способ идентификации вызывающих муковисцидоз мутаций в гене cftr человека, набор праймеров, биочип, набор мишеней и тест-система, используемые в способе

Формула изобретения

1. Набор праймеров для амплификации фрагментов гена CFTR при осуществлении способа идентификации мутаций в гене CFTR человека, вызывающих муковисцидоз, где праймеры имеют последовательности SEQ ID NO: 1-51.

2. Биочип для идентификации мутаций в гене CFTR человека, вызывающих муковисцидоз, содержащий иммобилизованные на твердой подложке олигонуклеотидные мишени, имеющие последовательности SEQ ID NO: 52-98.

3. Набор олигонуклеотидных мишеней для получения биочипа по п.2, где указанные мишени имеют последовательности SEQ ID NO: 52-98.

4. Способ идентификации мутаций в гене CFTR человека, вызывающих муковисцидоз, при котором осуществляют:

(а) мультиплексную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для амплификации фрагментов гена CFTR с использованием геномной ДНК пациента в качестве матрицы и набора праймеров для первой стадии ПЦР, имеющих последовательности SEQ ID NO: 1-24,

(б) мультиплексную ПЦР для амплификации фрагментов гена CFTR с использованием ПЦР-продуктов, полученных на стадии (а), в качестве матрицы и набора праймеров для второй стадии ПЦР, имеющих последовательности SEQ ID NO: 25-51, где праймеры, имеющие последовательности SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 36, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, являются флуоресцентно меченными, с получением преимущественно одноцепочечных флуоресцентно меченных ПЦР-продуктов,

(в) гибридизацию флуоресцентно меченных ПЦР-продуктов, полученных на стадии (б), на биочипе по п.2,

(г) регистрацию результатов указанной гибридизации, и

(д) анализ и интерпретацию результатов указанной гибридизации с установлением отсутствия или наличия мутаций в гене CFTR.

5. Способ по п.4, при котором геномную ДНК пациента выделяют из материала клинического образца, представляющего собой цельную кровь, сухое пятно крови или слюну.

6. Способ по п.4, при котором на стадии (б) с целью получения преимущественно одноцепочечных флуоресцентно меченных продуктов ПЦР указанные флуоресцентно меченные праймеры используют в молярном избытке по отношению ко второму праймеру, составляющему ту же пару.

7. Способ по п.4, при котором на стадии (г) для регистрации результатов гибридизации используют сканер для биочипов.

8. Способ по п.4, при котором на стадии (д) результаты гибридизации анализируют визуально или с помощью программного обеспечения.

9. Способ по п.4, где указанные мутации в гене CFTR представляют собой мутации Dele2-3, G85E, 621+1G>T, R334W, R347P, R347H, 1078delT, I507del, F508del, 1677delTA, G542X, G551D, R553X, 1717-1G>A, 2143delT, 2184insA, 2183AA-G, 2789+5G>A, R1162X, S1196X, 3732delA, 3821delT, 3849+10kbC>T, W1282X и N1303K.

10. Тест-система для идентификации мутаций в гене CFTR человека, вызывающих муковисцидоз, которая включает набор для проведения мультиплексной ПЦР и набор для гибридизации, где указанный набор для проведения мультиплексной ПЦР содержит набор праймеров по п.1, а указанный набор для гибридизации содержит биочип по п.2.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины и представляет собой способ идентификации вызывающих муковисцидоз мутаций в гене CFTR человека, набор праймеров, биочип, набор олигонуклеотидных мишеней и тест-систему, которые используются в указанном способе.

Предшествующий уровень техники

Муковисцидоз (OMIM #219700) представляет собой наиболее частое и тяжелое наследственное аутосомно-рецессивное заболевание среди европеоидов, которое вызывается мутациями в гене CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator, трансмембранный регулятор муковисцидоза). При муковисцидозе в патологический процесс вовлекаются экзокринные железы разных систем организма: органов дыхания, системы пищеварения (поджелудочная железа, печень, желчные пути, пищеварительный тракт), а также потовые железы и урогенитальный тракт.

