ингибиторы протеинфосфатазы-1 и их применение

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция для ингибирования репликации ВИЧ-1, содержащая соединение, представленное Формулой (I)



где n равен 1 или 2;

Ar обозначает фенил, замещенный одним заместителем, выбранным из группы, состоящей из OH и NO₂, или двумя заместителями OR, или тиенил;

R¹ выбран из группы, состоящей из R⁶ , C(O)N(R⁶)₂, и C₁-C₆ алкила, замещенного OR;

R² обозначает H или C₁-C₆ алкил;

R⁶, независимо, в каждом случае выбирают из H и C₁-C₆ алкила;

каждый R независимо представляет собой C₁-C ₈ алкил;

или его фармацевтически приемлемую соль,

или соединение 1G3:

Соединение 1G3

,

или его фармацевтически приемлемую соль,

в смеси по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым эксципиентом или разбавителем.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, где n равен 1.

3. Фармацевтическая композиция по п.1, где n равен 2.

4. Фармацевтическая композиция по п.1, где R² обозначает H или C1-C4 алкил.

5. Фармацевтическая композиция по п.1, где Ar обозначает 2-тиенил.

6. Фармацевтическая композиция по п.1, где Ar обозначает 3-тиенил.

7. Фармацевтическая композиция по п.1, где R¹ выбран из группы, состоящей из CH₂CH₂OCH₃, CONCH₂ CH₃, CONH₂ и CH₃.

8. Фармацевтическая композиция по п.1, где R¹ обозначает H или C₁ -C₆ алкил.

9. Способ лечения субъекта, инфицированного ВИЧ-1 или с повышенным риском инфицирования ВИЧ-1, включающий введение нуждающемуся в таком лечении субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по любому из пп.1-8.

10. Способ по п.9, где R¹ выбран из группы, состоящей из СН₂СН₂ОСН₃ , CONCH₂CH₃, CONH₂ и СН ₃, R² обозначает H или C₁-C₄ алкил, и Ar выбран из группы, состоящей из фенила, замещенного одним заместителем, выбранным из группы, состоящей из OH и NO ₂, или двумя заместителями OR, 2-тиенила или 3-тиенила.

11. Способ ингибирования репликации вируса ВИЧ-1, включающий приведение в контакт вируса ВИЧ-1 или клетки, содержащей вирус ВИЧ-1, с фармацевтической композицией по любому из пп.1-8.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к ингибиторам протеинфосфатазы- 1 и применению таких ингибиторов в медицине. Более конкретно, изобретение включает класс соединений, которые ингибируют РР1. Помимо этого описываются способы применения ингибиторов РР1 для лечения ВИЧ-1 инфекций.

Уровень техники

Недавние исследования показали, что для транскрипции ВИЧ-1 необходима протеинфосфатаза-1(РР1) (Ammosova, et al., J. Biol. Chem. 280, 36, 364-71 (2005)). По-видимому, Tat ВИЧ-1 связывается с РР1 через Q³⁵VCF³⁸ последовательность Tat и транслоцирует РР1 в ядро инфицированной клетки. Было высказано предположение, что низкомолекулярный ингибитор связывания РР1 с ВИЧ-1 Tat должен ингибировать транскрипцию ВИЧ-1, что, в свою очередь, предоставляет способ лечения субъектов, инфицированных ВИЧ-1.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение включает соединения, которые ингибируют транскрипцию ВИЧ-1. Не связывая себя какой- либо теорией, полагают, что эти соединения ингибируют взаимодействие между РР1 и ВИЧ-1 Tat, тем самым ингибируют транскрипцию ВИЧ-1. Было показано, что эти соединения ингибируют транскрипцию ВИЧ-1 в живых клетках. Таким образом, данные соединения применимы для лечения или предупреждения ВИЧ-1 инфекции.

В одном аспекте изобретение включает соединения представленной ниже Формулы (I):

где n обозначает 1 или 2;

Аr обозначает фенил или тиенил и, необязательно, является замещенным;

R¹, независимо, в каждом случае обозначает R⁶, C(O)R⁶, C(O)-OR⁶ или C(O)N(R ⁶)₂;

R² обозначает Н или необязательно замещенный С1-С6 алкил или группу формулы -C(O)NH-R¹;

R³, независимо, в каждом случае выбирают из галогена, NO₂, CN, R, OR, NR₂;

S(O)_qR, COOR и CONR₂, где каждый R, независимо, обозначает Н, С1-С4 алкил или С1-С4 галогеналкил;

m обозначает 0-4;

R⁴ обозначает R⁶, галоген,=O, COOR⁶, CO N(R⁶)₂, S(O)_q R⁶, N(R⁶)₂ или OR⁶ ;

p обозначает 0-2;

каждый q, независимо, обозначает 0-2;

Z обозначает О или NR⁵ ;

R⁵ обозначает R⁶ или C(O)R ⁶; и

R⁶, независимо, в каждом случае выбирают из Н, С1-С6 алкила, С5-С6 арила и (С5-С6- арил)- С1-С6 алкила, где каждый алкил и арил, необязательно, является замещенным;

при условии, что n обозначает 2, когда Z обозначает О, а Ar представляет собой пара-галогенфенил;

или его фармацевтически приемлемую соль.

Изобретение охватывает фармацевтические композиции, которые включают, по меньшей мере, одно соединение формулы (I) и другие соединения по данному описанию в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом. Изобретение включает также применение соединений формулы (I) и других соединений по данному описанию для получения лекарственного препарата, в особенности лекарственного препарата для лечения ВИЧ-инфицированных субъектов.

В другом аспекте изобретение включает способы лечения или предупреждения инфекции ВИЧ-1 путем введения нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения формулы (I) и других соединений по данному описанию. Способы включают различные пути введения соединений формулы (I) и других соединений по данному описанию, а также применение соединения формулы (I) в комбинации с другими терапевтическими агентами, эффективными для лечения или предупреждения ВИЧ-1 инфекции.

Подробное описание изобретения

Термины "алкил", "алкенил" и "алкинил" по данному описанию включают линейные, разветвленные или циклические одновалентные радикалы и их комбинации, которые, будучи незамещенными, содержат только С и Н атомы. Примеры включают метил, этил, изобутил, циклогексил, циклопентилэтил, 2-пропенил, 3-бутинил и т.п. Общее число углеродных атомов в каждой такой группе иногда указывается в данном описании, например, когда группа может содержать до десяти углеродных атомов, ее можно представить как 1-10 С или как С1-С10 или как С 1-10. Если предусматривается, что в гетероалкильных группах углеродные атомы заменены на гетероатомы (обычно N, О или S), численные значения, описывающие группу, обозначают общее число углеродных атомов в группе плюс число таких гетероатомов, которые заменяют углеродные атомы в описываемом цикле или в описываемой цепи, хотя по-прежнему такая группа обозначается как С1-С6.

Как правило, алкильные, алкенильные и алкинильные заместители по изобретению содержат 1-10 атомов С (алкил) или 2-10 атомов С (алкенил или алкинил). Предпочтительно они содержат 1-8 атомов С (алкил) или 2-8 атомов С (алкенил или алкинил). Иногда они содержат 1-4 атома С (алкил) или 2-4 атома С (алкенил или алкинил). Единичная группа может включать более одного типа кратной связи или более одной кратной связи; такие группы определяются термином "алкенил", если они содержат по меньшей мере одну двойную углерод- углеродную связь, и термином "алкинил", если они содержат по меньшей мере одну тройную углерод-углеродную связь.

