рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli - продуцент янтарной кислоты (варианты) и способ получения янтарной кислоты с использованием этого штамма

Формула изобретения

1. Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli SGM1.0 [pPYC] - продуцент янтарной кислоты, обладающий инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE и активностью пируваткарбоксилазы.

2. Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli по п.1, отличающийся тем, что активность пируваткарбоксилазы обеспечивается за счет введения в клетки штамма молекулы ДНК, содержащей ген, кодирующий фермент, обладающий активностью, классифицируемой как К.Ф. 6.4.1.1.

3. Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli SGM1.1 [pPYC] - продуцент янтарной кислоты, обладающий инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, iclR и активностью пируваткарбоксилазы.

4. Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli по п.3, отличающийся тем, что активность пируваткарбоксилазы обеспечивается за счет введения в клетки штамма молекулы ДНК, содержащей ген, кодирующий фермент, обладающий активностью, классифицируемой как К.Ф. 6.4.1.1.

5. Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli SGM2.0 [pPYC] - продуцент янтарной кислоты, обладающий инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF, lpdA и активностью пируваткарбоксилазы.

6. Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli по п.5, отличающийся тем, что активность пируваткарбоксилазы обеспечивается за счет введения в клетки штамма молекулы ДНК, содержащей ген, кодирующий фермент, обладающий активностью, классифицируемой как К.Ф. 6.4.1.1.

7. Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli по п.5, отличающийся тем, что экспрессия генов асеЕ, aceF и lpdA усилена за счет замены в хромосоме штамма нуклеотидной последовательности природного промотора, контролирующего экспрессию генов aceEF-lpdA оперона, на более сильный промотор.

8. Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli SGM2.1 [pPYC] - продуцент янтарной кислоты, обладающий инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, iclR, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA и активностью пируваткарбоксилазы.

9. Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli по п.8, отличающийся тем, что активность пируваткарбоксилазы обеспечивается за счет введения в клетки штамма молекулы ДНК, содержащей ген, кодирующий фермент, обладающий активностью, классифицируемой как К.Ф. 6.4.1.1.

10. Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli по п.8, отличающийся тем, что экспрессия генов асеЕ, aceF и lpdA усилена за счет замены в хромосоме штамма нуклеотидной последовательности природного промотора, контролирующего экспрессию генов aceEF-lpdA оперона, на более сильный промотор.

11. Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli SGM3.0 [pPYC] - продуцент янтарной кислоты, обладающий инактивированными генами ackA, pta, рохВ, ldhA, adhE, pflB, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA и активностью пируваткарбоксилазы.

12. Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli по п.11, отличающийся тем, что активность пируваткарбоксилазы обеспечивается за счет введения в клетки штамма молекулы ДНК, содержащей ген, кодирующий фермент, обладающий активностью, классифицируемой как К.Ф. 6.4.1.1.

13. Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli по п.11, отличающийся тем, что экспрессия генов асеЕ, aceF и lpdA усилена за счет замены в хромосоме штамма нуклеотидной последовательности природного промотора, контролирующего экспрессию генов aceEF-lpdA оперона, на более сильный промотор.

14. Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli SGM3.1 [pPYC] - продуцент янтарной кислоты, обладающий инактивированными генами ackA, pta, рохВ, ldhA, adhE, pflB, iclR, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA и активностью пируваткарбоксилазы.

15. Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli по п.14, отличающийся тем, что активность пируваткарбоксилазы обеспечивается за счет введения в клетки штамма молекулы ДНК, содержащей ген, кодирующий фермент, обладающий активностью, классифицируемой как К.Ф. 6.4.1.1.

16. Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli по п.14, отличающийся тем, что экспрессия генов асеЕ, aceF и lpdA усилена за счет замены в хромосоме штамма нуклеотидной последовательности природного промотора, контролирующего экспрессию генов aceEF-lpdA оперона, на более сильный промотор.

17. Способ получения янтарной кислоты путем культивирования рекомбинантного штамма по п.1, или 3, или 5, или 8, или 11, или 14 в питательной среде и выделения янтарной кислоты из культуральной жидкости.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности, к рекомбинантным штаммам бактерий Escherichia coli - продуцентам янтарной кислоты, способным к эффективной продукции янтарной кислоты из глюкозы, а так же к способу получения янтарной кислоты, с использованием этих штаммов, с улучшенными показателями коэффициента конверсии субстрата в целевой продукт.

Янтарная кислота, традиционно получаемая нефтехимическим синтезом, является одним из соединений, продукция которых из возобновляемого сырья является наиболее востребованной в связи ростом цен на нефть и ограниченностью ее запасов. Янтарная кислота служит одним из важнейших "строительных блоков" для получения широкого спектра химических веществ с высокой добавленной стоимостью, также синтезируемых в настоящее время из нефтепродуктов. Ожидаемый рынок янтарной кислоты составляет более 300000 тон/год.

В силу относительной дешевизны и значительных объемов производства предпочтительным субстратом для микробиологического получения янтарной кислоты является глюкоза (Song H. and Lee S.Y., Production of succinic acid by bacterial fermentation. Enz. Microbial TechnoL, 2006, 39(3), 352-361). Однако эффективно конвертировать глюкозу в янтарную кислоты способны лишь некоторые виды бактерий, такие как Actinobacillus succinogenes (Urbance S.E. et al., Evaluation of succinic acid continuous and repeat-batch biofilm fermentation by Actinobacillus succinogenes using plastic composite support bioreactors. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2004, 65, 664-670), Anaerobiospirillum succiniproducens (Nghiem N.P. et al., Production of succinic acid by Anaerobiospirillum succiniciproducens. Appl. Biochem. Biotechnol., 63-65, 565-576.) и Mannheimia succiniproducens (Lee P.C. et al., Isolation and characterization of a new succinic acid-producing bacterium, Mannheimia succiniciproducens MBEL55E, from bovine rumen. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002, 58, 663-668). Вместе с тем, данные бактерии требуют для своего культивирования дорогостоящих комплексных питательных сред, что резко ограничивает возможность их экономически оправданного применения в промышленном производстве янтарной кислоты.

Факультативно анаэробная бактерия Escherichia coli способна к формированию лишь незначительных количеств янтарной кислоты в анаэробном процессе смешаннокислотного брожения. Тем не менее, изученность метаболизма и развитость доступного генно-инженерного инструментария позволили создать на основе клеток Е.coli, как с привлечением генно-инженерных методов, так и мутагенеза, рекомбинантные продуценты янтарной кислоты, превосходящие по своим характеристикам природные продуценты (Cheng K.K. et al., Biotechnological production of succinic acid: current state and perspectives. Biofpr. Journal, 2012, 6, 302-318).

Наиболее эффективным процессом микробиологического получения янтарной кислоты и ее солей является анаэробное сбраживание глюкозы, с формированием целевого вещества в восстановительной части цикла трикарбоновых кислот. В данном процессе максимально возможный коэффициент конверсии субстрата в продукт в расчете на углерод составляет 2 моль/моль. Это обуславливается фиксацией CO₂ на стадии образования из гликолитических интермедиатов оксалоацетата - предшественника в анаэробном пути сбраживания глюкозы в янтарную кислоту. Однако практической реализуемости данного процесса, препятствует его окислительно-восстановительная несбалансированность. Конверсия каждой из двух молекул оксалоацетата, полученных из интермедиатов гликолитической утилизации глюкозы, в янтарную кислоту требует 2-х восстановленных эквивалентов (NADH), в то время как в ходе гликолиза формируется лишь половина необходимых эквивалентов (1 NADH на одну молекулу оксалоацетата).

Этим обуславливается то, что лучшие показатели продукции янтарной кислоты специально полученными мутантными штаммами достигаются в процессах биосинтеза, представляющих сочетание двух биохимических путей - восстановительной части цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного шунта. Соотношение вкладов каждого из путей в биосинтез янтарной кислоты определяет конечный выход целевого вещества.

С участием глиоксилатного шунта две молекулы янтарной кислоты могут быть синтезированы из одной молекулы оксалоацетата, двух молекул Ацетил-CoA и одного NADH. Глиоксилатный шунт, потребляющий меньшее количество NADH на каждую синтезируемую молекулу янтарной кислоты выступает в данном случае как донор "остаточных" гликолитических NADH для высокопродуктивного формирования целевого вещества в восстановительной части цикла трикарбоновых кислот. Однако, поскольку в глиоксилатный шунт, наряду с оксалоацетатом, вовлечены 2 молекулы Ацетил-CoA, формирующиеся из гликолитического предшественника с потерей CO₂, вклад этого процесса в общий биосинтез янтарной кислоты приводит к снижению суммарного выхода продукта.

Исходя из электронного и углеродного балансов, принято считать, что максимально возможный коэффициент конверсии глюкозы в янтарную кислоту составляет 1,71 моль/моль (McKinlay J.B., et al., Prospects for a bio-based succinate industry. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2007, 76(4), 727-740). Действительно, если считать, что глюкоза содержит 24 электрона, а янтарная кислота, исходя из степени ее восстановленности, 14, то образование янтарной кислоты из глюкозы можно представить следующей нетто-формулой:

C₆H₁₂O₆+0,86 CO ₂ 1,714 C₄H₆O₄+0,86 H ₂O.

Однако в действительности, в зависимости от участия конкретных ферментов в формировании ключевых метаболитов-предшественников в биосинтезе целевого вещества, окислительно-восстановительно сбалансированный биосинтез янтарной кислоты из глюкозы может достигаться при различных максимально возможных коэффициентах конверсии субстрата в продукт. Иными словами, участие конкретного фермента в пути биосинтеза янтарной кислоты из глюкозы задает необходимость соблюдения клеткой окислительно-восстановительного баланса, определяющего теоретически возможный выход продукта.

В клетках Е.coli Ацетил-CoA, необходимый для функционирования глиоксилатного шунта, может образовываться из пировиноградной кислоты под действием пируватформатлиазы или под действием пируватдегидрогеназы. Конверсия пировиноградной кислоты в Ацетил-CoA под действием пируватформатлиазы не сопровождающаяся формированием NADH, в то время как действие пируватдегидрогеназы приводит к формированию дополнительной молекулы NADH на каждый образующийся Ацетил-CoA.

В анаэробных условиях гликолитическая конверсия одной молекулы глюкозы в две молекулы пировиноградной кислоты сопровождается формированием двух NADH. Синтез одной молекулы янтарной кислоты из оксалоацетата в восстановительной части цикла трикарбоновых кислот сопровождается расходом 2-х восстановленных эквивалентов NADH. Синтез двух молекул янтарной кислоты из одной молекулы оксалоацетата и двух молекул Ацетил-CoA с участием глиоксилатного шунта сопровождается расходом одного восстановленного эквивалента NADH. Таким образом, окислительно-восстановительно сбалансированный анаэробный биосинтез янтарной кислоты из глюкозы, при формировании Ацетил-CoA под действием пируватформатлиазы, возможен при образовании 8-ми молекул янтарной кислоты из 5-ти молекул глюкозы и 2-х молекул CO₂. В данном случае максимально возможный коэффициент конверсии глюкозы в янтарную кислоту составляет 1,6 моль/моль. При формировании Ацетил-CoA под действием как пируватформатлиазы, так и пируватдегидрогеназы окислительно-восстановительно сбалансированный анаэробный биосинтез янтарной кислоты из глюкозы возможен при образовании 10-ти молекул янтарной кислоты из 6-ти молекул глюкозы и 4-х молекул CO₂. В данном случае максимально возможный коэффициент конверсии глюкозы в янтарную кислоту составляет 1,66 моль/моль. При формировании Ацетил-CoA исключительно под действием пируватдегидрогеназы окислительно-восстановительно сбалансированный анаэробный биосинтез янтарной кислоты из глюкозы возможен при образовании 12-ти молекул янтарной кислоты из 7-ти молекул глюкозы и 6-ти молекул CO₂. В данном случае максимально возможный коэффициент конверсии глюкозы в янтарную кислоту составляет 1,71 моль/моль. В данной связи следует отметить, что в Е.coli конверсия пировиноградной кислоты в Ацетил-CoA в анаэробных условиях осуществляется под действием пируватформатлиазы, в то время как пируватдегидрогеназа активна в аэробных условиях и экспрессия генов пируватдегидрогеназного комплекса в условиях анаэробиоза репрессирована (см., например, Soini J. et al., Norvaline is accumulated after a down-shift of oxygen in Escherichia coli W3110. Microb Cell Fact., 2008, 7:30, doi: 10.1186/1475-2859-7-30).