Современный подход к лечению муковисцидоза заключается в назначении лекарств, разжижающих секрет желез, а также регулярные курсы антибиотиков, препятствующих заселению слизистых бактериями. Причем, чем раньше выявлена патология, тем более благоприятное течение заболевания прогнозируется. С целью раннего выявления тяжелых наследственных заболеваний у новорожденных в Российской Федерации было введено обязательное неонатальное тестирование на муковисцидоз.

В настоящее время основными маркерами, сигнализирующими о возможной патологии состояния ребенка, являются уровень белка иммунореактивного трипсиногена (ИРТ) и результаты потовой пробы. Повышение концентрации ИРТ в крови не является строго специфическим маркером и может указывать как на наличие врожденных генетических отклонений, так и на целый спектр системных нарушений обмена. Данный подход приводит к появлению ложноположительных результатов, для уточнения которых используется 4-стадийный алгоритм повторного тестирования. Нельзя также исключать и наличие ложноотрицательных результатов биохимического тестирования, что приводит к пропусканию серьезного заболевания (по оценкам экспертов Ассоциации муковисцидоза России количество пропущенных случаев легких и средних по тяжести форм муковисцидоза в десятки раз превышает число выявленных при скрининге).

Помимо биохимических тестов, для диагностики муковисцидоза могут применяться генетические тесты (ДНК-диагностика муковисцидоза). В настоящий момент описано более 1500 мутаций и 250 полиморфизмов в гене CFTR, частоты которых широко варьируют в разных этнических группах. По разным оценкам 23-36 мутаций составляют до 92% всех случаев, остальные имеют одинаково низкую частоту встречаемости. Оценки частоты муковисцидоза в популяциях на территории Российской Федерации весьма различны (от 1:4900 до 1:12000 среди новорожденных). Существует несколько способов определения мутаций в гене муковисцидоза, отличающихся методом (лигазная реакция, гибридизация, секвенирование, электрофорез в денатурирующем геле, хроматография и др.) и форматом (полимеразная цепная реакция (ПЦР) и стрипы). Большинство из форматов проведения анализов плохо поддаются масштабированию и автоматизации, что является критическим фактором при проведении массового скрининга.

Наборы для ДНК-диагностики муковисцидоза, представленные на российском рынке и используемые после проведения биохимических тестов на муковисцидоз, определяют не более 14 мутаций в гене CFTR и являются достаточно трудоемкими. Недостатком принятой схемы является позднее выявление заболевания, а также наличие ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

Американской компанией AutoGenomics разработан диагностический набор для выявления муковисцидоза "The INFINITI® CFTR-31 BioFilmChip Microarray", выполненный в формате биочипа, который включает 31 мутацию в гене CFTR. Однако данная панель мутаций характерна для американской популяции и не подходит для использования в российской по причине отсутствия в ней некоторых регион-специфических мутаций. Учитывая присущую заболеванию региональную гетерогенность, этот недостаток является существенным и влияет на специфичность тест-системы в целом. Кроме того, для обработки этого биочипа требуется специальное дорогостоящее программное обеспечение и высококвалифицированный персонал, что делает его непригодным для использования в рутинной диагностике.

В WO 2005/006951 описана тест-система для диагностики мутаций в гене CFTR, которые приводят к возникновению муковисцидоза у человека, в том числе тех, которые наиболее распространены в популяции на территории РФ и стран СНГ. В данном техническом решении используется аналогичная ASPE методика детекции мутаций, которая представляет собой усложненный вариант аллель-специфической дискриминации, где помимо этапа гибридизации введен дополнительный этап энзиматической реакции включения дидезокситрифосфатов, меченых четырьмя различными флюорофорами. Это, в свою очередь, является дорогостоящей процедурой и для детекции сигналов требуется четырехканальный лазерный сканер.

Краткое описание изобретения

Учитывая недостатки известных способов диагностики муковисцидоза, в настоящее время существует потребность в разработке быстрого, легкого и экономически эффективного способа ДНК-диагностики муковисцидоза, который для своего осуществления не требует дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала, но при этом позволяет проводить диагностику муковисцидоза с высокой чувствительностью и специфичностью. Кроме того, есть потребность в надежном тесте для клинической ДНК-диагностики мутаций в гене CFTR, который адаптирован для применения на территории РФ и стран СНГ. Повышение доступности и упрощение процедуры молекулярно-генетического анализа позволяет решить проблему ранней и достоверной диагностики муковисцидоза, сократив сроки и увеличив специфичность скрининга.

