способ выделения спермаспецифического ингибитора трипсина человека

Формула изобретения

Способ выделения спермаспецифического ингибитора трипсина человека из семенной плазмы, заключающийся в том, что выделение проводят сочетая преципитацию сульфатом аммония и хроматографию, отличающийся тем, что на первой стадии выделения проводят тепловую обработку семенной плазмы, смешанной с 10 мМ трис-HCl буфером pH 7,4 в соотношении 1:1, при 70 С° в течение 30 мин, а через 1 час полученную смесь центрифугируют в течение 40-45 мин при 10000 g, собирая надосадочную жидкость, к которой добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония, а через 2-4 часа смесь центрифугируют при 10000 g в течение 60 мин и полученный осадок ресуспендируют в трис-HCl буфере pH 7,4, а на заключительной стадии выделения проводят аффинную хроматографию спермаспецифического ингибитора трипсина на иммобилизованном лектине бодяги речной, после чего промывают 1М раствором NaCl, забуференным трис-HCl буфером, и элюируют связанный на колонке спермаспецифический ингибитор трипсина 0,1675 М раствором лактозы в боратном буфере с pH=9,0.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно биохимии, и может быть использовано, в частности, для выделения спермаспецифического ингибитора трипсина человека из семенной плазмы.

В практике известен прототип - способ выделения спермаспецифического ингибитора трипсина, основанный на сочетании преципитации сульфатом аммония, гель-фильтрации, ионообменной и гидрофобной хроматографии (Николаев А.А., Карасев В'. С. Выделение и свойства специфического ингибитора трипсина из семенной плазмы человека // БИОХИМИЯ - 1990 - т.55. - № 6 - с.1065-1071).

Недостатками этого способа являются;

- трудоемкость;

- длительность проведения;

- невысокий выход продукта и недостаточная его чистота. Изобретение направлено на упрощение и ускорение выделения спермаспецифического ингибитора трипсина, а также на увеличение выхода и степени его чистоты.

Указанный технический результат достигается тем, что на первой стадии выделения проводят тепловую обработку семенной плазмы, смешанной с 10 мМ трис-HCl буфером pH 7,4 в соотношении 1:1, при 70 С° в течение 30 мин, а через 1 час полученную смесь центрифугируют в течение 40-45 мин при 10000 g, собирая надосадочную жидкость, к которой добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония, а через 2-4 часа смесь центрифугируют при 10000 g в течение 60 мин и полученный осадок ресуспендируют в трис-HCl буфере pH 7,4, а на заключительной стадии выделения проводят аффинную хроматографию спермаспецифического ингибитора трипсина на иммобилизованном лектине бодяги речной, после чего промывают 1М раствором NaCl, забуференным трис-HCl буфером и элюируют связанный на колонке спермаспецифический ингибитор трипсина 0,1675 М раствором лактозы в боратном буфере с pH=9,0.

Выделение спермаспецифического ингибитора трипсина проводили следующим способом. В работе использовали семенную плазму, которая отделялась центрифугированием от сперматозоидов (5000 g, 15 мин) и хранилась в замороженном виде при - 30 С° без добавления консервантов и ингибиторов протеолиза. Таким образом, было накоплено 800,0 мл семенной плазмы, которая далее использовалась для выделения спермаспецифического ингибитора трипсина.

На первой стадии выделения семенную плазму смешивали с 10 мМ трис-HCl буфером pH 7,4 в соотношении 1:1 и полученную смесь прогревали при 70 С° в течение 30 мин. Через 1 час указанную смесь центрифугировали в течение 40-45 мин при 10000 g в рефрижераторной центрифуге.

На следующей стадии выделения спермаспецифического ингибитора трипсина использовали надосадочную жидкость. К ней добавляли равный объем насыщенного раствора сульфата аммония. Через 2-4 часа смесь центрифугировали при 10000 g в течение 60 мин и полученный осадок ресуспендировали в трис-HCl буфере pH=7,4.

