флавивирус с двухкомпонентным геномом и его использование

Формула изобретения

1. Комбинация флавивирусных частиц для индуцирования иммунного ответа, включающая:

первую флавивирусную частицу, включающую первый псевдоинфицирующий вирусный геном, кодирующий цис-активные промоторные элементы, необходимые для репликации РНК, белки оболочки и полный набор неструктурных белков флавивируса; и не кодирующий капсидные белки флавивируса; и

вторую флавивирусную частицу, включающую второй комплементарный геном, кодирующий цис-активные промоторные элементы, необходимые для репликации РНК, капсидный белок и полный набор неструктурных белков флавивируса и не кодирующий белки оболочки флавивируса,

где указанный псевдоинфицирующий вирусный геном и комплементарный геном кодируют 5'UTR и амино-концевой фрагмент открытой рамки считывания для капсидного белка, который содержит последовательность циклизации, обязательную для репликации РНК.

2. Комбинация флавивирусных частиц по п.1, отличающаяся тем, что указанный псевдоинфицирующий вирусный геном или указанный комплементарный геном включают последовательность убихитина или протеазы 2А, специфичной для вируса ящура (FAMDV), слитые с последовательностью, кодирующей белки оболочки или капсидный белок.

3. Комбинация флавивирусных частиц по п.1, отличающаяся тем, что указанный псевдоинфицирующий вирусный геном и указанный комплементарный геном дополнительно включают:

дополнительный генетический материал, включающий структурные гены других вирусов, бактерий или паразитов, где экспрессия указанных генов индуцирует иммунный ответ против инфекций, вызываемых указанными вирусами, бактериями или паразитами.

4. Комбинация флавивирусных частиц по п.1, отличающийся тем, что указанный флавивирус представляет собой вирус желтой лихорадки, вирус лихорадки западного Нила, вирус Денге, вирус клещевого энцефалита, вирус энцефалита Сан-Луи, вирус японского энцефалита, вирус энцефалита долины Мюррея, вирус классической свиной лихорадки или вирус гепатита С.

5. Клетка-хозяин для размножения флавивирусов с двухкомпонентным геномом, инфицированная комбинацией флавивирусных частиц по п.1.

6. Клетка-хозяин по п.5, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой клетку Vero, ВНК-21, С7/10 или другую клетку позвоночных животных или комаров.

7. Способ крупномасштабного размножения флавивирусов с двухкомпонентным геномом, включающий:

инфицирование клетки комбинацией флавивирусных частиц по п.1 или их геномов, эффективное для достижения репликации обоих геномов в одной клетке, и

высвобождение указанного флавивируса с двухкомпонентным геномом, что позволяет достичь крупномасштабного размножения флавивируса с двухкомпонентным геномом.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанную клетку инфицируют комбинацией флавивирусных частиц с множественностью заражения более чем 1 инфицирующая единица/клетку.

9. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанный флавивирус, дефицитный по репликации, представляет собой вирус, дефектный по репликации, не способный вызвать заболевание, инфекционный и способный осуществлять единичный раунд инфекции in vivo.

10. Иммуногенная композиция для индуцирования иммунного ответа против флавивируса, включающая:

эффективное количество композиции флавивирусных частиц по п.1, адъювант, фармацевтически приемлемый носитель или их сочетания.

11. Способ защиты субъекта от инфекций, вызванных воздействием флавивируса, включающий:

введение иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции по п.10, субъекту, где указанная композиция вызывает иммунный ответ против флавивируса у субъекта, что защищает данного субъекта от инфекций, вызванных с воздействием указанного флавивируса.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанное введение осуществляют внутрибрюшинным, внутрикожным, подкожным, внутримышечным, пероральным или интраназальным способом.

13. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный флавивирус представляет собой вирус желтой лихорадки, вирус лихорадки западного Нила, вирус Денге, вирус клещевого энцефалита, вирус энцефалита Сан-Луи, вирус японского энцефалита, вирус энцефалита долины Мюррея, вирус классической свиной лихорадки или вирус гепатита С.

Описание изобретения к патенту

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и иммунологии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к дефицитным по репликации флавивирусам и описывает их использование в качестве вакцины против заболеваний, ассоциированных с флавивирусами.

Описание достигнутого уровня

Род Favivirus из семейства Flaviviridae включает множество важных патогенов человека и животных, в число которых входят вирусы желтой лихорадки, клещевого энцефалита, японского энцефалита, лихорадки Денге, лихорадки Западного Нила, классической свиной лихорадки, коровьей вирусной диареи и вирус гепатита С. В природных условиях флавивирусы циркулируют между позвоночными животным, в качестве своих хозяев, и векторами членистоногих, в основном представленными множеством комаров или москитов и различных видов клещей. Почти сорок представителей этого рода, сгруппированных, в рамках используемой классификации, в четыре разных антигенных комплекса, способны вызывать заболевания человека.

Геном флавивируса представлен одноцепочечной РНК размером примерно 12 кбайт с положительной полярностью. Указанный геном кодирует один полипептид, которые подвергается процессингу в ходе трансляции и после трансляции клеточными и вирусными протеазами с образованием структурных белков вирусов, C, prM/M и E, которые формируют инфекционные вирусные частицы, а также неструктурных белков NSl, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5, которые формируют ферментативный комплекс, необходимый для репликации вирусного генома (Lindenbach and Rice, 2001). Геном флавивируса имитирует структуру клеточных матричных РНК за счет наличия 5'-метилгуанилатного колпачка, который при этом отличается от клеточных матричных РНК отсутствием 3'-концевой поли(А) последовательности.

В вирионах флавивирусов единичная копия вирусной геномной РНК упакована за счет С (капсидного) белка в нуклеокапсид, окруженный липидной оболочкой с встроенными в нее димерами Е и М белка. Механизм взаимодействия между нуклеокапсидом и оболочкой в настоящее время не совсем понятен, но, по всей видимости, он менее специфичен, чем, например, взаимодействие между нуклеокапсидом и оболочкой у альфа-вируса, так что вирионы флавивирусов могут быть эффективно образованы капсидными и оболочечными белками, полученными на основе вирусов, которые принадлежат к разным антигенным комплексам (Chambers et al., 1999; Lorenz et al., 2002; Monath et al., 2002). Кроме того, наличие нуклеокапсида не является абсолютным требованием для сборки частиц, и образование вирусоподобных частиц и высвобождение их из клеток могут быть достигнуты при экспрессии только prM и E из большого множества векторов. Образуемые при этом так называемые субвирусные частицы (SVP) не содержат РНК или капсидный белок (Mason et al., 1991), но включают белки оболочки, организованные в виде двадцатигранных структур, содержащих липид. Указанные prM/E-встроенные субвирусные частицы способны индуцировать эффективный иммунный ответ, который защищает животных от последующей инфекции компетентными по репликации вирусами (Konishi and Fujii.2002; Konishi, Fujii, and Mason, 2001; Konishi et al., 1992; Qiao et al., 2004), DNA (Aberle et al., 1999; Colombage et al., 1998; Davis et al., 2001; Kochel et al., 1997; Kochel et al., 2000; Konishi et al., 2000a; Konishi et al., 2000b; Phillpotts, Venugopal, and Brooks, 1996; Schmaljohn et al., 1997). Отсутствие компетентной по репликации РНК, упакованной в нуклеокапсид, делает применение субвирусных структур очень привлекательным инструментом, в качестве потенциальных вакцин, но вызывает необходимость разработки новых способов их крупномасштабной продукции или доставки конструкций экспрессии. Такие prM/E-экспрессирующие кассеты могут быть разработаны на основе вирусных и невирусных векторов. В случае вирусных векторов, имеется проблема, связанная либо с развитием, либо с существованием иммунного ответа на используемый вирусный вектор. Кассеты на основе ДНК, кодирующие указанные гены под контролем эффективных промоторов на основе РНК-полимеразы II, по всей видимости, могут быть наиболее предпочтительными. Однако их применение в клинической практике остается все еще под вопросом. В этой связи вакцинация против флавивирусов все еще достигается в основном за счет использования либо инактивированных, либо живых ослабленных вакцин (INV и LAV соответственно).

Результаты проведенных в последнее время исследований дают основание полагать, что структурные белки флавивируса не являются обязательными компонентами для репликации геномной РНК. Они могут быть, полностью или частично, делетированы, и тем не менее такие РНК (репликоны) сохраняют способность к саморепликации и экспрессии не только неструктурных, но также оставшихся структурных и/или дополнительных гетерологичных генов. Так, например, были синтезированы in vitro флавивирусные геномы, не содержащие функциональный капсидный ген, но включающие другие интактные структурные гены, и далее использованы непосредственно для иммунизации. Их репликация приводила к образованию субвирусных частиц и в конечном итоге индуцировала защитную иммунную реакцию. Применение модифицированных флавивирусов, которые не способны к развитию продуктивной распространяющейся инфекции, представляет собой новый путь к разработке безопасных и эффективных, с точки зрения создания защитного иммунитета, вакцин (Aberle et al., 2005; Kofler et al., 2004). Однако для их применения необходимо будет, по всей видимости, усовершенствовать систему доставки синтезированных in vitro РНК в клетки, чувствительные к репликации РНК. Это может быть достигнуто при использовании наиболее близких к природным механизмов доставки за счет упаковки таких дефектных геномов в инфицирующие частицы, состоящие из структурных белков вируса.

Несмотря на растущую угрозу распространения ассоциированных с флавивирусом заболеваний и продолжающееся распространение вирусов на новые зоны, антивирусные терапевтические средства не были разработаны даже для таких инфекций, и к настоящему времени создано очень ограниченное число разрешенных к применению вакцин. Инактивированные вирусные вакцины (INV) были разрешены для применения с целью профилактики клещевого энцефалита (TBEV) и японского энцефалита (JEV). Однако, как и в случае других инактивированных вирусных вакцин, указанные вакцины обладают ограниченной активностью, требуют проведения множественных вакцинаций и являются дорогостоящими при их производстве. Несмотря на указанные недостатки, инактивированные вирусные вакцины против японского энцефалита и клещевого энцефалита подтвердили хорошие показатели безопасности, и было показано, что они не ассоциированы с развитием какого-либо заболевания. Единственной разрешенной вакциной с живым ослабленным вирусом (LAV) для флавивируса является широко используемая вакцина на основе штамма 17D вируса желтой лихорадки (YFV), которая была получена при серийном пассировании вируса желтой лихорадки, штамма дикого типа Asibi в тканях куриного эмбриона. Хотя такая живая ослабленная вакцина рассматривается как весьма безопасная и эффективная, были зарегистрированы случаи развития желтой лихорадки и неблагоприятных эффектов при использовании таких вакцин, включая недавно зарегистрированный случай среди военного контингента США.