Эффект активации пируватдегидрогеназы для анаэробного биосинтеза янтарной кислоты из глюкозы клетками Е.coli был продемонстрирован в RU 2010146281. Однако, соответствующий штамм SGM0.1 P_L-aceEF-lpdA [pPYC] демонстрировал коэффициент конверсии глюкозы в янтарную кислоту на уровне ~0,57 моль/моль. Достижению высоких показателей коэффициента конверсии глюкозы в янтарную кислоту данным штаммом препятствовало наличие в нем активности алкоголь/альдегид дегидрогеназы AdhE, конкурирующей с биосинтезом целевого вещества за метаболит-предшественник Ацетил-CoA.

Действительно, рациональное конструирование рекомбинантных микробных продуцентов янтарной кислоты предполагает необходимость инактивации конкурентных, по отношению к целевым, биохимических путей утилизации ключевых метаболических предшественников и восстановленных эквивалентов NADH. Эти конкурентные пути представляют собой:

А) конверсию, под действием лактатдегидрогеназы, пировиноградной кислоты, являющейся предшественником биосинтеза Ацетил-CoA и потенциальным предшественником в биосинтезе оксалоацетата, в молочную кислоту с расходом восстановленного эквивалента NADH;

Б) конверсию, под действием пируватоксидазы, пировиноградной кислоты в уксусную кислоту;

В) конверсию, под действием альдегид/алкоголь дегидрогеназы, Ацетил-CoA, субстрата глиоксилатного шунта, в этанол с расходом двух восстановленных эквивалентов NADH;

Г) конверсию, под действием фосфотрансацетилазы и ацетаткиназы, Ацетил-CoA в уксусную кислоту.

Среди штаммов Е.coli продуцентов янтарной кислоты полученных с помощью методов направленной генетической инженерии и без привлечения методов мутагенеза и селекции в наибольшей степени данным критериям соответствует штамм SBS550MG [pHL413] (Sanchez AM et al., Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increase succinate yield and productivity. Metab Eng. 2005, 7(3), 229-239.). Этот штамм рассматриваем в качестве ближайшего аналога заявляемого штамма, а способ получения янтарной кислоты на основе штамма SBS550MG [pHL413] в качестве ближайшего аналога заявляемого способа. В штамме SBS550MG [pHL413] инактивированны гены ackA, pta, IdhA, adhE, iclR, кодирующие ацетаткиназу, фосфотрансацетилазу, лактатдегидрогеназу, альдегид/алкоголь дегидрогеназу и белок транскрипционный репрессор экспрессии генов, кодирующих ферменты глиоксилатного шунта. Однако, данный штамм содержит интактный ген рохВ, кодирующий пируватоксидазу, конкурирующую с биосинтезом янтарной кислоты за метаболит-предшественник пировиноградную кислоту. Конверсия пировиноградной кислоты в Ацетил-CoA в штамме SBS550MG [pHL413] осуществляется под действием пируватформатлиазы, что обуславливает максимально возможный коэффициент конверсии глюкозы в янтарную кислоту - 1,6 моль/моль (Сох S.J. et al., Development of a metabolic network design and optimization framework incorporating implementation constraints: a succinate production case study. Metab. Eng., 2006, 8, 46-57). В богатых комплексных средах штамм SBS550MG [pHL413] синтезирует янтарную кислоту из глюкозы с коэффициентом конверсии 1,59 (Sanchez AM et al., Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increase succinate yield and productivity. Metab Eng. 2005, 7(3), 229-239.), 1,4 (PCT/FR2010/050230) и 1,25 (Martinez I. et al., Metabolic impact of the level of aeration during cell growth on anaerobic succinate production by an engineered Escherichia coli strain. Metab Eng., 2010, 12, 499-509) в зависимости от условий культивирования. Данные коэффициенты конверсии достигнуты при продукции штаммом янтарной кислоты в среде LB, содержащей значительное количество аминокислот. В условиях анаэробиоза окислительное дезаминирование аминокислот, сопровождающееся генерацией NADH, способно обеспечить дополнительные к гликолитическим восстановленные эквиваленты необходимые для формирования янтарной кислоты в восстановительной части цикла трикарбоновых кислот. При исчерпании в среде аминокислот, штамм лишается дополнительного источника восстановленных эквивалентов для эффективного биосинтеза янтарной кислоты. Действительно, при осуществлении процесса анаэробного биосинтеза янтарной кислоты из глюкозы штаммом SBS550MG [pHL413] в минимальной солевой среде с глюкозой коэффициент конверсии субстрата в целевой продукт составляет 1,3 моль/моль (WO 2009/083756).

Задача заявляемого изобретения состоит в расширении ассортимента штаммов бактерий Escherichia coli продуцентов янтарной кислоты и способов получения янтарной кислоты с использованием этих штаммов. Задача решена путем

- конструирования рекомбинантных штаммов Escherichia coli - продуцентов янтарной кислоты:

1. SGM1.0 [pPYC], обладающего инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE и активностью пируваткарбоксилазы;

2. SGM1.1 [pPYC], обладающего инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, iclR и активностью пируваткарбоксилазы;

3. SGM2.0 [pPYC], обладающего инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, и активностью пируваткарбоксилазы;

4. SGM2.1 [pPYC], обладающего инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, iclR, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, и активностью пируваткарбоксилазы;

5. SGM3.0 [pPYC], обладающего инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, pflB, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, и активностью пируваткарбоксилазы;

6. SGM3.1 [pPYC], обладающего инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, pflB, iclR, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, и активностью пируваткарбоксилазы.

- разработки способа получения янтарной кислоты с использованием заявляемых штаммов.

В отличие от штамма SBS550MG [pHL413], в заявляемых штаммах помимо генов ackA, pta, ldhA, adhE инактивирован ген poxB. Конверсия пировиноградной кислоты в Ацетил-CoA осуществляется в заявляемых штаммах либо под действием пируватформатлиазы, либо под действием пируватформатлиазы и пируватдегидрогеназы, либо под действием исключительно пируватдегидрогеназы что обуславливает максимально возможные коэффициенты конверсии глюкозы в янтарную кислоту - 1,6 моль/моль, 1,66 моль/моль, 1,71 моль/моль. Заявляемые штаммы способны анаэробно синтезировать янтарную кислоту из глюкозы с высокими коэффициентами конверсии как в комплексной, так и в минимальной солевой средах.

Объектом настоящего изобретения являются рекомбинантные штаммы бактерий вида Escherichia coli, обладающие способностью к эффективной конверсии глюкозы в янтарную кислоту.

Также объектом настоящего изобретения является рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, обладающий активностью пируваткарбоксилазы - продуцент янтарной кислоты с максимально возможным коэффициентом конверсии глюкозы в янтарную кислоту - 1,6 моль/моль.

Также объектом настоящего изобретения является рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами ackA, pta, poxB, IdhA, adhE, iclR, обладающий активностью пируваткарбоксилазы - продуцент янтарной кислоты с максимально возможным коэффициентом конверсии глюкозы в янтарную кислоту - 1,6 моль/моль.

Также объектом настоящего изобретения является рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, и обладающий активностью пируваткарбоксилазы - продуцент янтарной кислоты с максимально возможным коэффициентом конверсии глюкозы в янтарную кислоту - 1,66 моль/моль.

Также объектом настоящего изобретения является рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, iclR, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, и обладающий активностью пируваткарбоксилазы - продуцент янтарной кислоты с максимально возможным коэффициентом конверсии глюкозы в янтарную кислоту - 1,66 моль/моль.

Также объектом настоящего изобретения является рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, pflB, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, и обладающий активностью пируваткарбоксилазы - продуцент янтарной кислоты с максимально возможным коэффициентом конверсии глюкозы в янтарную кислоту - 1,71 моль/моль.

Также объектом настоящего изобретения является рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, pflB, iclR, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, и обладающий активностью пируваткарбоксилазы - продуцент янтарной кислоты с максимально возможным коэффициентом конверсии глюкозы в янтарную кислоту - 1,71 моль/моль.

Также объектом настоящего изобретения являются рекомбинантные штаммы бактерий Escherichia coli, описанные выше, при этом активность пируваткарбоксилазы обеспечивается за счет введения в бактерию молекулы ДНК, содержащей ген, кодирующий фермент, обладающий активностью, классифицируемой как К.Ф. 6.4.1.1..

Также объектом настоящего изобретения являются рекомбинантные штаммы бактерий Escherichia coli, в которых экспрессия генов асеЕ, aceF и lpdA усилена за счет замены в хромосомах штаммов нуклеотидной последовательности природного промотора, контролирующего экспрессию генов aceEF-lpdA оперона, на более сильный промотор.

Также объектом настоящего изобретения является способ получения янтарной кислоты, включающий стадии культивирования рекомбинантных штаммов, описанных выше, в питательной среде; и выделения произведенной и накопленной янтарной кислоты из культуральной жидкости.

Также объектом настоящего изобретения является, описанный выше способ, в котором процесс культивирования рекомбинантных штаммов включает в себя аэробную стадию накопления биомассы и анаэробную стадию продукции янтарной кислоты.

Рекомбинантный штамм, согласно настоящему изобретению, - это штамм бактерий вида Escherichia coli, сконструированный в результате направленных генно-инженерных манипуляций в рамках подхода рациональной метаболической инженерии.

Термин «рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE» означает, что указанная бактерия была модифицирована таким образом, что в результате модификации такая бактерия содержит пониженное количество белков AckA, Pta, PoxB, LdhA, AdhE по сравнению с немодифицированной бактерией, или указанная бактерия не способна синтезировать белки AckA, Pta, PoxB, LdhA, AdhE.

Термин «рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, iclR» означает, что указанная бактерия была модифицирована таким образом, что в результате модификации такая бактерия содержит пониженное количество белков AckA, Pta, PoxB, LdhA, AdhE и iclR по сравнению с немодифицированной бактерией, или указанная бактерия не способна синтезировать белки AckA, Pta, PoxB, LdhA, AdhE и iclR.

Термин «рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, pflB» означает, что указанная бактерия была модифицирована таким образом, что в результате модификации такая бактерия содержит пониженное количество белков AckA, Pta, PoxB, LdhA, AdhE и PflB по сравнению с немодифицированной бактерией, или указанная бактерия не способна синтезировать белки AckA, Pta, PoxB, LdhA, AdhE и PflB.

Термин «рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, pflB, iclR» означает, что указанная бактерия была модифицирована таким образом, что в результате модификации такая бактерия содержит пониженное количество белков AckA, Pta, PoxB, LdhA, AdhE, PflB и iclR по сравнению с немодифицированной бактерией, или указанная бактерия не способна синтезировать белки AckA, Pta, PoxB, LdhA, AdhE, PflB и IclR.

Термин «инактивация генов ackA, pta, poxB, ldhA, adhE» означает, что естественная экспрессия модифицированных участков ДНК невозможна из-за делеций данных генов или их частей или модификации примыкающих к генам областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию соответствующих генов, такие как промоторы, энхансеры, аттенуаторы, и т.д.

Термин «инактивация гена iclR» означает, что естественная экспрессия модифицированного участка ДНК невозможна из-за делеций данного гена или его части или модификации примыкающих к гену областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промоторы, энхансеры, аттенуаторы, и т.д.

Термин «инактивация гена pflB» означает, что естественная экспрессия модифицированного участка ДНК невозможна из-за делеций данного гена или его части или модификации примыкающих к гену областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промоторы, энхансеры, аттенуаторы, и т.д.

Наличие или отсутствие генов ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, а также iclR и/или pflB на хромосоме бактерии можно определить известными методами, включая ПЦР, блоттинг по Саузерну, и т.п. Кроме того, уровни экспрессии гена можно оценить определением количества транскрибируемой с гена РНК с использованием различных известных методов, включая блоттинг по Нозерну, количественную ОТ-ПЦР, и т.п.Количества или молекулярные массы кодируемых генами белков могут быть определены известными методами, включая SDS-ПААГ - электрофорез с последующим иммуноблоттингом ПЦР (блоттинг по Вестерну) и т.п..

