианте осуществления на фаговом происхождении, в еще одном варианте осуществления бактериального происхождения.

Изобретение также относится к прокариотическим и/или эукариотическим клеткам-хозяевам, подходящим для экспрессии указанного вектора и, в частности, полипептида по изобретению. В одном из вариантов осуществления указанная клетка-хозяин клостридиального происхождения, в другом варианте осуществления указанная клетка-хозяин происходит из стандартных клеток для рекомбинантной экспрессии, например, E.coli и так далее. В одном из вариантов осуществления полипептид модифицируют внутри клетки-хозяина (то есть, гликозилируют, фосфорилируют, подвергают действию протеазы и так далее). Следовательно, а предшественники полипептида, и любой промежуточный белковый продукт, и готовый полипептид охвачены данным изобретением.

Полипептид по изобретению может быть частью композиции или фармацевтической композиции. «Фармацевтическая композиция» представляет собой препарат, в котором содержится или в состав которого включен активный ингредиент для применения в качестве лекарственного средства или диагностического средства. Такая фармацевтическая композиция может подходить для диагностического или терапевтического введения (то есть, посредством внутримышечной или подкожной инъекцией) человеку.

Данная фармацевтическая композиция, которую будут применять в настоящем документе, может содержать полипептид по изобретению (то есть, модифицированный нейротоксичный компонент) в качестве единственного активного компонента или может содержать дополнительные фармацевтически активные компоненты, например, гиалуроновую кислоту или поливинилпирролидон, или полиэтиленгликоль, причем такие композиции необязательно стабилизированы по величине pH подходящим буфером pH, в частности, буфером на основе ацетата натрия и/или криозащитного полиспирта.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено, что фармацевтический препарат не содержит никаких белков, обнаруженных в комплексе ботулотоксина, кроме нейротоксичного компонента, который является частью полипептида по настоящему изобретению. Предшественник полипептида по настоящему изобретению может быть расщепляемым или нерасщепляемым, однако, в варианте осуществления особенного интереса предшественник расщепляют на тяжелую и легкую цепи. Как отмечено выше, полипептиды могут представлять собой последовательность дикого типа или могут быть модифицированы по одному или нескольким остаткам. Модификации включают в себя химическую модификацию, например, гликозилированием, ацетилированием, ацилированием или тому подобным, которая может оказать благоприятный эффект, например, на захват или стабильность полипептида. Полипептидная цепь полипептида по изобретению может быть тем не менее альтернативно или дополнительно модифицирована добавлением, заменой или делецией одного или нескольких аминокислотных остатков.

В одном из вариантов осуществления полипептид по изобретению обладает биологической активностью от 10 до 500 единиц LD ₅₀ на нг полипептида по изобретению, как определено в анализе LD₅₀ на мыши. В другом варианте осуществления полипептид по изобретению обладает биологической активностью приблизительно 150 единиц LD₅₀ на нанограмм. Как правило, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит полипептид по изобретению в количестве приблизительно от 6 пг до приблизительно 30 нг.

Фармацевтическая композиция, содержащая нейротоксичный компонент ботулотоксина типа A в выделенной форме, коммерчески доступна в Германии от фирмы Merz Pharmaceuticals GmbH под торговым наименованием ксеомин^®.

Получение нейротоксичного компонента ботулотоксина типа A и B описано, например, в международных патентных заявках WO 00/74703 и WO 2006/133818. Специалист может адаптировать композиции для полипептида по изобретению, упоминаемого в настоящем документе.

В одном из вариантов осуществления указанная композиция представляет собой восстановленный раствор полипептида по изобретению. В другом варианте осуществления композиция дополнительно содержит сахарозу или сывороточный альбумин человека или и то, и другое, еще в одном осуществлении соотношение сывороточного альбумина человека к сахарозе составляет приблизительно 1:5. В другом варианте осуществления указанный сывороточный альбумин человека представляет собой рекомбинантный сывороточный альбумин человека. Альтернативно, указанная композиция не содержит полученных от млекопитающих белков, таких как сывороточный альбумин человека. Любой такой раствор может обеспечить достаточную стабильность нейротоксина, заменяя сывороточный альбумин на другие небелковые стабилизаторы (ниже).