Эти потребности неожиданно решаются настоящим изобретением. В настоящем изобретении предложен новый биочип для ДНК-диагностики муковисцидоза, панель мутаций в котором пригодна для применения на территории России и СНГ с учетом рекомендаций ACMG (American College of Medical Genetics), частоты встречаемости и тяжести фенотипических проявлений. Это позволяет выявлять гораздо большее количество мутаций в гене CFTR, приводящих к муковисцидозу, по сравнению с доступными в настоящее время в РФ тест-системами, а именно 25 различных мутаций, что покрывает 96% мутаций, распространенных в РФ и СНГ. Настоящее изобретение может быть легко использовано в клинической практике. Выявление этих мутаций происходит со 100% специфичностью.

Преимуществами настоящего изобретения являются: высокая чувствительность и специфичность, значительное снижение времени проведения диагностики, общедоступность и безопасность, отсутствие необходимости в дорогостоящем оборудовании и высококвалифицированном персонале, относительная низкая стоимость в расчете на идентификацию одной мутации, настраиваемая панель мутаций, возможность использования для пренатальной диагностики и неонатального скрининга. Кроме того, изобретение позволяет установить гомо-гетерозиготность соответствующей мутации.

Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал средств для диагностики муковисцидоза, применяемых в диагностических лабораториях с целью неонатального скрининга, в клинической молекулярно-генетической и пренатальной диагностике, для скрининга муковисцидоза при планировании семьи, а также для диагностики мужского бесплодия.

Одним аспектом изобретения является набор праймеров для амплификации участков гена CFTR при осуществлении способа идентификации мутаций в гене CFTR человека, вызывающих муковисцидоз, где праймеры имеют последовательности SEQ ID NO: 1-51.

Другим аспектом изобретения является биочип для идентификации мутаций в гене CFTR человека, вызывающих муковисцидоз, содержащий иммобилизованные на твердой подложке олигонуклеотидные мишени (по другой терминологии, олигонуклеотидные зонды или олигонуклеотиды), имеющие последовательности SEQ ID NO: 52-98.

Еще одним аспектом изобретения является набор олигонуклеотидных мишеней для получения биочипа по изобретению, где указанные мишени имеют последовательности SEQ ID NO: 52-98.

Еще одним аспектом изобретения является способ идентификации мутаций в гене CFTR человека, вызывающих муковисцидоз, при котором осуществляют:

(а) мультиплексную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для амплификации фрагментов гена CFTR с использованием геномной ДНК пациента в качестве матрицы и набора праймеров для первой стадии ПЦР, имеющих последовательности SEQ ID NO: 1-24,

(б) мультиплексную ПЦР для амплификации фрагментов гена CFTR с использованием продуктов ПЦР, полученных на стадии (а), в качестве матрицы и набора праймеров для второй стадии ПЦР, имеющих последовательности SEQ ID NO: 25-51, где праймеры, имеющие последовательности SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 36, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, являются флуоресцентно меченными, с получением преимущественно одноцепочечных флуоресцентно меченных продуктов ПЦР,

(в) гибридизацию флуоресцентно меченных продуктов ПЦР, полученных на стадии (б), на биочипе по изобретению,

(г) регистрацию результатов указанной гибридизации,

(д) анализ и интерпретацию результатов указанной гибридизации с установлением отсутствия или наличия мутаций в гене CFTR.

Наконец, изобретение относится к тест-системе для идентификации мутаций в гене CFTR человека, вызывающих муковисцидоз, которая включает набор для проведения мультиплексной ПЦР и набор для гибридизации, где указанный набор для проведения мультиплексной ПЦР содержит набор праймеров по изобретению, а указанный набор для гибридизации содержит биочип по изобретению.

Краткое описание графических материалов

Фиг.1. Схема биочипа по изобретению (иллюстративный пример).

Фиг.2. Гибридизационная картина образца ДНК, содержащего мутацию F508del в гене CFTR.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение позволяет проводить диагностику одновременно по 25-и мутациям в гене CFTR человека, которые наиболее распространены на территории России и стран СНГ.

Мутации

Диагностируемые в настоящем изобретении мутации приведены ниже в таблице 1.