Разработка систем реверсивной генетики в применении к флавивирусам открыла возможность создания новых типов живой ослабленной вакцины на основе рациональной аттенюации таких вирусов. Указанный новый класс вакцин включает гибридные формы на основе YFV 17D, в которых prM-E кодирующий фрагмент генома вируса желтой лихорадки был замещен prM-E-кассетой, полученной из гетерологичных флавивирусов. Аналогичный подход, построенный на основе гибридных вирусов, был применен для вариантов на основе вирусов лихорадки Денге и клещевого энцефалита. В большинстве случаев, гибридные флавивирусы демонстрируют высокоаттенюированный фенотип, но тем не менее они способны вызывать эффективный защитный иммунный ответ и выполнять функцию защиты против последующей инфекции теми вирусами, структурные белки которых экспрессируются данными гидридами. Вакцинация такими предполагаемыми химерными вакцинами не затрагивается ранее существовавшим «векторным» иммунитетом, на который оказывает влияние активность рекомбинантных вирусных вакцин, полученных на основе других вирусных векторов.

Несмотря на то что гибридные флавивирусы обеспечивают, по всей видимости, достаточно универсальный подход для получения новых вакцин, имеется вполне обоснованная озабоченность, связанная с тем, что гибридные формы сами по себе будут обладать патогенностью, по меньшей мере в случае индивидуумов со сниженным иммунитетом, или в связи с тем, что могут возникать патогенные гибридные формы, поскольку были обнаружены мутации в процессе размножения тех вирусов, которые будут необходимы для получения вакцин.

Таким образом, недостатком, свойственным достигнутому уровню в данной области, является отсутствие безопасных, активных и эффективных вакцин, которые бы можно было использовать против возбудителей рода Flavivirus. Настоящее изобретение относится к решению проблемы, определяемой этой длительно существующей потребностью.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном варианте, настоящее изобретение относится к флавивирусу с двухкомпонентным геномом. Такой флавивирус включает псевдоинфицирующий вирусный геном, кодирующий цис-промоторные элементы, необходимые для репликации РНК, вовлекаемый в создание белков оболочки и полного набора неструктурных белков флавивируса и не кодирующий капсидный белок флавивируса. Дополнительно, указанный вирус включает комплементирующий геном, который кодирует цис-промоторные элементы, необходимые для репликации РНК, создания капсидного белка и полного набора неструктурных белков флавивируса, и не кодирует белки оболочки флавивируса.

В другом родственном варианте осуществления настоящего изобретения, рассматривается клеточная культуральная система, инфицированная описанным выше флавивирусом с двухкомпонентным геномом.

В еще одном родственном варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к способу крупномасштабного размножения флавивируса с двухкомпонентным геномом. Такой способ включает инфицирование клеточной культуральной системы описанным выше флавивирусом с двухкомпонентным геномом, который эффективен в направлении достижения репликации обоих геномов в одной клетке, с высвобождением двухкомпонентного флавивируса, что приводит к крупномасштабному размножению флавивируса с двухкомпонентным геномом.

В другом родственном аспекте своего осуществления, настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей описанный выше флавивирус с двухкомпонентным геномом, адъювант, фармацевтически приемлемый носитель или их сочетания.

В еще одном родственном варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к способу защиты субъекта от инфекций, возникающих при воздействии флавивируса. Такой способ включает введение иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции, описанной выше, субъекту, где указанная композиция создает иммунный ответ против флавивируса у данного субъекта, что приводит к защите такого субъекта от инфекций, связанных с воздействием флавивируса.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Нафиг.1A-1C показана упаковка дефектных по кодированию капсида и prM/E геномов YFV с образование инфицирующих вирусных частиц. На фиг.А представлена схема, изображающая 5'-концевые последовательностей в YFV геномах, дефицитных по репликации. Положение сигнальных пептидов и трансмембранных доменов показано в виде зачерненных прямоугольников. На фиг.1В проиллюстрировано высвобождение вирусных частиц, содержащих дефектных геном, из клеток, подвергнутых совместной трансфекции синтезированными in vitro РНК. Среды заменяют в указанные временные точки и определяют титры по описанной методике.

На фиг.2A-2B проиллюстрирована репликация YFV с дуплицированной капсид-специфичной последовательностью. На фиг.2A приведена схематическая иллюстрация рекомбинантных YFV геномов. Оптимизированные по кодонам последовательности, кодирующие капсид, показаны серым цветом. Альтернативная открытая рамка считывания в капсидном YF/Cfrs/GFP/C геноме, которая является результатом введения двух мутаций, приводящих к сдвигу в рамке считывания, показана в виде зачерненного прямоугольника. Титры и развитие CPE оценивают через 72 часа после трансфекции с использованием синтезированных in vitro РНК. На фиг.2B проиллюстрированы результаты анализа высвобожденных рекомбинантных вирусов. Синтезированные in vitro РНК трансфицируют в клетки. Среды заменяют в указанные временные точки и вирусные титры определяют по процедуре анализа бляшкообразования.

На фиг.3A-3B продемонстрирован процесс выбора вариантов, содержащих YF/C/GFP/C геном, которые способны к эффективной репликации, и идентификации адаптивных мутаций. На фиг.3Априведено схематическое изображение генома YF/C/GFP/C и делеций, идентифицированных у эффективно реплицирующихся вариантов. Цифры указывают положения делеций в аминокислотной последовательности капсида и GFP белков. На фиг.3B проиллюстрирована репликация реконструированных мутантов с делецией в BHK-21 клетках. Синтезированные in vitro РНК трансфицируют в клетки и среды заменяют в указанные временные точки. Определяют титры высвобожденных вирусов по методу анализа бляшкообразования согласно настоящему описанию. Пунктирная линия указывает на предел обнаружения.

На фиг 4A-4C проиллюстрирована репликация рекомбинантных YFV геномов, кодирующих гетерологичный ген против направления считывания полипротеина. На фиг.4A продемонстрирована схема, изображающая рекомбинантный геном и последовательность открытых рамок считывания, расположенных против направления считывания информации GFP гена. Оптимизированная по кодонам последовательность, кодирующая капсид, показана серым цветом. Стрелки указывают старт GFP-кодирующей последовательности. Прописные буквы указывают мутации, введенные в капсидную и GFP последовательности. На фиг.4B проиллюстрирована репликация созданных YFV вариантов в BHK-21 клетках. Синтезированные in vitro РНК трансфицируют в клетки и среды заменяют в указанные временные точки. Определяют титры высвобожденных вирусов по методу анализа бляшкообразования, приведенному в настоящем описании. Пунктирная линия указывает на предел обнаружения. На фиг.4C показаны титры рекомбинантного YF_mut/GFP вируса после серийного пассирования в BHK-21 клетках.

На фиг.5A-5F проиллюстрированы результаты анализа репликации вируса с двухкомпонентным геномом. На фиг.5A приведена схема, изображающая геномы, кодирующие капсид и prM/E YFV, которые способны к транскомплементации при репликации в одной клетке. Оптимизированный по кодонам ген, кодирующий капсид, показан серым цветом. На фиг.5B продемонстрировано высвобождение вирусных частиц, содержащих дефектный геном, из клеток, в которые были трансфицированы синтезированные in vitro РНК. Среды заменяли в указанные временные точки и определяли титры инфекционных вирусных частиц, содержащих каждый из описанных геномов. На фиг.5C проиллюстрирована репликация двухкомпонентного генома YFV при пассировании с множественностью инфекции, равной ~10 инфицирующих единиц/клетку. Среды заменяют в указанные временные точки и определяют титры высвобожденных инфекционных частиц, содержащих каждый из определенных в настоящем описании геномов. На фиг.5D проиллюстрирована репликация двухкомпонентного генома YFV после инфицирования клеток с различными показателями множественности заражения. Среды заменяют в указанные временные точки и определяют титры высвобожденных инфекционных частиц по приведенной методике. На фиг.5E проиллюстрирована репликация обоих дефектных геномов в инфицированных клетках. Клетки BHK-21 инфицировали двухкомпонентным геномом YFV с множественностью заражения, равной ~1 инфицирующая единица/клетку, и оценивали репликацию геномов через 48 часов после инфекции. На панели (а) изображены клетки, содержащие реплицирующиеся YF/Cherry/Cco; на панели (b) показаны клетки с реплицирующимся геномом YF/GFP/prME, и на панели (c) приведено их наложение. На фиг.5F показаны результаты анализа высвобождения инфекционного вируса и VLP из клеток, трансфицированных разными YFV-специфическими РНК. Клетки BHK-21 трансфицировали указанными РНК. Через 24 часа после инфекции среды заменяли бессывороточной средой и через 24 часа собирали полученные клетки. Частицы собирают ультрацентрифугированием и далее анализировали в непрерывном градиенте сахарозы, как будет описано ниже. Наличие YFV-специфичных белков во фракциях выявляли по методу вестерн-блоттинга с использованием D1-4G2 MAB, которые распознают вирусный белок E.

На фиг.6A-6C проиллюстрирована упаковка YFV репликона, утратившего все структурные гены, в линии пакующих клеток. На фиг.6A приведена схематическая иллюстрация YFV репликона, кодирующего флуоресцентный маркер и Cherry вместо структурных белков. На фиг.6B приведена схематическая иллюстрация ранее описанного VEE репликона, кодирующего C-prM-E и его новую версию. Показаны титры упакованных Yfrep/Cherry в созданных пакующих клеточных линиях с использованием обоих репликонов VEEV. На фиг.6C проиллюстрировано высвобождение инфекционных вирусных частиц, содержащих геном Yfrep/Cherry, из клеток, содержащих VEErep/GFP-C-prM-E/Pac, при наличии в них указанного YF репликона или при инфицировании теми же частицами на следующем пассаже. Среды заменяли в указанные временные точки и определяли титры высвобожденных упакованных репликонов, как приведено в настоящем описании.

На фиг.7 показаны предполагаемые стратегии для достижения репликации вируса с двухкомпонентным геномом в случае высокой и низкой множественности заражения. При высокой множественности заражения оба генома, геном PIV (кодирующий prM/E) и комплементарный геном (кодирующий капсид), доставляются в одну и ту же клетку и продуцируют полный набор белков, необходимых для репликации вируса. Клетки продуцируют вирус с двухкомпонентным геномом, который далее подвергали пассажам в возрастающем порядке. При низкой множественности заражения клетки получали только один из двух геномов, и те, которые были инфицированы PIV, создают SVP, не содержащие генетический материал и нуклеокапсид.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является разработка нового типа флавивируса, дефицитного по репликации, который мог бы использоваться в качестве профилактической вакцины против заболеваний, ассоциированных с флавивирусами. В этой связи настоящее изобретение относится к флавивирусу с двухкомпонентным геномом, например, описывает вирус желтой лихорадки (YFV), где геном флавивируса разделен на два генома. При этом оба генома являются дефицитными по экспрессии по меньшей мере одного из белков, необходимых для продуктивной репликации (капсид или prM/E), но способны к комплементации функций друг друга при доставке в одну и ту же клетку. Такие дефектные по репликации флавивирусы, в случае их продукции в промышленных масштабах, могли бы далее найти применения в качестве вакцин против инфекций, вызванных флавивирусами, поскольку являются инфекционными и способны осуществлять единичный цикл инфекции при инфицировании животных. У таких животных клетки, инфицированные частицами, которые содержат только один из геномов, продуцируют вирусные неструктурные белки и неполный набор структурных белков. Синтезированные prM/E белки образуют только субвирусные частицы, которые не содержат генетический материал, но функционируют как эффективные иммуногены. Таким образом, указанные дефектные флавивирусы могут быть объединены с инактивированными вакцинами, преимуществом которых является их безопасность, а также с живыми ослабленными вакцинами, которые характеризуются эффективностью и поддаются масштабированию. Дополнительно, такие дефектные флавивирусы способны не только к продукции SVP, но также к экспрессии гетерологичных белков.