В настоящей патентной заявке применение лекарственного средства, основанного на модифицированном нейротоксичном компоненте, упомянутом выше, можно использовать.

В отношении композиции и дозирования лекарственного средства на основе ботулотоксина, и в отношении композиции, дозирования и частоты применения лекарственного средства на основе нейротоксического компонента ботулотоксина, ссылка сделана на PCT/EP2007/005754.

Фармацевтическую композицию можно лиофилизировать или вакуумно высушить для восстановления или может находиться в растворе. Когда восстановлена, в одном из вариантов осуществления восстанавливающий раствор готовят, добавляя стерильный физиологический раствор (0,9% NaCl).

Такая композиция может содержать дополнительные эксципиенты. Термин «эксципиент» относится к веществу, присутствующему в фармацевтической композиции, помимо активного фармацевтического ингредиента, присутствующего в фармацевтической композиции. Эксципиент может представлять собой буфер, носитель, антиадгезивное вещество, обезболивающее вещество, связующее вещество, дезинтегрирующее вещество, наполнитель, разбавляющее вещество, консервант, среду, циклодекстрин и/или объемообразующее вещество, такое как альбумин, желатин, коллаген, хлорид натрия, консервант, криозащитное средство и/или стабилизатор.

«Буфер pH» относится к химическому веществу, способному доводить величину pH композиции, раствора и тому подобного до определенного значения или до определенного диапазона величин pH. В одном из вариантов осуществления такой диапазон величин pH может находиться в диапазоне от pH 5 до pH 8, в другом варианте осуществления от pH 7 до pH 8, в еще одном варианте осуществления от 7,2 до 7,6 и еще одном дополнительном варианте осуществления pH равно 7,4. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция имеет pH приблизительно от 4 до 7,5, при восстановлении или при инъекции, в еще одном варианте осуществления приблизительно от pH 6,8 до pH 7,6 и в дополнительном варианте осуществления в диапазоне от pH 7,4 до pH 7,6.

В одном из вариантов осуществления композиция также содержит 1-100 мМ, в другом варианте осуществления 10 мМ буфера ацетата натрия.

Приведенные диапазоны величин pH, упомянутые выше, являются только типичными примерами, и действительная величина pH может включать любой интервал среди числовых значений, приведенных выше. Подходящие буферы, которые находятся в соответствии с идеями настоящего изобретения, представляют собой, например, натрий-фосфатный буфер, натрий-ацетатный буфер, TRIS-буфер или любой буфер, который способен создать рН в пределах указанных выше диапазонов величин pH.

«Стабилизирующий», «стабилизирует» или «стабилизация» обозначает, что активный ингредиент, то есть полипептид по изобретению в фармацевтической композиции в восстановленном или водном растворе обладает большей чем приблизительно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, и вплоть до приблизительно 100% токсичностью, чем биологически активный полипептид по изобретению обладал до внесения в фармацевтическую композицию.

Примеры таких стабилизаторов представляют собой желатин или альбумин, в одном из вариантов осуществления человеческого происхождения или получаемый из рекомбинантного источника. Белки из не принадлежащих человеку или не принадлежащих животным источников также включены. Стабилизаторы можно модифицировать химическими способами или посредством рекомбинантной генетики. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено применение спиртов, например, инозитол, манит в качестве криозащитных эксципиентов для стабилизации белков во время лиофилизации.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения стабилизатор может быть небелковым стабилизирующим веществом, содержащим гиалуроновую кислоту или поливинилпирролидон (коллидон^®), гидроксиэтиловый крахмал, альгинат или полиэтиленгликоль или любое их сочетание, причем такая композиция необязательно стабилизирована по величине pH подходящим pH-буфером, в частности, буфером ацетата натрия или криозащитным средством, или и тем, и другим. Указанная композиция может содержать в дополнение к упомянутым выше стабилизаторам воду и, по меньшей мере, один полиспирт, такой как маннит или сорбит или их смесь. Она также может содержать моно-, ди- или высшие полисахариды, такие как глюкоза, сахароза или фруктоза. Такая композиция, как предполагают, является более безопасной композицией, обладающей значительной стабильностью.