Алкильные, алкенильные и алкинильные группы часто имеют такую степень замещения, которая имеет химический смысл. Типичные заместители включают, но без ограничения, галоген,=O,=N- CN,=N- OR,=NR, OR, NR₂, SR, SO₂R, SO ₂NR₂, NRSO₂R, NRCONR₂, NRCOOR, NRCOR, CN, COOR, CONR₂, OOCR, COR и NO ₂, где каждый заместитель R, независимо, обозначает Н, С1-С8 алкил, С2-С8 гетероалкил, С1-С8 ацил, С2-С8 гетероацил, С2-С8 алкенил, С2-С8 гетероалкенил, С2-С8 алкинил, С2-С8 гетероалкинил, С6-С10 арил или С5-С10 гетероарил, а каждый R, необязательно, имеет заместитель, такой как галоген,=O,=N-CN,=N-OR',=NR', OR', NR'₂, SR', SO₂R', SO₂NR'₂, NR'SO₂R', NR'CONR'₂, NR'COOR', NR'COR', CN, COOR', CONR'₂, OOCR', COR' и NO ₂, где каждый R', независимо, обозначает Н, С1-С8 алкил, С2-С8 гетероалкил, С1-С8 ацил, С2-С8 гетероацил, С6-С10 арил или С5-С10 гетероарил. Алкильная, алкенильная и алкинильная группы могут также иметь заместители, такие как С1-С8 ацил, С2-С8 гетероацил, С6-С10 арил или С5-С10 гетероарил, каждый из этих заместителей может быть замещен заместителями, подходящими для конкретной группы.

Термины "гетероалкил", "гетероалкенил" и "гетероалкинил" и т.п. определяются аналогично соответствующим углеводородным (гидрокарбильным) (алкильным, алкенильным и алкинильным), но приставка "гетеро" относится к группам, которые содержат 1-3 О, S или N гетероатомов, или их комбинации в каркасе остатка; таким образом, по меньшей мере один углеродный атом соответствующей алкильной, алкенильной или алкинильной группы заменен по меньшей мере на один из указанных гетероатомов с образованием гетероалкильной, гетероалкенильной или гетероалкинильной группы. Типичные и предпочтительные размеры гетероформ алкильной, алкенильной или алкинильной групп обычно такие же, что и для соответствующих нециклических углеводородных (гидрокарбильных) групп, а заместители, которые могут присутствовать в гетероформах, такие же, как и описанные выше для нециклических углеводородных (гидрокарбильных) групп. Понятно, что для химической устойчивости, если не указано иначе, такие группы не могут содержать более двух соседних гетероатомов за исключением тех случаев, когда оксо-группа находится при N или S в виде нитро- или сульфонильной группы.

Хотя термин "алкил" по данному описанию включает циклоалкильную и циклоалкилалкильную группы, термин "циклоалкил" можно использовать в данном описании для определения карбоциклической неароматической группы, которая связана через циклический углеродный атом, а термин "циклоалкилалкил" можно использовать для описания карбоциклической неароматической группы, которая связана с молекулой с помощью алкильного линкера. Аналогично термин "гетероциклил" можно использовать для описания неароматической циклической группы, которая содержит, по меньшей мере, один гетероатом в цикле и которая связана с молекулой через циклический атом, который может представлять собой С или N; а термин "гетероциклилалкил" можно использовать для описания такой группы, которая связана с другой молекулой с помощью алкильного линкера. Размеры и заместители, подходящие для циклоалкильной, циклоалкилалкильной, гетероциклильной и гетероциклилалкильной групп, такие же, как описанные выше для алкильных групп. Эти термины, применяемые в данном описании, включают также циклы, которые содержат двойную связь или две двойные связи, при условии, что цикл не является ароматическим.

Термин "ацил" по данному описанию включает группы, содержащие алкильный, алкенильный, алкинильный, арильный или арилалкильный радикал, связанный одной или двумя валентностями с углеродным атомом карбонильной группы (карбонильным углеродом), а термин "гетероацил" относится к соответствующим группам, в которых по меньшей мере один углеродный атом, отличный от карбонильного углеродного атома, заменен на гетероатом, выбранный из N, О или S. Таким образом, термин "гетероацил" включает, например, -C(=O)OR и -C(=O)NR₂, а также -С(=O)-гетероарил.

Ацильная и гетероацильная группы связываются с любой группой или молекулой, с которой они соединяются за счет свободной валентности карбонильного углеродного атома. Обычно эти группы представляют собой С1-С8 ацильные группы, которые включают формильную, ацетильную, пивалоильную и бензоильную группы, и С2-С8 гетероацильные группы, которые включают метоксиацетильную, этоксикарбонильную и 4-пиридиноильную группы. Нециклические углеводородные группы (гидрокарбильные группы), арильные группы и гетероформы таких групп, которые содержат ацильную или гетероацильную группу, могут иметь заместители по данному описанию, подходящие для каждого соответствующего компонента ацильной или гетероацильной группы.

"Ароматический" фрагмент или "арильный" фрагмент относится к моноциклическому или конденсированному бициклическому фрагменту, обладающему общеизвестными признаками ароматичности; примеры включают фенил и нафтил. Термин "арил" может включать ароматические циклические системы, содержащие только углеродные атомы, а также ароматические циклические системы, содержащие один или более гетероатомов (О, N или S) в цикле. Аналогично, термин "гетероароматический" и "гетероарил" относится к такой моноциклической или к конденсированной бициклической системе, которая содержит в цикле один или более гетероатомов, выбранных из О, S или N. Включение гетероатома обеспечивает ароматичность 5-членных циклов, а также 6-членных циклов. Типичные гетероароматические системы включают моноциклические С5-С6 ароматические группы, такие как пиридил, пиримидил, пиразинил, тиенил, фуранил, пирролил, пиразолил, тиазолил, оксазолил и имидазолил, и конденсированные бициклические фрагменты, образующиеся конденсацией одной или более этих моноциклических групп с фенильным кольцом или с любой из гетероароматических моноциклических групп с образованием С8-С10 бициклической группы, такой как индолил, бензимидазолил, индазолил, бензотриазолил, изохинолил, хинолил, бензотиазолил, бензофуранил, пиразолопиридил, хиназолинил, хиноксалинил, циннолинил и т.п. Любая моноциклическая или конденсированная бициклическая система, которая имеет признаки ароматичности, такие как распределение электронов по всей циклической системе, охватывается этим определением. Это определение включает также бициклические группы, в которых по меньшей мере цикл, который непосредственно связан с остальной частью молекулы, имеет признаки ароматичности. Как правило, циклические системы содержат 5-12 циклических атомов. Предпочтительно моноциклические гетероарилы содержат 5-6 атомов в цикле, а бициклические гетероарилы содержат 8-10 атомов в циклах.

