способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных вариантов waxy-генов пшеницы
Классы МПК: | C12N15/05 клетки растений C12Q1/68 использующие нуклеиновые кислоты |
Автор(ы): | Абдулина Индира Рамильевна (RU), Вафин Рамиль Ришадович (RU), Ржанова Ирина Владимировна (RU), Гараева Айсылу Линатовна (RU), Тюлькин Сергей Владимирович (RU), Асхадуллин Данил Фидусович (RU), Асхадуллин Дамир Фидусович (RU), Василова Нурания Зуфаровна (RU), Зайнуллин Ленар Ильгизарович (RU), Алимова Фарида Кашифовна (RU) |
Патентообладатель(и): | Вафин Рамиль Ришадович (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2013-01-29 публикация патента:
20.09.2014 |
Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ проведения ПЦР для эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы. Способ отличается от известных из уровня техники использованием прямого праймера 4F-c: 5'-CCCCCAAGAGCAACTACCAGT-3'. Также описан способ ПЦР-ПДРФ для эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы. Способ отличается от известных из уровня техники тем, что после этапа ПЦР проводят процедуру ПДРФ-анализа с эндонуклеазным расщеплением ампликонов рестриктазой AcsI. Цель изобретения - разработка способов проведения ПЦР и ПЦР-ПДРФ для эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл.
Формула изобретения
1. Способ проведения ПЦР для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, включающий пробоподготовку ДНК пшеницы, внесение выделенной пробы ДНК в реакционную смесь для ПЦР, состоящую из деионизированной воды, дНТФ, буферной системы, Taq ДНК полимеразы, праймеров, проведение ПЦР, гель-электрофорезную детекцию, отличающийся тем, что используется прямой праймер 4F-c: 5/-CCCCCAAGAGCAACTACCAGT-3 //(SEQ ID NO: 1) со следующей интерпретацией генерируемых или отсутствующих ПЦР-продуктов:
наличие 262 (266) bp=Wx-Ala (Wx-Ble) // отсутствие = Wx-Alb или Wx-Alg,
наличие 232 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble,
наличие 304 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb.
2. Способ проведения ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, включающий п.1, отличающийся тем, что после этапа ПЦР проводят процедуру ПДРФ-анализа с эндонуклеазным расщеплением ампликонов рестриктазой AcsI, со следующей интерпретацией генерируемых или отсутствующих ПЦР-ПДРФ-фрагментов:
наличие 148/114 bp=Wx-Ala // отсутствие = Wx-Alb или Wx-Alg,
наличие 148/84 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble,
наличие 266 bp=Wx-Ble,
наличие 156/148 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb.
Описание изобретения к патенту
Описание изобретения
Изобретение относится к области биохимии, а также селекции и семеноводства, в частности к молекулярной идентификации генотипов пшеницы по аллельным вариантам Waxy-генов для маркер-вспомогательной селекции сортов с высокими мукомольно-хлебопекарными и технологическими свойствами зерна.
Одним из подходов к идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы является способ проведения ПЦР (полимеразная цепная реакция) с праймерами: 4F: 5/-AAGAGCAACTACCAGT-3 / и 4R: 5/-TCGTACCCGTCG-ATGAAGTCGA-3/ , инициирующими амплификацию соответствующих аллель-специфичных продуктов Wx-Al-, Wx-Bl- и Wх-Dl-локусов. [1].
Существенным недостатком данного способа проведения ПЦР [1] является невозможность идентификации нуль-аллеля Wx-Blb от активного аллеля Wx-Ble, а также трудность дискриминации Wx-Ala от Wx-Alg.
Цель изобретения - разработка способа проведения ПЦР и ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция-полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) для эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы.
