способ прогнозирования задержки внутриутробного роста плода

Формула изобретения

Способ прогнозирования задержки внутриутробного роста плода, отличающийся тем, что с ранних сроков беременности определяют относительное содержание CD3⁺CD16⁺56 ⁺-лимфоцитов, уровень С3-компонента комплемента и растворимого рецептора фактора некроза опухоли (sTNF-R) в венозной крови женщины, вычисляют прогностический индекс (PI) по формуле:

PI=-0,8911X ₁-0,0321Х₂-2,3669Х₃+11,0779,

где X₁ - относительное содержание CD3⁺CD16 ⁺CD56⁺-лимфоцитов, %;

Х₂ - концентрация С3-компонента комплемента, мг/дл;

Х ₃ - концентрация sTNF-R, нг/мл

и при PI менее 0 прогнозируют задержку внутриутробного роста плода во второй половине беременности, а при PI более 0 делают заключение о низком риске развития данного патологического состояния.

Описание изобретения к патенту

Область применения: предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике.

Уровень техники

Плацентарная недостаточность, сопровождающаяся глубокими метаболическими и гемодинамическими расстройствами в функциональной системе «мать-плацента-плод», приводит к развитию задержки внутриутробного роста плода (ЗВРП), являющейся одной из основных причин перинатальной заболеваемости и смертности [1, 2]. Патогенетически синдром задержки роста плода обусловлен нарушением плацентарной перфузии, чаще всего формирующимся на фоне экстрагенитальной патологии, преэклампсии и хронических внутриматочных инфекций [3]. Частота данной патологии, по данным литературы, колеблется от 4,5% до 39% [4, 5, 6, 7].

Диагностика ЗВРП основана на сопоставлении фотометрических показателей, полученных в результате ультразвукового исследования, с нормативными показателями для определенного срока беременности, однако информативность этих параметров высока только в третьем триместре беременности. Предикторная ценность способов прогнозирования ЗВРП во второй половине беременности является низкой, поскольку не оставляет достаточного количества времени для профилактики и предотвращения развития данного патологического состояния. Раннее обнаружение маркеров, ассоциированных с недостаточностью фетоплацентарного комплекса, позволяет провести своевременную корригирующую терапию, в связи с чем доклиническая диагностика нарушений состояния плода и определение факторов риска развития ЗВРП является одной из наиболее важных задач современной перинатологии.

В последние годы уточнению причин развития задержки внутриутробного роста плода посвящены многочисленные исследования. По мнению ряда авторов существенную роль в генезе плацентарной недостаточности с исходом в ЗВРП играют нарушения механизмов иммунорегуляции гестационного процесса с ранних сроков беременности [8, 9, 10, 11]. По современным представлениям в первом триместре беременности, осложненной впоследствии ЗВРП, имеет место неадекватный ответ материнской иммунной системы на факторы плодово-плацентарного происхождения, однако эти нарушения не приводят к фатальному исходу, как при невынашивании. В этом случае формируется особый тип регуляции гестационного процесса, способствующий сохранению беременности, но недостаточный для полноценного развития плода. Отечественными исследователями установлено, что в ранние сроки беременности, осложненной впоследствии ЗВРП, нарушается соотношение клеточных популяций лимфоцитов, изменяется характер экспрессии ряда маркеров активации и молекул адгезии, нарушается синтез и продукция цитокинов, иммуноглобулинов [5]. Анализ литературы свидетельствует о том, что на сегодняшний день для оценки риска формирования ЗВРП востребованы лабораторные тесты, являющиеся одновременно доступными, клинически эффективными и экономически оправданными. Изучение иммунных механизмов формирования ЗВРП позволяет разработать ранние прогностические критерии данного патологического состояния.