В настоящее время флавивирусы остаются одной из наиболее серьезных проблем общественного здравоохранения. Они широко распространены в обоих полушариях земного шара и вызывают множество заболеваний человека. При этом безопасные и эффективные вакцины производятся против сотен флавивирусных инфекций. Вакцины могут быть охарактеризованы как живые ослабленные или инактивированные. Единственная широко распространенная разрешенная живая ослабленная вакцина против флавивируса создана на основе вируса желтой лихорадки, штамм 17D, которая была получена при серийном пассировании штамма вируса желтой лихорадки дикого типа Asibi в тканях куриных эмбрионов. Живые ослабленные вакцины были получены против JEV, TBEV и YFV, но не были получены разрешенные продукты против других флавивирусов, таких как вирус лихорадки Денге и WNE. Живые вакцины, по всей видимости, являются более эффективными продуктами, чем вакцины на основе инактивированных вирусов или субъединичные вакцины. Однако очевидные проблемы безопасности продолжают оставаться актуальными из-за возможности реверсии в патогенный фенотип. Применение инактивированных вакцин обычно требует проведения множественных вакцинаций и получения больших количеств материала, а также наличия сложно оборудованных систем для размножения вирулентных вирусов, используемых для создания инактивированных продуктов. Таким образом, несмотря на наличие перспективных вариантов получения флавивирусных вакцин обоих типов, нет универсального подхода к их разработке.

Отличительной особенностью флавивирусов является способность их белковой оболочки формировать так называемые субвирусные частицы (SVP). Такие частицы могут эффективно продуцироваться эукариотическими клетками, содержащими стандартные векторы, экспрессирующие prM/E гликопротеины, или дефектные флавивирусные геномы, содержащие делетированный капсидный ген. Указанные вирусоподобные частицы утрачивают генетический материал и полный нуклеокапсид, но функционируют как эффективный иммуноген и индуцируют защитную иммунную реакцию против последующей инфекции компетентными по репликации флавивирусами. Дефектные флавивирусные геномы, утратившие кодирующую капсид последовательность, могут быть доставлены в клетки в виде РНК или в виде упакованного в инфекционные вирусные частицы материала с использованием пакующих клеточных линий, в которых капсид представлен в транс-форме, например, с помощью персистентно реплицирующихся альфа-вирусных репликонов, кодирующих капсидный ген флавивируса под контролем субгеномного промотора. При инфекции «необученных» клеток in vitro и in vivo указанные псевдоинфицирующие флавивирусы демонстрируют способность к репликации и продукции SVP, но не они не могут вызвать распространяющуюся продуктивную инфекцию. В этой связи, их применение не приводит к развитию заболевания, так что они представляют собой интересную промежуточную форму между живыми и инактивированными вирусами. Они выполняют единичный цикл инфекции, приводя к индукции эффективного иммунного ответа, и получили, в этой связи, название псевдоинфицирующих вирусов (PIV).

Разработка систем реверсивной генетики для флавивирусов открыла возможность получения новых типов вакцин на основе живых ослабленных вирусов с использованием рациональной системы аттенюации таких вирусов. Такой новый класс вакцин включает гибриды на основе вируса желтой лихорадки 17D, в котором геномный фрагмент, кодирующий prM-E вируса желтой лихорадки, был замещен prM/E кассетой, полученной из гетерологичных флавивирусов. Указанные химерные флавивирусы, по всей видимости, представляют собой разумный универсальный подход к созданию новых вакцин. Однако имеется озабоченность, связанная с тем, что такие гибридные формы сами по себе могут быть патогенными, по меньшей мере для индивидуумов со сниженным иммунитетом, и патогенные гибриды могут возникать при репликации у иммунизированных позвоночных животных, или рекомбинантные, компетентные по репликации флавивирусы будут переноситься комарами, москитами или клещами.

Другим перспективным направлением в разработке вакцин является направление, основанное на создании невосстанавливаемых делеций в геноме флавивируса, которое позволяет достичь продуктивной репликации вируса у вакцинированного организма-хозяина либо с меньшей эффективность, либо это становится невозможным событием. В последнем случае, вирусные геномы, содержащие полный репликативный механизм, но утратившие, например, С-кодирующий участок, могут быть доставлены в случае иммунизации in vivo в виде синтезированных in vitro РНК, способных к саморепликации. Было показано, что прямая иммунизация с использованием синтезированных in vitro дефектных РНК геномов, которые определяют продукцию субвирусных частиц (SVP) в отсутствие полного цикла вирусной репликации, является безопасным и эффективным методом с точки зрения создания защитного иммунитета. Однако имеются серьезные препятствия на пути получения вакцин на основе РНК, определяемые синтезом, стабильностью и доставкой в ткани. Таким образом, имеющиеся способы разработки флавивирусных вакцин, основанные на получении либо инактивированных вирусных вакцин, которые являются весьма безопасными, но обладают ограниченной активностью и требуют множественных вакцинаций, либо на основе живых ослабленных вакцин, обладают мощным потенциалом с точки зрения реверсии в сторону патогенного варианта дикого типа и к их передаче членистоногими в качестве векторов.

Кроме того, применение PIV для вакцинации требует их крупномасштабного производства и разработка клеточных линий, которые позволяли бы упаковывать дефектные геномы с образованием вирусных вирионов, продемонстрировала такую возможность. PIV могут быть пассированы в клеточных пакующих линиях, но не в «обученных» клетках, в возрастающем порядке. Однако, по всей видимости, это не единственный способ их крупномасштабного размножения. Продукция флавивирусов согласно настоящему изобретению не требует разработки таких клеточных линий, при том что способ, описанный в настоящем изобретении, тем не менее ведет к эффективной продукции PIV. Дополнительно, флавивирусы, дефектные по репликации, согласно настоящему изобретению, являются не только безопасными для использования, но к тому же они способны к репликации в культуре ткани в возрастающих, пригодных для промышленного применения масштабах и к экспрессии дополнительных генов. Таким образом, указанные флавивирусы являются дефектными по репликации и не способны вызвать продуктивную распространяющуюся инфекцию у человека и животных.

В основном генетический материал, требуемый для вирусной репликации, был выделен из двух геномов, способных к транскомплементации имеющихся у них недостаточностей. Оба из них кодировали цис-активные промоторные элементы, необходимые для репликации РНК, и полный набор неструктурных белков, которые формируют репликативный ферментативный комплекс. Таким образом, оба РНК генома способны к саморепликации, но один из них кодирует капсид, но гены, кодирующие белки оболочки, в нем делетированы, а другой кодирует гены оболочки, но не капсида.

При доставке в одну и ту же клетку геномы продуцируют полный набор структурных белков и клетки высвобождают высокие титры инфекционных вирусных частиц, содержащих каждый из этих геномов. При следующем пассаже «необученные» клетки могут быть инфицированы вирусами с таким показателем множественности заражения, который позволяет обоим геномам доставляться в одну клетку. Это ведет к достижению продуктивной репликации и к высвобождению инфекционных вирусных частиц, содержащих каждый из указанных геномов. Таким образом, данная система позволяет размножать рекомбинантные вирусы в возрастающем порядке. При инокуляции в организм животного (который содержит большое число чувствительных клеток)ф каждый из геномов доставляется в разные клетки, распространяющаяся инфекция доходит до неприемлемого уровня, и клетки, инфицированные вирионами, которые содержат геномы, кодирующие белки оболочки, продуцируют неинфекционные вирусо-подобные частицы, утратившие генетический материал, но которые служат в качестве эффективных иммуногенов и индуцируют защитный иммунный ответ против следующей инфекции вирусом дикого типа (фиг.7).

Для усиления эффективной репликации и комплементации оба дефектных генома требуют наличия 5'UTR и более 60 нуклеотидов (элемент 1) в следующей природной последовательности, кодирующей белок, представленной амино-концевым фрагментом капсида, в случае большинства флавивирусов или N ^pro гена, для представителей рода пестивирусов. За этой последовательностью следует последовательность убихитина или протеаза 2А, специфичная для вируса ящура (FAMDV), слитая с другой последовательностью, кодирующей капсид или белки оболочки. Такое сочетание слитых генов является необходимым для репликации обоих геномов и их упаковки с равной эффективностью в вирусные частицы.

Использование искусственных, оптимизированных по кодону последовательностей, кодирующих вирусные структурные белки, исключает возможность рекомбинации между двумя дефектными вирусными геномами, которая в потенциале может привести к образованию компетентных по репликации флавивирусов. Оба дефектных генома могут использоваться для экспрессии дополнительных генов и в этой связи служить в качестве векторов для генерации иммунного ответа на гетерологичные белки. Указанные дополнительные гены могут быть клонированы между последовательностью элемента 1 и убихитином или FAMDV 2A протеазой.

Как указывалось выше, применение таких флавивирусов с двухкомпонентным геномом для вакцинации не приводит к развитию продуктивной распространяющейся инфекции у иммунизированных людей и животных. Поскольку люди и животные имеют множество клеток, эти клетки инфицируются с очень низким показателем множественности, что ведет к инфекции лишь одним геномом. Такие клетки способны продуцировать только так называемые вирусопободные частицы, которые утрачивают нуклеокапсид и какой-либо генетический материал. Последние частицы служат в качестве эффективного иммуногена, но они не способны проводить следующие циклы инфекции. Согласно настоящему описанию указанные дефектные вирусные геномы с комплементерными функциями могут экспрессировать дополнительную генетическую информацию и служить в качестве поливалентных вакцин.

