способ получения высокотитражной антимикробной сыворотки для оценки антигенной активности противостафилококковых вакцин

Формула изобретения

Способ получения высокотитражной антимикробной сыворотки для оценки антигенной активности противостафилококковых вакцин, включающий использование штамма S.aureus № 1991, характеризующегося высокой иммуногенностью ED ₅₀=(50-100)×10⁶ микробных клеток, слабой вирулентностью LD₅₀=(0,5-2,0)×10⁹ микробных клеток, инактивацию его и высушивание диметилкетоном путем 2-кратной обработки 3 объемами диметилкетона с последующим проведением иммунизации двукратно подкожно и двукратно внутривенно и выделением сыворотки.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к противостафилококковым вакцинным препаратам и методам оценки их антигенной активности. Целью изобретения является создание наиболее иммуногенного слаботоксичного противостафилококкового препарата для получения высокотитражных иммунных сывороток, пригодных для оценки антигенной активности стафилококковых вакцин различного антигенного состава на всех этапах их приготовления, контроля конечного продукта и стабильности в процессе хранения.

Преимущество изобретения заключается в стандартизации методов контроля противостафилококковых препаратов, предназначенных для активной специфической профилактики и терапии стафилококковой инфекции, путем использования серологических методов на основе применения высокотитражных антимикробных противостафилококковых сывороток, для получения которых предлагается способ приготовления иммуногенного, слаботоксичного и слабоаллергенного препарата.

Известны способы получения антистафилококковой плазмы и сывороток крови. Недостатком этих методов является индукция антител к отдельным факторам патогенности Staphylococcus aureus и невысокий уровень антител [2, 3, 4, 9, 10].

Во всем мире ведется разработка стафилококковых вакцин нового поколения. Значительные усилия научно-исследовательских и коммерческих организаций были направлены на получение и испытание моновалентных вакцин, состоящих из капсульных полисахаридов (Staphvax), альфа-токсина, других факторов патогенности [5] стафилококка. Исследование большинства этих препаратов было остановлено на этапе доклинических испытаний. Наиболее полно изучена вакцина Staphvax, эффективность которой при клинических испытаниях не подтвердилось. Эти данные привели авторов к выводу о необходимости разработки поливалентных стафилококковых вакцин с оптимальным набором антигенов [6, 7, 8].

В России проводятся исследования по разработке бесклеточной поливалентной антистафилококковой вакцины на основе водорастворимых белково-полисахаридных антигенов клеточной стенки S.aureus. Доклинические исследования установили слабую токсичность и существенную протективную активность этого препарата [1]. Однако даже использование многокурсовых сложных схем иммунизации этой вакциной не обеспечивает получения высокотитражных сывороток. В то же время была выявлена корреляция между титрами антител и выживаемостью кроликов на модели генерализованной стафилококковой инфекции у кроликов (табл.1), что определяет возможность использования серологических методов для оценки иммуногенной активности стафилококковых препаратов.

Таблица 1
Иммуногенная активность сухой стафилококковой вакцины в опытах на кроликах (титры антител и защита на модели генерализованной стафилококковой инфекции)
№ № опыта	№ № серии	Кратность иммунизации	Иммунизирующая доза, мг	Привитые		Непривитые
				Обратный ср. титр АТ±m	Выжило из числа кроликов, взятых в опыт	Обратный ср. титр АТ±m	Выжило из числа кроликов, взятых в опыт
1	69а	2	4	84±19,8	4/5	0	0/5
	69б	2	4	11±2,9	1/5
2	70	3	4	106±22,3	3/5	3±0,33	0/5
	70	2	4	48,4±4,3	2/5
	73	3	2	3±0,21	0/5
3	76	3	4	80±5,7	5/5	2±0,25	0/5
4	15	3	4	147±21	3/5	6±0,4	0/5

При разработке противостафилококковых вакцин и при проведении доклинических исследований оценку препаратов производят в опытах на экспериментальных животных (мыши, кролики, редко обезьяны). Эти исследования трудоемки. При повторных исследованиях часто получают разные результаты вследствие различной чувствительности мышей, их сложно использовать на этапах производства, и, как показали многие исследования, протективная активность, установленная на мышах, не подтвердилась при клинических испытаниях [5]. Заявленный способ получения иммуногенного слаботоксичного противостафилококкового препарата для иммунизации животных с целью получения высокотитражных иммунных сывороток позволит использовать их для оценки иммунных стафилококковых препаратов в серологических (конкурентный ИФА и др.) и иммунохимических (иммуноблот, иммунодиффузия) реакциях.

Для достижения указанной цели используют: 1) штамм S.aureus 1991, выделенный от больного пневмонией, характеризующийся высокой внутривидовой протективной активностью ED₅₀=(20-100)×10 ⁶ микробных клеток и при этом слабой вирулентностью - LD ₅₀>1×10⁹ микробных клеток; 2) наиболее щадящий метод инактивации микробной массы диметилкетоном; 3) короткая схема иммунизации, состоящая из двух подкожных и двух внутривенных ведений (табл.2).

