способ определения интерферон-гамма-продуцирующих т-лимфоцитов при хроническом лимфолейкозе

Формула изобретения

Способ определения интерферон- -продуцирующих T-лимфоцитов при хроническом лимфолейкозе, включающий ингибирование внутриклеточного транспорта в клеточной культуре, стимуляцию синтеза интерферона- , связывание с флуоресцеинизотиоционат-меченными анти-CD3 моноклональными антителами, фиксацию, пермеабилизацию, обработку фикоэритрин-меченными анти-интерферон- моноклональными антителами и цитометрический анализ, отличающийся тем, что клеточную культуру, смешанную с ингибитором внутриклеточного транспорта - брефелдином A, подвергают немедленной обработке флуоресцеинизотиоционат-меченными анти-CD3 антителами, затем проводят стимуляцию синтеза интерферона- , фиксацию, пермеабилизацию, окраску фикоэритрин-меченными анти-интерферон- моноклональными антителами и цитометрию: наблюдают совпадение флуоресцентной метки CD3-маркера в клеточной культуре с таковой, определяемой на основании контролируемого метода, при этом регистрируют повышение точности анализа.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике в гематологии, и касается определения одного из показателей иммунологической реактивности организма при хроническом лимфолейкозе (ХЛЛ).

T-лимфоциты имеют богатый рецепторный аппарат - около 100 маркеров, внесенных в современную номенклатуру [1]. Маркеры CD2, CD5 и CD7 применяются для количественной оценки Т-лимфоцитов, однако, кроме T-лимфоцитов, они экспрессируются на других популяциях лимфоцитов (натуральных киллерах, B-лимфоцитах). Высокоспецифическим «неперекрывающимся» маркером T-лимфоцитов является маркер CD3, это делает CD3 наиболее часто используемым при характеристике иммунного статуса человека.

Известны методы количественного определения числа Т-лимфоцитов, требующие применения моноклональных антител к дискретным T-клеточным антигенным детерминантам: метод комплементзависимой цитотоксичности, АРААР (alkaline phosphatase/anti-alkaline phosphatase)-тест, метод поверхностной иммунофлуоресценции. Однако количественная оценка T-лимфоцитов может оказаться недостаточной или неинформативной у иммунокомпрометированных лиц, например у больных с лимфопролиферативными заболеваниями. При хроническом лимфолейкозе в дебюте заболевания, B-клеточных лимфомах на стадии лейкемизации, а также при их рецидивировании в периферической крови больных наблюдается преобладание лимфоцитов, относящихся к B-линии и практически не отличающихся от здоровой популяции лимфоцитов по морфологическим признакам. Соотношение T/B-клеток у пациентов при данной группе заболеваний на указанных этапах соответствует в среднем 1,5±0,54, в то время как в группе здоровых лиц оно составляет 4,9±0,29. Абсолютное количество T-лимфоцитов нередко (в 30% случаев) значительно выше принятых нормативов, что объясняется влиянием некоторых цитокинов, вырабатываемых опухолевым клоном и запускающих пролиферацию T-лимфоцитов и их подвидов [2]. Уровень экспрессии рецепторов на T-лимфоцитах у таких больных оказывается ниже, чем в референтных группах (3). Малоинформативным для оценки иммунного статуса этой категории онкогематологических больных является и содержание иммуноглобулинов сыворотки крови в связи с известной способностью опухолевых лимфоцитов к продукции патологических иммуноглобулинов [4]. Изложенное диктует необходимость поиска тестов, отражающих функциональные способности T-лимфоцитов у названной группы иммунокомпрометированных лиц.