Гиалуроновую кислоту в готовой фармацевтической композиции в одном из вариантов осуществления объединяют с полипептидом по изобретению в количестве от 0,1 до 10 мг, в частности, 1 мг гиалуроновой кислоты на мл раствора ботулотоксина в концентрации 200 ед./мл.

Поливинилпирролидон (коллидон^®), если присутствует в готовой композиции, объединяют с полипептидом по изобретению в таком количестве, чтобы обеспечить получение восстановленного раствора, содержащего от 10 до 500 мг, в частности 100 мг поливинилпирролидона на мл раствора полипептида в концентрации 200 ед./мл по изобретению. В другом варианте осуществления восстановление осуществляют в растворе объемом до 8 мл. Это приводит к снижению концентрации до 12,5 мг поливинилпирролидона на мл раствора полипептида по изобретению в концентрации 25 ед./мл.

Полиэтиленгликоль в готовой фармацевтической композиции в одном из вариантов осуществления объединяют с полипептидом по изобретению в количестве от 10 до 500 мг, в частности, 100 мг полиэтиленгликоля на мл раствора ботулотоксина в концентрации 200 ед./мл. В другом варианте осуществления рассматриваемый раствор также содержит 1-100 мМ, в еще одном варианте осуществления 10 мМ буфера ацетата натрия.

Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением в одном из вариантов осуществления сохраняет свою активность, по существу, неизменной в течение периода шести месяцев, одного года, двух лет, трех лет и/или четыре лет, если хранится при температуре приблизительно от +8°C до приблизительно -20°C. Дополнительно, указанные фармацевтические композиции могут обладать активностью или процентом восстановления приблизительно от 20% до приблизительно 100% в процессе восстановления.

«Криозащитное средство» относится к эксципиентам, которые приводят к появлению активного ингредиента, то есть полипептида по изобретению в восстановленном или водном растворе фармацевтической композиции, который обладает большей чем приблизительно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и вплоть до приблизительно 100% токсичностью, чем биологически активный полипептид по изобретению обладал до лиофилизации в фармацевтической композиции.

В другом варианте осуществления композиция может содержать полигидроксильное соединение, например полиспирт, такой как криозащитное средство. Примеры полиспиртов, которые можно применять, включают в себя, например, инозитол, маннит и другие невосстанавливающие спирты. В некоторых вариантах осуществления композиции не содержат белкового стабилизатора или не содержат трегалозы, или мальтотриозы, или лактозы, или сахарозы, или родственного сахара, или углеводных соединений, которые иногда используют в качестве криозащитных средств.

Термины «консервант» и «консерванты» относятся к веществу или группе веществ, соответственно, которые предотвращают рост и выживание микроорганизмов, насекомых, бактерий или других заражающих организмов в указанной композиции. Консерванты также предотвращают указанную композицию от нежелательных химических изменений. Консерванты, которые можно использовать в объеме данного патента, представляют собой все консерванты в данной области, известные специалисту. Примеры консервантов, которые можно использовать, включают в себя среди прочего, например, бензиловый спирт, бензойную кислоту, хлорид бензалкония, пропионат кальция, нитрат натрия, нитрит натрия, сульфиты (диоксид серы, бисульфит натрия, гидросульфит калия и так далее), двунатриевую ЭДТА, формальдегид, глутаральдегид, диатомовую землю, этанол, метилхлоризотиазолинон, бутилированный гидроксианизол и/или бутилированный гидрокситолуол.

Термин «обезболивающее вещество» относится к обезболивающим лекарственных средствам, которые действуют различными способами на периферическую и центральная нервную системы и включают в себя, среди прочего, парацетамол^® (ацетаминофен), нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID), такие как салицилаты, наркотические лекарственные средства, такие как морфин, синтетические лекарственные средства с наркотическими свойствами, такие как трамадол^® и различные другие. Также включено сюда любое соединение с местным обезболивающим действием, такое как, например, лидокаин, бензиловый спирт, бензойная кислота и другие.