Арильные и гетероарильные фрагменты могут иметь различные заместители, включая С1-С8 алкил, С2-С8 алкенил, С2-С8 алкинил, С5-С12 арил, С1-С8 ацил и их гетероформы, причем каждый из этих заместителей сам по себе может быть дополнительно замещенным; другие заместители в арильных и гетероарильных частицах включают галоген, OR, NR₂, SR, SO₂R, SO ₂NR₂, NRSO₂R, NRCONR₂, NRCOOR, NRCOR, CN, COOR, CONR₂, OOCR, COR и NO ₂, где каждый заместитель R, независимо, обозначает Н, С1-С8 алкил, С2-С8 гетероалкил, С2-С8 алкенил, С2-С8 гетероалкенил, С2-С8 алкинил, С2-С8 гетероалкинил, С6-С10 арил, С5-С10 гетероарил, С7-С12 арилалкил или С6-С12 гетероарилалкил, и каждый R, необязательно, замещен, как указано выше, алкильными группами. Разумеется, заместители в арильной или гетероарильной группе, помимо этого, могут иметь замещающие группы по данному описанию, подходящие для каждого типа таких заместителей или для каждого компонента заместителя. Так, например, арилалкильный заместитель может быть замещен по арильному фрагменту заместителями по данному описанию, типичными для арильных групп, и помимо этого они могут быть замещены по алкильному участку заместителями по данному описанию, типичными или подходящими для алкильных групп.

Аналогично термины "арилалкил" и "гетероарилалкил" относятся к ароматическим и гетероароматическим циклическим системам, которые связаны с местом соединения через связывающую (линкерную) группу, такую как алкилен, включая замещенные или незамещенные, насыщенные или ненасыщенные, циклические или ациклические линкеры. Как правило, линкер представляет собой С1-С8 алкил или его гетероформу. Эти линкеры могут также включать карбонильную группу, что позволяет вводить заместители в виде ацильного или гетероацильного фрагмента. Арильное или гетероарильное кольцо в арилалкильной или гетероарилалкильной группе может быть замещенным теми же заместителями, которые описаны выше для арильных групп. Предпочтительно арилалкильная группа включает фенильное кольцо, необязательно замещенное группами по определению выше для арильных групп, и С1-С4 алкилен, незамещенный или замещенный одной или двумя С1-С4 алкильными группами или гетероалкильными группами, может, необязательно, циклизоваться с образованием цикла, такого как циклопропан, диоксолан или оксациклопентан. Аналогично, гетероалкильная группа предпочтительно включает С5-С6 моноциклическую гетероарильную группу, которая, необязательно, замещена группами, описанными выше в качестве заместителей, типичных для арильных групп, и С1-С4 алкилен, незамещенный или замещенный одной или двумя С1-С4 алкильными группами или гетероалкильными группами, или она включает необязательно замещенное фенильное кольцо или С5-С6 моноциклический гетероарил и С1-С4 гетероалкилен, незамещенный или замещенный одной или двумя С1-С4 алкильными группами или гетероалкильными группами, причем алкильные или гетероалкильные группы, необязательно, могут циклизоваться с образованием цикла, такого как циклопропан, диоксолан или оксациклопентан.

Если арилалкильная или гетероарилалкильная группа описывается как необязательно замещенная, заместители могут находиться как в алкильном, так и в гетероалкильном фрагменте или в арильном или гетероарильном фрагменте группы. Заместители, необязательно имеющиеся в алкильном или гетероалкильном фрагменте, являются теми же самыми, которые описаны выше для алкильных групп в целом; заместители, необязательно имеющиеся в арильном или гетероарильном фрагменте, являются теми же самыми, которые описаны выше для арильных групп в целом.

"Арилалкильные" группы по данному описанию представляют собой углеводородные (гидрокарбильные) группы, если они не являются замещенными, и описываются общим числом углеродных атомов в цикле и алкиленовом или аналогичном линкере. Так, бензильная группа обозначается как С7-арилалкильная группа, а фенилэтильная группа обозначается как С8-арилалкильная группа.

Термин "гетероарилалкил" по описанию выше относится к частице (фрагменту, группе), содержащей арильную группу, связанную через линкерную (связывающую) группу, и отличающейся от "арилалкила" ("арилалкильной" группы) тем, что по меньшей мере один циклический атом в арильной группе или один атом в связывающей (линкерной) группе представляет собой гетероатом, выбранный из N, О или S. Гетероарилалкильные группы представлены в данном описании в соответствии с общим числом атомов совместно в цикле и линкере, и они включают арильные группы, связанные через гетероарильный линкер; гетероарильные группы, связанные через углеводородный линкер, такой как алкилен; и гетероарильные группы, связанные через гетероалкильный линкер. Так например, С7-гетероарилалкил может включать пиридилметил, фенокси и N-пирролилметокси.

Термин "алкилен" по данному описанию относится к двухвалентной углеводородной (гидрокарбильной) группе; так как у этой группы две валентности, она может связывать вместе две другие группы. Как правило, этот термин относится к группе -(СН₂)_n-, где n обозначает 1-8, предпочтительно 1-4, хотя в точно определенных случаях алкилен может также быть замещен другими группами и может иметь другую длину, а свободные валентности необязательно находятся на противоположных концах цепи. Так, -СН(Ме)- и -С(Ме)₂ - можно также называть алкиленами, так же как циклическую группу, такую как циклопропан- 1,1- диил. Если алкиленовая группа является замещенной, заместители включают такие заместители, которые обычно (как правило) имеются в алкильных группах по данному описанию.

Обычно любая алкильная, алкенильная, алкинильная, ацильная или арильная или арилалкильная группа или любая гетероформа одной из этих групп, которая содержится в заместителе, может сама по себе, необязательно, быть замещенной дополнительными заместителями. Если иначе не указано, природа этих заместителей аналогична природе заместителей, перечисленных для самих первичных заместителей. Так, если, например, в варианте изобретения R7 обозначает алкил, этот алкил может, необязательно, быть замещен остальными заместителями, перечисленными как модификации (варианты осуществления) R7, если это имеет химический смысл и если это не нарушает предельную величину (размер) алкила как такового; например, алкил, замещенный алкилом или алкенилом, просто превысит верхний предел числа углеродных атомов для этих вариантов изобретения и не включается (в изобретение). Однако алкил, замещенный арильной, амино-, алкокси,=O и подобной группой, может входить в объем изобретения, а атомы этих замещающих групп не входят в число, используемое для описания данной алкильной, алкенильной и т.д. группы. Если число заместителей конкретно не указывается, каждая такая алкильная, алкенильная, алкинильная, ацильная или арильная группа может иметь число заместителей, определяемое числом имеющихся валентностей; в частности, например, любая из этих групп может быть замещена атомами фтора по любой или по всем имеющимся связям (валентностям). В некоторых вариантах изобретения, в которых не указано число заместителей, это число предпочтительно равно 0-2.

Термин "гетероформа" по данному описанию относится к производному группы, такой как алкил, арил или ацил, в которой по меньшей мере один углеродный атом указанной углеродсодержащей группы заменен на гетероатом, выбранный из N, О и S. Таким образом, гетероформами алкила, алкенила, алкинила, ацила, арила и арилалкила являются гетероалкил, гетероалкенил, гетероалкинил, гетероацил, гетероарил и гетероарилалкил соответственно. Понятно, что последовательно связывается не более двух атомов N, О или S, за исключением тех случаев, когда оксо-группа связана с N или S с образованием нитро- или сульфонильной группы.