Существующие способы доклинической диагностики и прогнозирования задержки внутриутробного роста плода обладают рядом недостатков. Некоторые способы не могут применяться в ранних сроках беременности, их использование предполагается только во втором триместре, что не всегда позволяет осуществить превентивные меры по предотвращению данного гестационного осложнения [12, 13, 14, 15]. Ряд способов связан с их использованием в отношении определенного, весьма ограниченного контингента женщин, что существенно сужает круг обследуемых и снижает ценность разработанных технологий. Так, известны способы диагностики и прогнозирования задержки роста плода у женщин с гестозом [16], у ВИЧ-инфицированных беременных [14], при беременности, индуцированной вспомогательными репродуктивными технологиями в связи с лечением бесплодия [15, 17], что уже само по себе чаще всего является условием для отнесения пациенток в группу риска по формированию перинатальной патологии, в том числе и ЗВРП. Вышеперечисленные факторы как изолированно, так и в сочетании друг с другом могут обусловливать нарушения процессов имплантации и плацентации, а также гемодинамические сдвиги, опосредующие в итоге нарушения обмена в системе «мать-плацента-плод». Кроме того, отдельные способы связаны с инвазивным вмешательством (использование амниотической жидкости для оценки содержания в ней аминокислот) [12]. В связи с этим наиболее ценными являются безопасные (неинвазивные или малоинвазивные) способы прогнозирования задержки роста плода с ранних сроков беременности (до клинических проявлений и манифестации патологических состояний).

Аналогами данного изобретения являются вышеуказанные способы доклинической диагностики и прогнозирования задержки роста плода. Наряду с перечисленными недостатками этих способов (использование только у определенного контингента женщин, определение показателей во втором и третьем триместрах беременности, небезопасность при инвазивных вмешательствах), несовершенство имеющихся способов связано с: трудоемкостью, обусловленной использованием методов капиллярного электрофореза или оценкой вирусной нагрузки при наличии инфекционного фактора [12, 14]; применением небезопасных химических реактивов (в том числе трихлоруксусной и соляной кислот) и необходимостью обеспечения специальных условий для работы с такого рода реагентами (оснащения вытяжным боксом и т.п.) [12]; низкой специфичностью, поскольку изменения целого ряда показателей (количества В-лимфоцитов и нейтрофилов, содержания васкуло-эндотелиального фактора роста и др.) [18, 19] могут являться предикторами различных патологических состояний при беременности, в том числе угрозы прерывания, гестоза, плацентарной недостаточности, невынашивания; сложностью применения достаточно громоздкого алгоритма обследования, включающего комплекс методов (сбор анамнестических данных не только матери, но и отца, определение спектра вирусных антигенов методом ПЦР, оценку результатов ультразвуковых и допплерометрических исследований) с итоговым подсчетом прогностического индекса [14].

Прототипом предложенного изобретения является способ раннего прогнозирования синдрома задержки роста плода, заключающийся в определении в сыворотке крови женщины в 6-12 недель гестации содержания васкуло-эндотелиального фактора роста методом иммуноферментного анализа [13].

Несмотря на очевидные достоинства способа-прототипа (возможность прогнозирования задержки роста плода в 6-12 недель беременности с использованием готовых тест-систем и оснащения стандартным оборудованием для иммуноферментного анализа), к недостаткам данного метода можно отнести невозможность прогнозирования задержки роста плода с более ранних сроков беременности. Авторы прогнозируют задержку роста плода при уровне васкуло-эндотелиального фактора роста 20 мг/мл и ниже, в то же время другими исследователями установлено повышение содержания VEGF в ранние сроки беременности, осложнившейся впоследствии клиническими проявлениями плацентарной недостаточности и ЗВРП [20]. По современным представлениям, формирование ЗВРП может быть обусловлено нарушением развития плаценты в результате дисфункции эндотелия, которая существенно ухудшает процессы васкуляризации в ранних сроках беременности. Возникающие при этом недостаточность кровообращения и ишемия плаценты обусловливают активизацию выработки VEGF, поддерживающего способность ворсин плаценты к образованию большого числа ветвящихся сосудов [20]. Кроме того, изменение содержания васкуло-эндотелиального фактора роста является предвестником и других патологических состояний при беременности, в том числе угрозы прерывания беременности, гестоза, невынашивания [3, 5, 6, 11], в связи с чем специфичность способа прогноза, основанного на определении только этого фактора невелика.