В одном из вариантов осуществления обезболивающее вещество является частью композиции, в другом варианте осуществления обезболивающее вещество вводят до, во время или после воздействия средством для химической денервации.

Термин «лиофилизация» применяют в данном документе для обработки раствора, содержащего полипептид по изобретению, при которой данный раствор замораживают и высушивают до тех пор, пока не останутся только твердые компоненты композиции. Лиофилизированный продукт такой обработки, следовательно, определяют в данном документе как «лиофилизат».

В данном документе термин «восстановление» определяют как процесс растворения указанной лиофилизированной композиции полипептида по изобретению. Это можно выполнить, добавляя соответствующее количество стерильной воды, например, если все необходимые компоненты уже содержатся в лиофилизате. Или, если дело обстоит не так, это можно сделать, например, добавляя один только стерильный физиологический раствор, или, в случае необходимости, с добавлением компонентов, содержащих, например, pH-буфер, эксципиент, криозащитное средство, консервант, обезболивающее вещество, стабилизатор или любое их сочетание. Физиологический раствор, упомянутый выше как «физиологический раствор», представляет собой раствор соли, например раствор хлорида натрия (NaCl) или изотонический раствор хлорида натрия (то есть, с концентрацией хлорида натрия 0,9%). Растворение осуществляют таким способом, что окончательное «восстановление» является непосредственным или косвенным, то есть, например, после разбавления, пригодного для введения пациенту. Нейротоксин можно восстановить в изотонической среде, например, в изотоническом физиологическом растворе или стерильном физиологическом растворе.

Примечательно, что концепция по настоящему изобретению, которая включает в себя введение полипептида по изобретению для лечения любого состояния, которое ассоциировано с гиперактивной холинэргической иннервацией мышцы или экзокринной железы, где полипептид по изобретению блокирует выброс ацетилхолина в синаптическую щель. Следовательно, лечение, предлагаемое настоящим изобретением, может быть направлено против любого из указанных ниже признаков, большинство из которых подробно описаны в Dressier D (2000) (Botulinum Toxin Therapy. Thieme Verlag, Stuttgart, New York):

дистония

черепная дистония

блефароспазм

оромандибулярная дистония

тип с открыванием рта

тип с закрыванием рта

бруксизм

синдром Мейжа

лингвальная дистония

апраксия при открывании век

шейная дистония

антеколлис

ретроколлис

латероколлис

кривошея

фарингеальная дистония

ларингеальная дистония

спастическая дисфония/приводящего типа

спастическая дисфония/отводящего типа

спастическое затрудненное дыхание

дистония конечностей

дистония рук

дистония при выполнении определенных действий

писчий спазм

спазм музыканта

спазм игрока в гольф

дистония ног

приведение бедра, отведение бедра

сгибание колена, разгибание колена

сгибание стопы, разгибание стопы

эквиноварусная деформация стопы

дистония стопы

стриарный палец

сгибание пальца

разгибание пальца

аксиальная дистония

синдром «Пизанской башни»

