способ диагностики мембранотоксичности

Формула изобретения

Способ экспресс-оценки мембранотоксичности ксенобиотиков, включающий исследование мембранных структур реагирующих клеток под влиянием исследуемого вещества, отличающийся тем, что в вакуумную пробирку Vakutainer с напылением 2,2 мг этилендиаминтетрауксусной кислоты берется кровь из расчета 1 мл на пробу, затем из общего объема отбирают по 1,0 мл в пробирки эппендорф, контрольную и содержащие навески ксенобиотиков, после 30-минутной инкубации по унифицированной методике готовят мазки крови - на сухое предметное стекло наносят каплю крови, получают мазок, окрашивают его по методу Лейшмана и проводят исследование форменных элементов крови с помощью светового микроскопа «Zeiss» при увеличении 1500, появление в поле зрения эхиноцитов - эритроцитов с шиловидными выростами мембраны, отсутствующих в контроле, является показателем мембранотоксичности ксенобиотика.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно мембранологии, и может быть использовано для тестирования мембранотоксичности ксенобиотиков, применяемых в терапевтической и ортопедической стоматологии в качестве пломбировочных и реконструктивных материалов, а также в токсикологии и фармакологии наряду с традиционными методами оценки токсичности веществ, лекарственных препаратов.

Существует метод определения потенциальной цитотоксичности биоматериала на культуре клеток мышиных фибробластов (L 929), основанный на определении качественных и количественных изменений в культуре клеток после инкубации с пломбировочным материалом.

Недостатком данного метода является то, что он трудоемкий, дорогостоящий и не достаточно специфичный.

Известен «Способ определения мембранотоксичных свойств ксенобиотиков» (Патент РФ № 2073244, дата публикации - 10.02.1997) с использованием реакции спонтанного розеткообразования лимфоцитов до и после введения тестируемых веществ экспериментальным животным, который близок по оцениваемому эффекту и достигаемому результату.

Недостатком данного принятого за прототип способа является длительность, трудоемкость, многоэтапность, необходимость использования экспериментальных животных с последующей обработкой тканей, получение только отсроченного результата.

Целью изобретения является разработка способа оценки мембранотоксичности ксенобиотиков, позволяющего провести экспресс-оценку вещества.

Поставленный технический результат достигается тем, что в вакуумную пробирку Vakutainer с напылением 2,2 мг этилендиаминтетрауксусной кислоты берется кровь из расчета 1 мл на пробу, затем из общего объема отбирают по 1,0 мл в пробирки эппендорф, контрольную и содержащие навески ксенобиотиков, после 30-минутной инкубации по унифицированной методике готовят мазки крови - на сухое предметное стекло наносят каплю крови, получают мазок и окрашивают его по методу Лейшмана и проводят исследование форменных элементов крови с помощью светового микроскопа «Zeiss» при увеличении 1500. Показателем мембранотоксичности ксенобиотика является появление в поле зрения эхиноцитов - эритроцитов с шиловидными выростами мембраны, отсутствующих в контроле.

Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является разработка быстрого, специфичного, минимально затратного способа определения мембранотоксичности ксенобиотиков.

Способ осуществляется следующим образом: в вакуумную пробирку Vakutainer с напылением 2,2 мг этилендиаминтетрауксусной кислоты брали 4 мл крови, затем отбирали по 1,0 мл в 4 пробирки эппендорф: контрольную (1) и содержащие по 25 мг навесок полимеризованных стоматологических композитов и адгезива - Filtek Ultimate (2), Filtek Bulk Fill (3) и Single Bond Universal (4). После 30-минутной инкубации по унифицированной методике готовили мазки крови - на сухое предметное стекло наносили каплю исследуемой крови и распределяли ее с помощью чистого шлифовального стекла, держа под углом 45°. Мазок крови при этом располагался на расстоянии 1,0-1,5 см от краев стекла, занимая почти всю его длину, и заканчивался «метелочкой». Полученные препараты (1-4) высушивали на воздухе, маркировали, окрашивали по методу Лейшмана, смывали дистиллированной водой, высушивали на воздухе. Критериями хорошей окраски являлись розовый цвет эритроцитов, фиолетовое окрашивание зернистости нейтрофилов на розовом фоне, нежная азурофильная зернистость моноцитов. Морфологическое исследование форменных элементов крови проводили с помощью светового микроскопа «Zeiss» при увеличении 1500. Показателем мембранотоксичности ксенобиотика является появление в поле зрения эхиноцитов - эритроцитов с шиловидными выростами мембраны, отсутствующих в контроле. В пробе 2 с Filtek Ultimate их количество составило 1%, в пробе 3 с Filtek Bulk Fill - 3%, а пробе 4 с Single Bond Universal количество эхиноцитов составило 12%. Таким образом, подлежавший исследованию адгезив обладает достаточно выраженным мембранотоксичными свойствами, что требует его герметичной изоляции от соприкосновения с тканями полости рта.

Способ может применяться для экспресс-оценки мембранотоксичности различных ксенобиотиков.

Литература

1. ГОСТ РИСО 10993-5-2009.

2. «Способ определения мембранотоксичных свойств ксенобиотиков» (Патент РФ № 2073244, дата публикации - 10.02.1997).