Популяция T-лимфоцитов периферической крови представляет собой многофункциональную группу, в которой часть клеток синтезирует интерферон- . Определение способности T-лимфоцитов к продукции этого цитокина может дать дополнительную информацию о состоянии T-клеточного звена иммунитета, например противовирусной и противоопухолевой защиты. В исследованиях in vitro установлено, что количество T-лимфоцитов, продуцирующих интерферон- в неактивированных культурах мононуклеаров, оказывается крайне незначительным как у новорожденных, так и у взрослых. В то же время выявленная способность некоторых веществ активировать синтез цитокинов in vitro позволила проводить изучение стимулированной продукции цитокинов на уровне одной клетки. Форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА) является активатором протеинкиназы C, центральной молекулы многих сигнальных путей, приводящих к индукции синтеза цитокинов. Для работы протеинкиназы C требуется Ca²⁺, поэтому ФМА применяется в сочетании с ионофорами кальция. Иономицин кальция является таким ионофором - жирорастворимым веществом, способным транспортировать ионы через липидный бислой клеточной мембраны. Сочетание ФМА с иономицином кальция считается наиболее эффективным для активации синтеза разных видов цитокинов лейкоцитами человека [5].

Для определения внутриклеточных цитокинов подходит метод лазерной проточной цитометрии с использованием моноклональных антител, напрямую конъюгированных с разными флуорохромами, при котором флуорохромы имеют существенные различия по длине волны испускаемого света. Известно, что длительная инкубация с химическими веществами способна повредить мембраны лимфоцитов и влияет на их рецепторный аппарат. Вследствие этого исследователи зачастую предпочитают обходиться без детекции мембранных структур. В этом случае анализируется цитокин-секретирующая функция не в конкретной популяции лимфоцитов, а во всем пуле этих клеток. Однако оценка цитокин-секретирующей функции всего пула лимфоцитов периферической крови при B-клеточных хронических лимфопролиферативных заболеваниях в большинстве случаев оказывается некорректной в связи с преобладанием в периферическом русле моноклональных опухолевых B-лимфоцитов.

При выявлении внутриклеточных цитокинов необходимым явлется ингибирование выхода синтезированных цитокинов из клеток. Такими блокаторами могут выступать вещества: брефелдин A (антибиотик, продуцируемый грибком Eupenicillium brefeldianum) и моненсин (ациклический природный антибиотик полиэфирного типа со свойствами ионофора, выделенный из Streptomyces cinnamonensis). Наибольшей эффективностью обладает брефелдин A, поэтому на практике он наиболее часто используется [6].

По завершении стимуляции синтеза и ингибирования внутриклеточного транспорта выполняются собственно иммунологические реакции - связывание моноклональных антител с антигенами, экспрессированными как на поверхности лимфоцитов, так и внутри клетки. При этом требуется фиксация и пермеабилизация лейкоцитов, в настоящее время в качестве наилучшего фиксирующего агента используется параформальдегид (0,5-2%), а в качестве пермеабилизующего - сапонин (0,05-0,1%) [7]. Только после процедур фиксации и пермеабилизации становится возможным связывание интерферона- , находящегося в цитозоле, с флуорохром-меченными моноклональными анти-интерферон- антителами.

Таким образом, прототип способа идентификации интерферон- -продуцирующих T-лимфоцитов является трудоемкой лабораторной методикой, этапы которой описаны в разных инструктивных материалах [5, 6, 7, 8]. Опубликован опыт применения ближайшего аналога способа [9].

Пошаговое воспроизведение прототипа лабораторной методики было выполнено при исследовании образцов венозной крови 10 доноров и 12 больных ХЛЛ. Для выявления стимулированного и спонтанного синтеза интерферона- T-лимфоцитами из образца крови в стерильных условиях готовили клеточные культуры двух видов. Подготовка клеточных культур включала в себя смешивание 1000 мкл крови с 1000 мкл среды RPMI 1640 и инкубирование с брефелдином A в течение 2 часов в среде CO ₂. Для подготовки стимулированной клеточной культуры проводилась инкубация с ФМА (при конечной концентрации вещества - 100 нг/мкл) и кальциевой солью иономицина (при конечной концентрации вещества - 1 мкг/мкл) в течение 18 часов. При подготовке клеточной культуры для оценки спонтанного синтеза интерферона- вместо ФМА и иономицина в клеточную культуру вносили аналогичные аликвоты разбавителей этих веществ.