дистония исполнительницы танца живота

сегментарная дистония

односторонняя дистония

генерализованная дистония

дистония при синдроме Lubag

дистония при кортикобазальной дегенерации

дистония при синдроме Lubag

тардивная дистония

дистония при спинально-церебеллярной атаксии

дистония при болезни Паркинсона

дистония при болезни Хантингтона

дистония при болезни Галлервордена-Шпатца

допа-индуцированная дискинезия/допа-индуцированная дистония

тардивная дискинезия/тардивная дистония

пароксизмальная дискинезия/дистония

кинезигенная

некинезигенная

вызванная действием

велопалатинная миоклония

миоклония

миокимия

оцепенелость, обусловленная напряжением мышц

легкие мышечные судороги

врожденная дрожь подбородка

парадоксальная мышечная активность челюстей

спазм жевательных мышц

гипертрофическая бронхиальная миопатия

гипертрофия жевательной мышцы

гипертрофия передней большеберцовой мышцы

нистагм

осциллопсия

интенсивное потение

надъядерный паралич взора

эпилепсия парциальная непрерывная

планирующаяся операция по поводу спастической кривошеи

паралич отведения голосовой связки

не поддающаяся лечению мутационная дисфония

дисфункция верхнего эзофагального сфинктера

гранулема голосовой складки

заикание

синдром Жиля де ля Туретта

миоклония среднего уха

защитное закрытие гортани

нарушение речи после ларингэктомии

защитное опущение верхнего века

заворот века

дисфункция сфинктера Одди

псевдоахалазия

не являющиеся ахалазией двигательные эзофагальные нарушения

вагинизм

послеоперационное обездвиживание

тремор

заболевания мочеполовых органов

дисфункция мочевого пузыря

гиперактивность мочевого пузыря

недержание мочи

задержка мочевыделения

спастический мочевой пузырь

желудочно-кишечные заболевания

детрузорно-сфинктерная диссинергия

спазм сфинктера мочевого пузыря

гемифациальный спазм

дискинезия при реиннервации

косметическое применение

гусиные лапки

нахмуривание бровей

асимметрия лица

впадины на подбородочной мышце

морщины от нахмуренных бровей над переносицей

морщины на лбу

подкожная мышца шеи

морщины курильщика

вертикальные морщины, идущие от уголков губ к подбородку

подтягивание жевательной мышцы

синдром скованного человека

столбняк

заболевания простаты

гиперплазия простаты

рак предстательной железы

лечение ожирения

детский церебральный паралич

косоглазие

смешанный тип

паралитический тип

сопутствующий тип

после операции по поводу отслоения сетчатки

после операции по поводу катаракты

при афакии

косоглазие при миозите

миопатическое косоглазие

диссоциированное вертикальное отклонение

в качестве дополнения к операции по поводу косоглазия

эзотропия

экзотропия

ахалазия

трещина заднего прохода

гиперфункция железы внешней секреции

синдром Фрей

синдром "крокодиловых слез"

чрезмерная потливость

подмышечная

ладонная

подошвенная

ринорея

относительная гиперсаливация

при инсульте

при паркинсонизме

при амиотрофическом боковом склерозе

спастические состояния

при энцефалите и миелите

аутоиммунные процессы

рассеянный склероз

поперечный миелит

синдром Девика

вирусные инфекции

бактериальные инфекции

паразитарные инфекции

грибковые инфекции

при врожденном спастическом парапарезе

постинсультный синдром

инфаркт полушарий головного мозга

инфаркт ствола головного мозга

инфаркт спинного мозга

при травмах центральной нервной системы

поражения полушарий головного мозга

поражения ствола головного мозга

поражения спинного мозга

при кровоизлиянии в центральной нервной системе

внутримозговое кровоизлияние

субарахноидальное кровоизлияние

субдуральное кровоизлияние

интраспинальное кровоизлияние

при возникновении новообразования

опухоли полушарий головного мозга

опухоли ствола головного мозга

опухоли спинного мозга

головная боль

мигрень

головная боль напряжения

синусовая головная боль

хроническая головная боль

и/или выпадение волос.

Фармацевтическую композицию, содержащую ботулотоксин, в одном из вариантов осуществления вводят несколько раз в эффективном количестве для улучшения состояния пациента. Также следует отметить, что в зависимости от персистентности полипептида по изобретению необходимы меньшие или большие дозировки, следовательно, следующие ниже дозировки приведены только с ориентировочной целью.

Типично, вводимая пациенту доза будет составлять до приблизительно 1000 единиц, но, в основном, она не должна превышать 400 единиц для пациента. В одном из вариантов осуществления диапазон величин находится приблизительно от 80 до приблизительно 400 единиц. Данные значения в одном из вариантов осуществления применимы для взрослых пациентов. Для детей соответствующие дозировки находятся в диапазоне от 25 до 800 и в другом варианте осуществления от 50 до 400 единиц.

