способ прогнозирования развития гематогенных метастазов после комбинированного лечения рака почки

Формула изобретения

Способ прогнозирования развития гематогенных метастазов после комбинированного лечения при раке почки путем исследования пациента, отличающееся тем, что в ткани опухоли определяют тотальную активность протеасом, экспрессию NF-kB р50, HIF-1 содержание сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF и рассчитывают дискриминантные функции Y1, Y2 по уравнениям:

Y1=-3,2+0,026·Х1+0,03·Х2-0,02·Х3+0,34·Х4+0,3·Х5

Y2=-33,3-0,01·Х1+0,11·Х2-1,2·Х3+1,57·Х4+1,8·Х5,

где X1 - тотальная активность протеасом ·10^-3 МЕ/мг белка;

Х2 - содержание VEGF, пг/мг белка;

Х3 - экспрессия HIF-1 , УЕ/мг белка в лунке;

Х4 - экспрессия NF- В р50, УЕ/мг белка в лунке;

Х5 - коэффициент NF- В р65/50;

и при Y1>Y2 прогнозируют отсутствие, а при Y1<Y2 прогнозируют развитие гематогенных метастазов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, может быть использовано для определения прогрессирования заболевания в виде появления гематогенных метастазов у больных раком почки после проведения комбинированного лечения.

Заболеваемость раком почки в настоящее время неуклонно растет, что связано как с улучшением диагностики новообразований данного органа, так и с ростом истинной заболеваемости [6]. Ежегодно в мире регистрируется около 230 тыс. новых случаев рака почки (РП) и более 100 тыс. смертей от этого заболевания. В России заболеваемость данным видом опухоли возросла с 1998 по 2008 г. с 9,0 до 12,2 на 100 тыс. населения. Заболевание характеризуется отсутствием ранних симптомов, поздней клинической манифестацией и резистентностью к лучевой и химиотерапии. Основной причиной летальности при РП являются отдаленные метастазы.

По данным патентных источников выявлено, что отношение свободных 17-ОКС к их сумме в суточной моче позволяет прогнозировать наличие метастазов и рецидивов при раке почки [патент РФ № 2064179, опубл. 20.07.1996]. В исследованной научно-медицинской литературе выявлена роль транскрипционного фактора HIF, а также ростового фактора bFGF и его рецептора, плацентарного фактора роста и тромбоспондина в качестве прогностического при развитии светлоклеточной почечноклеточной карциномы. Однако эти факты носят предварительный характер и они не подтверждены в патентных источниках.

Наиболее близким к заявляемому является способ прогнозирования течения заболевания у больных раком почки, предложенный Баклановой О.В. (Патент РФ № 2373864, опубл. 27.11.2009), в котором для прогнозирования течения заболевания у больных раком почки, осложненного венозной инвазией, где учитываются объем оперативного вмешательства, наличие отдаленных метастазов и инвазии опухоли, определяют размер тромба и концентрацию фибриногена в сыворотке крови. Способ обеспечивает возможность прогноза ожидаемой продолжительности жизни больных в месяцах путем определения показателей стандартного обследования больного и с учетом проведенного хирургического лечения.

Недостатками данного способа являются:

отсутствие в данном способе чувствительности и специфичности данного способа, что не позволяет оценить ее практическую значимость и эффективность ее применения;

- также не учитывается биологическое поведение самой опухоли, что может оказывать выраженное влияние на прогноз заболевания

- способ не позволяет провести оценку риска развития гематогенных метастазов при раке почки.

Новая техническая задача - повышение точности и информативности способа. Для решения поставленной задачи в способе прогнозирования развития гематогенных метастазов после комбинированного лечения при раке почки путем исследования биологически активных молекул в ткани опухоли определяют тотальную активность протеасом, экспрессию NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В cells - ядерный транскрипционный фактор kB) р50, HIF-1 (hypoxia inducible transcription factor), содержание сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и рассчитывают дискриминантные функции Y1, Y2 по уравнениям: Y1=-3,2+0,026·Х1+0,03·Х2-0,02·Х3+0,34·Х4+0,3-Х5 (отсутствие гематогенных метастазов)

Y2=-33,3-0,01·Х1+0,11·Х2-1,2·Х3+1,57·Х4+1,8·Х5 (наличие гематогенных метастазов),