Выражение "необязательно замещенный" по данному описанию указывает на то, что описанные конкретная группа или конкретные группы могут не содержать отличных от водорода заместителей, или группа или группы могут иметь один или более отличных от водорода заместителей. Если не указано иначе, общее число таких возможных имеющихся заместителей равно числу Н атомов, имеющихся в незамещенной форме описываемой группы. Если необязательный заместитель связан через двойную связь, как карбонильный кислород (=O), группа занимает две имеющиеся валентности, так что общее число заместителей, которое можно вводить, уменьшается в соответствии с числом доступных валентностей.

Термин "галоген" по данному описанию включает фтор, хлор, бром и йод. Часто предпочтительными являются фтор и хлор.

Термин "галогеналкил" ("галоидалкил") по данному описанию включает алкильные группы, имеющие один или более галоидных заместителей. Примеры включают трифторметил, 2,2,2-трифторэтил, 2-хлорэтил, 2-фторэтил и т.п.

Термин "амино" по данному описанию относится к группе NH₂, но там, где аминогруппа описана как "замещенная" или "необязательно замещенная", термин включает NR'R , где каждый из R' и R , независимо, обозначает Н или алкильную, алкенильную, алкинильную, ацильную, арильную или арилалкильную группу или гетероформу одной из этих групп, а каждая алкильная, алкенильная, алкинильная, ацильная, арильная или арилалкильная группа или гетероформа одной из этих групп, необязательно, замещена заместителями по данному описанию, подходящими для соответствующей группы. Термин включает также формы, в которых R' и R связываются вместе с образованием 3-8-членного цикла (циклической системы), который может быть насыщенным, ненасыщенным или ароматическим и содержит 1-3 гетероатома в цикле, независимо выбранных из N, О и S, и который является необязательно замещенным заместителями, описанными как подходящие для алкильных групп, или, если NR'R обозначает ароматическую группу, она необязательно имеет заместители, описанные как типичные для гетероарильных групп.

В тех случаях, когда возможны изомеры, изобретение включает каждый индивидуальный изомер, а также смеси изомеров. В тех случаях, когда имеется хиральный центр, изобретение включает каждый индивидуальный энантиомер по хиральному центру, а также смеси энантиомеров, включая рацемические смеси.

В одном аспекте изобретение включает соединения, которые ингибируют РР1. В некоторых вариантах изобретения соединения имеют формулу (I):

где n обозначает 1 или 2;

Аr обозначает фенил или тиенил и является необязательно замещенным;

каждый R¹, независимо, обозначает R ⁶, C(O)R⁶, C(O)-OR⁶ или C(O)N(R ⁶)₂;

R² обозначает Н или необязательно замещенный С1-С6 алкил или группу формулы -C(0)NH- R¹;

R³, независимо, в каждом случае выбирают из галогена, NO₂, CN, R, OR, NR₂; S(O)_qR, COOR и CONR₂ , где каждый R, независимо, обозначает Н, С1-С4 алкил или С1-С4 галогеналкил;

m обозначает 0-4;

R⁴ обозначает R⁶, галоген, -О, COOR ⁶, CON(R⁶)₂, S(O)_qR ⁶, N(R⁶)₂ или OR⁶;

p обозначает 0-2;

каждый q, независимо, обозначает 0-2;

Z обозначает О или NR⁵ ;

R⁵ обозначает R⁶ или C(O)R ⁶; и

R⁶, независимо, в каждом случае выбирают из Н, С1-С6 алкила, С5-С6 арила и (С5-С6- арил)- C₁-С₆ алкила, где каждый алкил и арил является необязательно замещенным;

при условии, что n обозначает 2, когда Z обозначает О, а Ar представляет собой пара-галогенфенил;

или его фармацевтически приемлемая соль,

В некоторых вариантах изобретения Z обозначает NR⁵ . В таких вариантах изобретения R⁵ иногда обозначает Н, а иногда он обозначает -C(O)R', где R' обозначает С1-С4 алкил или С1-С4 галогеналкил. В других вариантах изобретения Z обозначает О или NH; предпочтительно Z обозначает О.

В некоторых вариантах изобретения Аr обозначает фенил, который необязательно является замещенным. Предпочтительно в тех случаях, когда n обозначает 1(?), Аr не обозначает 4-галогенфенил.

В других вариантах изобретения Аr обозначает тиенил, который может быть замещенным. Тиенил может присоединяться либо по положению 2, либо по положению 3 тиофенового цикла. В некоторых вариантах изобретения Аr обозначает 2-тиенил, необязательно замещенный. В других вариантах изобретения Аr обозначает необязательно замещенный 3-тиенил.

В некоторых вариантах изобретения n обозначает 1. В некоторых вариантах изобретения n обозначает 2.

В некоторых вариантах изобретения R² обозначает Н или С1-С4 алкил С1-С4 галогеналкил. Предпочтительно R обозначает Н, метил или этил.

В некоторых вариантах изобретения m обозначает О. В других вариантах изобретения m обозначает 1-2.

В некоторых вариантах изобретения, когда m не обозначает 0, по меньшей мере, один R³ обозначает галоген, С1-С4 алкил или С1-С4 галогеналкил.

В некоторых вариантах изобретения р обозначает 0. В других вариантах изобретения р обозначает 1-2..

В некоторых вариантах изобретения, если р не обозначает 0, по меньшей мере один R ⁴ обозначает=O, С1-С4 алкил или С1-С4 галогеналкил.

В некоторых вариантах изобретения R¹ обозначает необязательно замещенный С1-С6 алкил. В других вариантах изобретения R¹ обозначает C(O)R⁶. В других вариантах изобретения R¹ обозначает C(O)NHR⁶.

Соединения формулы (I) легко образуют соли присоединения кислот. В некоторых вариантах изобретения соединение формулы (I) представляет собой соль присоединения кислоты. Во многих вариантах изобретения соль присоединения кислоты представляет собой фармацевтически приемлемую соль.

Некоторые конкретные соединения, которые, как было показано, ингибируют транскрипцию ВИЧ-1 с эффективной концентрацией (IC-50) около 10 микромолей или менее, включают:

В Таблице 1 приводятся некоторые данные, показывающие эффективность выбранных соединений для ингибирования индуцируемой Tat транскрипции ВИЧ-1 в двух клеточных линиях. Также приводится количественная оценка токсичности соединений в этих клеточных линиях и показано, что одно соединение (Соединение А) ингибирует репликацию ВИЧ-1 на 50% в концентрации 10 мкМ.

Таблица 1
Данные по биоактивности для выбранных соединений
Соед.	Ингибирование транскрипции в клетках СЕМ (IC-50)	Ингибирование транскрипции в клетках 293Т (IC-50)	50% ингибирование репликации ВИЧ	Токсичность в клетках СЕМ	Токсичность в клетках 293Т
А	10 мкМ	5 мкМ	10 мкМ	Нет	Нет
В	2 мкМ	3 мкМ	N/A	Нет	Нет
С	N/A	1 мкМ	N/A	Нет	Нет

Найдено, что нижеприведенные соединения со сходной структурой неэффективны для ингибирования транскрипции ВИЧ-1 и, по-видимому, наоборот, повышают скорость транскрипции. По причине отсутствия у этих соединений активности они исключены из объема изобретения; соответственно исключены соединения, в которых Аr обозначает 4-галоген в случае, когда n обозначает 1, a Z обозначает О.