В то время, как вышеупомянутые диапазоны относятся к максимальным суммарным дозам, диапазон доз на мышцу в одном из вариантов осуществления находится в пределах от 3 до 6 единиц/кг масса тела (м.т.), для небольших мышц 0,5-2 ед./кг м.т., в другом варианте осуществления 0,1-1 ед./кг м.т. Как правило, дозы не должны превышать 50 ед. на участок инъекции и 100 ед. на мышцу.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения эффективное количество вводимого ботулотоксина превышает 500 ед. полипептида по изобретению для взрослых или превышает 15 ед./кг массы тела для детей.

Что касается частоты дозирования, интервал до повторной инъекции очень зависит от персистентности модифицированного нейротоксина. Таким образом, по настоящему изобретению лекарственный препарат, который необходимо ввести, повторно вводят с интервалом в диапазоне от 3 до 6 месяцев, в другом варианте осуществления лекарственный препарат повторно вводят с интервалом в диапазоне от 2 недель до менее чем 3 месяцев. Тем не менее в зависимости от модификации нейротоксина в других вариантах осуществления предусмотрены процедуры более чем от 6 месяцев до 12 месяцев или процедуры в период времени менее чем 2 недели.

В отношении композиции и дозирования лекарственного препарата на основе ботулотоксина и в отношении композиции, дозирования и частоты введения лекарственного препарата на основе нейротоксичного компонента ботулотоксина в настоящий документ в качестве ссылки включена US 60/817756.

Хотя указанные выше значения следует понимать как общее руководство для введения лекарственного препарата, применяемого в настоящем изобретении, тем не менее, в конечном счете, врач, который ответственен за лечение, является человеком, который определяет и количество вводимого токсина, и частоту его введения.

Лекарственный препарат на основе ботулотоксина можно вводить непосредственно в поврежденную мышцу. Для того чтобы найти подходящий участок инъекции, существует несколько способов, которые помогают врачу найти таковое. В настоящем изобретении применимы все способы для обнаружения наилучшего места для инъекции, такие как инъекция под контролем электромиографии (ЭМГ), инъекция под контролем пальпации, инъекция под контролем CTVMRI, а также инъекция под контролем сонографии (ультразвука). Среди данных способов последний представлен в одном из вариантов осуществления способа выбора, при лечении детей. В отношении дополнительных деталей, относящихся к инъекции под контролем сонографии, авторы изобретения ссылаются на Berweck «Sonography-guided injection of botulinum toxin A in children with cerebral palsy», Ne ropediatric 2002 (33), 221-223.

Термин «инъекция» определяют как любой процесс, который позволяет специалисту в данной области ввести активное средство в участок-мишень, прокалывая кожу. Неполное количество примеров «инъекций» представляет собой подкожное, внутримышечное, внутривенное, интратекальное, внутриартериальное и так далее введение.

Следует понимать, что терминология, применяемая в настоящем документе, предназначена только для цели описания определенных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения. Необходимо отметить, что используемые в описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают в себя обозначения множественного числа, если контекст ясно не определяет иначе.

Литература

de Paiva A, Meunier FA, Molgo J, Aoki KR, Dolly JO. Related Articles, Functional repair of motor endplates after botulinum neurotoxin type A poisoning: biphasic switch of synaptic activity between nerve sprouts and their parent terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96(6):3200-5.

E. L. V. Harris (Ed.), S. Angal (Ed.), "Protein Purification Methods: A Practical Approach", Oxford University Press (December 1989), ISBN- 10: 019963002X, ISBN-13: 978-0199630028.

Eleopra R, Tugnoli V, Quatrale R, Gastaldo E, Rossetto O, De Grandis D, Montecucco C. Botulinum neurotoxin serotypes A and C do not affect motor units survival in humans: an electrophysiological study by motor units counting. Clin Neurophysiol. 2002; 113(8): 1258-64.

Eleopra R, Tugnoli V, Rossetto O, Montecucco C, De Grandis D. Botulinum neurotoxin serotype C: a novel effective botulinum toxin therapy in human. Neurosci Lett. 1997;224(2):91-4.