где X1 - тотальная активность протеасом - 10-3 МЕ/мг белка;

Х2 - содержание VEGF, пг/мг белка;

Х3 - экспрессия HIF-1, УЕ/мг белка в лунке;

Х4 - экспрессия NF-kВ p50, УЕ/мг белка в лунке;

Х5 - коэффициент NF-kВ p65/50

и при Y1>Y2 прогнозируют отсутствие, а при Y1<Y2, развитие гематогенных метастазов

Данные существенные признаки не выявлены из научно-медицинской литературы. Они явным образом не следуют из уровня техники для специалистов. Способ апробирован на базе клиник НИИ онкологии СО РАМН. Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям «новизна», «изобретательский уровень», «промышленно применимо».

Способ осуществляют следующим образом.

Для прогнозирования развития гематогенных метастазов рака почки проводят флуорометрическое определение тотальной активности протеасом, активности 20S протеасом, а также иммуноферментное определение экспрессии NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В cells - ядерный транскрипционный фактор kB) p50, HIF-l (hypoxia inducible transcription factor) в опухолевой ткани. Для этого из операционного материала берут образцы опухолевой ткани в течение 2-3 часов после операции, очищают от участков некроза, кровоизлияний и помещают в жидкий азот. Образцы тканей до определения активности ферментов хранят при температуре -70°C и размораживают не более 1 раза для исследования активности и содержания маркеров. Перед определением активности исследуемых ферментов замороженную опухолевую ткань гомогенизируют до порошкообразного состояния в жидком азоте. 20S протеасомы выделяют методом высаливания с помощью сульфата аммония до 70% насыщения [1]. Химотрипсинподобную активность 26S протеасом, осуществляющейся химотрипсинподобными центрами протеасом, оценивают по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC (Sigma, США) [4]. Образовавшийся продукт регистрируют на флуориметре «Hitachi-850» (Япония) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм. Для оценки активности примесных протеаз в образцах применяют специфический ингибитор протеасом - MG132. За единицу активности протеасом принимают количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль Suc-LLVY-AMC в течение 1 мин. Удельную активность протеасом выражают в единицах активности на 1 мг белка. Содержание белка определяют по методу Лоури.

Приготовление ядерных экстрактов для определения NF-kB (p50 и p65 форм), HIF-la проводят в соответствии с рекомендациями фирмы производителя Caymanchem (США). Замороженную ткань (100 мг) гомогенизируют в жидком азоте, затем ресуспендируют. Гомогенат центрифугируют при 2400g и 4°C для получения осадка, который ресуспендируют в 50 мкл 50 mM Трис-HCl буфера (pH 7,5) и затем центрифугируют при 14000g и 4°C. Полученный супернатант используют для определения экспрессии транскрипционных факторов. Экспрессию форм NF-kB p50, p65 и HIF-1 определяют в ядерных экстрактах иммуноферментным методом. Результаты определения содержания транскрипционных факторов выражают в условных единицах на мг белка в лунке.

Такой подход к прогнозированию риска возникновения гематогенных метастазов ПКГШ обусловлен рядом предпосылок:

Одним из патогенетических механизмов, лежащих в основе развития и прогрессирования рака почки, является особенность неопластической трансформации при РП, связанные с мутацией гена VHL (von Hippel-Lindau), которая приводит к повышенной экспрессии внутриклеточного фактора транскрипции HIF (hypoxia inducible factor) за счет его неспособности утилизироваться в протеасомном комплекса [11,7]. Фактор транскрипции HIF активируется в условиях гипоксии, связан с ангиогенезом и приводит к усилению основного обмена, энергетического обмена и увеличению экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) [8]. Прогрессирование светлоклеточного рака почки тесно связано с активацией процессов неоангиогенеза, что влечет развитие гематогенных метастазов [3,2].

Протеасомы способны активировать NF-kB за счет быстрой деградации его собственного ингибитора IкВ, что способствует выработке p105 - предшественника p50 субъединицы NF-kB [5,10]. Известно, что посттрансляционная модификация p105 - предшественника NF-kB p50 осуществляется с помощью 20S протеасом без процесса убиквитинирования [9].