Конкретно, настоящее изобретение относится к использованию генетического материала из вируса желтой лихорадки для целей демонстрации эффективности описанного метода. В этой связи следует отметить, что генетический материал из вируса желтой лихорадки разделен между двумя вирусными геномами, способными к транскомплементации недостаточностей друг у друга. Каждый из первоначально разработанных дефектных YFV геномов кодировал полный механизм репликации РНК и один их них содержал делецию практически полного капсидного гена, а второй геном не кодировал prM/E. Для отслеживания репликации каждого из геномов в культуре ткани и для определения титров инфекционных частиц использовали геномы, кодирующие разные флуоресцентные маркеры, GFP и Cherry. Их экспрессия в клетках указывала на уровень инфекции и репликации конкретного генома. При доставке в одни и те же клетки ожидалось, что YF/GFP/prME и YF/C/Cherry будут продуцировать полный набор структурных белков вирусов и в итоге упакованных в инфекционные вирионы. Однако неожиданно было обнаружено, при первых попытках установить продуктивную репликацию, что это невозможно из-за высокой цитотоксичности, определяемой репликацией YF/C/Cherry. При этом продуцировались очень высокие уровни флуоресцентного белка, но также создавался жесткий CPE, что приводило к низкому уровню высвобождения инфекционных вирусных частиц.

Для дальнейшего исследования этого феномена был разработан геном YFV, который кодировал две копии капсидного гена, где один из них мог бы использоваться для широкого набора генетических манипуляций. Этот вирус также характеризовался необычной цитотоксичностью и реплицировался с низкими тирами. После модификаций последовательности, кодирующей капсид, было показано, что повышение цитотоксичности связано с самим капсидным белком (когда он экспрессировался не в рамках C-prM-E кассеты), а не с возможным изменением во вторичной структуре РНК (фиг.2). Кроме того, вирус YF/C/GFP/C, содержащий две копии капсидного гена в геноме, мог далее развиваться и создавать варианты, адаптированные для роста с более высокими титрами, но при низких уровнях вирусного развития CPE. К настоящему времени, точный механизм влияния экспрессии YFV капсида вирусами YF/C/Cherry или YF/C/GFP/C на индукцию CPE остается непонятным.

Секвенирование вариантов YF/C/GFP/C, адаптированных к более высокому уровню высвобождения вирусов, обеспечивает подходы к созданию модифицированных инфекционных вирусов, способных к стабильной экспрессии дополнительных различных гетерологичных белков in vivo и in vitro. Однако наиболее важен тот факт, что идентифицированные спонтанные делеции предоставляют возможность модифицировать первоначально разработанный дефектный по репликации геном вируса YF/C/Cherry до YF/Cherry/Cco, что привело к другой стратегии кодирования белков и создавало возможность эффективной транскомплементации при репликации YF/GFP/prME. Клетки, которые были подвергнуты совместной трансфекции синтезированными in vitro РНК из обоих геномов, продуцировали вирусные белки, в которых геномы, кодирующие и капсид, и prM/E, были представлены в одной и той же концентрации, и такой необычный вирус мог быть далее пассирован в «необученных» клетках в возрастающем порядке.

Инфекция клеток с низкой множественностью заражения недвусмысленно продемонстрировала, что оба генома упаковываются в отдельные вирусные частицы, и поэтому такой YFV, содержащий два генома с комплементарными функциями, не может быть обозначен как сегментированный геном вируса (что предполагает наложение всех геномных фрагментов, упакованных в один вирион), но, скорее всего, это вирус с двухкомпонентным геномом. Вирусы такого типа, содержащие оба геномных сегмента, упакованные по отдельности, были ранее описаны в растениях. Дальнейшее применение таких вирусов для иммунизации сопряжено с проблемами, определяемыми возможной рекомбинацией между геномами, которая могла бы привести к образованию инфекционных, полных, компетентных по репликации вирусов. В этой связи, несмотря на то, что это в высшей степени невероятное событие, капсидный ген в РНК YF/Cherry/C был представлен в виде синтетической, оптимизированной по кодонам версии, утратившей последовательность циклизации. Во множестве экспериментов с использованием YFV с двухкомпонентным геномом не было выявлено образования инфекционного YFV, содержащего не фрагментированный геном. Однако возможно дополнительно снизить вероятность рекомбинации за счет использования различных пар последовательностей циклизации в самореплицирующихся фрагментах, кодирующих капсид и prME.

Интересно отметить, что модификация стратегии кодирования C-prM-E в конструкциях генома, основанных не на YFV, приводила к резкому повышению эффективности упаковки YFV векторов, которые совсем не кодируют структурные белки. Указанные клеточные линии, продуцирующие C-GFP-Copt-prM-E с 25 аминокислотами из персистентно реплицирующихся VEErep/GFP-C-prM-E/Pac, создавала упакованные YFV репликоны со значительно более высокими титрами, чем аналогичная клеточная линия, экспрессирующая только C-prM-E кассету. Упакованные YFV репликоны не только высвобождались с более высокими титрами, превышающими 10⁸ инфицирующих единиц/мл, но могли также пассироваться в пакующих клеточных линиях без снижения титров. Таким образом, простая модификация субгеномной РНК кодирующей C-prM-E за счет клонирования 25 кодонов, специфичных для капсида, против направления считывания структурного полипротеина, оказывала очень выраженное положительное влияние на высвобождение инфекционных частиц и могла расширить число векторов на основе YFV для доставки и экспрессии гетерологичной генетической информации. Считается, что разработанная необычная стратегия экспрессии C-prM-E ведет к другой компартментализации транслированных структурных белков, которые усиливают образование инфекционных вирионов.

В заключение следует отметить, что обсуждавшиеся выше результаты позволяют полагать, что YF PIV, способные к экспрессии prM/E, и наиболее вероятно PIV, полученные из других флавивирусов, могут быть пассированы в культуре ткани с использованием другого дефектного по репликации флавивирусного генома, продуцирующего капсид (фиг.7). При репликации в той же клетке указанные два дефектных генома продуцируют полный набор вирусных структурных белков, которые далее эффективно упаковываются с образованием отдельных инфекционных вирусных частиц, которые могут быть охарактеризованы как вирус с двухкомпонентным геномом. Как указывалось выше, PIV служат в качестве эффективных иммуногенов, и в этой связи вирус с двухкомпонентным геномом может использоваться для разработки рекомбинантных вакцин, специфичных для флавивируса (фиг.7). Указанные вакцины будут дешевле, чем инактивированные вакцины, и безопаснее, чем вакцины на основе живых ослабленных вирусов. Экспрессия капсида из YFV генома, содержащего делетированные prM/E гены, требует дополнительной модификации 5'-концевой последовательности и клонирования дополнительной последовательности, специфичной для капсида. Применение такого же рода модификаций в случае компетентного по репликации YFV привело к разработке вируса, который не способен к экспрессии дополнительной генетической информации. Модификация YFV C-prM-E кассет экспрессии в VEEV репликонах, используемых для создания пакующих клеточных линий, резко улучшает упаковку векторов на основе YFV. Разделение последовательности, кодирующей капсид, и промоторных элементов в YFV геноме или в дефектном по репликации YFV в геноме, кодирующем капсид, обеспечивает возможность экспрессии структурных генов, полученных из гетерологичных флавивирусов, независимо от сигнала циклизации, и представляет возможное средство для изучения механизма процесса упаковки.

Далее в настоящем изобретении описывается процесс получения и оценки новых типов конструкций RepliVAX, который включает, без ограничения, следующие положения:

(1) Продукция частиц с двухкомпонентным геномом (включая удаление репортерных генов из существующих конструкций) и системы тестирования. Система RepliVAX может быть реплицирована с использованием либо стабильных клеточных линий, либо с использованием уникальной системы с двухкомпонентным геномом. В случае YFV, была разработана система с двумя дефектными геномами, где один из геномов кодирует обязательный С ген и красный флуоресцентный белок (Cherry), а другой геном кодирует prM и E белки и зеленый флуоресцентный белок (GFP). Клетки, подвергнутые совместной трансфекции синтезированными in vitro РНК из обоих геномов, продуцировали вирусные частицы, где С- или prME-кодирующие геномы представлены в одной и той же концентрации, и такой вирус с двухкомпонентным геномом может быть далее пассирован в «необученных» клетках в возрастающем порядке, если множественность заражения превышает 1 инфицирующую единицу/клетку.

Для усиления данной системы делетируют репортерные гены в обоих YFV геномах (RepliVAX YF и хелпер) для создания вирусов с двухкомпонентным геномом, применимых при тестировании животных и для разработки клеточных линий, которые могут использоваться для количественного анализа частиц, содержащих каждый из геномов. В настоящем изобретении также рассматривается аналогичный подход при разработке WNV. Модифицированные C- и prM/E кодирующие геномы синтезируют in vitro и трансфицируют их в клетки Vero. Были разработаны способы количественного определения содержания частиц каждого из геномов (C или prM/E) при разбавлении таких совместных двухкомпонентных культур с последующей оценкой клеточных линий, которые экспрессируют С или prM/E белки. Частицы RepliVAX с геномом, кодирующим prM/E, способны образовывать очаги в С-продуцирующих клатках и С-продуцирующие «хелперные» геномы будут образовывать очаги в С-продуцирующей клеточной линии.

(2) Создание TBE гибридов. Используют RepliVAX, кодирующий TBEV prM/E, на основе системы YFV. Кассету, кодирующую prM/E, синтезируют на основе олигонуклеотидов и последовательность оптимизируют для достижения наиболее эффективной экспрессии за счет применения частоты кодонов, определенной при оценке наиболее эффективно транслируемых человеческих мРНК. На основании предварительных данных проводят замену TBEV сигнального пептида в prM YFV-специфичными аминокислотными последовательностями, поскольку по результатам предварительных экспериментов было сделано предположение о том, что такие замещения будут в значимой степени повышать продукцию вирусных частиц. Указанные RepliVAX геномы подвергают i) оценке на их способность продуцировать SVP и ii) на их способность упаковываться в TBEV оболочку при использовании обеих пакующих клеточных линий Vero, экспрессирующих TBEV капсид и систему упаковки на основе двухкомпонентного генома, где второй дефектный геном экспрессирует TBEV С, оптимизированный по кодонам.

Дополнительно, настоящее изобретение относится к разработке систем трансинкапсидирования. Настоящее изобретение также относится к разработке систем трансупаковки для YFV RepliVAX платформ. Была разработана универсальная система упаковки RepliVAX YF в оболочки, которая будет наиболее эффективна с точки зрения инфицирования дендритных клеток и, следовательно, с точки зрения презентации антигена. Такая упаковка не зависит от гликопротеинов флавивируса, кодируемых геномами RepliVAX. Указанная транспакующая система, как ожидается, позволит преодолеть возможную неэффективную инфекцию, возникающую при использовании DEN гликопротеинов, а также различие в иммунном ответе, индуцируемом геномами RepliVAX, кодирующими гликопротеины оболочки, которые были получены из разных DEN вирусов.

В настоящем изобретении рассматриваются: i) различные стратегии упаковки (пакующие клеточные линии в сравнении с двухкомпонентными геномами) для достижения наиболее эффективной продукции инфекционных частиц; ii) белки, получаемые из различных DEN вирусов (DENl и DEN2); iii) эффективность крупномасштабной продукции упакованных RepliVAX геномов в клетках Vero; iv) стабильность DEN кассет при последующем пассировании; и v) эффективность иммунного ответа, индуцированного у мышей против DENl и 2 после иммунизации RepliVax.