В настоящее время перспективным направлением научных исследований, проводимых с целью поиска прогностических критериев формирования перинатальной патологии с ранних сроков беременности, является разработка оптимального комплекса предикторов, отражающих эффективность регуляторных механизмов, направленных на сохранение и успешное прогрессирование беременности. На сегодняшний день общепризнанным является тот факт, что в основе патогенеза гестационных осложнений лежат нарушения механизмов иммунологической регуляции в эмбриональном и раннем фетальном периоде. В результате обобщения опыта многолетних исследований, проводимых в ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Министерства здравоохранения Российской Федерации, установлено, что патогенетические механизмы формирования СЗРП связаны с увеличением цитотоксического потенциала лимфоцитов, нарушением процессов иммунного распознавания и формирования иммунологической толерантности материнской иммунной системы в отношении антигенов плода, нарушением апоптоза клеток-эффекторов, а также провоспалительной направленностью иммунного ответа. Такие изменения характера иммунного ответа способствуют нарушению формирования фетоплацентарного комплекса и проявлению эмбриотоксических эффектов. Таким образом, совокупность наиболее информативных факторов, характеризующих состояние клеточного и гуморального звеньев иммунной системы матери, может иметь высокую предикторную значимость для прогнозирования задержки внутриутробного роста плода.

Сущность изобретения

Целью изобретения является разработка способа прогнозирования задержки внутриутробного роста плода с ранних сроков беременности (с момента наступления беременности до конца первого триместра), заключающегося в определении относительного содержания CD3⁺CD16⁺56⁺-лимфоцитов, уровня С3-компонента комплемента и растворимого рецептора фактора некроза опухоли (sTNF-R) в крови женщины с последующим вычислением прогностического индекса (PI).

Способ осуществляют следующим образом. Забор периферической венозной крови для исследования проводят натощак, в утренние часы, в две пробирки: в пробирку с антикоагулянтом (ЭДТА) в количестве 0,5 мл и в сухую чистую пробирку в количестве 3 мл. Пробирку с ЭДТА используют для определения относительного содержания CD3⁺CD16⁺CD56 ⁺-клеток методом проточной цитофлюориметрии. Вторую пробирку используют для получения путем центрифугирования сыворотки крови, в которой проводят определение содержания уровня С3-компонента комплемента и растворимого рецептора фактора некроза опухоли (sTNF-R) методом иммуноферментного анализа в соответствии с инструкциями фирм-производителей. Измерение оптической плотности образцов выполняют на иммуноферментном анализаторе «SUNRISE» фирмы «TECAN» (Австрия).

Полученные значения используют для вычисления прогностического индекса (PI) по формуле, разработанной с использованием метода дискриминантного анализа:

PI=-0,8911X₁-0,0321Х₂ -2,3669Х₃+11,0779,

где X₁ - относительное содержание CD3⁺CD16⁺CD56 ⁺-лимфоцитов, %;

Х₂ - концентрация С3-компонента комплемента, мг/дл;

Х₃ - концентрация sTNF-R, нг/мл.

При PI<0 прогнозируют задержку роста плода во второй половине беременности, а при PI>0 делают заключение о низком риске развития данного патологического состояния.

Чувствительность предлагаемого способа составляет 92,1% специфичность - 72,2%. Эффективность способа - 82,2%.

Пример 1. Ковалева Е.О. (история родов № 2662). Обследовалась амбулаторно в научной поликлинике ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России 25.05.2010. Первобеременная, первородящая. Диагноз: беременность 9-10 недель, носитель ЦМВ, артериальная гипертензия I ст., хронический тонзиллит в стадии ремиссии, аппендэктомия в 13 лет без осложнений, эрозия шейки матки, уреаплазмоз. При лабораторном исследовании крови получены следующие показатели: относительное содержание CD3⁺ CD16⁺CD56⁺-лимфоцитов - 8%, уровень С3-компонента комплемента - 77,02 мг/дл, концентрация sTNF-R - 1,89 нг/мл. Прогностический индекс, рассчитанный по формуле, равен -2,997, отрицательное значение индекса свидетельствует о высоком риске развития задержки внутриутробного роста плода, в связи с чем пациентка отнесена в группу риска по формированию данного осложнения беременности. В сроке 34 недели беременности по данным ультразвукового исследования выявлена задержка внутриутробного роста плода I ст. по асимметричному типу. Женщина была госпитализирована в стационар, наблюдалась и получала терапию в соответствии со стандартом оказания медицинской помощи. Беременность завершилась самостоятельными срочными родами в сроке 39-40 нед. и рождением живого доношенного мальчика с массой тела 2880 г, ростом 50 см. Диагноз ребенка при рождении: синдром задержки роста плода I ст., гипотрофический вариант.