Информативность отобранных критериев обоснована наличием связи экспрессии NF-кВ p50, HIF-1 и VEGF с возникновением гематогенных метастазов рака почки, полученное при исследовании 65 больных почечноклеточным раком, наблюдавшихся в отделении общей онкологии ФГБУ НИИ онкологии СО РАМН с 2006 по 2012 год. Средний возраст больных был равен 58,0±1,4 лет. Мужчины составляли 58% (38 человек), женщины - 42% (27 человек). Объемы диагностики и лечения больных раком почки соответствовали рекомендуемым алгоритмам объемов диагностики и лечения злокачественных новообразований, утвержденным министерством здравоохранения и социального развития РФ. Проведение данной работы одобрено этическим комитетом ФГБУ НИИ онкологии СО РАМН.

Опухолевая ткань забиралась из операционного материала не позднее чем через 2-3 часа после операции, замораживалась в жидком азоте. Затем в опухолевой ткани определялась активность 26S протеасом, экспрессия NF-kВ p50 и HIF-1 . Оценку качества полученных функций проводили на 10 пациентах, не включенных в основную выборку. Чувствительность и специфичность полученной дискриминантной модели составила соответственно 96% и 90%, диагностическая точность - 93%.

В Таблице 1 представлены показатели, включенные в модель оценки риска развития гематогенных метастазов при раке почки. Примечание: Wilks Lambda -величина, отвечающая за выполнение условий о правомерности включения показателя в модель и значимости различий значений дискриминантной функции в группах, что является необходимым условием при создании модели; Toler. (толерантность) - величина, отражающая информативность переменной, которая является необходимым условием для включения переменной в модель; p-level - уровень значимости.

Показатели специфичности и прогностической значимости положительного результата (риска развития метастазов) свидетельствуют о высокой информативности заявляемого способа, который предполагает большее число возможных случаев гематогенного метастазирования, чем реально выявлено на момент клинического обследования. Выделение группы больных раком почки, характеризующихся высоким риском гематогенного метастазирования позволяет определить адекватные сроки динамического наблюдения (более частое посещение врача-онколога) и в случае прогрессирования заболевания принять своевременные лечебные меры.

Чувствительность и специфичность полученной дискриминантной модели составила соответственно 96% и 70%, диагностическая точность - 88,9%.

Пример 1. Больной С., 70 лет, обратился в НИИ онкологии СО РАМН г. Томска, где по результатам комплексного обследования у него был диагностирован рак почки, стадия T ₃N₀M₀.

После проведения комбинированного лечения выявлено прогрессирование заболевания, было проведено исследование согласно предлагаемому способу. Для этого из операционного материала брали образцы опухолевой ткани в течение 2-3 часов после операции, определяли следующие показатели: тотальную активность протеасом, активность 20S протеасом, а также проводили иммуноферментное определение экспрессии NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В cells - ядерный транскрипционный фактор kB) р50, HIF-1 (hypoxia inducible transcription factor).

Тотальная активность протеасом составила 36,1·1000 Ед/мг белка; содержание VEGF была равна 82,2 пг/мг белка; экспрессия HIF-1 - 4,3 УЕ/мг белка в лунке; экспрессия NF- В р50 - 2,2 УЕ/мг белка в лунке; коэффициент NF- В р65/р50 составил 2,1. Вычисление дискриминантных функций с использованием биохимических и клинико-морфологических показателей (Y₁=1,49; что больше чем Y₂=-22,5). Данный клинический случай был классифицирован как минимальным риск развития гематогенного метастазирования, что в дальнейшем подтвердилось результатами клинических наблюдений. При динамическом наблюдении в течение 20 месяцев с момента диагностирования опухоли не было выявлено прогрессирования заболевания.

Пример 2. Больной П., 52 лет, обратился в НИИ онкологии СО РАМН г. Томска, где по результатам комплексного обследования у него рак почки, стадия T₃N₀M₀.

После проведения комбинированного лечения выявлено прогрессирование заболевания, было проведено исследование согласно предлагаемому способу. Для этого из операционного материала брали образцы опухолевой ткани в течение 2-3 часов после операции, определяли следующие показатели: тотальную активность протеасом, активность 20S протеасом, а также проводили иммуноферментное определение экспрессии NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В cells - ядерный транскрипционный фактор kB) р50, HIF-1 (hypoxia inducible transcription factor).