Соединения по данному описанию можно получать общеизвестными реакциями из доступных исходных, таких как 1,2,3,4-тетрагидроакридин-9-карбоновая кислота, как показано на Схеме 1. Эту кислоту можно легко превратить в эфир или амид, чтобы получать соединения, в которых Z обозначает О или N соответственно в стандартных условиях, известных в области органического синтеза. Широкий спектр доступных спиртов и аминов позволяет синтезировать многие соединения, вводя различные группы R¹ и R ². После образования из карбоксилата сложного эфира или амида этот промежуточный сложный эфир или амид может конденсироваться с различными доступными альдегидами в апротонном растворителе, таком как ДМСО, ДМФА, ДМЭ (диметоксиэтан) или ТГФ, или в ненуклеофильном протонном растворителе, таком как трет- бутанол, в присутствии основания, такого как трет-бутоксид калия, в результате чего в насыщенное кольцо вводится группа "Аr-СН=". Можно также получать пространственно затрудненный эфир исходной карбоновой кислоты, такой как трет-бутиловый эфир, и конденсировать акридиновый эфир с альдегидом как описано, затем гидролизовать сложный эфир, получая промежуточную карбоновую кислоту, содержащую группу Аr-СН=. Этот интермедиат может затем конденсироваться с различными имеющимися или легкодоступными спиртами или аминами с образованием продуктов Формулы (I). Методы осуществления таких реакций конденсации хорошо известны в области органического синтеза. Схема 1: Синтез соединений Формулы (I).

Показано, что соединения по данному описанию являются эффективными ингибиторами репликации ВИЧ-1 в клеточных линиях. Следовательно, эти соединения применимы для лечения или предупреждения инфекции ВИЧ-1 у животных, включая людей. Применение этих соединений включает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения формулы I или других соединений по данному описанию или их фармацевтических композиций. Изобретение охватывает фармацевтические композиции, содержащие эффективное количество по меньшей мере одного соединения Формулы I или других соединений по данному описанию и включающие по меньшей мере одно соединение Формулы I или другие соединения по данному описанию в смеси по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым эксципиентом. В некоторых вариантах изобретения способ включает идентификацию субъекта, нуждающегося в таком лечении. Соединения по данному описанию можно применять для получения лекарственного препарата и для получения лекарственного препарата для лечения ВИЧ-1.

Соединения Формулы I и другие соединения по данному описанию можно вводить перорально, парентерально (например, с помощью внутримышечной, интраперитонеальной, внутривенной, интрацистернальной инъекции или инфузии, подкожной инъекции или имплантата), в виде спрея для ингаляции, назальным, вагинальным, ректальным, сублингвальным (подъязычным) или топическим методом введения и можно приготовить, самостоятельно или совместно, в виде препаратов в подходящей стандартной лекарственной дозе, содержащих обычные нетоксические фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и наполнители, подходящие для каждого пути введения. Методы и препараты для каждого из этих путей введения находятся в компетенции рядового специалиста в данной области техники.

Также рассматривается, что соединения по настоящему изобретению можно использовать в комбинациях с одним или более агентами, применимыми для предупреждения или лечения ВИЧ. Примеры таких агентов включают: (1) нуклеотидный ингибитор обратной транскриптазы, такой как зидовудин, диданозин, ламивудин, зальцитабин, абакавир, ставудин, адефовир дипивоксил, фозивудин тодоксил и т.п.; (2) ненуклеотидный ингибитор обратной транскриптазы (включая агент, обладающий противоокислительной активностью (антиоксидант), такой как иммунокал, олтипраз и т.д.), такой как невирапин, делавирдин, эфавиренз, ловирид, иммунокал, олтипраз и т.п.; и (3) ингибитор протеаз, такой как саквинавир, ритонавир, индинавир, нелфинавир, ампренавир, палинавир, лазинавир и т.д.

Комбинации соединений Формулы I и других соединений по данному описанию с другими агентами против ВИЧ не ограничиваются соединениями (1), (2) и (3), но включают в принципе любую комбинацию с любой фармацевтической композицией, применимой для лечения ВИЧ. Далее, при лечении такой комбинацией соединения по настоящему изобретению и другие агенты против ВИЧ можно вводить раздельно или вместе, в виде единой композиции или в виде раздельных композиций. Кроме того, вводить один компонент можно до, во время или после введения другого агента (других агентов).

Соединения Формулы I и других соединений по данному описанию применяются для лечения животных, включая, но без ограничения, мышей, крыс, лошадей, крупный рогатый скот, овец, собак, кошек и обезьян. Соединения по данному описанию эффективны также для лечения людей.

Соединения Формулы I и другие соединения по данному описанию могут образовывать гидраты или сольваты, которые входят в объем формулы изобретения. Если соединения Формулы I и другие соединения по данному существуют в качестве региоизомеров, конфигурационных изомеров, конформеров или диастереоизомеров, все такие формы и их различные смеси охватываются общими формулами. При желании можно выделять индивидуальные изомеры известными методами разделения и очистки. Например, если соединение Формулы I является рацематом, то рацемат можно разделить на (S)- и (R)-энантиомеры методами разделения оптических изомеров. Индивидуальные оптические изомеры и их смеси охватываются общей формулой.

Соединения по изобретению можно использовать в их нейтральной форме или в виде соли. Соединения формулы I и другие соединения по данному описанию легко образуют соли присоединения кислот, и в некоторых вариантах изобретения соли присоединения кислот предпочтительны для применения в способах и фармацевтических композициях по изобретению. Образование таких солей относится к компетенции рядового специалиста в данной области техники и может быть осуществлено контактированием соединения формулы I или других соединений по данному описанию с подходящей кислотой. Применяемая соль может представлять собой любую устойчивую соль; в некоторых вариантах изобретения кислоту выбирают таким образом, чтобы получить фармацевтически приемлемую соль. Примерами фармацевтически приемлемых солей являются соли присоединения органических кислот, полученные из кислот, образующих физиологически приемлемый анион, например тозилат, метансульфонат, безилат, ацетат, формиат, цитрат, малонат, тартрат, сукцинат, бензоат, аскорбат, -кетоглутарат, лактат и -глицерофосфат. Можно также получать соли подходящих неорганических кислот, включая гидрохлорид, сульфат, бисульфат, фосфат, нитрат, гидробромид и т.п.

Изобретение охватывает композиции, которые включают фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и эффективное количество соединения Формулы I или других соединений по данному описанию. Предпочтительно фармацевтические композиции содержат по меньшей мере один приемлемый разбавитель или эксципиент, отличный от воды, метанола, этанола или ДМСО. В некоторых вариантах изобретения фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере один эксципиент, выбранный из буфера, физиологического солевого раствора и моно- или дисахарида.

Соединение Формулы I и другие соединения по данному описанию можно вводить самостоятельно или в виде смеси с фармацевтически приемлемым носителем (например, твердые (сухие) препараты, такие как таблетки, капсулы, гранулы, порошки и т.п.; жидкие препараты, такие как сиропы, препараты для инъекций и т.д.), их можно вводить перорально и неперорально. Примеры непероральных препаратов включают инъекции, капли, суппозитории и вагинальные суппозитории.