После окончания культивирования обе клеточные культуры дважды отмывали средой RPMI 1640, инкубировали с флуоресцеинизотиоционат-меченными анти- CD3 моноклональными антителами в течение 20 минут в темноте и отмывали от несвязавшихся антител методом центрифугирования в течение 5 минут при 600 g забуференным фосфатно-солевым раствором.

Затем проводили фиксацию клеток 0,5% раствором параформальдегида: энергичное встряхивание на вортексе, инкубирование в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут, в процессе чего происходил частичный лизис эритроцитов. Выполняли однократную отмывку клеток. Пермеабилизация включала пятиминутную обработку клеток раствором сапонина при деликатном покачивании пробирок. Проводили 30-минутную обработку клеток фикоэритрин-меченными моноклональными антителами против интерферона- человека, после чего выполняли отмывку от несвязавшихся антител забуференным фосфатно-солевым раствором путем центрифугирования в течение 5 минут при 600 g.

Спонтанную и стимулированную клеточные культуры анализировали на лазерном проточном цитофлуориметре. Для этого на основе определения параметров малоуглового и бокового светорассеяния на точечном графике выделяли полигон лимфоцитов и проводили анализ лимфоцитов на наличие двух флуоресцентных меток. Кроме того, процентное содержание CD3⁺-лимфоцитов у каждого донора и больного определяли стандартным методом проточной цитофлуориметрии, прошедшим внутрилабораторный и внешний контроль качества. Для этого использовались моноклональные антитела к антигенам, экспрессия которых в пределах лимфоцитов не перекрывается (анти-CD3 и анти-CD19) и далее выполнялось лизирование эритроцитов NH₄Cl-содержащим раствором, фиксирование и отмывка.

Группа больных хроническим лимфолейкозом характеризовалась более выраженным варьированием по относительному содержанию в крови CD3⁺-лимфоцитов (2,5-43,0%) по сравнению с группой доноров (69,8-87,0%). В то же время в обеих группах количество CD3⁺-лимфоцитов, оцененное в стимулированных клеточных культурах, было значительно ниже по сравнению с таковым как в клеточных культурах без стимуляции, так и в цельной крови, определенном на основании контролируемого метода (табл.1). Выявленное различие может быть обусловлено влиянием ФМА и кальциевой соли иономицина на экспрессию CD3 на лимфоцитах, а именно на ее интернирование или частичное расщепление, что делает молекулу CD3 недоступной для дальнейшего связывания с моноклональными антителами. Таким образом, при оценке результатов в стимулированной культуре было зарегистрировано недовыявление CD3⁺-лимфоцитов как у доноров, так и больных хроническим лимфолейкозом.

Таблица 1
Относительное содержание CD3+-лимфоцитов в крови доноров и больных ХЛЛ, оцененное разными способами
Группы обследованных	Результаты определения, %, Me (I кв.; III кв.)
	I	II	III
	в цельной крови (контролируемый метод)	в спонтанной клеточной культуре	в стимулированной клеточной культуре (прототип способа)
Доноры	72,9(70,3; 76,6)	69,3(65,8; 72,0)	25,6(13,6:39,3)
			pI-III<0,001
		pI-II=0,14
			pII-III <0,001
Больные ХЛЛ	10,2(6,5; 16,4)	9,2(5,5; 16,4)	5,2(3,8; 10,8)
			pI-III<0,05
		pI-II=0,93	pII-III<0,05

Число CD3⁺-лимфоцитов, подсчитанное в клеточных культурах без стимуляции, не отличалось от результата, полученного в контролируемом методе. Это свидетельствует о том, что на определение CD3 ⁺-лимфоцитов в культуре крови не влияет добавление брефелдина A и длительная (20 часов) инкубация в среде RPMI 1640.

Таким образом был зарегистрирован существенный недостаток в прототипе способа, отражающийся на точности подсчета CD3⁺-лимфоцитов, а следовательно, и интерферон- T-лимфоцитов. Технической задачей настоящего изобретения являлось устранение указанного недостатка и повышение точности способа подсчета интерферон- -продуцирующих Т-лимфоцитов у больных ХЛЛ.