Пример 2. Кузнецова М.И. (история родов № 3714). Обследовалась амбулаторно в научной поликлинике ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России 28.12.2009. Повторно беременная, первородящая. Диагноз: беременность 9-10 недель, отягощенный акушерский анамнез (привычное невынашивание, бесплодие II - 12 лет), множественная субсерозно-интерстициальная миома матки небольших размеров с атипичным расположением одного из узлов, гиперандрогения, хронический аднексит, хронический пиелонефрит в стадии ремиссии, остеохондроз, грыжа межпозвоночных дисков, уреаплазмоз, микоплазмоз, хронический гепатит C, ожирение I ст., угроза выкидыша (жалобы на боли внизу живота). При лабораторном исследовании крови получены следующие показатели: относительное содержание CD3⁺CD16⁺CD56⁺-лимфоцитов - 2%, уровень С3-компонента комплемента - 184,4 мг/дл, концентрация sTNF-R - 1,442 нг/мл. Прогностический индекс, рассчитанный по формуле, равен -0,036 отрицательное значение индекса свидетельствует о высоком риске развития задержки внутриутробного роста плода, в связи с чем пациентка отнесена в группу риска по формированию данного осложнения беременности. В сроке 21-22 нед. по результатам ультразвукового и допплерометрического исследований выявлено нарушение маточно-плацентарного кровообращения I А ст., синдром задержки внутриутробного роста плода I ст. по асимметричному типу. Женщина была госпитализирована в стационар, наблюдалась и получала терапию в соответствии со стандартом оказания медицинской помощи. Беременность завершилась преждевременными оперативными родами в сроке 34 нед. и рождением живой недоношенной девочки с массой тела 2220 г, ростом 44 см. Диагноз ребенка при рождении: недоношенность, синдром задержки роста плода I ст., гипотрофический вариант.

Пример 3. Мелкомукова Е.В. (история родов № 2359). Обследовалась амбулаторно в научной поликлинике ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России 26.04.2010 г. Повторно беременная, первородящая. Диагноз: беременность 10 недель, отягощенный акушерский анамнез (медицинский аборт), носитель ВПГ, ЦМВ, миопия I ст., синдром дисплазии соединительной ткани (аномальная хорда левого желудочка), вегетососудистая дистония по гипотоническому типу, нефроптоз справа, дрожжевой кольпит при данной беременности. При лабораторном исследовании крови получены следующие показатели: относительное содержание CD3⁺CD16⁺CD56 ⁺-лимфоцитов - 9%, уровень С3-компонента комплемента - 95,17 мг/дл, концентрация sTNF-R - 1,23 нг/мл. Прогностический индекс, рассчитанный по формуле, равен -2,908 отрицательное значение индекса свидетельствует о высоком риске развития задержки внутриутробного роста плода, в связи с чем пациентка отнесена в группу риска по формированию данного осложнения беременности. В сроке 31-32 нед. по результатам ультразвукового исследования выявлено маловодие, синдром задержки роста плода I ст. по асимметричному типу. Женщина была госпитализирована в стационар, наблюдалась и получала терапию в соответствии со стандартом оказания медицинской помощи. Беременность завершилась самостоятельными срочными родами в сроке 39-40 нед. и рождением живой доношенной девочки с массой тела 2765 г, ростом 49 см. Диагноз ребенка при рождении: перенесенная умеренная асфиксия, синдром задержки роста плода I ст., гипотрофический вариант.

