способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора клетками костного мозга in vitro

Формула изобретения

Способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора клетками костного мозга in vitro, заключающийся в том, что прилипающую фракцию миелокариоцитов культивируют в питательной среде с добавлением стимулятора, отличающийся тем, что в качестве стимулятора используют ингибитор протеинкиназы p38.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и касается способа стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора in vitro.

Наиболее близким по технической сущности, механизму действия и техническому результату прототипом является способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора с помощью липополисахаридов, которые добавляют в необходимой концентрации в культуру ткани и инкубируют при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов [1].

Недостатком данного способа является незначительная стимуляция выработки колониестимулирующего фактора под действием данного митогена.

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности способа.

Поставленная задача достигается тем, что к адгезирующей фракции костного мозга, которую культивируют в CO₂ -инкубаторе при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов в полувязкой культуральной среде, добавляют ингибитор протеинкиназы p38 (300 мкМ), определяющей функциональную активность гемопоэтических клеток.

Новым в предлагаемом изобретении является применение ингибитора протеинкиназы p38 в качестве стимулятора продукции гемопоэтина.

На сегодняшний день среди разнообразных фармакологических средств, используемых в качестве гемостимуляторов, наиболее значимой группой являются препараты на основе эндогенных стимуляторов кроветворения (эритропоэтин и колониестимулирующие факторы), которые, связываясь со специфическими рецепторами, запускают многочисленные сигнальные механизмы, участвующие в реализации ключевых функций клетки - дифференцировки, пролиферации, старения, опухолевой трансформации. Особого внимания заслуживает препарат гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, способный модулировать всю цитокиновую сеть и выступать в качестве плейотропного регулятора [2]. Учитывая перспективность разработки лекарственных препаратов с таргетным действием для модуляции выработки эндогенных гемопоэтинов путем активации/ингибирования внутриклеточного сигналинга, исследование синтеза и специфических биологических свойств данного гемопоэтина в системе in vitro ляжет в основу методологии создания данной группы фармсредств.

Известно, что наряду с классическими STAT-путями, в проведении сигналов от ростовых факторов в клетку могут быть задействованы MAP- и PI3K/Akt-сигнальные каскады [3, 4, 5]. Следует отметить, что данные пути также играют важную роль и в контроле продукции гемопоэтинов клетками кроветворного микроокружения [6]. Однако работ, результаты которых позволили бы вскрыть конкретную роль данных сигнальных путей (их активация либо ингибирование) в продукции гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в изучаемой нами литературе, не найдено. Таким образом, исследования, направленные на изучение путей контроля уровня гемопоэтинов, являются, несомненно, актуальными и помогут в разработке новых препаратов для стимуляции кроветворения.

Факт применения ингибитора протеинкиназы p38 с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора in vitro, для специалиста является не очевидным.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом

Взвесь клеток костного мозга мышей (5×10⁶ клеток/мл) разделяют на адгезирующую и неадгезирующую фракции. Для получения супернатантов прилипающих нуклеаров среда с неадгезирующими элементами удаляются, а прилипающие клетки инкубируются в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 300 мкМ ингибитора протеинкиназы p38, в CO₂-инкубаторе при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов. По окончании инкубации собирают кондиционные среды после центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 минут и хранят не более месяца при - 26°C.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac (животные 1 категории, конвенциональные линейные мыши) в количестве 2 шт., массой 20-22 г. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (сертификат имеется).

Пример 1

Суспензию костномозговых клеток, полученную в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром), инкубировали в течение 45 мин в среде RPMI-1640 ("Sigma", США), содержащей 10% ЭТС («Sigma», США), в 90 мм пластиковых чашках Петри («Corning», США) диаметром 35 мм в течение 40-50 мин при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности для выделения адгезирующей фракции миелокариоцитов. После чего с помощью пипетки собирали неприлипающие миелокариоциты, а прилипающие клетки инкубировались в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640 («Sigma», США), 10% ЭТС («Sigma», США), 280 мг/л L-глутамина («Sigma», США), 50 мг/л гентамицина («Sigma», США), 300 мкМ ингибитора протеинкиназы р38 («Calbiochem», США), при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности. По окончании инкубации собирали кондиционные среды и определяли в них уровень Г-КСФ методом ИФА с помощью набора фирмы «R&D systems» (USA) согласно методическим указаниям производителя.

При этом контролем и группой сравнения служили кондиционные среды от прилипающих клеток костного мозга без добавления ингибитора и с добавлением липополисахаридов соответственно, полученных по способу-прототипу аналогичным описанному выше путем.

В ходе эксперимента показано, что добавление ингибитора протеинкиназы p38 в культуру прилипающих миелокариоцитов значительно повышало уровень Г-КСФ в кондиционных средах по сравнению с таковым в супернатантах, полученных при культивировании адгезирующих миелокариоцитов без ингибитора и с добавлением липополисахаридов (табл.1).

Таблица 1
Уровень гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ, pg/mL) в кондиционных средах от прилипающих миелокариоцитов мышей линии CBA/CaLac культивированных без ингибитора (1), с добавлением липополисахаридов (2) либо ингибитора p38 (3), (X±m)
Группы	Г-КСФ
1	58,40±13,30
2	166,22±9,40*
3	358,84±46,06*#
* - отмечена достоверность различий с показателями в 1-ой группе при p<0,05;
# - отмечена достоверность различий с показателями во 2-ой группе при p<0,05.

Таким образом, инкубация прилипающей фракции гемопоэзиндуцирующего микроокружения с ингибитором протеинкиназы р38 приводит к стимуляции выработки Г-КСФ in vitro.

Предлагаемый способ позволяет эффективно стимулировать выработку гранулоцитарного колониестимулирующего фактора адгезирующими миелокариоцитами in vitro.

Источники информации

1. Hofer М., Vacek A., Lojek A., Hola J., Streitova D. Ultrafiltered pig leukocyte extract (IMUNOR) decreases nitric oxide formation and hematopoiesis-stimulating cytokine production in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages. // Immunopharmacol. 2007, 7(10), P. 1369-74.

2. Дыгай A.M., Жданов В.В. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Фармакологические аспекты. Москва, 2009, с.18-19.

3. Fischer О.М., Hart S., Gschwind A., Ullrich A. EGFR signal transac-tivation in cancer cells. // Biochemical Society Transactions, 2003, 31, P. 1203-1208.

4. Grimberg A. Mechanisms by which IGF-I may promote cancer. // Cancer Biol Ther, 2003, 2, P.630-635.

5. Whitmarsh A.J., Cavanagh J., Tournier C. et al. A mammalian scaffold complex that selectively mediates MAP kinase activation // Science. 1998, 281, P. 1671-1674.

6. Абатуров A.E., Юлиш Е.И. // Здоровье ребенка. 2007, 1(4). URL: http://www.mif-ua.com/archive/article/840.