Ген ackA (синонимы: ЕСК2290, b2296) кодирует белок AckA (синоним: В2296), проявляющий активность ацетаткиназы, классифицируемую как К.Ф. 2.7.2.1. Ген ackA (нуклеотиды с 2,411,492 по 2,412,694 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между открытой рамкой считывания yfbV и геном pta на хромосоме штамма Е.coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена ackA и аминокислотная последовательность AckA, кодируемого геном ackA, приведены в Перечне последовательностей под номерами 1 (SEQ ID NO: 1) и 2 (SEQ ID NO: 2) соответственно. Ten pta (синонимы: ЕСК2291, b2297) кодирует белок Pta (синоним: В2297), проявляющий активность фосфотрансацетилазы, классифицируемую как К.Ф. 2.3.1.8. Ген pta (нуклеотиды с 2,412,769 по 2,414,913 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном ackA и открытой рамкой считывания yfcC на хромосоме штамма Е.coli К-12. Нуклеотидная последовательность теш pta и аминокислотная последовательность Pta, кодируемого геном pta, приведены в Перечне последовательностей под номерами 3 (SEQ ID NO: 3) и 4 (SEQ ID NO: 4) соответственно. Ген рохВ (синонимы: ЕСК0862, b0871) кодирует белок РохВ (синоним: В0871), проявляющий активность пируватоксидазы, классифицируемую как К.Ф. 1.2.5.1. Ген рохВ (нуклеотиды комплементарные нуклеотидам с 908,554 по 910,272 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном ltaE и геном her на хромосоме штамма Е.coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена рохВ и аминокислотная последовательность РохВ, кодируемого геном рохВ, приведены в Перечне последовательностей под номерами 5 (SEQ ID NO:5) и 6 (SEQ ID NO:6) соответственно. Ген ldhA (синонимы: ЕСК1377, b1380) кодирует белок LdhA (синоним: В1380), проявляющий активность лактатдегидрогеназы, классифицируемую как К.Ф. 1.1.1.28. Ген ldhA (нуклеотиды комплементарные нуклеотидам с 1,439,878 по 1,440,867 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном hslJ и открытой рамкой считывания ydbH на хромосоме штамма Е.coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена ldhA и аминокислотная последовательность LdhA, кодируемого геном ldhA, приведены в Перечне последовательностей под номерами 7 (SEQ ID NO: 7) и 8 (SEQ ID NO: 8) соответственно. Ген adhE (синонимы: ЕСК1235, b1241) кодирует белок AdhE (синоним: В1241), проявляющий активность алкоголь дегидрогеназы и альдегид дегидрогеназы, классифицируемые как К.Ф. 1.1.1.1. и К.Ф. 1.2.1.3. Ген adhE (нуклеотиды комплементарные нуклеотидам с 1,294,669 по 1,297,344 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между открытой рамкой считывания ychG и открытой рамкой считывания ychE на хромосоме штамма Е.coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена adhE и аминокислотная последовательность AdhE, кодируемого геном adhE, приведены в Перечне последовательностей под номерами 9 (SEQ ID NO: 9) и 10 (SEQ ID NO: 10) соответственно. Ген iclR (синонимы: ЕСК4010, b4018) кодирует белок iclR (синоним: В4018) являющийся транскрипционным репрессором асеВАК оперона, кодирующего ферменты глиоксилатного шунта. Ген iclR (нуклеотиды комплементарные нуклеотидам с 4,220,827 по 4,221,651 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном arpA и геном metHm хромосоме штамма Е.coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена iclR и аминокислотная последовательность iclR, кодируемого геном iclR, приведены в Перечне последовательностей под номерами 11 (SEQ ID NO: 11) и 12 (SEQ ID NO: 12) соответственно. Ген pflB (синонимы: ЕСК0894, b0903) кодирует белок PflB (синоним: В0903), проявляющий активность пируватформатлиазы, классифицируемую как К.Ф. 2,3.1.54. Ген pflB (нуклеотиды комплементарные нуклеотидам с 950,495 по 952,777 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном pflA и геном focA на хромосоме штамма Е.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена pflB и аминокислотная последовательность PflB, кодируемого геном pfl, приведены в Перечне последовательностей под номерами 13 (SEQ ID NO: 13) и 14 (SEQ ID NO: 14) соответственно.

Поскольку у представителей различных штаммов вида Escherichia coli возможны некоторые вариации в нуклеотидных последовательностях, понятие инактивируемого гена не ограничивается генами, последовательности которых приведены в Перечне последовательностей под номерами 1 (SEQ ID No: 1), 3 (SEQ ID No: 3), 5 (SEQ ID No:5 ), 7 (SEQ ID No: 7), 9 (SEQ ID No: 9), 11 (SEQ ID No: 11), 13 (SEQ ID NO: 13), но также может включать и гены, гомологичные SEQ ID No:1, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 7, (SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 11, SEQ ID NO: 13, кодирующие варианты белков AckA, Pta, PoxB, LdhA, AdhE, IclR и PflB. Термин «вариант белка» в значении, в котором он используется в настоящем изобретении, означает белок, имеющий изменения в аминокислотной последовательности, а именно делеции, вставки, добавления или замены аминокислот. Количество изменений в варианте белка зависит от положения аминокислотного остатка в трехмерной структуре или его типа. Количество изменений может быть от 1 до 30, предпочтительно от 1 до 15 и наиболее предпочтительно от 1 до 5 изменений в последовательностях SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14. Данные изменения в вариантах белка являются консервативными мутациями, при которых сохраняется функция белка. Другими словами, данные изменения могут иметь место в областях белка, некритичных для его трехмерной структуры. Это становится возможным благодаря тому, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг к другу, и поэтому третичная структура при таких заменах не нарушается. Консервативная мутация - это мутация, при которой имеют место взаимные замены среди Phe, Trp, Tyr, если сайт замены - ароматическая аминокислота; среди Leu, He, Val, если сайт замены - гидрофобная аминокислота; между Gin, Asn, если сайт замены - положительно заряженная аминокислота; среди Lys, Arg, His, если сайт замены - основная аминокислота; между Asp, Glu, если сайт замены - кислая аминокислота и между Ser, Thr, если это аминокислота с гидроксильной группой. Консервативные замены являются типичными консервативными мутациями. Примеры консервативных замен включают замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gin, His или Lys, замену Asn на Glu, Gin, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gin, замену Cys на Ser или Ala, замену Gin на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gin, Lys или Asp, замену Gly на Pro, замену His на Asn, Lys, Gin, Arg или Tyr, замену He на Leu, Met, Val или Phe, замену Leu на He, Met, Val или Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gin, His или Arg, замену Met на He, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Tyr, Met, He или Leu, замену Ser на Thr или Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Tyr, замену Tyr на His, Phe или Trp, и замену Val на Met, He или Leu. Описанные выше замены, делеции, вставки, добавления, перестановки и т.п. одного или нескольких аминокислотных остатков включают природные мутации (мутант или вариант) в зависимости от видовых различий или индивидуальных различий микроорганизмов, содержащих гены ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, iclR и pflB. Такие гены могут быть получены модифицированием нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 7, (SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 11 и SEQ ID NO: 13 с использованием, например, сайт-специфического мутагенеза, таким образом, что сайт-специфический аминокислотный остаток в соответствующем кодируемом белке включает замены, делеции, вставки или добавления.

Следовательно, варианты белков, кодируемых генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, iclR и pflB, могут иметь гомологию не менее 80%, предпочтительно не менее 90%, и наиболее предпочтительно не менее 95%, по отношению к полной аминокислотной последовательности, показанной в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14, соответственно.

В связи с этим гены ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, iclR и pflB могут быть вариантами, которые гибридизуются в жестких условиях с нуклеотидными последовательностями, приведенными в Перечне последовательностей под номерами 1 (SEQ ID No: 1), 3 (SEQ ID No: 3), 5 (SEQ ID No: 5), 7 (SEQ ID No: 7), 9 (SEQ ID No: 9), 11 (SEQ ID No: 11), 13 (SEQ ID NO: 13), или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности. «Жесткие условия» включают такие условия, при которых специфические гибриды, например, гибриды с гомологией не менее 60%, предпочтительно не менее 70%, более предпочтительно не менее 80%, еще более предпочтительно не менее 90%, и наиболее предпочтительно не менее 95%, образуются, а неспецифические гибриды, например, гибриды с меньшей гомологией, чем указано выше, - не образуются. Практическим примером жестких условий является однократная отмывка, предпочтительно двух- или трехкратная, при концентрации солей 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от типа используемой для блоттинга мембраны и, как правило, такова, как рекомендовано производителем. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для нейлоновой мембраны Hybond N+(Amersham) при строгих условиях-15 минут. Предпочтительна двух- трехкратная отмывка. Длина зонда может быть выбрана в зависимости от условий гибридизации, обычно от 100 н.п. до 1000 н.п.

Гомология между последовательностями аминокислот может быть определена с использованием известных методов, например, компьютерной программы BLAST 2.0.

Экспрессия генов ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, а также iclR и/или pflB может быть ослаблена введением мутации в соответствующий ген на хромосоме, при которой внутриклеточная активность белка, кодируемого геном, снижена или отсутствует по сравнению с немодифицированным штаммом. Такой мутацией гена может быть вставка гена устойчивости к антибиотику, или делеция гена или его части (Qiu, Z. and Goodman, M.R, J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D. H. et al, J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)). Экспрессия генов ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, а также iclR и/или pflB также может быть ослаблена модификацией регуляторных последовательностей, таких как промотор или последовательность Shine-Dalgamo (SD) (заявка РСТ W095/34672; Carrier, Т.А. and Keasling, J.D., Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)).

Например, следующие методы могут применяться для введения мутаций путем генной рекомбинации. Конструируется мутантный ген, и бактерия для ее модификации трансформируется фрагментом ДНК, содержащим мутантный ген. Затем нативный ген на хромосоме замещается гомологичной рекомбинацией мутантным геном, отбирается полученный штамм. Такое замещение гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведено методом с использованием линейной ДНК, известным как "Red-зависимая интеграция" или "интеграция посредством Red-системы" (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 97, 12, 6640-6645 (2000)) или методом с использованием плазмиды, репликация которой чувствительна к температуре (патент США 6,303,383 или патентная заявка Японии JP 05-007491A). Далее, введение сайт-специфической мутации путем замещения гена с использованием вышеупомянутой гомологичной рекомбинации может также быть осуществлено с использованием плазмиды с пониженной способностью к репликации в клетке хозяина.

Экспрессия гена также может быть ослаблена вставкой транспозона или IS фактора в кодирующую область гена (патент США 5,175,107), или традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин).

Инактивация гена также может быть осуществлена традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-специфический мутагенез, разрушение гена с использованием гомологичной рекомбинации, или/и мутагенез вставкой-делецией (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83 and Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45) также называемый "Red-зависимая интеграция".

Приведенное выше описание, касающееся вариантов белков, инактивации гена и других методов, может быть применимо к другим белкам, генам и конструированию бактерий, приведенным ниже.

Термин "усиление экспрессии гена" может означать, что экспрессия гена выше, чем в немодифицированном штамме, например, в штамме дикого типа. Примеры таких модификаций могут включать увеличение числа копий экспрессируемого гена в клетке, усиление экспрессии гена и т.д. Количество копий экспрессируемого гена определяют, например, путем рестрикции хромосомной ДНК с последующим блоттингом по Саузерну с использованием зонда, сконструированного на основе последовательности гена, флуоресцентной гибридизации т situ (FISH), и т.п. Уровень экспрессии гена можно определить различными известными методами, включая Нозерн-блоттинг, количественную ОТ-ПЦР, и т.п. Кроме того, штаммы, которые могут быть использованы в качестве контроля, включают, например, Escherichia coli К-12.

Гены асеЕ, aceF и lpdA (синонимы: b0114, ЕСК0113; b0115, ECK0114; b0116, ЕСК0115) кодируют белки АсеЕ, AceF и LpdA - компоненты ферментативного комплекса NAD⁺-восстанавливающей пируватдегидрогеназы. Гены aceEF-lpdA оперона (нуклеотиды, гомологичные нуклеотидам с 123017 по 129336; в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990) расположены между генами pdhR и уасН на хромосоме Е.coli К-12. Нуклеотидные последовательности генов aceEF-lpdA оперона и аминокислотные последовательности белков АсеЕ, AceF и LpdA, кодируемых генами асеЕ, aceF и lpdA представлены в SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, соответственно.

Понятие "вариант белка" также применимо белков АсеЕ, AceF и LpdA - компонентов ферментативного комплекса NAD⁺-восстанавливающей пируватдегидрогеназы. Термин "вариант белка" трактуется аналогично тому, как это описано выше.

В связи с этим гены асеЕ, aceF и lpdA также могут существовать в виде вариантов, которые гибридизуются в жестких условиях с нуклеотидными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, или с зондами, которые могут быть синтезированы на основе указанных нуклеотидных последовательностей, при условии, что они кодируют функциональные белки АсеЕ, AceF и LpdA. Термин "жесткие условия" трактуется аналогично тому, как это описано выше.

Методы, которые могут быть использованы для усиления экспрессии гена, включают увеличение числа копий гена. Введение гена в вектор, способный функционировать в бактерии вида Escherichia coli, может увеличивать число копий гена. Могут использоваться низкокопийные векторы. Примеры низкокопийных векторов включают, но не ограничиваются ими, pSC101, pMW118, pMW119, и т.п. Термин "низкокопийный вектор" используется для векторов, число копий которого в клетке достигает пяти.