Настоящее изобретение также относится к упаковке TBEV prM/E, кодирующего RepliVAX YF в гомологичные YFV структурные белки. Предварительные данные в значительной мере свидетельствуют в пользу того, что такая упаковка является эффективной и ее дальнейшая разработка может в итоге привести к получению универсальных пакующих систем для RepliVAX геномов, кодирующих любые гетерологичные prM/E кассеты.

Настоящее изобретение относится к флавивирусу с двухкомпонентным геномом, включающему псевдоинфицирующий вирусный геном, кодирующий цис-активные промоторные элементы, необходимые для репликации РНК, оболочечных белков и полного набора неструктурных белков флавивируса, и не кодирующий капсидные белки флавивируса; и комплементарный геном, кодирующий цис-активные промоторные элементы, необходимые для репликации РНК, капсидного белка и полного набора неструктурных белков флавивируса, и не кодирующий белки оболочки флавивируса. Дополнительно, псевдоинфицирующий вирусный геном и комплементарный геном должны также кодировать 5'- UTR и амино-концевой фрагмент открытой рамки считывания для капсидного белка, который содержит последовательность циклизации, обязательную для репликации РНК, Кроме того, псевдоинфицирующий вирусный геном или комплементарный геном могут включать убихитин или 2А протеазу, специфичную для вируса ящура (FAMDV), слитую с последовательностью, кодирующей белки оболочки или капсидный белок. Кроме того, псевдоинфицирующий вирусный геном и комплементарный геном могут также включать дополнительный генетический материал, включающий структурные гены из других вирусов, бактерий или паразитов, где экспрессия таких генов индуцирует иммунный ответ против инфекций, вызываемых вирусами, бактериями или паразитами. Репрезентативные примеры флавивируса могут включать, без ограничения, вирус желтой лихорадки, вирус лихорадки западного Нила, вирус Денге, вирус клещевого энцефалита, вирус энцефалита Сан-Луи, вирус японского энцефалита, вирус энцефалита долины Мюррея, вирус классической свиной лихорадки или вирус гепатита С.

Настоящее изобретение также относится к клеточной культуральной системе, инфицированной описанным выше флавивирусом с двухкомпонентным геномом. Репрезентативные примеры клеточной культуральной системы включают, без ограничения, клетки Vero, BHK-21, C7/10 или другие клетки позвоночных и из комаров и москитов.

Настоящее изобретение также относится к способу крупномасштабного размножения флавивируса с двухкомпонентным геномом, включающему: инфицирование клеточной культуральной системы флавивирусом с двухкомпонентным геномом согласно приведенному выше описанию, который является эффективным для достижения репликации обоих геномов в одной клетке; и высвобождение флавивируса с двухкомпонентным геномом, что позволяет достичь крупномасштабного размножения флавивируса с двухкомпонентным геномом. В основном клеточную культуральную систему инфицируют флавивирусом с двухкомпонентным геномом с множественностью заражения более, чем инфицирующая 1 единица/клетку. Дополнительно, флавивирус, дефектный по репликации, является дефектным по репликации и не способен вызывать заболевание, инфекцию и способен осуществлять единственный раунд инфекции in vivo.

Настоящее изобретение также относится к иммуногенной композиции, включающей: описанный выше флавивирус с двухкомпонентным геномом, адъювант, фармацевтически приемлемый носитель или их сочетания.

Настоящее изобретение также относится к способу защиты субъекта от инфекции, возникающей в результате воздействия флавивируса, включающему: введение иммунологически эффективного количества описанной иммуногенной композиции данному субъекту, где указанная композиция вызывает иммунный ответ против флавивируса у субъекта, что приводит к защите данного субъекта от инфекций, возникающих в результате воздействия флавивируса. При этом указанное введение может быть осуществлено путем внутрибрюшинного, внутрикожного, подкожного, внутримышечного, перорального или интраназального способа введения. Примеры флавивируса могут включать, без ограничения, вирус желтой лихорадки, вирус лихорадки Западного Нила, вирус Денге, вирус клещевого энцефалита, вирус энцефалита Сан-Луи, вирус японского энцефалита, вирус долины Мюррея, вирус классической свиной лихорадки или вирус гепатита С.

Использование форм неопределенного артикля в сочетании с термином «включающий» в тексте формулы изобретения и в тексте описания может означать «один», но также может соответствовать значению «один или более», «по меньшей мере один» и «один или более, чем один». Некоторые варианты настоящего изобретения могут состоять или состоять по существу из одного или нескольких элементов, стадий осуществления метода и/или методов согласно настоящему изобретению. В рамках настоящего изобретения принимается, что любой способ или любая композиция, приведенные в настоящем описании, могут быть осуществлены применительно к любому другому способу или композиции согласно настоящему описанию. В формуле изобретения используемый термин «или» следует понимать как означающий «и/или», если нет указания на альтернативы, или альтернативы являются взаимоисключающими, хотя в настоящем описании дается определение, которое относится только к альтернативным вариантам и «и/или».

В контексте настоящего описания термин «иммунологически эффективное количество» относится к количеству, которое приводит к улучшению или излечиванию симптомов заболевания или состояния за счет индукции иммунного ответа. Для специалистов в данной области очевидно, что эффективное количество может улучшать состояние пациента или субъекта, но может и не привести к полному излечению от заболевания и/или состояния. В контексте настоящего описания, термин «адъювант» применяется для определения вещества, которое при включении в вакцинную композицию специфически повышает иммунный ответ на антиген.

Иммуногенная композиция согласно настоящему описанию может вводиться либо сами по себе, либо в сочетании с другим лекарственным веществом, соединением или антибиотиком. Такое лекарственное вещество, соединение или антибиотик могут вводиться одновременно или последовательно относительно иммуногенной композиции согласно настоящему описанию. Эффект совместного введения с иммуногенной композицией заключается в снижении дозировки лекарственного средства, соединения или антибиотика, которая в норме требуется для достижения по меньшей мере минимального фармакологического или терапевтического эффекта, известного, применительно к тому заболеванию, которое подвергается лечению. При этом токсичность лекарственного средства, соединения или антибиотика для нормальных клеток, тканей или органов снижается, без снижения, ослабления, устранения или иного влияния на цитотоксический, цитостатический, апоптозный иди другой терапевтический эффект, связанный с уничтожением или ингибированием, свойственный лекарственному средству, соединению или антибиотику.

Приведенные в настоящем описании композиции, а также лекарственное средство, соединение или антибиотик могут вводиться независимо, в системном или локальном режиме, с использованием любого традиционного для данной области способа, например, путем подкожного, внутривенного, парентерального, внутрибрюшинного, внутрикожного, внутримышечного, местного, энтерального, ректального, назального, трансбуккального, вагинального введения или введения путем ингаляции, с помощью насоса для введения лекарств или с использованием трансдермального пластыря или имплантата. Дозированные формы композиции согласно настоящему изобретению могут включать традиционные нетоксичные физиологические или фармацевтически приемлемые носители или наполнители, подходящие для выбранного способа введения.

Иммуногенная композиция согласно настоящему описанию и лекарственное средство, соединение или антибиотик могут вводиться независимо, один или несколько раз, для достижения, поддержания или улучшения терапевтического эффекта. Специалисты в данной области могут определить дозировку или выяснить, является ли достаточной дозировка иммуногенной композиции и лекарственного средства, соединения или антибиотика, которая содержится в однократной дозе или в дозах, вводимых несколько раз.

Как хорошо известно в данной области, специфический уровень дозирования такой иммуногенной композиции для любого конкретного пациента зависит от множества факторов, включающих активность используемого конкретного соединения, возраст, вес тела, состояние здоровья, диетические привычки пациента, время введения, способ введения, скорость экскреции, наличие сочетания лекарственных средств и тяжесть конкретного заболевания, которое подлежит лечению. Лицо, ответственное за введение, должно определить подходящую дозу применительно к конкретному субъекту. Кроме того, в случае введения человеку препараты должны отвечать требованиям стерильности, должны соответствовать принятым стандартам на пирогенность, общую безопасность и чистоту, определенным Федеральной Администрацией США по контролю за лекарственными средствами биологических компонентов.

Введение иммуногенных композиций согласно настоящему изобретению субъекту должно соответствовать общим протоколам, принятым для введения терапевтических средств, используемых при лечении бактериальных инфекций, где принимается во внимание токсичность, если она свойственна компонентам в иммуногенной композиции, и/или наличие комбинированной терапии, токсичность антибиотика. Ожидается, что циклы лечения будут повторяться, при необходимости. Рассматриваются также различные стандартные подходы к терапии, а также возможность хирургической интервенции, которая может использоваться в сочетании с описанными терапевтическими подходами.

Как известно специалистам в данной области, иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению могут вводиться вместе с любыми известными фармакологически приемлемыми носителями. Дополнительно, иммуногенная композиция может вводиться в режиме любых известных способов введения, таких как подкожный, интараназальный или слизистый способ. Кроме того, дозировка вводимой композиции может быть определена при проведении экспериментов, известных специалистам в данной области.

Ниже описываются примеры, которые приведены с целью иллюстрации различных вариантов осуществления настоящего изобретения и которые не следует понимать как ограничивающие каким-либо образом настоящее изобретение. Для специалистов в настоящей области вполне очевидно, что настоящее изобретение может быть хорошо адаптировано для достижения целей и получения указанных преимуществ и решения поставленных задач, а также других объектов, задач и преимуществ, свойственных настоящему изобретению. При этом изменения и другие варианты использования, которые соответствуют принципам настоящего изобретения, определенным в формуле изобретения, будут очевидны специалистам в данной области.

ПРИМЕР 1

Клеточные культуры

Клетки BHK-21 были получены от Paul Olivo (Washington University, St. Louis, Mo). Указанные клетки поддерживают при температуре 37°C в альфа-минимальной эссенциальной среде ( MEM) с добавкой 10% фетальной сыворотки теленка (ФСТ) и витаминов.

ПРИМЕР 2

Плазмидные конструкции

Были использованы стандартные методики рекомбинантных ДНК для получения всех плазмидных конструкций. Исходная низкокопийная плазмида pACNR/FLYF-17Dx, содержащая инфицирующую кДНК из генома YFV, штамм 17D, была ранее описана (Bredenbeek et al., 2003) и предоставлена д-ром Чарльзом Райсом (Dr. Charles Rice (Rockefeller University, New York)).

pYF/GFP/prME содержит дефектный геном YFV (YF PIV), в котором фрагмент, кодирующий аминокислоты 26-100 в капсидном гене GFP, был заменен оптимизированным по кодонам геном, полученным из pEGFP-Nl (Clontech). Указанная плазмида была разработана в рамках предшествующего исследования, где она была обозначена как pYF/PIV. Указанная плазмида pYF/C/Cherry, кодирующая полный капсидный белок, за который следует сигнальный пептид prM и шесть аминокислот из prM, слита с последовательностью, кодирующей Cherry (один из красных флуоресцентных белков). Последний указанный ген был слит в рамке считывания с оставшейся частью YF ORF, которая начинается от трансмембранного домена белка E.