Foran PG, Mohammed N, Lisk GO, Nagwaney S, Lawrence GW, Johnson E, Smith L, Aoki KR, Dolly JO. Evaluation of the therapeutic usefulness of botulinum neurotoxin B, C1, E, and F compared with the long lasting type A. Basis for distinct durations of inhibition of exocytosis in central neurons.J Biol Chem. 2003 Jan 10;278(2): 1363-71. [Epub 2002 Oct 14].

John M. Walker, Humana Press; «The Protein Protocols Handbook (Methods in Molecular Biology)», Volume: 2 (February 2002), ISBN-10: 0896039404, ISBN-13: 978-0896039407.

Jurasinski CV, Lieth E, Dang Do AN, Schengrund CLCorrelation of cleavage of SNAP-25 with muscle function in a rat model of Botulinum neurotoxin type A induced paralysis Toxicon. 2001; 39(9): 1309-15.

Robert K. Scopes, «Protein Purification: Principles and Practice», Verlag: Springer, Berlin; Auflage: 3 Sub (Januar 1994), ISBN-10: 0387940723, ISBN-13: 978-0387940724.

Настоящее изобретение теперь дополнительно иллюстрируется при помощи неограничивающих примеров, приведенных в настоящем документе ниже.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - создание экспрессирующей плазмиды

ДНК-последовательность тяжелой цепи ботулотоксина A амплифицируют из хромосомной ДНК C. botulinum типа A (номер в базе данных AAA23262) при помощи ПЦР. К 5'-концу добавляют последовательность для распознавания, кодирующую последовательность тромбина. К 3'-концу добавляют последовательность ДНК, кодирующую маркерный пептид для аффинности, подходящий для последующей очистки (например, His-метку или Strep-метку). ДНК встраивают в экспрессирующую плазмиду. Последовательности ДНК для первой и второй легкой цепи также представляют собой серотип A и их амплифицируют схожим образом из хромосомной ДНК C. botulinum типа A (номер в базе данных AAA23262) посредством ПЦР. Последовательность легкой цепи затем встраивают дважды в последовательном порядке в экспрессирующую плазмиду ниже последовательности тромбина (TE) для распознавания. В целом, следовательно, последовательности представляют следующую ниже кодирующую структуру: LC-LC-TE-HC-метка.

Пример 2 - Получение слитого белка в E.coli

Слитый белок трансфецируют в TG1 E.coli. Встраивание проводят при 21°C в течение 4 часов. Затем слитый белок очищают хроматографией на колонке StrepTactin-Sepharose (IBA GmbH, Геттинген) по протоколу производителя. Слитый белок затем активируют при помощи иммоболизированного тромбина (тромбин-сефароза), который расщепляет связь между тяжелой цепью и двумя легкими цепями. Субъединицы белка остаются связанными только через дисульфидные связи.

Пример 3 - Анализ персистентности (короткая мышца-разгибатель пальцев, EDB)

Исследуемым пациентам вводили 4 единицы ксеомина^® (Merz Pharmaceuticals GmbH) в правую EDB, растворенного в 0,1 мл физиологического раствора, и в левую EDB 4 единицы модифицированного ботулотоксина (слитый белок ботулотоксина типа A, конъюгированного с дополнительной легкой цепью ботулотоксина типа A). Каждые 30 дней электрофизиологически измеряли «электрический вызванный ответ мышцы» (CMAP). Через 90 дней амплитуда CMAP правой EDB снижалась приблизительно на 40% (по сравнению с исходной активностью), тогда как для EDB слева амплитуда снижалась приблизительно на 70%. Слева CMAP достиг 40% через 150 дней.

Пример 4 - Пролонгация персистентности

Пациента, страдающего спастической кривошей, лечили ботоксом ^® (Allergan, Inc.) (240 единиц). Необходимо было повторять процедуру для него каждые 10-12 недель в неврологическом отделении вследствие снижения активности ботулотоксина. Затем пациенту вводили 240 единиц модифицированного нейротоксина (ботулотоксина типа A с дополнительной слитой легкой цепью ботулотоксина типа A). Пациент не нуждался в дополнительной инъекции вплоть до 18 недель после первой процедуры.