Усиление экспрессии гена может также быть достигнуто путем введения множества копий гена в бактериальную хромосому, например, методом гомологичной рекомбинации, Mu интеграции и т.п. Например, один акт Mu интеграции позволяет ввести в бактериальную хромосому до 3 копий гена.

Число копий гена также может быть увеличено путем введения множества копий гена в хромосомную ДНК бактерии. Для введения множества копий гена в бактериальную хромосому может быть выполнена гомологичная рекомбинация с использованием в качестве целевых последовательностей, присутствующих в хромосоме во множестве копий. Последовательности с множеством копий в хромосомной ДНК, включают, но не ограничиваются ими, повторяющиеся ДНК или инвертированные повторы на концах транспонируемых элементов. Также возможно включить ген в состав транспозона и обеспечить его перенос для введения множества копий гена в хромосомную ДНК.

Усиление экспрессии гена также может быть достигнуто путем подстановки фрагмента ДНК под контроль сильного промотора. Примерами сильных промоторов являются lac промотор, trp промотор, trc промотор, P_R или P_L промоторы фага . Использование сильного промотора можно сочетать с увеличением копий гена.

С другой стороны, действие промотора может быть усилено, например, введением в промотор мутации, ведущей к увеличению уровня транскрипции локализованного за промотором гена. Кроме того, известно, что замена нескольких нуклеотидов в области между сайтом связывания рибосомы (ribosome binding site - RBS) и стартовым кодоном, особенно в последовательности непосредственно перед стартовым кодоном, существенно влияет на трансляционную способность мРНК. Например, обнаружен 20-кратный разброс в уровне экспрессии в зависимости от природы трех нуклеотидов, предшествующих стартовому кодону (Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J, 3, 623-629, 1984).

Кроме того, возможно ввести нуклеотидную замену в область промотора гена на бактериальной хромосоме, результатом чего является усиление функции промотора. Изменение последовательности, контролирующей экспрессию, можно осуществить, например, таким же способом, что и замена гена с использованием чувствительной к температуре плазмиды, как раскрыто в международной заявке WO 00/18935 и заявке Японии JP 1-215280 А.

Рекомбинантными штаммами бактерий Escherichia coli, согласно настоящему изобретению, также являются штаммы, описанные выше, модифицированные таким образом, что приобретают активность пируваткарбоксилазы. Активность пируваткарбоксилазы может обеспечиваться, в частности, присутствием в бактерии молекулы ДНК, содержащей ген, кодирующий пируваткарбоксилазу.

Пируваткарбоксилаза - фермент, способный катализировать реакцию карбоксилирования пировиноградной кислоты с образованием щавелеуксусной кислоты: АТФ + пируват + HCO₃ ^-= АДФ + фосфат + оксалоацетат. Указанную активность классифицируют как К.Ф. 6.4.1.1. Наличие активности пируваткарбоксилазы может быть установлено, например, с использованием метода, описанного Peters-Wendisch P.O. et al. (Pyruvate carboxylase from Corynebacterium glutamicum: characterization, expression and inactivation of the рус gene. Microbiology, 1998; 144; 915-927). Примером фермента, обладающего активностью пируваткарбоксилазы, может являться белок РусА из Bacillus subtilis (последовательность с инвентарным номером NP_3 89369.1 в базе данных GenBank, gi: 16078550), кодируемый геном русА (нуклеотиды с 1554185 по 1557631 в последовательности с инвентарным номером NC_000964.3 в базе данных GenBank, gi: 255767013). Нуклеотидная последовательность гена русА и аминокислотная последовательность кодируемого им белка РусА представлены в SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22, соответственно.

Понятие "вариант белка" также применимо для пируваткарбоксилазы. Термин "вариант белка" трактуется аналогично тому, как это описано выше.

В связи с этим ген русА также может существовать в виде вариантов, которые гибридизуются в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 21, или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности, при условии, что они кодируют функциональный белок РусА. Термин "жесткие условия" трактуется аналогично тому, как это описано выше.

Молекула ДНК, содержащая ген, кодирующий пируваткарбоксилазу, может быть введена в бактерию в составе плазмидного вектора или же интегрирована в хромосому бактерии методом гомологичной рекомбинации или Ми интеграции. Ген русА может быть получен с помощью ПЦР с использованием в качестве матрицы хромосомы организма, природно содержащего данный ген, и праймеров, синтезированных в соответствии с целевой нуклеотидной последовательностью.

Методы приготовления плазмидной ДНК, рестрикции и лидирования ДНК, трансформации, выбора нуклеотидов в качестве праймера и т.п. могут быть обычными методами, известными специалисту в этой области. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Способ получения янтарной кислоты в общем виде.

Заявляемый способ продукции янтарной кислоты осуществляют путем культивирования заявляемого рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli в питательной среде, обеспечивающей продукцию, накопление янтарной кислоты в культуральной жидкости и выделение янтарной кислоты или ее соли из культуральной жидкости.

Согласно заявляемому способу выращивание, выделение и очистка янтарной кислоты или ее соли из культуральной или подобной ей жидкости осуществляют способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых янтарная кислота продуцируется с использованием микроорганизмов. В качестве питательной среды, используют как синтетическую, так и натуральную, при условии, что среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относят различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические полиолы, такие как глицерин. В качестве источника азота используют различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, зерновые или бобовые гидролизаты, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок используют фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. При необходимости в питательную среду добавляют дополнительные источники CO₂ и/или ионов HCO₃ ^- и CO₃ ^2-, вводимые в среду за счет газообмена или же растворения соответствующих солей.

Выращивание и инкубацию осуществляют при температуре в пределах от 30°С до 37°С, предпочтительно в пределах от 35°С до 37°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6,5 до 7,2. рН среды регулируют аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно, культивирование в течение от 1-го до 5-ти дней приводит к накоплению янтарной кислоты в культуральной жидкости.

Заявляемый способ включает аэробную ростовую и анаэробную продуктивную стадии.

После культивирования твердые остатки, такие как клетки, удаляют из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем янтарная кислота или ее соль может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, обращено-фазовой хроматографии, концентрирования и/или кристаллизации.

Пример 1. Конструирование рекомбинантных штаммов бактерий Escherichia coli.

Сконструированы и использованы следующие штаммы и плазмиды - SGM1.0 (Е.coli MG1655 ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE}, SGM1.1 (Е.coli MG1655 ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE, iclR), SGM2.0 (Е.coli MG1655 ackA-pta, poxB, ldhA, adhE, P_L-aceEF-lpdA), SGM2.1 (E.coli MG1655 ackA-pta, poxB, ldhA, adhE, P_L-aceEF-lpdA, iclR), SGM3.0 (Е.coli MG1655 ackA-pta, poxB, ldhA, adhE, P_L-aceEF-lpdA, pflB), SGM3.1 (E.coli MG1655 ackA-pta, poxB, ldhA, adhE, P_L-aceEF-lpdA, pflB, iclR), SGM1.0 [pPYC], SGM1.1 [pPYC], SGM2.0 [pPYC], SGM2.1 [pPYC], SGM3.0 [pPYC], SGM3.1 [pPYC]. В качестве базового для конструирования всех рекомбинантных штаммов использован штамм дикого типа Escherichia coli К-12 MG1655 (ВКПМ В-6195). Плазмида pPYC, содержащая ген русА, кодирующий функционально активную пируваткарбоксилазу из Bacillus subtilis, известна (RU 2010146281).

1.1. Конструирование штамма SGM1.0.

Штамм SGM1.0 (Е.coli MG1655 ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE) получен на основе штамма E.coli MG1655 в результате инактивации генов ackA-pta, poxB, ldhA и adhE, с помощью рекомбинационной инженерии, основанной на методе, использующем XRed-зависимую гомологичную рекомбинацию. Принцип метода детально описан, например, в (Sawitzke J. et al., Recombineering: In Vivo Genetic Engineering in E.coli, S. enterica, and Beyond. Methods in Enzymology. 2007, 421, 171-199), а примеры его практического применения, например, в (RU 2330883).

Первоначально все хромосомные модификации получены индивидуально с использованием в качестве реципиента штамма E.coli MG1655. На основе отобранных индивидуальных колоний штаммов, несущих маркированные целевые хромосомные модификации получены препараты соответствующих P1-трансдуцирующих фагов. Далее серией последовательных трансдукций полученные модификации объединены в хромосоме целевого рекомбинантного штамма. После каждого раунда трансдукций, из хромосомы полученных штаммов осуществляли удаление маркера устойчивости к антибиотику, фланкированного аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием плазмиды pMWts-Int/Xis (WO 2007 013638; RU 2005123423), включающей гены Int/Xis зависимой системы сайт-специфической рекомбинации фага лямбда.

Первоначально получены фрагменты ДНК для инактивации генов ackA-pta, poxB, ldhA и adhE.

Линейные фрагменты ДНК для делеций целевых генов получены при помощи ПЦР с использованием пар праймеров P1 (SEQ ID NO: 23) и Р2 (SEQ ID NO: 24), P5 (SEQ ID NO: 25) и P6 (SEQ ID NO: 26), P9 (SEQ ID NO: 27) и P10 (SEQ ID NO: 28), P13 (SEQ ID NO: 29) и Р14 (SEQ ID NO: 30) и плазмиды pMW118-attL-Cm-attR (Каташкина Ж.И. и др., 2005 Направленное изменение уровня экспрессии генов в бактериальной хромосоме. Мол. Биол., 39 (5), 823-831) в качестве матрицы.

Праймеры Р1, P5, P9 и P13 содержат участки ДНК размером в 36 нуклеотидов, гомологичные участкам ДНК, расположенным на 5'-концах генов ackA, poxB, ldhA, и adhE и участки ДНК размером 28 нуклеотидов, комплементарные участку ДНК, расположенному на 3'-конце области attR. Праймеры Р2, P6, Р10 и Р14 содержат участки ДНК размером в 36 нуклеотидов, комплементарные участкам ДНК, расположенным на 3'-концах генов pta, poxB, ldhA, и adhE, а также участки ДНК размером 28 нуклеотидов, гомологичные участку ДНК, расположенному на 5'-конце области attL. Температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 52°С, 1 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва).

Полученные ПЦР-продукты длиной 1700 п.н. для инактивации генов ackA-pta, poxB, ldhA и adhE, индивидуально очищали электрофорезом в агарозном геле и выделяли, в соответствии с рекомендациями производителя, с помощью Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, США). Итоговые фрагменты содержат ген устойчивости к хлорамфениколу (ген. cat, кодирующий хлорамфениколацетилтрансферазу), фланкированный сайтами attL и attR фага лямбда, а также 36-звенные области фланговой гомологии с кодирующими областями целевых генов.

Интеграцию полученных линейных фрагментов ДНК в хромосому штамма Е.coli MG1655 осуществляли с использованием системы Red-зависимой гомологичной рекомбинации фага .

Для этого рекомбинантные ДНК вводили электротрансформацией в индивидуальные клоны штамма Е.coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46 с термочувствительным репликоном. Плазмида pKD46 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645) содержит ДНК-фрагмент фага длиной 2154 п.н. (позиции с 31088 по 33241 нуклеотидной последовательности с инвентарным номером J02459 в базе данных GenBank), а также содержит гены Red-гомологичной системы рекомбинации (гены , , exo) под контролем промотора P_araB, индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции линейных ДНК в хромосому штамма.

Электрокомпетентные клетки штамма Е.coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46, получали следующим образом: ночную культуру штамма Е.coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46, выращивали при 30°С в среде LB с добавкой ампициллина (100 мг/л) и разводили в 100 раз, добавляя 10 мл среды SOB (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), содержащей ампициллин и L-арабинозу (10 мМ). Полученную культуру растили с перемешиванием при 30°С до достижения OD₆₀₀ 0,8, после чего придавали клеткам свойства электрокомпетентности, путем концентрирования в 100 раз и трехкратного отмывания ледяной деионизированной H₂O. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ~300 нг индивидуального ПЦР-продукта. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим 30 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивали при 37°С для отбора C_m ^R-рекомбинантов. Удаление плазмиды-помощника pKD46 осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с селекцией устойчивых к хлорамфениколу и чувствительных к ампициллину Cm^RAp^S вариантов.

Факты соответствия предполагаемых и полученных экспериментально структур хромосом отобранных Cm^RAp^S колоний подтверждали ПЦР анализом с помощью пар локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO: 31) и Р4 (SEQ ID NO: 32), P7 (SEQ ID NO: 33) и Р8 (SEQ ID NO: 34), P11 (SEQ ID NO: 35) и P12 (SEQ ID NO: 36), P15 (SEQ ID NO: 37) и P16 (SEQ ID NO: 38), для оперона ackA-pta и генов рохВ, ldhA, и adhE, соответственно. Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С.

Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ackA-pta, 1872 для интактного гена рохВ, 1299 для интактного гена ldhA, и 2903 для интактного гена adhE. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантных штаммов, составляла 1920 п.н. для инактивированного оперона ackA-pta, 1852 для инактивированного гена рохВ, 2008 для инактивированного гена IdhA, и 1926 для инактивированного гена adhE.

На основе отобранных индивидуальных Cm^RAp^S колоний штаммов с замененными геном cat опероном ackA-pta и генами рохВ, ldhA, и adhE по стандартной методике (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) получены препараты соответствующих P1-трансдуцирующих фагов.

Штамм Е.coli с делегированными генами ackA-pta получен переносом в хромосому штамма Е.coli MG1655 фрагмента хромосомы, с опероном ackA-pta, замененным геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием препарата трансдуцирующего фага, несущего целевую маркированную генетическую модификацию. Для этого клетки штамма Е.coli MG1655 выращивали в течение ночи при 37°С в среде LB (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Клетки из 500 мкл ночной культуры штамма-реципиента собирали центрифугированием, ресуспендировали в 100 мкл буфера, содержащего 0,1 М MgSO₄ и 5 мМ CaCl₂, добавляли препарат трансдуцирующего фага, в разведении соответствующем 10⁹ фаговых частиц/мл, и инкубировали 20 мин при 37°С. Клетки осаждали центрифугированием, промывали 1 мл стерильной воды, высевали на чашку с L-агаром, содержащим 30 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивали при 37°С для отбора Cm^R-трансдуктантов. Очистку полученных трансдуктантов от остаточных фаговых частиц осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с последующей селекцией устойчивых к хлорамфениколу Cm^R вариантов. В хромосомах клонов, формирующих наиболее быстрорастущие колонии правильной формы, подтверждали замену генов оперона ackA-pta геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO:31) и Р4 (SEQ ID NO:32). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ackA-pta. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток полученных трансдуктантов, составляла 1920 п.н. для оперона ackA-pta, замененного геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда. С целью удаления из хромосом трансдуктантов маркера устойчивости к антибиотику, отобранные клоны трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis (WO 2007013638; RU 2005123423). Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ген cat был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний штаммов на чашках с LB средой с селекцией чувствительных к хлорамфениколу и устойчивых к ампициллину Cm^SAp_R вариантов. Удаление гена cat из хромосом трансдуктантов и делецию в них генов оперона ackA-pta подтверждали ПЦР с помощью соответствующих локус-специфичных праймеров Р3 и Р4. Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ackA-pta. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток штамма с делегированным опероном ackA-pta, составляла 323 п.н.. В результате последующего излечивания клонов от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, проведенного с помощью повторного рассева до отдельных колоний на чашках с LB средой и селекции Cm^SAp^S-вариантов, получен штамм Е.coli MG1655 ( ackA-ptd) с делегированным генами ackA-pta.

Штамм Е.coli с делетированными генами ackA-pta и рохВ получен переносом в хромосому штамма Е.coli MG1655 ( ackA-pta) фрагмента хромосомы, с геном рохВ, замененным геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием препарата трансдуцирующего фага, несущего целевую маркированную генетическую модификацию, как описано выше. Очистку полученных трансдуктантов от остаточных фаговых частиц осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с последующей селекцией устойчивых к хлорамфениколу Cm вариантов. В хромосомах клонов, формирующих наиболее быстрорастущие колонии правильной формы, подтверждали замену гена рохВ геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р7 (SEQ ID NO: 33) и Р8 (SEQ ID NO: 34). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655 (AackA-pta), составляла 1872 п.н. для интактного гена рохВ. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток полученных трансдуктантов, составляла 1852 п.н. для гена рохВ, замененного геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда. С целью удаления из хромосом трансдуктантов маркера устойчивости к антибиотику, отобранные клоны трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis (WO 2007013638; RU 2005123423). Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ген cat был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний штаммов на чашках с LB средой с селекцией чувствительных к хлорамфениколу и устойчивых к ампициллину Cm^SAp^R вариантов. Удаление гена cat из хромосом трансдуктантов и делецию в них генов оперона ackA-pta и гена рохВ подтверждали ПЦР с помощью соответствующих пар локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO: 31), Р4 (SEQ ID NO: 32) и Р7 (SEQ ID NO: 33), Р8 (SEQ ID NO: 34). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток исходного штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ackA-pta и 1872 п.н. для интактного гена рохВ. Длина соответствующих продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток штамма с делегированными опероном ackA-pta и геном рохВ, составляла 323 п.н. и 255 п.н.. В результате последующего излечивания клонов от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, проведенного с помощью повторного рассева до отдельных колоний на чашках с LB средой и селекции Cm^SAp^S-вариантов, получен штамм Е.coli MG1655 ( ackA-pta, poxS) с делетированными генами ackA-pta и рохВ.

Штамм Е.coli с делетированными генами ackA-pta, рохВ и ldhA получен переносом в хромосому штамма Е.coli MG1655 ( ackA-pta, рохВ) фрагмента хромосомы, с геном IdhA, замененным геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием препарата трансдуцирующего фага, несущего целевую маркированную генетическую модификацию, как описано выше. Очистку полученных трансдуктантов от остаточных фаговых частиц осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с последующей селекцией устойчивых к хлорамфениколу Cm^R вариантов. В хромосомах клонов, формирующих наиболее быстрорастущие колонии правильной формы, подтверждали замену гена ldhA геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров P11 (SEQ ID NO:35) и Р12 (SEQ ID NO:36). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655 ( ackA-pta, рохВ), составляла 1299 п.н. для интактного гена ldhA. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток полученных трансдуктантов, составляла 2008 п.н. для гена ldhA, замененного геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда. С целью удаления из хромосом трансдуктантов маркера устойчивости к антибиотику, отобранные клоны трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis (WO 2007013638; RU 2005123423). Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ген cat был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний штаммов на чашках с LB средой с селекцией чувствительных к хлорамфениколу и устойчивых к ампициллину Cm^SAp^R вариантов. Удаление гена cat из хромосом трансдуктантов и делецию в них генов оперона ackA-pta, гена рохВ и гена ldhA подтверждали ПЦР с помощью соответствующих пар локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO: 31) и Р4 (SEQ ID NO: 32), P7 (SEQ ID NO: 33) и P8 (SEQ ID NO: 34), P11 (SEQ ID NO: 35) и Р12 (SEQ ID NO: 36). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток исходного штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ackA-pta, 1872 п.н. для интактного гена рохВ и 1299 п.н. для интактного гена ldhA. Длина соответствующих продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток штамма с делегированными опероном ackA-pta, геном рохВ и геном ldhA составляла 323 п.н., 255 п.н. и 411 п.н.. В результате излечивания клонов от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, проведенного с помощью повторного рассева до отдельных колоний на чашках с LB средой и селекции Cm^SAp ^S-вариантов, получен штамм Е.coli MG1655 ( ackA-pta, рохВ, ldhA) с делегированным генами ackA-pta, рохВ и ldhA.

Штамм Е.coli с делетированными генами ackA-pta, рохВ, ldhA и adhE получен переносом в хромосому штамма Е.coli MG1655 ( ackA-pta, рохВ, ldhA) фрагмента хромосомы, с геном adhE, замененным геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием препарата трансдуцирующего фага, несущего целевую маркированную генетическую модификацию, как описано выше. Очистку полученных трансдуктантов от остаточных фаговых частиц осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с последующей селекцией устойчивых к хлорамфениколу Cm^R вариантов. В хромосомах клонов, формирующих наиболее быстрорастущие колонии правильной формы, подтверждали замену гена adhE геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р15 (SEQ ID NO:37) и Р16 (SEQ ID NO:38). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655 ( ackA-pta, рохВ, ldhA), составляла 2903 п.н. для интактного гена adhE. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток полученных трансдуктантов, составляла 1926 п.н. для гена adhE, замененного геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда. С целью удаления из хромосом трансдуктантов маркера устойчивости к антибиотику, отобранные клоны трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis (WO 2007013638; RU 2005123423). Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ген cat был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний штаммов на чашках с LB средой с селекцией чувствительных к хлорамфениколу и устойчивых к ампициллину Cm^SAp^R вариантов. Удаление гена cat из хромосом трансдуктантов и делецию в них генов оперона ackA-pta, гена рохВ, гена ldhA и гена adhE подтверждали ПЦР с помощью соответствующих пар локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO: 31) и Р4 (SEQ ID NO: 32), P7 (SEQ ID NO: 33) и Р8 (SEQ ID NO: 34), P11 (SEQ ID NO: 35) и Р12 (SEQ ID NO: 36), P15 (SEQ ID NO: 37) и Р16 (SEQ ID NO: 38). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток исходного штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ackA-pta, 1872 п.н. для интактного гена рохВ, 1299 п.н. для интактного гена ldhA и 2903 п.н. для интактного гена adhE. Длина соответствующих продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток штамма с делегированными опероном ackA-pta, геном рохВ, геном ldhA и геном adhE составляла 323 п.н., 255 п.н., 411 п.н. и 329 п.н.. В результате излечивания клонов от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, проведенного с помощью повторного рассева до отдельных колоний на чашках с LB средой и селекции Cm^SAp^S -вариантов, получен штамм Е.coli MG1655 ( ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE) с инактивированными генами ackA-pta, рохВ, ldhA и adhE, названный SGM1.0.

1.2. Конструирование штамма SGM1.1.

Штамм SGM1.1 (Е.coli MG1655 ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE, iclR) получен на основе штамма SGM1.0 (Е.coli MG1655 ackA-pta, рохВ, idhA, adhE) в результате инактивации в нем гена iclR.

Первоначально целевая хромосомная модификации была получена индивидуально с использованием в качестве реципиента штамма E.coli MG1655. На основе полученного штамма, несущего маркированную целевую хромосомную модификацию получен препарат соответствующего P1-трансдуцирующего фага. Далее P1-трансдукций полученная модификация внесена в хромосому целевого рекомбинантного штамма. После трансдукции, из хромосомы полученного штамма осуществляли удаление маркера устойчивости к антибиотику, фланкированного аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием плазмиды pMWts-Int/Xis (WO 2007013638; RU 2005123423), включающей гены Int/Xis зависимой системы сайт-специфической рекомбинации фага лямбда.

Первоначально был получен фрагмент ДНК для инактивации гена iclR.

Линейный фрагмент ДНК для делеции целевого гена получен при помощи ПЦР с использованием праймеров Р17 (SEQ ID NO:39) и Р18 (SEQ ID NO:40) и плазмиды pMW118-attL-Cm-attR (Каташкина Ж.И. и др., 2005 Направленное изменение уровня экспрессии генов в бактериальной хромосоме. Мол. Биол., 39 (5), 823-831) в качестве матрицы.

Праймер Р17 содержит участок ДНК размером в 36 нуклеотидов, гомологичный участку ДНК, расположенному на 5'-конце гена iclR и участок ДНК размером 28 нуклеотидов, комплементарный участку ДНК, расположенному на 3'-конце области attR. Праймер Р18 содержит участок ДНК размером в 36 нуклеотидов, комплементарный участку ДНК, расположенному на 3'-конце гена iclR, а также участок ДНК размером 28 нуклеотидов, гомологичный участку ДНК, расположенному на 5'-конце области attL. Температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 52°С, 1 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва).

Полученный ПЦР-продукт длиной 1700 п.н. для инактивации гена iclR очищали электрофорезом в агарозном геле и выделяли, в соответствии с рекомендациями производителя, с помощью Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, США). Итоговый фрагмент содержит ген устойчивости к хлорамфениколу (ген cat, кодирующий хлорамфениколацетилтрансферазу), фланкированный сайтами attL и attR фага лямбда, а также 36-звенные области фланговой гомологии с кодирующими областями целевого гена.

Интеграцию полученного линейного фрагмента ДНК в хромосому штамма Е.coli MG1655 осуществляли с использованием системы Red-зависимой гомологичной рекомбинации фага .

Для этого рекомбинантную ДНК вводили электротрансформацией в клетки штамма Е.coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645).

Электрокомпетентные клетки штамма Е.coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46, получали как описано выше. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ~300 нг индивидуального ПЦР-продукта. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим 30 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивали при 37°С для отбора Cm ^R-рекомбинантов. Удаление плазмиды-помощника pKD46 осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с селекцией устойчивых к хлорамфениколу и чувствительных к ампициллину Cm^RAp^S вариантов.