Таблица 2.
Сравнительные данные протективной и сенсибилизирующей активность препаратов, полученных из разных штаммов стафилококка
Штамм		Протективная активность					Сенсибилизирующая активность
№ №	LD50, микр. кл. ×109	штамм для заражения	мыши		кролики		Морские свинки
			выжило/всего	%±m	выжило/всего	ср. продол. жизни, сут±m	препарат из штамма	кратность п/к введения	индекс анафилактического шока, %±m
6	0,1	6	1/24	4,0±3,0	0/8	6,2±2,5	6	1-крат	70±4,8
2003	0,2	-«-	4/20	20,0±8,9	н.о.	н.о.	2003	3-крат	75,0±5,8
-«-	-«-	1986	6/28	21±7,6	н.о.	н.о.	н.о.	н.о.	н.о.
1986	0,18	-«-	18/45	40±7,2	2/4	27,0±7,6	н.о.	н.о.	н.о.
1991	1,0	6	13/20	65±10	6/10	20,0±4,5	1991	1-крат	27,5±2,9
1991	1,0	1986	23/45	51±7,0	4/4	60 (срок наблюдения)	-«-	3-крат	28,5±4,0
Контроль интактн.)	-	6	0/25	0	0/10	2,0±0,05		Интак.	14,2±3,6
	-	1986	2/25	8±5,0	0/4	4,0±3,0		Интак.	12,0±3,2

Выделение антигенных компонентов производится инактивацией и высушиванием микробной массы клеток диметилкетоном путем 2-кратной обработки в количестве 3 объемов по отношению к объему микробной массы.

Пример осуществления способа.

Штамм S.aureus 1991 (депонирован в ГИСК им. Л.А. Тарасевича) культивируют на плотной агаровой среде на основе панкреатического гидролизата казеина при температуре 37°C в течение 16-18 часов. Культуру смывают дистиллированной водой. Возможно культивирование в реакторах путем глубинного культивирования в течение 7-8 часов при температуре 37°C или путем управляемых процессов культивирования (сливно-доливной, непрерывный) на полисинтетической среде. Например, среда из солей КН₂РО₄, К₂НРО ₄, (NH₄)₂SO₄, MgSO ₄, цитрат натрия, с добавлением глюкозы. и дрожжевого экстракта.

При культивировании в реакторах отделение микробной массы от культуральной среды производят центрифугированием или сепарированием, возможно также микрофильтрацией в тангенциальном потоке.

Инактивацию микробной массы производят путем 2-кратной обработки диметилкетоном в течение 18-24 часов в количестве 3 объема по отношению к объему микробной массы. После 2-й обработки получают сухую микробную массу, стандартизуемую по весу.

Полученную сухую инактивированную микробную массу используют для иммунизации животных (мыши, кролики). Высокая протективная активность позволяет существенно сократить схему иммунизации для получения высокотитражных сывороток до 2-3-х курсов:

1 курс - 2-кратно подкожно с интервалом 3-4 дня;

2 курс 2-кратно внутрибрюшинно с интервалом 3-4 дня;

3 курс проводится дополнительно по схеме 2-го курса только при недостаточности 2 курса (табл.3).

Таблица 3
Титр кроличьих сывороток в РПГА в динамике 3-х курсов иммунизации стафилококковым антигеном
Антигенный стафилококковый препарат, приготовленный по заявленному способу	№ № сыворотки кроликов	Обратный титр антител
		до иммунизации	после 1 курса п/к иммунизации	после 2 курса в/в иммунизации	после 3 курса в/в иммунизации
		1	2	3	4
	1	16	256	1024	5120
	2	32	1024	1024	5120
	3	32	512	1024	5120
	4	32	128	1024	2560
	5	16	256	1024	5120
	М±m	25,6±3,4	435±159,9	1024±0	4608±512
Р1 и 2<0,05; Р2 и 3<0,01; Р3 и 4<0,001

Литература

1. Егорова Н.Б., Ефремова В.Н., Курбатова Е.А., Грубер И.М. Экспериментальная и клинико-иммунологическая оценка бесклеточной стафиококковой вакцины «Стафиловак». Журн. микробиол. 2008. - № 6. - С.101-108.

2. Иванова СП. Метод получения иммунной антистафилококковой сыворотки. Лаб. Дело. 1975. - № 5. - 306-308.

3. Михайлова Н.А. и др. Опты применения вакцины «пиопол» для иммунизации доноров-добровольцев. Иммунология. - 2006. - Т.27. - № 2. - С.80-83.

4. Федоровская Е.А. и др. Иммунный ответ организма доноров при иммунизации стафилококковым анатоксином. Врачебное дело. 1989. - № 2. - С.70-72.

5. Otto М. Novel targeted immunotherapy approaches for staphylococcal Infection. Expert Opin Biol Ther. 2010. - Vol.10. - № 7. P - 1049-1059.

6. Poole-Warren LA, Hallett MD, Hone PW, Burden SH, Farrell PC. Vaccination for prevention of CAPD associated staphylococcal infection: results of a prospective multicentre clinical trial. Clin. Nephrol.1991. - Vol.35. № 5. P.198-206. [PubMed: 1855327]

7. Schaffer A.C, Lee J.C. Staphylococcal vaccines and immunotherapies. Infect. Dis. Clin. North Am. 2009 - Vol.23. № 1. 153-71. [PubMed: 19135920]

8. Stranger-Jones Y.K., Bae Т., Schneewind O. Vaccine assembly from surface proteins of Staphylococcus aureus. Proc. Natl. Acad. Sci. 2006. - Vol.103. - № 45. - P16942-7. [PubMed: 17075065]

9. Ekstedt R.D. Ann N.Y. Immune response to surface antigens of Staphylococcus aureus and their role in resistance to staphylococcal disease. N.Y. Acad. Sci., 1974. - Vol.236. - P.203-220.

10. Richter U., Karsch W.Z. Production of diagnostic antisera for the detection of staphylococcal enterotoxins A-E. Gesamte. Hyg. 1980. - Vol.26. - N1. - P.53-55.