Заключительная стадия выделения спермаспецифического ингибитора трипсина представляет собой аффинную хроматографию спермаспецифического ингибитора трипсина на иммобилизованном лектине бодяги речной. Через колонку (1,5×12 см) лектин-сефарозы, уравновешенную трис-HCl буфером, пропускали весь объем полученной на предшествующей стадии фракции. Далее колонку промывали 1М раствором хлорида натрия, забуференного трис-HCl буфером, а затем элюировали связанный на колонке спермаспецифический ингибитор трипсина 0,1675 М раствором лактозы в боратном буфере с pH=9,0. Полученный элюат диализовали и концентрировали до приемлемого объема (12 мл).

Нами обнаружена способность лектина бодяги речной (Ephydatia fluviatilis) преципитировать спермаспецифический ингибитор трипсина. На рис.1 (преципитация препаратов спермаспецифического ингибитора трипсина лектином бодяги речной) показана преципитация фракций поэтапного выделения спермаспецифического ингибитора трипсина по сравнению со стандартным препаратом, полученным по способу, описанному в прототипе в агаровом геле, содержащем лектин бодяги речной (1 - препарат спермаспецифического ингибитора трипсина (80 мкг/мл); 2 - термостабильная фракция семенной плазмы; 3 - преципитат сульфата аммония из термостабильной фракции семенной плазмы; 4 - фракция, после аффинной хроматографии. Агаровый гель содержит полуочищенный лектин бодяги речной в конечной концентрации 0,50 мг на 100 мл агара. Окраска на общий белок кумаси блю. Образцы № 2, 3, 4 стандартизованы по уровню общего белка и приведены по концентрации его к уровню в стандартном препарате спермаспецифического ингибитора трипсина - 80 мкг/мл.

Снижение диаметра колец преципитации обусловлено повышением степени очистки спермаспецифического ингибитора трипсина и уменьшением количества балластных белков, способных преципитироваться лектином бодяги речной.

В таблице 1 показаны стадии выделения спермаспецифического ингибитора трипсина. Обращает на себя внимание увеличение общей активности ингибитора трипсина в семенной плазме после ее температурной обработки. Мы считаем, что этот феномен обусловлен инактивацией многочисленных протеиназ семенной плазмы и поэтому мы сочли возможным расчитывать выход спермаспецифического ингибитора трипсина на последующих стадиях, принимая ингибиторную активность термостабильной фракции за 100% - цифры в скобках.

В таблице 2 приведена сравнительная характеристика предлагаемого способа выделения спермаспецифического ингибитора трипсина человека с прототипом.

На рис.2 (электрофорез в полиакриламидном геле), где А - семенная плазма человека; В - фракция спермаспецифического ингибитора трипсина после аффинной хроматографии, показано, что препарат спермаспецифического ингибитора трипсина гомогенен при электрофоретическом контроле чистоты.

Предлагаемый способ был успешно апробирован на кафедре общей и биоорганической химии ГБОУ ВПО АГМА, с апреля 2011 года до ноября 2012 года на 217 образцах семенной плазмы, собранных в центре планирования семьи г.Астрахань и ООО «Техномед».

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример № 1. В работе использовали семенную плазму, которая отделялась центрифугированием 1 от сперматозоидов (5000g, 15 мин) и хранилась в замороженном виде при - 30 С° без добавления консервантов и ингибиторов протеолиза. Таким образом, было накоплено 300,0 мл семенной плазмы, которая далее использовалась для выделения спермаспецифического ингибитора трипсина.

На первой стадии выделения семенную плазму смешивали с 10 мМ трис-HCl буфером pH 7,4 в соотношении 1:1 и, полученную смесь прогревали при 70 С° в течение 30 мин. Через 1 час указанную смесь центрифугировали в течение 40 мин при 10000 g в рефрижераторной центрифуге.

На следующей стадии выделения спермаспецифического ингибитора трипсина использовали надосадочную жидкость. К ней добавляли равный объем насыщенного раствора сульфата аммония. Через 2 часа смесь центрифугировали при 10000 g в течение 60 мин и полученный осадок ресуспендировали в трис-HCl буфере pH=7,4.

Заключительная стадия выделения спермаспецифического ингибитора трипсина представляет собой аффинную хроматографию спермаспецифического ингибитора трипсина на иммобилизованном лектине бодяги речной. Через колонку (1,5×12 см) лектин-сефарозы, уравновешенную трис-HCl буфером, пропускали весь объем полученной на предшествующей стадии фракции. Далее колонку промывали 1М раствором хлорида натрия, забуференного трис-HCl буфером, а затем элюировали, связанный на колонке спермаспецифический ингибитор трипсина 0,1675 М раствором лактозы в боратном буфере с pH=9,0. Полученный элюат диализовали и концентрировали до приемлемого объема (8,0 мл).