Факт соответствия предполагаемой и полученной экспериментально структур хромосом отобранных Cm^RAp^S колоний подтверждали ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р19 (SEQ ID NO: 41) и Р20 (SEQ ID NO: 42). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С.

Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655, составляла 946 п.н. для интактного гена iclR. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма, составляла 1781 п.н. для инактивированного гена iclR.

На основе отобранного Cm^R Ap^S варианта штамма с замененными геном cat геном iclR был получен препарат соответствующего P1-трансдуцирующего фага.

Штамм Е.coli с делегированными генами ackA-pta, poxB, ldhA, adhE и iclR получен переносом в хромосому штамма SGM1.0 (Е.coli MG1655 ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE) фрагмента хромосомы, с геном iclR, замененным геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием препарата трансдуцирующего фага, несущего целевую маркированную генетическую модификацию, как описано выше. Очистку полученных трансдуктантов от остаточных фаговых частиц осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с последующей селекцией устойчивых к хлорамфениколу Cm^R вариантов. В хромосомах клонов, формирующих наиболее быстрорастущие колонии правильной формы, подтверждали замену гена iclR геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р19 (SEQ ID NO: 41) и Р20 (SEQ ID NO: 42). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма SGM1.0, составляла 946 п.н. для интактного гена iclR. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток полученных трансдуктантов, составляла 1781 п.н. для гена iclR, замененного геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда. С целью удаления из хромосом трансдуктантов маркера устойчивости к антибиотику, отобранные клоны трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis (WO 2007013638; RU 2005123423). Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ген cat был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний штаммов на чашках с LB средой с селекцией чувствительных к хлорамфениколу и устойчивых к ампициллину Cm^SAp^R-вариантов. Удаление гена cat из хромосом трансдуктантов и делецию в них генов оперона ackA-pta, гена рохВ, гена ldhA, гена adhE и гена iclR подтверждали ПЦР с помощью соответствующих пар локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO: 31) и Р4 (SEQ ID NO: 32), P7 (SEQ ID NO: 33) и Р8 (SEQ ID NO: 34), P11 (SEQ ID NO: 35) и Р12 (SEQ ID NO: 36), PI 5 (SEQ ID NO: 37) и P16 (SEQ ID NO: 38), P19 (SEQ ID NO: 41) и Р20 (SEQ ID NO: 42). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток исходного штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ackA-pta, 1872 п.н. для интактного гена рохВ, 1299 п.н. для интактного гена ldhA, 2903 п.н. для интактного гена adhE и 946 п.н. для интактного гена iclR. Длина соответствующих продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток штамма с делегированными опероном ackA-pta, геном рохВ, геном ldhA, геном adhE и геном iclR составляла 323 п.н., 255 п.н., 411 п.н., 329 п.н. и 184 п.н.. В результате излечивания клонов от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, проведенного с помощью повторного рассева до отдельных колоний на чашках с LB средой и селекции Cm^SAp^S-вариантов, получен штамм Е.coli MG1655 ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE, iclR) с инактивированными генами ackA-pta, рохВ, IdhA, adhE и iclR, названный SGM1.1.

1.3. Конструирование штамма SGM2.0.

Штамм SGM2.0 (Е.coli MG1655 ackA-pta, рохВ, ldbA, adhE, P_L-aceEF-lpdA) получен на основе штамма SGM1.0 (Е.coli MG1655 ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE) в результате замены в нем нативной регуляторной области оперона aceEF-lpdA промотором P_L фага лямбда.

Первоначально целевая хромосомная модификации была получена индивидуально с использованием в качестве реципиента штамма E.coli MG1655. Для усиления экспрессии асеЕ, aceF и lpdA, составляющих оперон aceEF-lpdA, промотор P_L фага лямбда, соединенный с последовательностью Shine-Dalgamo (последовательность SD) гена aceF, являющейся более эффективной, нежели SD последовательность гена асеЕ, был интегрирован перед кодирующим участком гена aceE, расположенного первым в составе соответствующего оперона, в хромосому реципиентного штамма. На основе полученного штамма, несущего маркированную целевую хромосомную модификацию получен препарат соответствующего P1-трансдуцирующего фага. Далее P1-трансдукций полученная модификация была внесена в хромосому целевого рекомбинантного штамма. После трансдукции, из хромосомы полученного штамма осуществляли удаление маркера устойчивости к антибиотику, фланкированного аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием плазмиды pMWts-Int/Xis (WO 2007013638; RU 2005123423), включающей гены Int/Xis зависимой системы сайт-специфической рекомбинации фага лямбда.

Первоначально был получен фрагмент ДНК для замены нативной регуляторной области aceEF-lpdA оперона.

Получение вышеупомянутого искусственного фрагмента ДНК, для интеграции в соответствующий участок бактериальной хромосомы, осуществлялось в несколько стадий. На первой стадии, с помощью ПЦР получен фрагмент ДНК, содержащий в начале участок узнавания эндонуклеазы рестрикции BglII, промотор P_L, последовательность SD гена aceF и, наконец, 36 нуклеотидов комплементарных 5'-концу кодирующей области гена асеЕ. Фрагмент получали в два этапа. На первом этапе, с использованием в качестве матрицы геномной ДНК фага лямбда (последовательность с инвентарным номером NC_001416.1 в базе данных GenBank, gi: 9626243), получен фрагмент ДНК, содержащий в начале участок узнавания BglII, промотор P_L и последовательность SD гена aceF. ПЦР проводили с использованием праймеров Р21 (SEQ ID NO: 43) и Р22 (SEQ ID NO: 44). Праймер Р21 содержит участок узнавания BglII и область гомологичную 5'-концу промотора P_L . Праймер Р22 содержит последовательность SD гена aceF и область, комплементарную 3'-концу промотора P_L. Температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 51°С, 60 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Использовали Pfu ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва).

Полученный ПЦР-продукт, очищенный в агарозном геле и выделенный в соответствии с рекомендациями производителя с помощью Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit, был использован в качестве матрицы в следующем раунде ПЦР. Использовали праймеры Р21 (SEQ ID NO: 43) и Р23 (SEQ ID NO: 45). Праймер Р23 содержит область, комплементарную 3'-концу промотора P _L, последовательность SD гена aceF и 36 нуклеотидов из рамки считывания гена асеЕ. Температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 53°С, 60 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Использовали Pfu ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва).

Параллельно осуществляли вторую стадию конструирования фрагмента ДНК. Фрагмент ДНК, содержащий маркер Cm^R, кодируемый геном cat, получен при помощи ПЦР с использованием праймеров Р24 (SEQ ID NO: 46) и Р25 (SEQ ID NO: 47) и плазмиды pMW118-attL-Cm-attR (Каташкина Ж.И. и др., 2005 Направленное изменение уровня экспрессии генов в бактериальной хромосоме. Мол. Биол., 39 (5), 823-831) в качестве матрицы. Праймер Р24 содержит 36 нуклеотидов гомологичных участку ДНК предшествующему непосредственно кодирующей области гена асеЕ и участок ДНК размером 28 нуклеотидов, комплементарный участку ДНК, расположенному на 3'-конце области attR. Праймер Р25 содержит участок узнавания BglII и участок ДНК размером 28 нуклеотидов, гомологичный участку ДНК, расположенному на 5'-конце области attL. Температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 52°С, 1 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва).

Полученные фрагменты ДНК очищали в агарозном геле и выделяли, в соответствии с рекомендациями производителя, с помощью Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit, с последующим осаждением этанолом.

Два полученных фрагмента ДНК были обработаны эндонуклеазой рестрикции BglII с последующим лигированием с использованием Т4 ДНК-лигазы в соответствии со стандартной процедурой (Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning:A Laboratory Manual. 2^nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Продукт лигирования амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров Р23 (SEQ ID NO: 45) и Р24 (SEQ ID NO: 46). Температурный профиль для ПЦР: денатурация при 98°С в течение 1 мин; последующие 30 циклов: 15 сек при 98°С, 15 сек при 55°С, 1 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Использовали Phusion ДНК полимеразу и соответствующий буфер производства Finnzymes; дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Полученный ПЦР-продукт длиной 1970 п.н., очищали электрофорезом в агарозном геле и выделяли, в соответствии с рекомендациями производителя, с помощью Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, США). Итоговый фрагмент содержал промотор P_L, соединенный с последовательностью Shine-Dalgamo (последовательность SD) гена aceF, ген устойчивости к хлорамфениколу (ген cat, кодирующий хлорамфениколацетилтрансферазу), фланкированный сайтами attL и attR фага лямбда, а также 36-звенные области фланговой гомологии с участком ДНК предшествующем непосредственно кодирующей области гена асеЕ и 5'-регионом кодирующей области гена асеЕ.

Интеграцию полученного линейного фрагмента ДНК в хромосому штамма Е.coli MG1655 осуществляли с использованием системы Red-зависимой гомологичной рекомбинации фага .

Для этого рекомбинантную ДНК вводили электротрансформацией в клетки штамма Е.coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645).

Электрокомпетентные клетки штамма Е.coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46, получали как описано выше. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ~300 нг индивидуального ПНР-продукта. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим 30 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивали при 37°С для отбора Cm ^R-рекомбинантов. Удаление плазмиды-помощника pKD46 осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с селекцией устойчивых к хлорамфениколу и чувствительных к ампициллину Cm^RAp^S вариантов.

Факт соответствия предполагаемой и полученной экспериментально структур хромосомы соответствующих Cm^RAp^S колоний подтверждали ПЦР анализом с помощью пар локус-специфичных праймеров Р26 (SEQ ID NO: 48) и Р27 (SEQ ID NO: 49), P21 (SEQ ID NO: 43) и Р27 (SEQ ID NO: 49), P25 (SEQ ID NO: 47) и Р27 (SEQ ID NO: 49). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655 и праймеров Р26 и Р27 составляла 201 п.н. для интактной регуляторной области оперона aceEF-lpdA. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма и праймеров Р26 и Р27, составляла 2099 п.н. для модифицированной регуляторной области оперона aceEF-lpdA. При использовании пар праймеров Р21 и Р27, Р25 и Р27 и хромосомы родительского штамма в качестве матрицы специфические фрагменты не наблюдались среди продуктов ПЦР в силу отсутствия в хромосоме штамма Е.coli дикого типа attL и промотора P_L фага лямбда, соответственно. Длины продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма и пар праймеров Р21 и Р27, Р25 и Р27 составляли 377 п.н. и 491 п.н., соответственно. Также в хромосомах полученных клонов соответствие запланированной и экспериментально полученной нуклеотидной последовательности нового регуляторного элемента, введенного перед кодирующей областью гена асеЕ, было подтверждено секвенированием.

На основе отобранного Cm^RAp^S варианта штамма, в котором нативная регуляторная область оперона aceEF-lpdA заменена промотором P_L, соединенным с последовательностью SD гена aceF и сопряженным с геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, получен препарат соответствующего Р1-трансдуцирующего фага.

Штамм Е.coli с делегированными генами ackA-pta, poxB, ldhA, adhE и усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA получен переносом в хромосому штамма SGM1.0 (Е.coli MG1655 ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE) фрагмента хромосомы, в котором нативная регуляторная область оперона aceEF-lpdA заменена промотором P_L, соединенным с последовательностью SD гена aceF и сопряженным с геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием препарата трансдуцирующего фага, несущего целевую маркированную генетическую модификацию, как описано выше. Очистку полученных трансдуктантов от остаточных фаговых частиц осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с последующей селекцией устойчивых к хлорамфениколу Cm^R вариантов. В хромосомах клонов, формирующих наиболее быстрорастущие колонии правильной формы, замену нативной регуляторной области оперона aceEF-lpdA искусственным регуляторным элементом, сопряженным с геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, подтверждали ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р26 (SEQ ID NO: 48) и Р27 (SEQ ID NO: 49). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма SGM1.0, составляла 201 п.н. для интактной регуляторной области оперона aceEF-lpdA. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток полученных трансдуктантов, составляла 2099 п.н. для регуляторной области оперона aceEF-lpdA, замененной искусственным регуляторным элементом, сопряженным с геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда. С целью удаления из хромосом трансдуктантов маркера устойчивости к антибиотику, отобранные клоны трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis. Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ген cat был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний штаммов на чашках с LB средой с селекцией чувствительных к хлорамфениколу и устойчивых к ампициллину Cm^SAp ^R вариантов. Удаление гена cat из хромосом трансдуктантов и делецию в них генов оперона ackA-pta, гена poxB, гена ldhA и гена adhE, а также факт наличия искусственного регуляторного элемента перед генами оперона aceEF-lpdA, подтверждали ПЦР с помощью соответствующих пар локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO: 31) и Р4 (SEQ ID NO: 32), P7 (SEQ ID NO: 33) и Р8 (SEQ ID NO: 34), P11 (SEQ ID NO: 35) и Р12 (SEQ ID NO: 36), P15 (SEQ ID NO: 37) и Р16 (SEQ ID NO: 38), P26 (SEQ ID NO: 48) и Р27 (SEQ ID NO: 49). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток исходного штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ackA-pta, 1872 п.н. для интактного гена рохВ, 1299 п.н. для интактного гена IdhA, 2903 п.н. для интактного гена adhE и 201 п.н. для интактной регуляторной области оперона aceEF-lpdA. Длина соответствующих продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток штамма с делегированными опероном ackA-pta, геном рохВ, геном ldhA, геном adhE и содержащими искусственный регуляторный элемент перед генами оперона aceEF-lpdA составляла 323 п.н., 255 п.н., 411 п.н., 329 п.н. и 502 п.н.. В результате последующего излечивания клонов от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, проведенного с помощью повторного рассева до отдельных колоний на чашках с LB средой и селекции Cm^SAp^S -вариантов, получен целевой рекомбинантный штамм Е.coli MG1655 ( ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE, P_L-aceEF-lpdA) с инактивированными генами ackA-pta, poxB, ldhA, adhE и усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, названный SGM2.0.