При лечении или предупреждении патологических состояний у человека соответствующая величина дозы обычно составляет около 0.01-500 мг на кг массы пациента в сутки; это количество можно вводить в виде однократной дозы или в виде многократных доз. Предпочтительно величина дозы составляет около 0.1-100, или около 0.1-10 мг/кг в сутки. Понятно, что конкретная величина дозы и частота введения доз для каждого конкретного пациента может меняться и зависит от различных факторов, включая активность конкретного применяемого соединения, метаболическую стабильность и продолжительность действия этого соединения, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол, питание, способ и время введения, скорость экскреции, лекарственную комбинацию, тяжесть конкретного состояния и терапию, которой подвергается пациент.

В одном варианте изобретения соединение вводят системно (например, перорально) в комбинации с фармацевтически приемлемой средой, такой как инертный разбавитель или хорошо усвояемый пищевой носитель. Эту комбинацию можно заключать в твердые или мягкие желатиновые капсулы, прессовать в виде таблеток или вводить непосредственно больному вместе с пищей. Для перорального терапевтического применения активное соединение можно объединять с одним или более эксципиентов и применять в виде таблеток для проглатывания, трансбуккальных таблеток (таблеток для рассасывания), пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и т.п. Такие композиции и препараты должны содержать по меньшей мере 0.1% активного соединения. Процентное содержание его в композиции и препарате может варьироваться и обычно составляет, примерно, от 2 до 60% вес. от данной стандартной лекарственной формы. Количество активного соединения в таких терапевтически применимых композициях таково, чтобы достигался эффективный уровень дозы.

Таблетки, пастилки, пилюли, капсулы и т.п.могут также содержать следующие компоненты: связующие, такие как камедь трагаканта, аравийскую камедь, кукурузный крахмал или желатин; эксципиенты, такие как дикальцийфосфат; вещества, способствующие расщеплению лекарственной формы, такие как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота и т.п.; смазки, такие как стеарат магния; и подсластители, такие как сахароза, фруктоза, лактоза или аспартам, или корригенты, такие как перечная мята, винтергреновое (гаультеровое) масло или вишневый ароматизатор. Если стандартная лекарственная форма представляет собой капсулу, она может содержать помимо вышеперечисленных веществ жидкий носитель, такой как растительное масло или полиэтиленгликоль. Различные другие вещества могут присутствовать в качестве покрытия или с целью иным образом модифицировать физический вид твердой лекарственной формы. Например, таблетки, пилюли или капсулы можно покрывать желатином, воском, шеллаком или сахаром и т.п. Сироп или эликсир может содержать активное соединение, сахарозу или фруктозу в качестве подсластителя, метил- и пропилпарабены в качестве консервантов, краситель и корригент, такой как вишневый или апельсиновый ароматизатор. Любой материал, применяемый для приготовления любой стандартной (разовой) лекарственной формы, является фармацевтически приемлемым и практически нетоксическим в применяемых количествах. Помимо этого активное соединение можно вводить в препараты и устройства с пролонгированным высвобождением.

Активное соединение можно также вводить внутривенно или интраперитонеально (внутрибрюшинно) в виде инфузии или инъекции. Растворы активного соединения или его солей могут быть приготовлены в буферном растворе, часто в фосфатно-солевом буферном растворе, необязательно в смеси с нетоксическим поверхностно-активным агентом. Можно также приготовить дисперсии в глицерине, жидком полиэтиленгликоле, триацетине (триацетате глицерина) и в их смесях и в маслах. Для хранения и применения в обычных условиях эти препараты содержат консерванты для предупреждения роста микроорганизмов. Иногда соединение готовят в виде полиматричного препарата для такого введения (например, липосомы или микросомы). Липосомы описаны, например, в патенте США 5703055 (Felgner, et а1.) и Gregoridis, Liposome Technology vols. I-II (2^nd ed. 1993).

Фармацевтические лекарственные формы для инъекции или инфузии включают стерильные водные растворы или дисперсии или стерильные порошки, содержащие активный ингредиент, которые адаптированы для экстемпорального приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций или инфузии, необязательно инкапсулированные в липосомы. Во всех случаях конечная лекарственная форма должна быть стерильной, жидкой и устойчивой в условиях получения и хранения. Жидкий носитель или наполнитель (среда) может представлять собой растворитель или жидкую дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), растительные масла, нетоксические глицериловые сложные эфиры и их подходящие смеси. Нужную текучесть можно поддерживать, например, с помощью образования липосом, сохранения степени дисперсности (гранулометрического состава) в случае дисперсий или с помощью поверхностно-активных веществ. Действие микроорганизмов можно предупреждать с помощью различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимеросаля и т.п. Во многих случаях предпочтительно включать изотонические агенты, например сахара, буферы или хлорид натрия. Пролонгированного всасывания инъецируемых композиций можно достичь, применяя в композициях агенты, замедляющие всасывание, например моностеарат алюминия и желатин.

Стерильные инъецируемые растворы готовят, вводя нужное количество активного соединения в соответствующий растворитель с различными нужными другими ингредиентами, перечисленными выше, с последующей стерилизацией. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъецируемых растворов предпочтительными методами приготовления являются методы вакуумной сушки и лиофилизации, которые дают порошок активного соединения плюс любого нужного ингредиента, присутствующего в растворах, предварительно подвергнутых стерилизации фильтрованием.

Для топического введения соединения по настоящему изобретению можно применять в жидком виде. Соединения часто вводят в виде композиций или составов в комбинации с дерматологически приемлемым носителем, который может быть твердым или жидким. Примеры подходящих дерматологических композиций, применимых для доставки соединений на кожу, известны (см., например, Jacket et al. (патент США No. 4608392), Geria (патент США No. 4992478), Smith et al. (патент США No. 4559157) и Wortman (патент США No. 4820508).

Соединения можно приготовить с твердым носителем, который может включать тонкоизмельченные твердые вещества, такие как тальк, глина, микрокристаллическая целлюлоза, диоксид кремния или оксид алюминия и т.п. Подходящие жидкие носители включают воду, спирты или смеси вода- спирт/гликоль, в которых соединения по настоящему изобретению могут растворяться или диспергироваться в эффективных количествах, необязательно в присутствии нетоксических поверхностно-активных веществ. Для оптимизации свойств при данном применении можно добавлять адъюванты, такие как ароматизирующие вещества и дополнительные противомикробные агенты. Полученные жидкие композиции можно применять с помощью гигроскопических прокладок, применяемых для пропитки перевязочных материалов и других повязок, или можно наносить в виде спрея на пораженную поверхность с помощью дозирующего пульверизатора или аэрозольного распылителя. Загустители, такие как синтетические полимеры, жирные кислоты, соли и сложные эфиры жирных кислот, жирные спирты, модифицированную целлюлозу или модифицированные минеральные вещества, можно также применять с жидкими носителями для получения паст, гелей, мазей, мыла и т.п., для нанесения непосредственно на кожу пользователя.