Плазмида pYF/C/GFP/C содержит геном YFV, в котором последовательность, кодирующая капсидный белок длиной из 101 аминокислота, была слита с GFP, за которой следует протеаза 2А вируса ящура (FAMDV 2A), оптимизированный по кодонам капсидный белок и оставшаяся часть последовательности, кодирующей prM-NS5 из полипротеина YF. Указанные pYF/Cfrs/GFP/C и pYF/Chyb/GFP/C имели по существу одну и ту же конструкцию (фиг.2А), но в pYF/Cfrs/GFP/C один нуклеотид был встроен после нуклеотида 202, а нуклеотид 422 был делетирован, а в pYF/Chyb/GFP/C последовательность между нуклеотидами 201 и 422 была замещена синтетическим геном, кодирующим ту же самую аминокислотную последовательность, но при использовании других кодонов.

pYF/DC/GFP/C и pYF/C/DGFP/C представляют собой производные pYF/C/GFP/C, которые содержат делеции в последовательностях, кодирующих капсид и GFP соответственно, и которые были идентифицированы в выбранных мутантах с делецией (см. фиг.3А, где описаны соответствующие детали). pYF/GFP содержит геном YFV, в котором за 5'UTR следует открытая рамка считывания, кодирующая 25 аминокислот из капсида YFV, которая была слита с GFP и FAMDV 2A, и полный полипротеин C-NS5 из YFV, где капсидный ген представлен в версии, оптимизированной по кодонам (фиг.4А). pYF/GFPmut имел по существу ту же конструкцию, но фрагмент, кодирующий 25 аминокислот капсида, содержал 3 однонуклеотидные вставки и точечные мутации в начале GFP- кодирующей последовательности.

pYF/Cherry/Cco содержит дефектный геном YFV, в котором 75 нуклеотидов капсида были слиты с геном Cherry, за которым следует последовательность, кодирующая 2А протеазу FAMDV, оптимизированный по кодонам капсид с prM-сигнальным пептидом, 6 аминокислот prM, 49 карбокси-концевых аминокислот Е белка и остаточная часть полипептида YFV (фиг.5А). pYFrep/Cherry содержит репликон YFV, в котором структурные гены были замещены последовательностью, кодирующей белок Cherry. На амино-конце Cherry был слит с 25 аминокислотами из капсида YFV, а на карбокси- конце за ним следует FAMDV 2A, и далее сигнальный пептид NSl и остаточная часть полипротеина YFV (фиг.6A).

Плазмида pVEErep/C-prM-E/Pac была достаточно широко описана. Плазмиду pVEErep/GFP-C-prM-E/Pac, содержащую репликон VEEV, где субгеномная РНК, кодирующая 25 аминокислот из капсида YFV, была слита с GFP, за которым следуют гены FMDV 2A протеазы, оптимизированного по кодонам капсида YFV и prM/E. Второй субгеномный промотор осуществляет экспрессию Pac, пуромицинацетилтрансферазы. Все рекомбинантные вирусные геномы или репликоны были клонированы под контролем промотора РНК полимеразы SP6.

ПРИМЕР 3

Транскрипции РНК

Плазмиды очищают путем центрифугирования в градиентах CsCl. Перед проведением реакции транскрипции геном YFV или репликон-содержащие плазмиды линеаризуют при обработке Xhol. Плазмиды с репликонами VEEV линеаризуют при обработке Mlul. РНК синтезировали с использованием РНК- полимеразы SP6 в присутствии кэп аналога, как было описано ранее. Выход и целостность транскриптов были проанализированы при проведении гель-электрофореза в неденатурирующих условиях. Аликвоты квот, взятых из реакций транскрипции, были использованы для электропорации без дополнительной очистки.

ПРИМЕР 4

Трансфекции РНК

Электропорацию клетки BHK-21 проводили в описанных ранее условиях (Liljestrom et al., 1991). Для установления пакующих клеточных культур к средам добавляли Pur в концентрации 10 мг/мл через 24 часа после электропорации VEEV репликонов. Трансфекцию синтезированного in vitro YF PIV генома проводили через 5 дней, когда репликон-содержащие клетки достигали эффективного роста.

ПРИМЕР 5

Определение титров инфицирующих вирусных частиц, содержащих дефектные YFV геномы

Для определения титров высвобожденных вирионов, содержащих различные дефектные геномы, клетки BHK-21 высевали в шестиячеечные планшеты Costar в концентрации 5×10⁵ клеток/ячейку. Через четыре часа клетки инфицировала образцами в разных разбавлениях. После одного часа инкубации при температуре 37°C в инкубаторе с содержанием 5% CO₂ на клетки наслаивали 2 мл среды MEM с добавкой 10% ФСТ. Число инфицированных клеток определяли при подсчете GFP- и Cherry-положительных клеток под UV микроскопом с инверсией после 36 часов инкубации. Фракцию инфицированных клеток относительно посеянного количества определяли при подсчете флуоресцирующих клеток в определенной зоне микроскопа. Результаты подсчета для 5 разных полей усредняли и пересчитывали титры, соответствующие каждому из исследованных серийных разведений.

Титры вирусов, компетентных по репликации, определяли по стандартному тесту для анализа бляшкообразования с использованием образцов BHK-21 клеток (Lemm et al., 1990). После трех дней инкубации при температуре 37°C монослои фиксировали обработкой 2,5% формальдегидом и окрашивали кристаллическим фиолетовым.

ПРИМЕР 6

Пассирование вирусов

Пакующие клеточные линии устанавливают путем трансфекции синтезированных in vitro РНК VEEV репликона с последующей селекцией по Pur. Указанные клеточные линии либо были подвергнуты трансфекции синтезированными in vitro РНК YFV репликона, либо были инфицированы ранее упакованными репликонами. Образцы собирали в заданные временные точки, указанные в описании для чертежей, заменяя среды. Пассирование YF вирусов с двухкомпонентным геномом проводили путем инфекции клеток с указанными выше значениями множественности заражения. Образцы отбирали в указанные временные точки, обозначенные на чертежах при замене используемых сред, и титры частиц, содержащих дефектные геномы, определяли по указанной выше процедуре. Вирусы, компетентные по репликции, подвергали пассажу путем инфицирования «необученных» клеток BHK-21 добавлением 100 мкл вируса, собранного на стадии предшествующего пассажа. Образцы собирали через 72 часа после инфекции и определяли титры при анализе бляшкообразования.

ПРИМЕР 7

Анализ продукции YF SVP

Клетки BHK-21 подвергали трансфекции с использованием 8 мг синтезированных in vitro вирусных геномов YFV 17D или YF/GFP/prME или путем трансфекции геномов YF/Cherry/Cco и YF/GFP/prME. После 24-часовой инкубации в 10 мл среды MEM с добавкой 10% ФСТ указанную среду заменяли 10 мл бессыворточной среды VP-SF (Invitrogen), которую собирали через 24 часа для анализа уровня высвобождения SVP. Собранные VP-SF образцы осветляли при проведении низкоскоростного центрифугирования (5000 об/мин, 10 мин, при 4°C) и затем концентрировали путем ультрацентрифугирования в 2 мл 10% сахарозы, приготовленной на ФБР с использованием ротора SW-41 при скорости 39000 об/мин, температуре 4°C в течение 6 часов.

Осажденные материал далее анализировали в градиенте плотности сахарозы, как было описано ранее (Schalich et al., 1996). В общих чертах, процедура состояла в том, что 0,5 мл образцов вносили в непрерывный сахарозный ингредиент (1,5 мл 50%, 1,5 мл 35% и 1,5 мл 10% сахарозы, приготовленной на ФБР). Центрифугирование проводят с использованием ротора SW-55 со скоростью 45000 об/мин при 4°C в течение 4 часов. После фракционирования образцы разбавляли в три раза с использованием ФБР и осаждали SVP путем центрифугирования с использованием ротора TLP-55 со скоростью 45000 об/мин, при 4°C в течение 1 часа в ультрацентрифуге Optima MAX (Beckman). Осадок растворяли в буфере, используемом для электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле, без -меркаптоэтанола (для сохранения связи с Dl-4G2 MAB), и далее анализировали по методу вестерн-блоттинга. После переноса белка нитроцеллюлозные мембраны обрабатывали с использованием D1-4G2 MAB и вторичных противомышиных антител осла, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP), полученных от компании Santa Cruz Biotechology. Наличие HRP детектировали с использованием люминол-реагента для вестерн-блоттинга согласно рекомендациям производителя (Santa Cruz Biotechnology). Проводили анализы путем сравнения градиентных зон, полученных с использованием YFV (2×10⁸ БОЕ), по тем же процедурам, которые были описаны выше применительно к SVP, полученным из YFV-PIV.

ПРИМЕР 8

Эксперименты invivo

6-дневных мышей (аутбредные мыши Swiss Webster, Harlan) инфицировали рекомбинантным YFV в дозах, указанных в описании, путем интракраниальной (и/к) инъекции (объем 20 мл). Далее, в течение 8 дней мышей наблюдали для выявления возможных признаков заболевания и для регистрации летальных исходов, после чего мышей умерщвляли и определяли титры в головном мозге по методу анализа бляшкообразования.

ПРИМЕР 9

Геномы YFV, дефектные по экспрессии капсида и prM/E, в значительной мере отличаются по эффективности репликации

В предшествующем исследовании была разработана система для транскомплементации дефектов в репликации YFV и в упаковке дефектных геномов с образованием инфекционных YF вирусных частиц. Для достижения этой цели клеточное линии были сконструированы таким образом, чтобы они содержали VEEV репликоны, продуцирующие либо капсид YFV, либо полный структурный полипротеин, который комплементирует репликацию капсид-дефицитных YFV геномов. Однако использование альфа-вирусных репликонов не является абсолютным условием для транскомплементации. Функциональный капсид может быть получен с использованием других кассет, способных к продукции на уровне, достаточном для упаковки флавивирусного генома. В этой связи были сделаны попытки исключить любые гетерологичные векторы экспрессии из пакующей системы и получать капсид на основе второго YFV генома, который не содержит структурные гены, отличные от гена, кодирующего капсид.

PIV геном (YF/GFP/prME) содержит делецию практически полной последовательности, кодирующей капсид, и второй комплементарный геном (YF/C/Cherry) содержит делетированную последовательность, кодирующую prM/E, а капсидный ген остается интактным. Для анализа характера репликации обоих геномов в культуре ткани два разных флуоресцентных белка, GFP и Cherry, клонировали в их открытых рамках считывания (фиг.1А). Ожидалось, что оба генома будут не способны вызывать продуктивную распространяющуюся инфекцию из-за их неспособности продуцировать полный набор структурных белков. Однако они могли продуцировать все белки, необходимые для образования вирусных частиц, при репликации в той же клетке.