1.4. Конструирование штамма SGM2.1.

Штамм SGM2.1 (Е.coli MG1655 ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE, P_L-aceEF-lpdA, iclR) получен на основе штамма SGM2.0 (Е.coli MG1655 ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE, P_L-aceEF-lpdA) в результате инактивации в нем гена iclR.

Штамм Е.coli с делегированными генами ackA-pta, poxB, ldhA, adhE, iclR и усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA получен переносом в хромосому штамма SGM2.0 (E.coli MG1655 ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE, P_L-aceEF-lpdA) фрагмента хромосомы, с геном iclR, замененным геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием препарата соответствующего трансдуцирующего фага, полученного ранее (Пример 1.2). P1-трансдукцию осуществляли, как описано выше. Очистку полученных трансдуктантов от остаточных фаговых частиц осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с последующей селекцией устойчивых к хлорамфениколу Cm^R вариантов. В хромосомах клонов, формирующих наиболее быстрорастущие колонии правильной формы, подтверждали замену гена iclR геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р19 (SEQ ID NO: 41) и Р20 (SEQ ID NO: 42). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма SGM2.0, составляла 946 п.н. для интактного гена iclR. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток полученных трансдуктантов, составляла 1781 п.н. для гена iclR, замененного геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда. С целью удаления из хромосом трансдуктантов маркера устойчивости к антибиотику, отобранные клоны трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis (WO 2007013638; RU 2005123423). Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ген cat был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний штаммов на чашках с LB средой с селекцией чувствительных к хлорамфениколу и устойчивых к ампициллину Cm^SAp^R вариантов. Удаление гена cat из хромосом трансдуктантов и делецию в них генов оперона ackA-pta, гена рохВ, гена ldhA, гена adhE и гена iclR, а также факт наличия искусственного регуляторного элемента перед генами оперона aceEF-lpdA, подтверждали ПЦР с помощью соответствующих пар локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO: 31) и Р4 (SEQ ID NO: 32), P7 (SEQ ID NO: 33) и Р8 (SEQ ID NO: 34), P11 (SEQ ID NO: 35) и Р12 (SEQ ID NO: 36), P15 (SEQ ID NO: 37) и P16 (SEQ ID NO: 38), P19 (SEQ ID NO: 41) и Р20 (SEQ ID NO: 42), P26 (SEQ ID NO: 48) и Р27 (SEQ ID NO: 49). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток исходного штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ackA-pta, 1872 п.н. для интактного гена poxB, 1299 п.н. для интактного гена ldhA, 2903 п.н. для интактного гена adhE, 946 п.н. для интактного гена iclR и 201 п.н. для интактной регуляторной области оперона aceEF-lpdA. Длина соответствующих продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток штамма с делегированными опероном ackA-pta, геном рохВ, геном ldhA, геном adhE и геном iclR, и содержащими искусственный регуляторный элемент перед генами оперона aceEF-lpdA составляла 323 п.н., 255 п.н., 411 п.н., 329 п.н., 184 п.н. и 502 п.н.. В результате излечивания клонов от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, проведенного с помощью повторного рассева до отдельных колоний на чашках с LB средой и селекции Cm^SAp^S-вариантов, получен штамм Е.coli MG1655 ( ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE, P_L-aceEF-lpdA, iclR) с инактивированными генами ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE и iclR, и усиленной экспрессией генов aceE, aceF и lpdA, названный SGM2.1.

1.5. Конструирование штамма SGM3.0.

Штамм SGM3.0 (E.coli MG1655 ackA-pta, poxB, ldhA, adhE, P_L-aceEF-lpdA, pflB) получен на основе штамма SGM2.0 (Е.coli MG1655 ackA-pta, poxB, ldhA, adhE, P_L-aceEF-lpdA) в результате инактивации в нем гена pflB.

Первоначально целевая хромосомная модификации была получена индивидуально с использованием в качестве реципиента штамма E.coli MG1655. На основе полученного штамма, несущего маркированную целевую хромосомную модификацию получен препарат соответствующего P1-трансдуцирующего фага. Далее P1-трансдукций полученная модификация была внесена в хромосому целевого рекомбинантного штамма. После трансдукции, из хромосомы полученного штамма осуществляли удаление маркера устойчивости к антибиотику, фланкированного аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием плазмиды pMWts-Int/Xis (WO 2007013638; RU 2005123423), включающей гены Int/Xis зависимой системы сайт-специфической рекомбинации фага лямбда.

Первоначально был получен фрагмент ДНК для инактивации гена pflB.

Линейный фрагмент ДНК для делеции целевого гена получен при помощи ПЦР с использованием праймеров Р28 (SEQ ID NO: 50) и Р29 (SEQ ID NO: 51) и плазмиды pMW118-attL-Cm-attR (Каташкина Ж.И. и др., 2005 Направленное изменение уровня экспрессии генов в бактериальной хромосоме. Мол. Биол., 39 (5), 823-831) в качестве матрицы.

Праймер Р28 содержит участок ДНК размером в 36 нуклеотидов, гомологичный участку ДНК, расположенному на 5'-конце гена pflB и участок ДНК размером 28 нуклеотидов, комплементарный участку ДНК, расположенному на 3'-конце области attR. Праймер Р29 содержит участок ДНК размером в 36 нуклеотидов, комплементарный участку ДНК, расположенному на 3'-конце гена pflB, а также участок ДНК размером 28 нуклеотидов, гомологичный участку ДНК, расположенному на 5'-конце области attL. Температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 52°С, 1 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва).

Полученный ПЦР-продукт длиной 1700 п.н. для инактивации гена pflB очищали электрофорезом в агарозном геле и выделяли, в соответствии с рекомендациями производителя, с помощью Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, США). Итоговый фрагмент содержал ген устойчивости к хлорамфениколу (ген cat, кодирующий хлорамфениколацетилтрансферазу), фланкированный сайтами attL и attR фага лямбда, а также 36-звенные области фланговой гомологии с кодирующими областями целевого гена.

Интеграцию полученного линейного фрагмента ДНК в хромосому штамма Е.coli MG1655 осуществляли с использованием системы Red-зависимой гомологичной рекомбинации фага .

Для этого рекомбинантную ДНК вводили электротрансформацией в клетки штамма Е.coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12): 6640-6645).

Электрокомпетентные клетки штамма Е.coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46, получали как описано выше. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ~300 нг индивидуального ПЦР-продукта. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим 30 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивали при 37°С для отбора Cm ^R-рекомбинантов. Удаление плазмиды-помощника pKD46 осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с селекцией устойчивых к хлорамфениколу и чувствительных к ампициллину Cm^RAp^S вариантов.

Факт соответствия предполагаемой и полученной экспериментально структур хромосом отобранных Cm^RAp^S колоний подтверждали ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р30 (SEQ ID NO: 52) и Р31 (SEQ ID NO: 53). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С.

Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655, составляла 2566 п.н. для интактного гена pflB. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма, составляла 1983 п.н. для инактивированного гена iclR.

На основе отобранного Cm^R Ap^S варианта штамма с замененными геном cat геном pflB получен препарат соответствующего P1-трансдуцирующего фага.

Штамм Е.coli с делегированными генами ackA-pta, poxB, ldhA, adhE, pflB и усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA получен переносом в хромосому штамма SGM2.0 (Е.coli MG1655 ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE, P_L-aceEF-lpdA) фрагмента хромосомы, с геном pflB, замененным геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием препарата трансдуцирующего фага, несущего целевую маркированную генетическую модификацию, как описано выше. Очистку полученных трансдуктантов от остаточных фаговых частиц осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с последующей селекцией устойчивых к хлорамфениколу Cm^R вариантов. В хромосомах клонов, формирующих наиболее быстрорастущие колонии правильной формы, подтверждали замену гена pflB геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р30 (SEQ ID NO: 52) и Р31 (SEQ ID NO: 53). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма SGM2.0, составляла 2566 п.н. для интактного гена pflB. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток полученных трансдуктантов, составляла 1983 п.н. для гена pflB, замененного геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда. С целью удаления из хромосом трансдуктантов маркера устойчивости к антибиотику, отобранные клоны трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis (WO 2007013638; RU 2005123423). Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ген cat был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний штаммов на чашках с LB средой с селекцией чувствительных к хлорамфениколу и устойчивых к ампициллину Cm^SAp^R вариантов. Удаление гена cat из хромосом трансдуктантов и делецию в них генов оперона ackA-pta, гена рохВ, гена ldhA, гена adhE и гена pflB, а также факт наличия искусственного регуляторного элемента перед генами оперона aceEF-lpdA, подтверждали ПЦР с помощью соответствующих пар локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO: 31) и Р4 (SEQ ID NO: 32), P7 (SEQ ID NO: 33) и Р8 (SEQ ID NO: 34), P11 (SEQ ID NO: 35) и Р12 (SEQ ID NO: 36), P15 (SEQ ID NO: 37) и Р16 (SEQ ID NO: 38), P30 (SEQ ID NO: 52) и Р31 (SEQ ID NO: 53), P26 (SEQ ID NO: 48) и Р27 (SEQ ID NO: 49). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток исходного штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ackA-pta, 1872 п.н. для интактного гена рохВ, 1299 п.н. для интактного гена ldhA, 2903 п.н. для интактного гена adhE, 2566 п.н. для интактного гена pflB и 201 п.н. для интактной регуляторной области оперона aceEF-lpdA. Длина соответствующих продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток штамма с делегированными опероном ackA-pta, геном рохВ, геном ldhA, геном adhE и геном pflB, и содержащими искусственный регуляторный элемент перед генами оперона aceEF-lpdA составляла 323 п.н., 255 п.н., 411 п.н., 329 п.н., 386 п.н. и 502 п.н.. В результате излечивания клонов от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, проведенного с помощью повторного рассева до отдельных колоний на чашках с LB средой и селекции Cm^SAp^S-вариантов, получен штамм Е.coli MG1655 ( ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE, P_L-aceEF-lpdA, pflB) с инактивированными генами ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE и pflB, и усиленной экспрессией генов aceE, aceF и lpdA, названный SGM3.0.

1.6. Конструирование штамма SGM3.1.

Штамм SGM3.1 (E.coli MG1655 ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE, P_L-aceEF-lpdA, pflB, iclR) получен на основе штамма SGM3.0 (Е.coli MG1655 ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE, P_L-aceEF-lpdA, pflB) в результате инактивации в нем гена iclR.