Пример 4. Фомина И.А. (история родов № 3782). Обследовалась амбулаторно в научной поликлинике ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России 25.01.2010. Повторно беременная, повторнородящая. Диагноз: беременность 6 недель, отягощенный акушерский анамнез (самопроизвольный выкидыш в 12 недель беременности, 2 медицинских аборта), микроаденома гипофиза, гиперпролактинемия, гиперандрогения, носитель ЦМВ, двусторонний диспластический коксартроз I ст. (деформация шеек бедер), эрозия шейки матки (криодеструкция в 1990 г.). При лабораторном исследовании крови получены следующие показатели: относительное содержание CD3⁺CD16⁺CD56⁺-лимфоцитов - 2%, уровень С3-компонента комплемента - 78,7 мг/дл, концентрация sTNF-R - 1,668 нг/мл. Прогностический индекс, рассчитанный по формуле, равен 2,821, положительное значение индекса свидетельствует о низком риске развития задержки внутриутробного роста плода. При дальнейшем наблюдении, по данным ультразвуковых и допплерометрических исследований в течение беременности состояние плаценты и плода оценивалось как нормальное, соответствующее сроку гестации, беременность завершилась самостоятельными срочными родами в сроке 39-40 нед. и рождением живой доношенной девочки с массой тела 3410 г, ростом 51 см. Диагноз ребенка при рождении: здоров.

Пример 5. Кузнецова О.Д. (история родов № 3915). Обследовалась амбулаторно в научной поликлинике ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России 24.02.2010. Повторно беременная, повторнородящая. Диагноз: беременность 8 недель, привычное невынашивание, бесплодие II (8 лет), язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, обострение хронического гайморита, отит, уреаплазмоз и трихомониаз санированы в 2002 г., носитель ЦМВ, ВПГ, аутоиммунный тиреоидит, субклинический гипотиреоз. При лабораторном исследовании крови получены следующие показатели: относительное содержание CD3⁺CD16⁺CD56 ⁺-лимфоцитов - 2%, уровень С3-компонента комплемента - 144,9 мг/дл, концентрация sTNF-R - 1,467 нг/мл. Прогностический индекс, рассчитанный по формуле, равен 1,172, положительное значение индекса свидетельствует о низком риске развития задержки внутриутробного роста плода. При дальнейшем наблюдении, по данным ультразвуковых и допплерометрических исследований в течение беременности состояние плаценты и плода оценивалось как нормальное, соответствующее сроку гестации, беременность завершилась самостоятельными срочными родами в сроке 39-40 нед. и рождением живого доношенного мальчика с массой тела 3700 г, ростом 52 см. Диагноз ребенка при рождении: здоров.

Приведенные клинические примеры показывают, что нарушение иммунорегуляции, характеризующееся сдвигами в клеточном и гуморальном звеньях иммунной системы женщины в ранние сроки беременности, является патогенетической основой формирования задержки внутриутробного роста плода, манифестирующей во второй половине гестации. Вышеизложенное подтверждает прогностическую ценность заявляемого способа.

Таким образом, заявляемый способ прогнозирования задержки внутриутробного роста плода в сравнении с известными имеет следующие преимущества:

1. Способ является малоинвазивным, поскольку прогнозирование осуществляется по результатам исследования периферической крови.

2. Способ позволяет прогнозировать риск формирования задержки роста плода с использованием иммунологических параметров, являющихся ключевыми регуляторами гестационного процесса и вовлеченных в патогенез данного осложнения беременности.

3. Предлагаемый способ позволяет с ранних сроков гестации (с момента наступления беременности) выявить группу риска по формированию задержки внутриутробного роста плода, что дает возможность осуществления превентивных мероприятий, направленных на профилактику данного патологического состояния.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Павлова Н.Г. Плацентарная недостаточность: учебно-методическое пособие / Н.Г.Павлова, О.Н.Аржанова, М.С.Зайнулина, А.В.Колобов // СПб.: ООО «Издательствово Н-Л», 2007. - 32 с.

2. Доброхотова Ю.Э. Плацентарная недостаточность. Современная терапия. Особенности течения плацентарной недостаточности при варикозной болезни: учебно-методическое пособие / Ю.Э.Доброхотова, Э.М.Джобава // М.: «АдамантЪ», 2011. - 32 с.

3. Ранние сроки беременности / Под ред. В.Е.Радзинского, А.А.Оразмурадова. - М.: «Status Preasens», 2009.

4. Игнатко И.В. Профилактика плацентарной недостаточности у беременных высокого перинатального риска / И.В.Игнатко // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2007. - Т.6, № 5. - С.11-18.

5. Кудряшова А.В. Роль иммунной системы в формировании задержки внутриутробного развития плода / А.В.Кудряшова, Н.Ю.Сотникова, Л.В.Посисеева, И.А.Панова, М.В.Веденеева // Иваново, 2009. - 240 с.