Синтезированные in vitro РНК были подвергнуты совместной трансфекции клетками BHK-21, и экспрессия их маркеров, GFP и Cherry, подтвердила наличие их репликации. Неожиданно было обнаружено, что титры высвобожденных инфекционных вирусных частиц, содержащих либо геном, кодирующий капсид, либо геном, кодирующий prM/E, были ниже ожидаемого уровня, приближаясь к значению 10⁶ инфицирующих единиц/мл, и это могло указывать на то, что транс-комплементация была неэффективной (фиг. 1В). Сравнение характера экспрессии GFP и Cherry указывает на то, что кодирующий капсид геном реплицируется значительно более эффективно, чем геном, продуцирующий prM/E. После электропорации экспрессия Cherry достигала значимых уровней на 18-24 часа раньше, чем экспрессирующий GFP дефектный геном, но, что было нам более важно, его репликация также вызывала гибель клеток в течение 2-3 дней после трансфекции. Быстрое развитие CPE не представляло собой побочный эффект экспрессии Cherry белка, поскольку та же самая кассета, в которой Cherry был замещен GFP, демонстрировала высокую цитопатогенность (данные не показаны).

В другом наборе дополнительных экспериментов, репликацию геномов, экспрессирующих GFP и Cherry, сравнивали с использованием разработанных ранее клеточных линий, в которых предшественник полного структурного полипротеина YFV, C-prM-E экспрессируется на основе VEEV репликона. С указанными выше данными согласуется и тот факт, что репликация генома YF/C/Cherry, экспрессирующего капсид, оказывала вредное воздействие на клетки и по существу все трансфицированные клетки погибали через 96 часов после трансфекцции (фиг.1С), и инфекционные вирусные частицы высвобождались с более низкими титрами, чем это было обнаружено в средах для тех же клеток, трансфицированных prM/E- экспрессирующей конструкцией YF/prME/GFP.

Как отмечалось ранее (Mason, Shustov, and Frolov, 2006), клетки, содержащие YF/prME/GFP, не демонстрируют развитие CPE (фиг.1С) и продолжают высвобождать упакованные вирусные геномы даже после проведения пассирования клеток. Таким образом, результаты приведенных выше экспериментов указывают на то, что либо наличие последовательности, кодирующей капсид в геноме YF/C/Cherry, либо экспрессия самого капсидного белка (или оба фактора в сочетании) в значительной мере определяли цитопатогенность такой реплицирующейся РНК и в этой связи создавали выраженные различия в репликации геномов, продуцирующих капсид и prM/E, что могло быть причиной неэффективной транскомплементации. Кроме того, трансфицированные клетки с большей вероятностью погибали до высвобождения высоких титров инфицирующих вирусных частиц.

ПРИМЕР 10

Эффект капсидного белка на репликацию геномной РНК из YFV

Для разграничения различий эффектов капсида и капсид-кодирующей последовательности на репликацию дефектных YFV-специфичных РНК был разработан набор рекомбинантных YFV геномов, в которых были разделены последовательности, кодирующие полный полипротеин, включали все структурные и не структурные гены, и 5'-концевые последовательности, содержащие промоторные элементы РНК, необходимые для репликации, были разделены. Для достижения этой цели природный капсидный ген в полипротеине был заменен его оптимизированной по кодонам версией (Ceo), где содержалась мутированная последовательность циклизации, которая была не способна функционировать в репликации РНК. Затем была клонирована последовательность 5'UTR YFV против направления считывания информации Ceo, за которой следовала последовательность, кодирующая природный капсид без prM-специфичного сигнального пептида, слитая с генами GFP и 2A- протеазы FAMDV. Таким образом, капсидный ген против направления считывания информации содержал сигнал циклизации, обязательный для репликации РНК, а также метиониновый кодон инициации репликации.

В готовой конструкции YF/C/GFP/C открытая рамка считывания начинается с указанного инициирующего кодона AUG и продолжается на протяжении всего полипротеина. Аминокислотная последовательность Ceo отличалась от природного YFV капсида только наличием пролина в качестве первой аминокислоты, поскольку она была необходима для FAMDV 2A-специфичного процессинга. Указанная экспериментальная система позволяла проводить большое число манипуляций на 5'-конце, включая обширные модификации в амино-концевой, природной капсид-кодирующей части открытой рамки считывания, без воздействия на экспрессию функционального капсидного белка (Ceo). В этой связи была использована другая кассета YF/Cfrs/GFP/C, где первый капсид содержал вставку из 1 нуклеотида после нуклеотида 202 и делецию 1 нуклеотида после нуклеотида 421. Указанные модификации были выполнены таким способом, чтобы сохранить возможность компьютеризированного прогноза вторичных структур на 5'-конце вирусного генома и 3'-конце отрицательной цепи РНК, однако они меняли последовательность пептида из 73 аминокислот, который охватывал полный капсидный фрагмент.

В третьей конструкции YF/Chyb/GFP/C первый капсидный ген представлял собой гибрид между природной и оптимизированной по кодонам последовательностями. Он кодировал белок дикого типа, но последовательность РНК по направлению считывания информации для сигнала циклизации, начинающаяся от нуклеотида 202, отличалась от соответствующей последовательности в геноме YFV дикого типа. Таким образом, 5'-конец рекомбинантных вирусных геномов кодировал либо i) природный капсидный ген, слитый с GFP (YF/C/GFP/C), либо ii) практически природную последовательность РНК (содержащую только две рамочные мутации), но в значительной мере модифицированный белок (YF/Cfrs/GFP/C), либо iii) модифицированную последовательность РНК, но природный белок (YF/Chyb/GFP/C). Все три РНК и РНК в геноме YF 17D были синтезированы in vitro, и равные количества их были трансфицированы в клетки BHK-21.

Анализ высвобождения инфекционного вируса показал, что только конструкция, экспрессирующая мутированный первый капсид YF/Cfrs/GFP/C, была способна к эффективной репликации до титров, сравнимых с титрами, достигаемыми в случае YFV 17D (фиг.2B). Однако различия в скоростях репликации были еще более заметны. YF/Chyb/GFP/C и в особенности YF/C/GFP/C, оба генома, экспрессирующие капсид дикого типа, слитые с GFP, продемонстрировали высокоцитопатический фенотип и резкое снижение титров высвобождающихся инфекционных вирусов, несмотря на тот факт, что они экспрессировали GFP на более высоких уровнях, чем YF/Cfrs/GFP. В сочетании результаты указанных экспериментов и результаты, представленные в предшествующем разделе, указывают на то, что YFV капсид, экспрессируемый в условиях, отличных от природного окружения, оказывает сильный эффект на цитопатогенность рекомбинантных вирусов и, следовательно, на их рост в культуре ткани. В дополнительной серии экспериментов было показано, что цитотоксичность конструкций не зависит от экспрессии капсида в слитой с GFP форме или в свободной форме (данные не показаны). Единственный заметный эффект между GFP, экспрессированным в слитой или свободной форме, отмечается в картине внутриклеточного распределения.

ПРИМЕР 11

Выбор YFV вариантов со сниженной цитопатогенностью

В описанных выше экспериментах вирус YF/C/GFP/C, содержащий две копии капсидного гена, продемонстрировал в высшей степени необычную репликацию (фиг.2B), которая характеризовалась очень неэффективным высвобождением инфекционного вируса в течение первых трех дней после трансфекции синтезированной in vitro РНК и гибель большей части клеточной популяции. Однако небольшой процент GFP-положительных клеток выживал, продолжая расти и в период через 72 часа после трансфекции, и при этом они продуцировали более эффективный вирус, чем в более ранний период после трансфекции (фиг.2B). На 5 день титры вируса достигали 10⁸ инфицирующих единиц/мл. Приведенные данные указывают на возможную аккумуляцию мутаций в вирусных геномах, которые могут влиять на такой высокоцитопатический фенотип и приводить к пролонгированному, более эффективному высвобождению инфекционного вируса.

Для идентификации указанных адаптивных изменений было проведено секвенирование 5'-UTR, амино-концевого фрагмента, кодирующего капсид и GFP- кодирующего фрагмента в отобранных случайным образом мутантах. Они содержали крупные делеции в рамках считывания в капсидном гене (аминокислоты 29-66) или в гене GFP (аминокислоты 3-121), или обе делеции вместе. (Фиг.3А). Интересно отметить, что делеции наблюдались между очень короткими повторами (UAAA; SEQ ID NO: 1) и располагались в капсидной последовательности (в петлях, прогнозированных при компьютерном расчете вторичной структуры) и в повторах UGGUGA (SEQ ID NO: 2) в гене GFP. Полученные при секвенировании результаты были недостаточными для полного понимания того, какая делеция оказывала решающее позитивное влияние на репликацию вируса. В этой связи обе делеции, специфичные для GFP и капсида, были по отдельности клонированы в геноме YF/C/GFP/C (фиг.3B). Синтезированные in vitro РНК были подвергнуты трансфекции в клетки BHK-21, и единственная делеция в капсиде оказала позитивный эффект на выход инфекционного вируса. Рекомбинантный YF/DC/GFP/C, но не YF/C/DGFP/C демонстрировал скорость роста, аналогичную скорости роста, характерную для YFV 17D (фиг.3B). Таким образом, результаты проведенных экспериментов позволяют полагать, что модификация первой последовательности, кодирующей капсид, может быть очень эффективным подходом для изменения эффективности репликации вируса и конструирования вариантов, способных к эффективному размножению в культуре ткани.

ПРИМЕР 12

Разработка YFV, способного к экспрессии гетерологичных генов.

Для тестирования в экспериментальном варианте возможности разработки YFV, способного к эффективной репликации и стабильной экспрессии гетерологичных генов, были созданы два рекомбинантных генома YFV, YF/GFP и YFmut/GFP. Фрагмент длиной 75 нуклеотидов последовательности, кодирующей капсид, был клонирован против направления считывания информации в генах GFP и FAMDV 2A, за которыми следовала последовательность, кодирующая полный YFV полипротеин (фиг.4A), содержащая отпимизированный по кодонам капсидный ген. YF/GFP не содержал других изменений в 5'-концевой последовательности, а в YFmut/GFP имелись следующие дополнительные модификации: i) последовательность UGGUGA (SEQ ID NO: 2) в GFP была заменена последовательностью UCGUCA (SEQ ID NO: 3), которая не меняла последовательность, кодирующую белок, но модифицировала один из повторов, которые, как было показано, используются при образовании делеций в геномах YF/C/DGFP и YF/DC/DGFP; ii) короткий фрагмент, локализованный между последовательностью циклизации и GFP был модифицирован за счет введения трех нуклеотидных вставок.