Тотальная активность протеасом составила 52,2·1000 Ед/мг белка; содержание VEGF была равна 261,5 пг/мг белка; экспрессия HIF-1 - 6,2 УЕ/мг белка в лунке; экспрессия NF- В р50 - 29,2 УЕ/мг белка в лунке; коэффициент NF- В р65/р50 составил 0,24. Вычисление дискриминантных функций с использованием биохимических и клинико-морфологических показателей классифицировало данный клинический случай как сопряженный с риском развития гематогенного метастазирования (Y₁ =22; что меньше чем Y₂=47,2). При динамическом наблюдении через 25 месяцев с момента диагностирования опухоли были выявлены гематогенные метастазы. Период динамического наблюдения за больным составил 32 месяца.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет с высокой точностью и информативностью прогнозировать прогрессирование заболевание и делает возможным наиболее своевременное назначение наиболее адекватных лечебных мероприятий.

Источники информации

1. Абрамова Е.Б., Астахова Т.М., Ерохов П.А., Шарова Н.П. Множественность форм протеасомы и некоторые подходы к их разделению // Изв. РАН Сер.биол. - 2006. - № 2. - С.150-156.

2. Регуляция ангиогенеза при злокачественных новообразованиях почки и мочевого пузыря / Спирина Л.В., Кондакова И.В., Усынин Е.А., Винтизенко С.И. // Сибирский онкологический журнал. - 2008. - № 4. - С.65-70.

3. Фактор роста эндотелия сосудов и его рецептор 2-го типа в опухолях и сыворотке крови больных раком почки / Кушлинский Н.Е., Трапезникова М.Ф., Герштейн Е.С., Глыбин П.А., Казанцева И.А., Кылычбеков М.Б. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - № 6. - С.691-694.

4. Ben-Shahar S., Komlosh A., Nadav Е. et al. 26 S proteasome-mediated production of an authentic major histocompatibility class I-restricted epitope from an intact protein substrate // The J of Biol. Chem. - 1999. - Vol.274. - No.31. - P.21963-21972.

5. Goldberg A.L. Functions of the proteasome: from protein degradation and immune surveillance to cancer therapy // Biochemical Society, Transactions - 2007 - Vol.35. - P.12-17.

6. Jonasch E. Presurgical therapy in metastatic renal cell carcinoma // Expert. Rev.

Anticancer Ther. - 2007. - Vol. 7 (1). - P.73-78.

7. Kaelin W.G. Jr. The von Hippel-Lindau tummor supressor gene and kidney cancer / W.G. Jr. Kaelin // Clin. Cancer Res. - 2004. - Vol.10(18 Pt 2). - P. 6290 - 6295.

8. mAKAP compartmentalizes oxygen-dependent control of HIF-lalpha. /Wong W., Goehring A.S., Kapiloff M.S., Langeberg L.K., Scott J.D. // Sci Signal. - 2008. - Vol.1 (51). - P.1-18.

9. Moorthy A.K., Savinova O.V., Ho J.Q., Wang V.Y., Vu D., Ghosh G. The 20S proteasome processes NF-kappaBl pl05 into p50 in a translation-independent manner. // EMBO J. - 2006. - Vol.25(9). - P.1945-56.

10. Shah S.A., Potter M.W., McDade T.P., Ricciardi R., Perugini R.A., Elliot P.J., Adams J., Gallery M.P. 26S proteasome inhibition induces apoptosis and limits growth of human pancreatic cancer. // J. Cell Biochem. - 2001. - Vol. 82(1). - P.110-122.

11. Understanding familial and non-familial renal cell cancer / D. Bodmer, W. van den Hirk, J.J. van Groningen et al. // Hum. Mol. Genet. - 2002. - Vol. 11. - P.2489-2498.

Таблица 1
показатели	Wilks Lambda	Toler.	p-level
Тотальная активность протеасом	0,26	0,57	0,05
Содержание VEGF	0,29	0,41	0,009
Экспрессия HIF-1	0,30	0,42	0,005
Экспрессия NF-kВ p50	0,53	0,46	0,00001
Коэффициент NF-kB p65/50	0,35	0,46	0,0008
Wilks Lambda: 0,22; p<0,0001