Как правило, концентрация соединения в жидкой композиции составляет: часто, примерно, 0.1-25% вес., иногда, примерно, 0.5-10% вес. Концентрация в полутвердой или твердой композиции, такой как гель или порошок, составляет часто, примерно, 0.1-5% вес., иногда, примерно, 0.5-2.5% вес. Композицию соединения можно приготовить в виде стандартной (разовой) лекарственной формы обычными методами, известными в фармацевтической промышленности. В общих чертах, такие методы включают смешивание соединения (контактирование) с фармацевтическими носителями и/или эксципиентом (эксципиентами) в жидком виде или в виде тонкоизмельченного твердого вещества, или и в том и в другом виде, а затем, при необходимости, формование продукта. Композицию соединения можно приготовить в любой лекарственной форме, такой как таблетки, капсулы, гелевые капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели, суппозитории и спринцовки. Композиции можно также приготовить в виде суспензий в водных, неводных или смешанных средах. Водные суспензии могут дополнительно содержать вещества, которые повышают вязкость, включая, например, натрий карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Суспензии могут также содержать один или более стабилизаторов.

Методы определения активности соединений по изобретению против транскрипции ВИЧ-1 хорошо известны в уровне техники и используются для испытания соединений по изобретению на активность.

В нижеприведенных примерах описаны различные аспекты изобретения. Эти примеры не следует понимать как ограничивающие объем настоящего изобретения, представленный в прилагаемой Формуле изобретения. Если не указано иначе, все части и процентные содержания даются в виде весовых частей и весовых процентов, а указанные параметры и другие данные получены в условиях окружающей среды.

Примеры

Пример 1: Скрининг соединений

Получение базы данных соединений: РСА координаты последовательности RVSF пептида gm, связанного с РР1 (любезно предоставлены David Barford (Egloff et al., 1997)), используют для виртуального скрининга имеющихся соединений в коллекции Enamine_(Enamine's stock collection) (www.enamine.net), применяя QXP в качестве программы докинга и оригинальные фильтры для обработки данных. Операции для Enamine's stock выполняют в соответствии с руководствами, аналогичными руководствам для лекарств, за двумя исключениями: (i) 280<MW<550 и (ii) Способные поворачиваться связи<10. Более 300000 соединений анализируют виртуальным скринингом (w silico), получают библиотеку из 262 низкомолекулярных соединений (MW~500 Да).

Идентификация соединений-ингибиторов: Библиотеку анализируют на ингибирование транскрипции ВИЧ-1, используя клетки СЕМ с репортерным белком GFP (СЕМ GFP, предоставлены AIDS Reagents Program, NIH), инфицированные аденовирусом, экспрессирующим ВИЧ-1 Tat активаторный белок (Ad-Tat), как описано ранее (Nekhai et al., 2007). Инфицирование клеток CEM-GFP с помощью Adeno-Tat индуцирует транскрипцию ВИЧ-1, которую измеряют как повышение интенсивности GFP флуоресценции (Nekhai et al., 2007). Соединения с концентрацией 25 мкМ прибавляют к клеткам CEM-GFP, инфицированным Ad-Tat, и инкубируют в течение 24-48 часов. Цитотоксичность определяют по поглощению пропидия йодида (PI). Начальный скрининг позволил идентифицировать более 70 соединений, которые ингибируют транскрипцию ВИЧ-1 по меньшей мере на 75% в концентрации 25 мкМ (?М) (см. ниже Таблицу 2).

Выбранные соединения (69 соединений из Таблицы 1, выделенные серым цветом) анализируют далее с целью определения их IC50, а также клеточной токсичности. Анализ этих соединений позволяет идентифицировать довольно много соединений, которые являются ингибиторами (Таблица 2).

Таблица 3
Выбранные соединения, которые вызывают ингибирование транскрипции ВИЧ-1. Нетоксические соединения с величинами IC50 ниже 10 мкМ выделены серым цветом.
Планшет Id.	лунка	IC50 в клетках СЕМ-GFP	IC50 в клетках 293Т	Токсичность (PI)
Планшет 01	G03	~7 мкМ	>40 мкМ	-
Планшет 01	Н04	~10 мкМ	~5 мкМ	-
Планшет 01	В07	~25 мкМ		-
Планшет 01	С07	~10 мкМ	>10 мкМ	+
Планшет 01	G10	~20 мкМ		-
Планшет 01	D12	~20 мкМ		-
Планшет 02	D02	~25 мкМ		-
Планшет 02	С03	~25 мкМ	>10 мкМ	+
Планшет 02	D07	<10 мкМ, но только 50%	>10 мкМ	+
Планшет 02	G03	~17 мкМ		+
Планшет 02	С04	>10 мкМ		-
Планшет 02	С05	>10 мкМ	>10 мкМ	-
Планшет 02	В07	(6 мкМ		-
Планшет 02	Е09	(25 мкМ	>10 мкМ	-
Планшет 02	G10	(25 мкМ		-
Планшет 02	D12	(6 мкМ		-
Планшет 03	Е01	(25 мкМ		-
Планшет 03	G01	(25 мкМ		+
Планшет 03	С02	>10 мкМ		-
Планшет 03	F03	>10 мкМ		-
Планшет 03	А06	>10 мкМ	>10 мкМ	-
Планшет 03	А08	>10 мкМ	>10 мкМ	-
Планшет 03	C08	>10 мкМ	>10 мкМ	+

Далее соединения из Таблицы 2 анализируют, используя клетки 293Т, трансфецированные с помощью Tat- и ВИЧ-1 UTR- LacZ. На Фиг.1А показан пример ингибирования транскрипции и количественного определения цитотоксичности, проявляемого соединениями, закодированными как 1Н4, 3C8, 1G3 и 1С7. Соединения 1Н4 и 3С8 являются нетоксическими и ингибируют транскрипцию ВИЧ-1 (Фиг.1А). Напротив, 1С7 является сильным ингибитором транскрипции ВИЧ-1, но также демонстрирует высокую цитотоксичность (Фиг.1А). Соединение 1G3 не является ингибитором и не проявляет токсичность (Фиг.1А). Соединения 1Н4, 3С8 и 1G3 анализируют далее на 293Т клетках, трансфецированных Tat-экспрессирующим вектором, ВИЧ-1 UTR- LacZ репортером и CMV-EGFP репортером. Ингибирующие свойства этих соединений определяют, используя клетки 293Т, трансфецированные Tat-экспрессирующим вектором, ВИЧ-1 LTR-LacZ репортером и CMV-EGFP репортером (Ammosova et al., 2005a). Клетки 293Т трансфецируют липофектамином, а затем обрабатывают каждым из выбранных соединений в течение 18 часов. После этого клетки лизируют и определяют GFP и -галактозидазную активность, как описано нами ранее (Ammosova et al., 2005a). Соединение 1Н4 является наиболее сильным ингибитором с IС₅₀=5 мкМ (Фиг.1 В). Соединение 1С7 не ингибирует индуцированную Tat транскрипцию ВИЧ-1 в этой системе (результаты не приводятся). По данным анализа ЛДГ (лактатдегидрогеназы, LDH) ни одно из соединений не является цитотоксическим (результаты не приводятся).

Репликация ВИЧ-1 ингибируется низкомолекулярным миметиком QVCF пептида. Соединение 1Н4 анализируют, чтобы определить, может ли оно ингибировать репликацию ВИЧ-1. Клетки МТ4 инфицируют рекомбинантной плазмидой pNL4-3 ВИЧ-1 и обрабатывают соединением 1Н4 в различных концентрациях, а в качестве контроля используют соединение 1G3. Соединение 1Н4 ингибирует репликацию ВИЧ-1 в концентрациях 10 мкМ или 25 мкМ (Фиг.2). Соединение 1G3 не ингибирует репликацию ВИЧ-1, но, напротив, индуцирует примерно двукратное повышение репликации (Фиг.2). Итак, соединение 1Н4 ингибирует репликацию ВИЧ-1.