Нами разработан способ проведения ПЦР и ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, схожий с прототипом [1], включающий пробоподготовку ДНК пшеницы, внесение выделенной пробы ДНК в реакционную смесь для ПЦР, состоящую из dH2O, дНТФ, буферной системы, Taq ДНК полимеразы, праймеров, проведение ПЦР, гель-электрофорезную детекцию, с тем отличием, что на этапе ПЦР используется прямой праймер: 4F-c: 5/-CCCCCAAGAGCAACTACCAGT-3/ /(SEQ ID NO: 1), а процедура ПДРФ-анализа проводится с эндонуклеазным расщеплением ампликонов рестриктазой AcsI.
Условия проведения реакции
Выделение геномной ДНК из зерновок растений яровой пшеницы осуществляли сорбционным способом («ДНК-сорб С», ЦНИИЭМ, Россия).
ПЦР и ПЦР-ПДРФ выполняли согласно протоколам идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, представленным в табл.1-2.
Детекцию результатов ДНК-анализа проводили методом горизонтального электрофореза в 3% агарозном геле в буфере TBE (pH 8,0), содержащем этидий бромид в концентрации 0,5 мкг/мл, с последующей визуализацией амплифицированных продуктов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе ( =310 нм).
Размеры фрагментов ДНК оценивали по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами.
В работе были использованы продукты для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим», Россия.
Выравнивание частичных нуклеотидных последовательностей аллелей Waxy-генов пшеницы: CLUSTAL W (v.1.83).
ПЦР-ПДРФ-моделирование: NEBcutter v.2.0.
Заключение
По результатам практических исследований, направленных на апробацию предложенного способа проведения ПЦР и ПЦР-ПДРФ, нами получен обеспечиваемый заявленным способом технический результат, выраженный в эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, ввиду корректной интерпретации генерируемых ПЦР-продуктов (фиг.3) и ПЦР-ПДРФ-фрагментов (фиг.4), сопоставимых с расчетными данными (фиг.1-2).
Источники информации
1. Vanzetti, L.S. Genetic variability for waxy genes in Argentinean bread wheat germplasm / L.S. Vanzetti, L.A. Pfluger, M. Rodriguez-Quijano, J.M. Carrillo, M. Helguera // Electronic Journal of Biotechnology. - 2009. - V.12. - N.1. - P.1-9.
Табл.1 | ||||
Протокол ПЦР для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы (прототип) | ||||
Протокол ПЦР | ||||
Реагенты | Исходная концентрация | Рабочая концентрация | 1 проба (мкл) | 10 проб (мкл) |
dH2O | 13,4 | 134 | ||
dNTPs | 2,5 мМ | 0,25 мМ | 2 | 20 |
Буфер | 10× | 1× | 2 | 20 |
Taq ДНК полимераза | 5 ед | 1 ед | 0,2 | 2 |
4F | 50 мкМ | 0,5 мкМ | 0,2 | 2 |
4R | 50 мкМ | 0,5 мкМ | 0,2 | 2 |
Проба ДНК | 2 | |||
ВСЕГО | 20 | |||
Нуклеотидные последовательности праймеров: | ||||
4F: 5/-AAGAGCAACTACCAGT-3/ (16 н.) | ||||
4R: 5/-TCGTACCCGTCGATGAAGTCGA-3 / (22 н.) | ||||
Режим амплификации: | ||||
×1: 94°C - 4 мин | ||||
×40: 94°C - 30 сек, 58°C - 30 сек, 72°C - 30 сек | ||||
×1: 72°C - 7 мин | ||||
ХРАНЕНИЕ +10°C | ||||
Электрофорез в 3% агарозе | ||||
Интерпретация ПЦР-продуктов: | ||||
Наличие 257 (261) bp=Wx-Ala или Wx-Alg (Wx-Ble) // отсутствие = Wx-Alb | ||||
Наличие 227 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble | ||||
Наличие 299 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb |
Табл.2 | |||||