GFP-специфичные мутации были введены для того, чтобы дополнительно снизить возможность рекомбинации в GFP гене, ведущую к делециям в кодирующей последовательности. Указанные изменения в последовательности, кодирующей капсид, были введены, с тем чтобы избежать возможности рекомбинации между остаточной последовательностью в 75 нуклеотидов длиной в начале открытой рамки считывания для оптимизированного по кодонам капсидного гена, локализованного по направлению считывания информации для GFP. Синтезированные in vitro РНК повергали трансфекции в клетки BHK-21. По существу, все клетки демонстрировали очень сходные уровни экспрессии GFP, которые выявлялись в течение 18 часов после трансфекции, что позволяет полагать, что оба вируса были жизнеспособными и не требовали дополнительной адаптации для репликации. Вирусы YF/GFP и YFmut/GFP были менее цитопатическими, чем YFV 17D дикого типа, и GFP-положительные клетки продолжали расти до полного слияния. Однако, несмотря на сниженную цитопатогенность, оба вируса были способны к эффективной репликации и накапливались в среде до титров, превышающих 5×10⁸ инфицирующих единиц/мл (фиг.4B).

Для оценки стабильности GFP вставки один из концентрированных образцов вируса YFmut/GFP подвергли в слепом варианте 5-кратному пассажу в клетках BHK-21. Не было выявлено значительных изменений в титре среди собранных образцов (фиг.4C). После 5 пассажей 11% очагов имели GFP-отрицательный характер, но окрашивались YFV-специфичными антителами. Указанные GFF варианты были все еще не способны образовывать бляшки, что указывает на то, что мутации, по всей видимости, накапливались в GFP гене в связи с недостаточностью функционального белка как результата положительной селекции, но не как результат отбора на основе наилучшим образом реплицирующегося вируса. Анализ по процедурее ПЦР также не выявил фрагментов, которые бы в заметной степени были короче, чем это ожидалось. Таким образом, если использовались кассеты, экспрессирующие гетерологичные гены, отличные от GFP, то не выявлялись различия в продукции белка.

В другом эксперименте проводили интракраниальную инокуляцию 6-дневным мышам 5×10⁶ и 5×10⁵ инфицирующих единиц YF/GFP. У всех мышей развились клинические признаки энцефалита, и они были подвергнуты эвтаназии на 8 день после инфекции. У всех мышей был выявлен GFP-экспрессирующий вирус в головном мозге в концентрации 2,46±0,68×l0⁸ инфицирующих единиц/мл. Не было выявлено вариантов с повышенной репликацией, которые бы экспрессировали более высокие уровни GFP или демонстрировали более цитопатический фенотип. Через восемь дней после инфекции вирусные образцы, выделенные из головного мозга, также содержали менее 3% GFP-отрицательных вариантов. Эти данные указывают на то, что разработанная стратегия модификации YFV генома, направленная на разделение функциональной последовательности, кодирующей полипротеин, и промоторных элементов открывает возможность стабильной экспрессии гетерологичных белков. Для YF/GFP и YFmut/GFP были выявлены очень сходные характеристики репликации, но тем не менее векторы на основе YFmut, по всей видимости, являются более предпочтительными для исследований, требующих длительных экспериментов и/или проведения повторных пассажей.

ПРИМЕР 13

Транс-комплементации между двумя дефектными YFV геномами

На основе результатов указанных выше экспериментов был разработан дефектный по репликации YFV геном, YF/Cherry/Cco (фиг.5A). Указанный геном был способен к экспрессии капсидного гена и содержал делецию в последовательности, кодирующей prM/E. Он содержал последовательность 5'UTR YFV, за которой следовали последовательности для гена капсида длиной 25 аминокислот, Cherry, FAMDV 2A, Cco с prM-специфичным сигнальным пептидом и карбокси-концевого фрагмента белка E, необходимого для соответствующего процессинга и компартментализации создаваемого NS1-5 полипротеина. Синтезируемый in vitro YF/Cherry/Cco и его транс-комплементирующий компонент, геномы YF/GFP/prME были трансфицированы в клетки BHK-21. Они комплементировали недостаточности друг у друга при синтезе структурных белков, и клетки эффективно создавали инфекционные вирусные частицы, содержавшие дефектные геномы, кодирующие капсид или prM/E, способные к экспрессии Cherry или GFP соответственно (фиг.5B). Важно отметить, что оба генома были упакованы до достижения очень сходных титров, которые составляли 10⁸ инфицирующих единиц/мл. Они неэффективно вызывали CPE и легко устанавливали персистентную инфекцию. Клетки продолжали расти и продуцировали вирусы не только через 4-5 дней после инфекции, но также после пассажей.

Для тестирования возможности крупномасштабной продукции концентрированные образцы вируса в клетках BHK-21 далее пассировали в «необученных» BHK-21 клетках и титры частиц, содержащих каждый из геномов, достигали значения 10⁸ инфицирующих единиц/мл. Кроме того, было необходимо провести пассаж при высокой множественности заражения. Клетки, инфицированные с множественностью заражения, равной ~1 инфицирующая единица/клетку, высвобождали упакованные геномы столь же эффективно, как и клетки, инфицированные с множественностью заражения ~10 инфицирующих единиц/клетку. Однако дополнительное снижение множественности заражения до ~0,1 инфицирующих единиц/клетку приводило к заметному снижению титров (фиг.5D). В клеточных монослоях, инфицированных с множественностью заражения 1, могли быть легко выявлены клетки, экспрессирующие только 1 маркер GFP или Cherry. Однако очень крупная фракция этих клеток экспрессировала оба маркера (фиг.5E). Анализ плотности вируса в градиенте плотности сахарозы показал, что клетки, трансфицированные РНК из YF/GFP/prME, высвобождали только вирусные частицы низкой плотности, которые соответствовали так называемым субвирусным единицам, содержащим prM/E (SVP), утратившим нуклеокапсид и РНК. Однако инфекция вирусами, содержащими оба дефектных транс-комплементарных генома, вела к высвобождению частиц и низкой, и высокой плотности, которые характеризовались такой же картиной распределения плотности сахарозы, что и образцы вируса дикого типа YF 17D. Приведенные данные дополнительно указывают на то, что вирус с двухкомпонентным геномом характеризуется показателями, близкими к таковому для природного YFV.

ПРИМЕР 14

Упаковка YFV репликонов, утративших структурные гены

В предшествующем исследовании была получена клеточная линия, экспрессирующая YFV C-prM-E кассету на основе персистентно реплицирующегося VEEV репликона. Указанная клеточная линия эффективно функционировала при упаковке YF/prME/GFP дефектного вирусного генома, и такая активность указывала на то, что капсидный белок продуцировался и соответствующим образом подвергался процессингу для геномного инкапсидирования. Однако та же самая клеточная линия была неэффективна в процессе упаковки YF репликонов, не кодирующих структурные белки. В результате титры упакованных репликонов были всегда ниже 10⁷ инфицирующих единиц/мл. Причина такого низкого уровня упаковки неясна, но полученные данные коррелируют с опубликованными ранее результатами другого исследования, в котором репликоны вируса Sindbis, продуцирующие кассету YF C-prM-E, упаковывались аналогично YF репликонам также неэффективно.

Для тестирования возможности упаковки YF репликонов с достижением более высоких титров авторы создали VEEV репликоны, кодирующие YFV C-prM-E в том же самом белке слияния, что и в случае вирусного генома YF/GFP/Cco. Одна из субгеномных РНК, кодируемая открытой рамкой считывания, которая начиналась с 25 аминокислоты капсидного белка, охватывала также ген GFP, ген FAMDV 2A протеазы, последовательность, кодирующую капсид с оптимизацией по кодонам и prM/E-кодирующую последовательность. Вторая субгеномная РНК направляла экспрессию PAC гена, кодирующего пуромицинацетилтрансферазу, которая придает клеткам устойчивость против действия пуромицина в среде, присутствие которого в среде блокирует трансляцию. Синтезированная in vitro РНК VEErep/GFP-C-prM-E/Pac была трансфицирована в клетки BHK-21, и клеточная линия Pur^r была установлена в течение нескольких дней при селекции на пуромицине. Затем клетки трансфицировали YFV репликоном (YFrep/Cherry), в котором все структурные гены были замещены Cherry-кодирующей последовательностью (фиг.6A). Как показано на фиг.6B, клеточная линия упаковывала последний репликон с достижением значительно более высоких титров и продолжала продуцировать инфекционные частицы в течение нескольких дней без развития выраженного CPE (фиг.6C). Клетки, содержащие YF репликон, продолжали расти, и обычно эксперименты заканчивались, поскольку клетки, экспрессирующие и GFP, и Cherry достигали слияния, что вызывало их гибель. При проведении множественных экспериментов не было выявлено упаковки VEEV репликонов в YFV структурном белке. Дополнительным преимуществом клеточной линии, содержащей VEErep/GFP-C-prM-E/Pac, была возможность использования ее для дальнейших пассажей YFV репликонов. Эти клетки могли быть инфицированы ранее упакованными конструкциями, и такая ситуация приводила к развитию распространяющейся инфекции и высвобождению репликон-содержащих частиц с титрами, достигавшими 10⁸ инфицирующих единиц/мл.

В настоящем описании процитированы следующие работы:

Aberle et al. (1999). J Immunol 163(12), 6756-61.

Aberle et al. (2005). J Virol 79(24), 15107-13. Chambers et al. (1999) J Virol 73(4), 3095-101.

Colombage et al. (1998) Virology 250(1), 151-63.

Davis et al. (2001) Journal of Virology 75(9), 4040-4047.

Kochel et al. (1997) Vaccine 15(5), 547-52.

Kochel et al. (2000). Vaccine 18(27), 3166-3173. Kofler et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101(7), 1951-6.

Konishi and Fujii (2002) Vaccine 20(7-8), 1058-67.

Konishi et al. (2001) Journal of Virology 75(5), 2204-2212.

Konishi, et al. (1992) Virology 188(2), 714-20.

Konishi, et al. (2000a) VaccineJan. 18(11-12), 1133-1139.

Konishi, et al. (2000b) Virology 268(1), 49-55.

Lindenbach and Rice (2001). Flaviviridae: The Viruses and Their Replication. Fourth ed. In "Fields Virology" (D. M. Knipe, P. M. Howley, D. G. Griffin, R. A. Lamb, M. A. Martin, and B. Roizman, Eds.), Vol. 1, pp. 991-1041. 2 vols. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia.

Lorenz et al. (2002) / Virol 76(11), 5480-91.

Mason et al. (1991) Virology 180(1), 294-305.

Mason et al. (2006) Virology 351(2), 432-43.

Monath, et al. (2002) Vaccine 20(7-8), 1004-18.

Phillpotts et al. (1996) Arch Virol 141(3-4), 743-9.

Qiao et al. (2004) J Infect Dis 190(12), 2104-8.

Schmaljohn et al. (1997) J Virol 71(12), 9563-9.