Соединение 1Н4 фиксируется к РР1 и ингибирует взаимодействие Tat-PP1 in vitro. Типичная регуляторная субъединица PP1 содержит по меньшей мере одни мотив RVxF, который непосредственно взаимодействует с гидрофобным "карманом" PP1. Взаимодействие 1Н4 с PP1 анализируют на основании докинга с помощью компьютерного моделирования. Докинг показывает, что 1Н4 занимает гидрофобные сайты пептида RVTF, но также взаимодействует с PP1 через дополнительные сайты связывания.

Чтобы определить, что соединение 1Н4 непосредственно связывается с RVxF-связывающим карманом PP1, проводят конкурентный анализ с Tat, который, как было показано ранее, связывается с RVxF карманом PP1 in vitro (Ammosova et al., 2005b). Конкурентный анализ проводят с 4 нМ PP1 в глицилглициновом буфере. Избыток Tat ингибирует PP1 (Фиг.3А, дорожка 3), тогда как мутантный Tat QACA не ингибирует PP1 (Фиг.3А, дорожка 4). Прибавление 50 мкМ 1Н4 к Tat и PP1 выявляет опосредуемое Tat ингибирование РР1 (Фиг.3А, дорожка 5), тогда как 50 мкМ 1G3 не влияет на опосредуемое Tat ингибирование РР1 (Фиг.3А, дорожка 6). Чтобы выяснить, влияет ли соединение 1Н4 на активность CDK.2, мы инкубируем рекомбинантный CDK-2/циклин Е с гистоном HI в отсутствие и в присутствии повышающихся концентраций 1Н4. Как показано на Фиг.4 В, 1Н4 не оказывает заметного влияния на активность CDK2, это наводит на мысль, что ингибирование транскрипции ВИЧ-1 под действием соединения 1Н4 осуществляется не вследствие ингибирования CDK2.

Идентификация дополнительных ингибиторов. Соединение 1Н4 используют для создания библиотеки соединений, скелет которых аналогичен скелету 1Н4. Эта вторая библиотека содержит 143 соединения. Эти соединения анализируют на ингибирование транскрипции ВИЧ-1 и токсичность в СЕМ Т - клетках и 293Т клетках аналогично описанному выше для анализа первой библиотеки. Результаты, представленные в Таблице 4, показывают, что некоторые соединения являются ингибиторами. Выбирают два соединения, 1E07 (T5236177) b 2А02 (T5430740) (заштриховано), так как они не проявляют токсичности в анализе поглощения пропидия йодида и ингибируют транскрипцию ВИЧ-1 как в клетках СЕМ, так и в клетках 293T.

Таблица 4
Соединения, выбранные из 1H4-библиотеки, ингибирующие транскрипцию ВИЧ-1
ID	Id планшета	Лунка	Ингибирование транскрипции ВИЧ-1 СЕМ IС50	Ингибирование транскрипции ВИЧ-1 293Т IС50	Токсичность в клетках СЕМ (PI)	Токсичность в клетках СЕМ (трипан синий)	Токсичность всем (кальцеин)
T0507-8302	Планшет 01	А02	3 мкМ	>> 10 мкМ	не токсично	13 мкМ
T0515-1487	Планшет 01	В04	7.5 мкМ	>>10 мкМ	не токсично
T0515-5982	Планшет 01	D04	10 мкМ	5 мкМ	не токсично
T0516-0241	Планшет 01	Н04	10 мкМ	>> 10 мкМ	не токсично
T0516-8237	Планшет 01	Н04	10 мкМ	4 мкМ	не токсично
T0519-1220	Планшет 01	D05	10 мкМ	0.1 мкМ	токсично	2 мкМ	2 мкМ
T5227431	Планшет 01	Е06	10 мкМ	5 мкМ	не токсично
T5229576	Планшет 01	G06	5 мкМ	4 мкМ	не токсично
T5236177	Планшет 01	Е07	2 мкМ	3 мкМ	не токсично	9 мкМ	10 мкМ
T5236177	Планшет 01	D09	15 мкМ	4 мкМ	не токсично
T539992	Планшет	C10	8 мкМ	>> 10 мкМ	не токсично

7	01
T5400634	Планшет 01	D10	8 мкМ	4 мкМ	не токсично
T5423152	Планшет 02	C02	6 мкМ	4 мкМ	не токсично
T5430740	Планшет 02	F02	6 мкМ	0.2 мкМ	не токсично	17 мкМ
T5434998	Планшет 02	B03	10 мкМ	6 мкМ	не токсично
T5448953	Планшет 02	A05	5 мкМ	0.1 мкМ	не токсично	26 мкМ
T5578540	Планшет 02	A06	12 мкМ	10 мкМ	не токсично
T5754083	Планшет 02	A08	1 мкМ	3 мкМ	не токсично	2 мкМ	2 мкМ

Создают разнообразные библиотеки соединений на основе структуры 1Е07 (80 соединений). Эти соединения анализируют на ингибирование транскрипции ВИЧ-1 в клетках 293Т. Результаты, приведенные в Таблице 5, показывают, что ингибиторами являются два соединения: В03 (Т5251792) и Е06 (Т5294712). Однако значения IC50 аналогичны значениям IC50 соединений 1Е07 и 2F02.

Таблица 5
Соединения, выбранные из разнообразной библиотеки на основе 1Е07, ингибирующие транскрипцию ВИЧ-1
ID	лунка	IС 50 в клетках 293Т	Комментарии	Токсичность в СЕМ (Трипан синий)	Токсичность в СЕМ (кальцеин)
Т5236177	А01	~2 мкМ	1Е07 (вторая библиотека)
Т5430740	В01	~2 мкМ	2F2 (вторая библиотека)
Т5219456	А02	>5 мкМ
Т5231792	В03	~1 мкМ		~100 мкм	>1 мМ
Т5402355	G04	>10 мкМ
Т5762096	D06	>10 мкМ
Т5294712	Е06	~2 мкМ		~100 мкМ
Т0519-1220	А09	>10 мкМ
Т5230167	Е09	>10 мкМ

Соединения 1Н4, 1Е07, В03 и, в качестве контроля, 1G3 анализируют на ингибирование репликации ВИЧ-1, результаты представлены в Таблице 6. Как 1Н4, так и 1Е07 ингибируют репликацию ВИЧ-1 с величиной IC50, аналогичной величине IC50, наблюдаемой для ингибирования транскрипции ВИЧ-1 в клетках СЕМ и 293Т. К нашему удивлению соединение В03 не является ингибитором, что противоречит данным.

Таблица 6
Ингибирование репликации ВИЧ-1 соединениями 1H4 и 1E07.
ID	Название	IIIB, IC50	Q148R, IC50	N155H, IC50
T0513-4428	1G3	37 мкМ	42 мкМ	59 мкМ

Т0516-8237	1Н4	9.4 мкМ	4.7 мкМ	8 мкМ
Т5236177	1Е07	2.5 мкМ	1.5 мкМ	3.2 мкМ
Т5251792	В03	N/A	N/A	N/A

Ниже дается структура соединений, описанных в Примере:

Соединение 1Н4

Соединение 1G3

Соединение 1С7

Соединение 3С8