6. Орлов В.И. Продукция факторов роста и вазоактивных веществ при синдроме задаржки роста плода / В.И.Орлов, В.В.Авруцкая, З.С.Крымшокалова, И.И.Крукиер // Журнал акушерства и женских болезней. - 2008. - Т.LVII, выпуск 2. - С.84-89.

7. Стрижаков А.Н. Клиническое значение приобретенных и наследственных форм тромбофилий в патогенезе синдрома задержки роста плода / А.Н.Стрижаков, А.Д.Макацария, Е.В.Тимохина, С.М.Баймурадова, У.А.Козлова // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2009. - Т.8, № 2. - С.16-21.

8. Иммунологическая загадка беременности. Под ред. Н.Ю.Сотниковой. - Иванове: Издательство МИК. - 2005. - 276 с.

9. Ширшев С.В. Иммунология материнско-фетальных взаимодействий / С.В.Ширшев. - ЕкатеринбургУрО РАН, 2009. - 584 с.

10. Сельков С.А. Иммунологические механизмы контроля развития

плаценты / С.А.Сельков, Д.И.Соколов // Журнал акушерства и женских болезней. - 2010. - Т.LIX, выпуск 1. - С.6-10.

11. Левкович М.А. Роль иммуно-гормональных взаимодействий в генезе угрозы прерывания беременности ранних сроков / М.А.Левкович, В.А.Линде, В.О.Андреева, Т.Г.Плахотя, Д.Д.Нефедова // Акушерство и гинекология. - 2012. - Спецвыпуск. - С.3-7.

12. Крукиер И.И. Способ диагностики задержки роста плода / И.И.Крукиер, Т.Н.Погорелова, В.В.Авруцкая, Е.В.Нарежная, А.А.Никашина, Н.А.Друккер, А.Т.Лигидова // Патент RU № 2425379 от 27.07.2011 г.

13. Сотникова Н.Ю. Способ раннего прогнозирования синдрома задержки развития плода / Н.Ю.Сотникова, А.В.Кудряшова // Патент RU № 2295132 от 10.03.2007.

14. Рымашевский А.Н. Способ прогнозирования задержки внутриутробного развития плода во 2-м триместре у ВИЧ-инфицированных / А.Н.Рымашевский, А.В.Опруженков // Патент RU № 2435515 от 10.12.2011.

15. Башмакова Н.В. Способ прогноза задержки внутриутробного развития плода во втором триместре беременности после вспомогательных репродуктивных технологий / Н.В.Башмакова, Ю.М.Трапезникова, Н.Р.Шабунина-Басок, К.А.Изместьева, А.Д.Мазуров // Патент на изобретение № 2436087 от 10.12.2011.

16. Кудряшова А.В. Способ диагностики задержки внутриутробного развития плода у женщин с гестозом / А.В.Кудряшова, И.А.Панова, Н.Ю.Сотникова, Н.Ю.Филинова, А.Г.Филинов // Патент RU № 2188427 от 27.08.2002.

17. Башмакова Н.В. Способ прогнозирования задержки внутриутробного развития плода при беременности после вспомогательных репродуктивных технологий / Н.В.Башмакова, Ю.М.Трапезникова, Н.Р.Шабунина-Басок, К.А.Изместьева, А.Д.Мазуров // Патент на изобретение № 2444995 от 20.03.2012.

18. Сотникова Н.Ю. Способ оценки состояния плода / Н.Ю.Сотникова, А.В.Кудряшова, А.Г.Филинов, Ю.С.Анциферова, Н.В.Крошкина // Патент RU № 2086981 от 10.08.1997.

19. Орлов А.В. Способ прогнозирования задержки внутриутробного развития плода / А.В.Орлов, И.И.Крукиер, И.В.Маркарьян, Н.А.Друккер, Т.Н.Погорелова, Э.Ю.Мелконов // Патент на изобретение № 2246733 от 20.02.2005 г.

20. Plaiser M., Dennert I., Rost E. et al. Decidual vascularization and the expression of angiogenic growth factors and proteases in first trimester spontaneous abortions. Human Reprod 2009; 24 (1):185-197.