Сущность изобретения заключается в следующем. Из венозной гепаринизированной крови 25 доноров и 35 больных ХЛЛ, взятой в стерильную пробирку, готовили клеточную культуру, для чего смешивали 1000 мкл крови с 1000 мкл среды RPMI 1640; к полученной смеси добавляли 1 мкл брефелдина A, проводили тщательное перемешивание культуры на лабораторном вортексе. После этого приготовленную клеточную культуру немедленно обрабатывали анти-CD3 антителами, соблюдая необходимое соотношение объемов клеточной культуры и моноклональных антител: отделяли 100 мкл полученной клеточной культуры в другую стерильную пробирку, в нее вносили 20 мкл флуоресцеинизотиоционат-конъюгированных моноклональных антител к CD3 человека, клеточную культуру тщательно перемешивали на лабораторном вортексе и инкубировали в CO ₂-камере в течение 2 часов. Затем в клеточную культуру вносили активаторы синтеза цитокинов (ФМА и кальциевую соль иономицина) при перемешивании на вортексе и проводили инкубацию в CO ₂-камере в течение 18 часов. Дальнейшее проведение реакции выполняли при повторении всех этапов, предусмотренных прототипом, кроме этапа связывания с анти-CD3 моноклональными антителами. Оценка результатов иммунологической реакции выполнялась при сохранении прежних настроек лазерного проточного цитофлуориметра.

Сравнили результаты выявления CD3⁺-лимфоцитов в контролируемом методе и в стимулированной клеточной культуре доноров и больных ХЛЛ. Как видно из таблицы 2, процентное содержание CD3⁺ -лимфоцитов среди клеток лимфоцитарного полигона при этом как у доноров, так и у больных не различалось. Таким образом, при применении описанного подхода нивелируется влияние активаторов синтеза цитокинов на понижение экспрессии CD3 на мембране и повышается точность метода определения интерферон- -продуцирующих T-лимфоцитов в крови.

Таблица 2
Относительное содержание CD3+-лимфоцитов в крови доноров и больных хроническим лимфолейкозом, оцененное разными способами
Группы обследованных	Результаты определения, %, Me (I кв.; III кв.)		p
	в цельной крови (контролируемый метод)	в стимулированной клеточной культуре по предлагаемому способу
Доноры	69,7±2,8	68,8±3,3	p=0,35
	69,3(65,8; 72,0)	66,0(62,0; 71,3)
Больные хроническим лимфолейкозом	14,2±1,9	13,0±3,86	p=0,68
	12,0(5,5; 16,4)	11,7(4,5; 12,3)

При анализе спонтанной и стимулированной клеточных культур регистрировали процент интерферон- ⁺ клеток среди CD3⁺-лимфоцитов, что достигалось использованием методов программного обеспечения лазерного проточного цитофлуориметра. Провели расчеты, позволяющие использовать результаты лабораторного исследования стимулированного синтеза интерферона- T-лимфоцитами в практике клинического иммунолога. Для каждой пары наблюдений подсчитывали индекс стимуляции: процентное содержание интерферона- ⁺ клеток среди CD3⁺-лимфоцитов в стимулированном тесте, деленное на процентное содержание интерферона- ⁺ клеток среди CD3⁺-лимфоцитов в спонтанном тесте.

Разработанный способ определения интерферон- -продуцирующих T-лимфоцитов при ХЛЛ рекомендуется использовать в комплексной оценке состояния иммунной системы в этой группе онкогематологических больных. Повышение точности оценки рассматриваемого иммунологического показателя имеет несомненную практическую ценность.

Способ найдет применение в клинико-диагностических лабораториях учреждений, оказывающих специализированную, в том числе высокотехнологичную, медицинскую помощь больным лимфопролиферативными заболеваниями; предлагаемый метод исследования является технически доступным для специализированных лабораторий.