Штамм Е.coli с делегированными генами ackA-pta, poxB, ldhA, adhE, pflB, iclR и усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA получен переносом в хромосому штамма SGM3.0 (Е.coli MG1655 ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE, P_L-aceEF-lpdA, pflB) фрагмента хромосомы, с геном iclR, замененным геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием препарата соответствующего трансдуцирующего фага, полученного ранее (Пример 1.2). P1-трансдукцию осуществляли, как описано выше. Очистку полученных трансдуктантов от остаточных фаговых частиц осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с последующей селекцией устойчивых к хлорамфениколу Cm^R вариантов. В хромосомах клонов, формирующих наиболее быстрорастущие колонии правильной формы, подтверждали замену гена iclR геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р19 (SEQ ID NO: 41) и Р20 (SEQ ID NO: 42). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма SGM2.0, составляла 946 п.н. для интактного гена iclR. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток полученных трансдуктантов, составляла 1781 п.н. для гена iclR, замененного геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда. С целью удаления из хромосом трансдуктантов маркера устойчивости к антибиотику, отобранные клоны трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis (WO 2007013638; RU 2005123423). Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ген cat был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний штаммов на чашках с LB средой с селекцией чувствительных к хлорамфениколу и устойчивых к ампициллину Cm^SAp^R вариантов. Удаление гена cat из хромосом трансдуктантов и делецию в них генов оперона ackA-pta, гена poxB, гена ldhA, гена adhE, гена pflB и гена iclR, а также факт наличия искусственного регуляторного элемента перед генами оперона aceEF-lpdA, подтверждали ПЦР с помощью соответствующих пар локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO: 31) и Р4 (SEQ ID NO: 32), P7 (SEQ ID NO: 33) и Р8 (SEQ ID NO: 34), P11 (SEQ ID NO: 35) и Р12 (SEQ ID NO: 36), P15 (SEQ ID NO: 37) и Р16 (SEQ ID NO: 38), P30 (SEQ ID NO: 52) и Р31 (SEQ ID NO: 53), P19 (SEQ ID NO: 41) и Р20 (SEQ ID NO: 42), P26 (SEQ ID NO: 48) и Р27 (SEQ ID NO: 49). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток исходного штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ackA-pta, 1872 п.н. для интактного гена рохВ, 1299 п.н. для интактного гена IdhA, 2903 п.н. для интактного гена adhE, 2566 п.н. для интактного гена pflB, 946 п.н. для интактного гена iclR и 201 п.н. для интактной регуляторной области оперона aceEF-lpdA. Длина соответствующих продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток штамма с делегированными опероном ackA-pta, геном рохВ, геном ldhA, геном adhE, геном pflB и геном iclR, и содержащими искусственный регуляторный элемент перед генами оперона aceEF-lpdA составляла 323 п.н., 255 п.н., 411 п.н., 329 п.н., 386 п.н., 184 п.н. и 502 п.н.. В результате излечивания клонов от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, проведенного с помощью повторного рассева до отдельных колоний на чашках с LB средой и селекции Cm^SAp^S-вариантов, получен штамм Е.coli MG1655 ( ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE, P_L-aceEF-lpdA, pflB, iclR) с инактивированными генами ackA-pta, рохВ, ldhA, adhE, pflB и iclR, и усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, названный SGM3.1.

1.7. Получение штаммов SGM1.0 [pPYC], SGM1.1 [pPYC], SGM2.0 [pPYC], SGM2.1 [pPYC], SGM3.0 [pPYC], SGM3.1 [pPYC].

Рекомбинантные штаммы бактерий Escherichia coli SGM1.0 [pPYC], SGM1.1 [pPYC], SGM2.0 [pPYC], SGM2.1 [pPYC], SGM3.0 [pPYC], SGM3.1 [pPYC] - продуценты янтарной кислоты - получены в результате трансформации штаммов SGM1.0, SGM1.1, SGM2.0, SGM2.1, SGM3.0, SGM3.1 плазмидой pPYC, содержащей ген русА, кодирующий функционально активную пируваткарбоксилазу из Bacillus subtilis (RU 2010146281), по стандартной методике (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Пример 2. Продукция янтарной кислоты сконструированными рекомбинантными штаммами бактерий Escherichia coli.

Клетки штамма SGM1.0 [pPYC] или SGM1.1 [pPYC] или SGM2.0 [pPYC] или SGM2.1 [pPYC] или SGM3.0 [pPYC] или SGM3.1 [pPYC] выращивают в течение ночи в среде М9 (Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), содержащей 2 г/л глюкозы, при 37°С. По 5 мл полученных ночных культур разбавляют в 10 раз, добавляют 45 мл среды М9, содержащей 5 г/л дрожжевого экстракта и 10 г/л глюкозы. Полученные культуры выращивают в колбах объемом 750 мл закрытых ватными пробками при 37°С на роторной качалке при 250 об/мин в течение 6 часов. Полученные клеточные суспензии центрифугируют в течение 15 минут при 4000 об/мин при 4°С. Осадки ресуспендируют в 15 мл богатой комплексной среды, основанной на среде М9 и содержащей 5 г/л дрожжевого экстракта, 4,5 г/л глюкозы и 4,5 г/л NaHCO₃. Затем проводят инкубацию полученных клеточных культур в течение 24 часов в пробирках объемом 15 мл закрытых невентилируемыми пробками при 37°С на роторной качалке при 250 об/мин. Для поддержания плазмиды pPYC все среды содержали дополнительно 100 мг/л ампициллина. Концентрации органических кислот и остаточной глюкозы в культуральной жидкости, освобожденной от биомассы центрифугированием, определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием системы Waters HPLC system (Waters, Milford, MA, USA). Для измерения концентраций органических кислот используют обращенно-фазовую колонку ReproSil-Pur C18-AQ (4×250 mm, 5 µm, Dr. Maisch, Ammerbuch, Germany). Детекцию осуществляют при длине волны 210 нм. В качестве подвижной фазы используют водный раствор фосфорной кислоты (100 мМ) с ацетонитрилом и метанолом (каждый в объемной концентрации 0,5%) со скоростью потока 1 мл/мин. Для измерения концентрации глюкозы, система Waters HPLC system укомплектована рефрактивным детектором Waters 2414 и колонкой Spherisorb-NH2 (4.6×250 mm, 5 µm, Waters, USA). В качестве подвижной фазы используют смесь ацетонитрил/этилацетат/вода (объемное соотношение 76/4/20) со скоростью потока 1 мл/мин. Вещества идентифицируют при сравнении времени их удерживания с временем удерживания соответствующих стандартов.

Концентрацию этанола в в культуральной жидкости определяют методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектором на колонке OmegaWax (30 м, 0,25 мм в.д., 0,25 мкм толщина пленки) ("Supeico", США). Используют хроматограф GC-17A "Shimadzu" (Япония), оснащенный автосамплером АОС-201. В качестве газа носителя используют гелий с постоянной скоростью потока 1,5 мл/мин. Температура термостата колонки - 4 минуты 40°С с последующим подъемом до 200°С со скоростью 30°С /мин, выдержкой 1 мин и возвратом к начальной температуре. Температура инжектора =150°С. Температура детектора =240°С.

Молярные концентрации потребленной штаммами глюкозы, накопленных метаболитов и молярные выходы янтарной кислоты в результате соответствующих пробирочных ферментации представлены в Таблице 1.

С целью исключить влияние компонентов богатой комплексной среды (аминокислот и отличных от глюкозы карбогидратов) на продукцию янтарной кислоты сконструированными рекомбинантными штаммами, стадию синтеза целевого вещества накопленной биомассой штаммов SGM1.0 [pPYC] или SGM1.1 [pPYC] или SGM2.0 [pPYC] или SGM2.1 [pPYC] или SGM3.0 [pPYC] или SGM3.1 [pPYC] осуществляют в минимальной солевой среде М9.

Ферментацию проводят как описано выше, за исключение того, что среда, используемая на финальной стадии, является минимальной солевой средой М9, содержащей, 4,5 т/л глюкозы и 4,5 г/л NaHCO ₃. Концентрации органических кислот, этанола и остаточной глюкозы в культуральных жидкостях, освобожденных от клеточной массы центрифугированием, определяют как описано ранее.

Молярные концентрации потребленной штаммами глюкозы, накопленных метаболитов и молярные выходы янтарной кислоты в результате соответствующих пробирочных ферментации представлены в Таблице 2.

Таким образом, коэффициенты конверсии глюкозы в янтарную кислоту демонстрируемые заявляемыми рекомбинантными штаммами бактерий Escherichia coli SGM1.0 [pPYC], SGM1.1 [pPYC], SGM2.0 [pPYC], SGM2.1 [pPYC], SGM3.0 [pPYC], SGM3.1 [pPYC] при реализации анаэробной продуктивной фазы в богатой комплексной среде соответствуют аналогичным показателям штамма - ближайшего аналога и составляют 1,3-1,59 моль/моль, а при реализации продуктивной фазы в минимальной солевой среде превосходят аналогичные показатели штамма - ближайшего аналога (1,3 моль/моль) и составляют 1,31-1,66 моль/моль.

Дизайн заявляемых рекомбинантных штаммов, обеспечивает возможность реализации одного из трех возможных вариантов окислительно-восстановительно сбалансированного биосинтеза янтарной кислоты из глюкозы:

- при формировании Ацетил-CoA под действием пируватформатлиазы,

- при формировании Ацетил-CoA при совместном действии пируватформатлиазы и пируватдегидрогеназы, и

- при формировании Ацетил-CoA исключительно под действием пируватдегидрогеназы.

Заявляемые рекомбинантные штаммы сконструированы с учетом того, что в клетках Е.coli конверсия пировиноградной кислоты в Ацетил-CoA в анаэробных условиях происходит под действием пируватформатлиазы, в то время как активность пируватдегидрогеназы в условиях анаэробиоза отсутствует и экспрессия генов пируватдегидрогеназного комплекса репрессирована.

Максимально теоретически возможный коэффициент конверсии глюкозы в янтарную кислоту как для штамма Escherichia coli SGM1.0 [pPYC], так и для штамма SGM1.1 [pPYC], формирующих Ацетил-CoA под действием конститутивно активной в условиях анаэробиоза пируватформатлиазы, составляет 1,60 моль/моль.

Максимально теоретически возможный коэффициент конверсии глюкозы в янтарную кислоту как для штамма Escherichia coli SGM2.0 [pPYC], так и для штамма SGM2.1 [pPYC], формирующих Ацетил-CoA при совместном действии пируватформатлиазы и пируватдегидрогеназы, за счет усиления экспрессии генов асеЕ, aceF и lpdA, кодирующих компоненты пируватдегидрогеназного комплекса, составляет 1,66 моль/моль.

Максимально теоретически возможный коэффициент конверсии глюкозы в янтарную кислоту как для штамма Escherichia coli SGM3.0 [pPYC], так и для штамма SGM3.1 [pPYC], формирующих Ацетил-CoA исключительно под действием пируватдегидрогеназы, в результате инактивации гена pflB, кодирующего пируватформатлиазу, и за счет усиления экспрессии генов асеЕ, aceF и lpdA, кодирующих компоненты пируватдегидрогеназного комплекса, составляет 1,7.1 моль/моль.

Заявляемые штаммы не только превосходят штамм - ближайший аналог по уровню конверсии в минимальной среде при культивировании их в соответствии с заявляемым способом, но и обладают реальными перспективами увеличения этого коэффициента и приближения к теоретически ожидаемому значению при усовершенствовании способа и создании оптимальных условий для продуктивной фазы.

Таблица 1
Штамм	Потребленная глюкоза	Уксусная кислота	Этанол	Янтарная кислота	Молярный выход янтарной кислоты
	мМ	мМ	мМ	мМ	%
SGM1.0 [pPYC]	25,0	6,8±0,5	3,3±0,3	32,6±0,4	130,6±1,5
SGM1.1 [pPYC]	25,0	6,3±0,5	2,9±0,3	32,9±0,5	131,6±2,0
SGM2.0 [pPYC]	25,0	3,2±0,3	2,0±0,2	34,7±0,5	139,0±2,1
SGM2.1 [pPYC]	25,0	2,5±0,3	1,5±0,2	36,4±0,3	145,8±1,4
SGM3.0 [pPYC]	25,0	1,7±0,2	2,0±0,2	36,8±0,4	147,5±1,7
SGM3.1 [pPYC]	25,0	1,7±0,2	1,7±0,2	39,8±0,4	159,4±1,9

Таблица 2
Штамм	Потребленная глюкоза	Уксусная кислота	Этанол	Янтарная кислота	Молярный выход янтарной кислоты
	мМ	мМ	мМ	мМ	%
SGM 1.0 [pPYC]	25,0	6,8±0,5	1,7±0,2	32,8±0,5	131,2±1,8
SGM1.1 [pPYC]	25,0	6,5±0,5	1,5±0,2	33,0±0,6	132,3+2,4
SGM2.0 [pPYC]	25,0	4,7±0,5	1,3+0,2	35,6±0,3	142,4±1,4
SGM2.1 [pPYC]	25,0	3,8±0,3	1,1+0,2	37,3+0,5	149,2±1,9
SGM3.0 [pPYC]	25,0	3,0+0,3	1,3+0,2	36,4+0,3	145,8±1,2
SGM3.1 [pPYC]	25,0	1,7±0,2	1,1±0,2	41,5±0,5	166,2±2,1