Протокол ПЦР и ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы (предлагаемый способ) | |||||
Протокол ПЦР | |||||
Реагенты | Исходная концентрация | Рабочая концентрация | 1 проба (мкл) | 10 проб (мкл) | |
dH2O | 13,4 | 134 | |||
dNTPs | 2,5 мМ | 0,25 мМ | 2 | 20 | |
Буфер | 10× | 1× | 2 | 20 | |
Taq ДНК полимераза | 5 ед | 1 ед | 0,2 | 2 | |
4F-c | 50 мкМ | 0,5 мкМ | 0,2 | 2 | |
4R | 50 мкМ | 0,5 мкМ | 0,2 | 2 | |
Проба ДНК | 2 | ||||
ВСЕГО | 20 | ||||
Нуклеотидные последовательности праймеров: | |||||
4F-c: 5/-CCCCCAAGAGCAACTACCAGT-3/ (21 н.) | |||||
4R: 5/-TCGTACCCGTCGATGAAGTCGA-3 / (22 н.) | |||||
Режим амплификации: | |||||
×1: 94°C - 4 мин | |||||
×40: 94°C - 30 сек, 64°C - 30 сек, 72°C - 30 сек | |||||
×1: 72°C - 7 мин | |||||
ХРАНЕНИЕ +10°C | |||||
Электрофорез в 3% агарозе | |||||
Интерпретация ПЦР-продуктов: | |||||
Наличие 262 (266) bp=Wx-Ala (Wx-Ble) // отсутствие = Wx-Alb или Wx-Alg | |||||
Наличие 232 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble | |||||
Наличие 304 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb | |||||
Протокол ПДРФ | |||||
Реагенты | Исходная концентрация | Рабочая концентрация | 1 проба (мкл) | 10 проб (мкл) | |
dH2O | 1,75 | 17,5 | |||
BSA | 10 мг/мл | 0,1 мг/мл | 0,25 | 2,5 | |
SE-буфер W | 10× | 1× | 2,5 | 25 | |
AcsI | 20 U | 10 U | 0,5 | 5 | |
ПЦР-проба | 20 | ||||
ВСЕГО | 25 | ||||
Инкубация при 50°C в течение 3 часов | |||||
Электрофорез в 3% агарозе | |||||
Интерпретация ПЦР-продуктов: | |||||
Наличие 148/114 bp=Wx-Ala // отсутствие = Wx-Alb или Wx-Alg | |||||
Наличие 148/84 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble | |||||
Наличие 266 bp=Wx-Ble | |||||
Наличие 156/148 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb |
Краткое описание графических материалов
Пояснение к фиг.1.
Выравнивание фланкируемых с праймерами 4F+4R нуклеотидных последовательностей аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, AcsI-рестрикционное картирование и моделирование AcsI-ПЦР-ПДРФ-профилей.
Пояснение к фиг.2.
Выравнивание фланкируемых с праймерами 4F-c+4R нуклеотидных последовательностей аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, AcsI-рестрикционное картирование и моделирование AcsI-ПЦР-ПДРФ-профилей.
Пояснение к фиг.3.
Электрофореграмма технического результата предложенного способа проведения ПЦР и прототипа для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы.
Обозначения: A) прототип (праймеры 4F+4R). B) предложенный способ проведения ПЦР (праймеры 4F-c+4R). M) ДНК-маркеры 100-1500 bp (СибЭнзим). 1-9) генотипы пшеницы с комбинациями Waxy-аллелей: 1-4) Wx-Ala/Bla/Dla; 5-7) Wx-Alg/Bla/Dla. 8-9) Wx-Ala/Blb/Dla.
Пояснение к фиг.4.
Электрофореграмма технического результата предложенного способа проведения ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы.
Обозначения: M) ДНК-маркеры 50-100 bp (СибЭнзим). 1) ПЦР-профиль генотипа пшеницы с комбинацией аллелей Wx-Ala/Bla/Dla (304/262/232 bp). 2-7) AcsI-ПЦР-ПДРФ-профили генотипов пшеницы с комбинациями Waxy-аллелей: 2) Wx-Ala/Bla/Dla (156/148/114/84 bp); 3-5) Wx-Alg/Bla/Dla (156/148/84 bp); 6-7) Wx-Ala/Blb/Dla (156/148/114 bp).
Класс C12N15/05 клетки растений
Класс C12Q1/68 использующие нуклеиновые кислоты