Пример

На основании результатов, полученных в группе здоровых доноров, были определены значения нормы изучаемых показателей. Для проведения статистического сравнительного анализа вычислено среднее значение со средней ошибкой, для выявления лиц с отклонениями установлен биологический разброс - 95% доверительный интервал (табл.3).

У больных хроническим лимфолейкозом зарегистрированы существенно более высокие значения содержания интерферон- ⁺ T-лимфоцитов в спонтанной культуре, что, вероятно, связано с присутствием в группе больных лиц с напряжением противовирусного и противоопухолевого иммунитета.

Таблица 3
Показатели спонтанного и стимулированного синтеза интерферона- CD3+-лимфоцитами у доноров и больных ХЛЛ
Интерферон- + CD3+ лимфоциты	Группы обследованных		P
	Доноры, n=25 (M±m, 95%-интервал)	Больные, n=35 (M±m)
В спонтанной клеточной культуре (%)	0,05±0,03	0,2±0,03	p<0,05
	0,01-0,04
В стимулированной клеточной культуре (%)	20,7±4,43	21,4±5,19	p=0,89
	12,0-29,4
Индекс стимуляции	1168,6±323,3	214,0±45,8	p<0,001
	625,6-1620,1

В общей группе больных наблюдалось возрастание относительного числа интерферон- ⁺ T-лимфоцитов в стимулированной клеточной культуре по сравнению с нестимулированной. Среднестатистическое значение индекса стимуляции у больных существенно отличалось от нормы в сторону понижения, что обусловлено более высокими значениями показателя в спонтанном тесте и присутствием в этой группе лиц, характеризующихся полным отсутствием эффекта стимуляции синтеза интерферона- . В группе больных в 20% случаев наблюдалось понижение относительного количества интерферон- ⁺ CD3⁺-лимфоцитов в стимулированной клеточной культуре по сравнению с референтными значениями. У 11,4% больных отмечалось совпадение результатов спонтанного и стимулированного тестов, то есть была полная неотвечаемость T-лимфоцитов на стимуляторы.

Литература

1. Бурместер Г.-Р. Наглядная иммунология. / Г.-Р. Бурместер, А. Пецутто. - М.: БИНОМ, 2007. - 320 с.

2. Воробьев А.И. Руководство по гематологии: в 3 т. Т.1 Под ред. А.И. Воробьева. 3-е изд., перераб. и допол. М. - Ньюдиамед, 2002, 280 с.

3. Laboratory signs of T-cell anergy in chronic lympholeukemia / N.V. Isaeva, G.A. Zaitseva, T.P. Zagoskina, Y.A. Poponina // Cellular Therapy and Transplantation. - 2011. - Vol.3. - P.49

4. Сисла Б. Руководство по лабораторной гематологии. - М.: Практическая медицина, 2011. - 352 с.

5. Detection of intrercellular cytokines by flow cytometry / T. Jung, U. Schauer, C. Heusser, C. Neumann, C. Rieger // Journal of Immunological Methods. - 1993. - Vol.159. - P.197-207.

6. Dynamics of GBF1, a Brefeldin A - Sensitive Arf1 Exchange factor at the Golgi / T.-K. Nui, A.C. Pfeifer, J. Lippincott-Schwartz, C.L. Jackson // Molecular Biology of the Cell. - 2005. - Vol.16. - P.1213-1222.

7. Enumeration of INF-gamma producing cells by flow cytometry. Comparison with fluorescence microscopy / U. Anderson, G. Hallden, U. Persson et al.//Journal of Immunological Methods. - 1988. - Vol.112. - P.139-142.

8. Kallel C. et al. Detection by flow cytometry of T cell subsets secreting IL-2 and UNF (Gamma): optimisation for the technic and the establishment of reference values // Pathology Biology (Paris). - 2007. - v.55 (5), h.222-229 (реферат).

9. Уровень CD3⁺ -лимфоцитов, содержащих интерферон- , у больных туберкулезом легких и его изменение после включения в комплексную терапию полиоксидония. / Е.Э. Комогорова, Е.В. Костенко, В.А. Стаханов [и др.] // Иммунология. - 2004. - № 4. - С.210-213.