Пример № 2. Для выделения использовали семенную плазму, отделенную центрифугированием от сперматозоидов (5000g, 15 мин) и хранившуюся в замороженном виде при - 30 С° без добавления консервантов и ингибиторов протеолиза. Таким образом, было накоплено 200,0 мл семенной плазмы, которая далее использовалась для выделения спермаспецифического ингибитора трипсина.

На первой стадии выделения семенную плазму смешивали с 10 мМ трис-HCl буфером pH 7,4 в соотношении 1:1 и, полученную смесь прогревали при 70 С° в течение 30 мин. Через 1 час указанную смесь центрифугировали в течение 45 мин при 10000 g в рефрижераторной центрифуге.

На следующей стадии выделения спермаспецифического ингибитора трипсина использовали надосадочную жидкость. К ней добавляли равный объем насыщенного раствора сульфата аммония. Через 4 часа смесь центрифугировали при 10000 g в течение 60 мин и полученный осадок ресуспендировали в трис-HCl буфере pH=7,4.

Заключительная стадия выделения спермаспецифического ингибитора трипсина представляет собой аффинную хроматографию спермаспецифического ингибитора трипсина на иммобилизованном лектине бодяги речной.

Через колонку (1,5×12 см) лектин-сефарозы, уравновешенную трис-HCl буфером, пропускали весь объем полученной на предшествующей стадии фракции. Далее колонку промывали 1М раствором хлорида натрия, забуференного трис-HCl буфером, а затем элюировали связанный на колонке спер-маспецифический ингибитор трипсина 0,1675 М раствором лактозы в боратном буфере с pH=9,0. Полученный элюат диализовали и концентрировали до приемлемого объема (6,0 мл).

Предложенный нами способ упрощает (в прототипе выделение состоит из 4 стадий, а в предложенном нами способе - из 3), ускоряет в 3,5 раза выделение спермаспецифического ингибитора трипсина человека из семенной плазмы по сравнению с прототипом и тем самым повышается эффективность способа (повышается выход конечного продукта на 30% по сравнению с прототипом).

Главное преимущество нашего способа заключается в применении аффинной хроматографии на малоизученном лектине животного происхождения из бодяги речной. Этот лектин обладает высоким сродством к галактозосодержащим гликопротеинам. По нашим данным константа диссоциации лактозы с этим лектином составляет 1,34×10 ^-4 мМ. Это позволяет однократно повысить степень очистки в 144 раза (по сравнению с предыдущей стадией очистки). Самое главное, в отличие от прототипа, наш способ позволяет связать всю массу спермаспецифического ингибитора трипсина, а не повторять многократно операцию хроматографии, выделяя за один сеанс не более 1 мг препарата.

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ СПЕРМАСПЕЦИФИЧЕСКОГО ИНГИБИТОРА ТРИПСИНА ЧЕЛОВЕКА

Таблица 1
Выделение спермаспецифического ингибитора трипсина человека
Стадия выделения	Белок, мг/мл	Общий белок, мг	Удельная активность, ИЕ/мг белка	Общая активность, ИЕ	Выход, %	Степень очистки
Нативная семенная плазма	59,0	47200,0	0,006	283,2	100	1
Тепловая обработка	22,0	16720,0	0,025	418,0	147,6 (100)	4,2
Преципитация сульфатом аммония	4,75	5370,0	0,068	367,5	129,8 (87,9)	11,3
Аффинная хроматография	1,8	21,7	9,76	211,75	74,8 (50,7)	1626,7

Таблица 2
Сравнительная характеристика предлагаемого способа выделения спермаспецифического ингибитора трипсина человека с прототипом
Сравниваемые показатели	Прототип	Предлагаемый способ
Общее количество стадий выделения	4	3
Общее время проведения выделения, часов	не менее 76 часов	не более 20 часов
Степень очистки	184,3	1626,7
Выход, %	21,2%	50,7%