Таблица 1
Диагностируемые мутации в гене CFTR
Мутация	Частота встречаемости (%)	Экзон/интрон (E/I) гена CFTR	Источники
Dele2-3	8,8	I2-3	1, 2, 3
G85E	0,4	E3	3, 4, 5, 9
621+1G>T	0,4	E4	2, 3, 4, 5, 9
R334W	0,2	E7	1, 2, 3, 4, 9
R347P	0,3		1, 2, 3, 4, 6
R347H	0,3		3, 5, 7, 9
1078delT	0,7		3, 4, 5
I507del	0,7	Е10	3, 4, 5, 9
F508del	64,7		1, 2, 3, 4, 5, 6, 9
1677delTA	0,8		1, 2, 3
G542X	2,0	E11	1, 2, 3, 4, 5, 6, 9
G551D	1,9		1, 2, 3, 4, 5, 6, 9
R553X	0,8		1, 2, 3, 5, 6, 9
1717-1G>A	1,0		3, 4, 5, 6, 9
2143delT	2,0	E13	1, 2, 3
2184insA	1,8		1, 2, 3, 5
2183AA-G	0,8		3, 6
2789+5G>A	0,7	I14b	3, 4, 6, 9
R1162X	0,6	E19	3, 4, 5, 9
S1196X	0,8		1, 2, 3
3732delA	1,2		1, 3, 7
3821delT	0,8		1, 3
3849+10kbC>T	0,5	I19	2, 3, 4, 6, 9
W1282X	1,6	E20	1, 2, 3, 4, 5, 6, 9
N1303K	1,3	E21	1, 2, 3, 4, 5, 6, 9

Приведенные обозначения мутаций являются номенклатурными и принятыми в данной области техники, однако ниже они дополнительно пояснены (таблица 2).

Таблица 2
Пояснения к обозначениям диагностируемых мутаций в гене и белке CFTR
Мутация	Пояснение
Dele2-3	Обширная делеция (21 килобаза), захватывающая 2, 3 экзоны
G85E	Замена нуклеотида в 3 экзоне, приводящая к замене глицина на глутаминовую кислоту
621+10Т	Замена нуклеотида на границе 4 экзона, приводящая к нарушению сплайсинга
R334W	Замена нуклеотида в 7 экзоне, приводящая к замене аргинина на триптофан
R347P	Замена нуклеотида в 7 экзоне, приводящая к замене аргинина на пролин
R347H	Замена нуклеотида в 7 экзоне, приводящая к замене аргинина на гистидин
1078delT	Делеция нуклеотида в 7 экзоне, приводящая к сдвигу рамки считывания
I507del	Делеция трех нуклеотидов в 10 экзоне, приводящая к выпадению изолейцина
F508del	Делеция трех нуклеотидов в 10 экзоне, приводящая к выпадению фенилаланина
1677delTA	Делеция двух нуклеотидов в 10 экзоне, приводящая к сдвигу рамки считывания
G542X	Замена нуклеотида в 11 экзоне, приводящая к образованию стоп-кодона
G551D	Замена нуклеотида в 11 экзоне, приводящая к замене глицина на аспарагиновую кислоту
R553X	Замена нуклеотида в 11 экзоне, приводящая к образованию стоп-кодона
1717-1G>A	Замена нуклеотида на границе 11 экзона, приводящая к нарушению сплайсинга
2143delT	Делеция нуклеотида в 13 экзоне, приводящая к образованию стоп-кодона
2184insA	Инсерция нуклеотида в 13 экзоне, приводящая к сдвигу рамки считывания
2183AA-G	Замена двух нуклеотидов (АА) на нуклеотид (G) в 13 экзоне, приводящая к сдвигу рамки считывания
2789+5G>A	Замена нуклеотида в 14 интроне, приводящая к нарушению сплайсинга
R1162X	Замена нуклеотида в 19 экзоне, приводящая к образованию стоп-кодона
S1196X	Замена нуклеотида в 19 экзоне, приводящая к образованию стоп-кодона
3732delA	Делеция нуклеотида в 19 экзоне, приводящая к сдвигу рамки считывания
3821delT	Делеция нуклеотида в 19 экзоне, приводящая к сдвигу рамки считывания
3849+10kbOT	Замена нуклеотида в 19 интроне, приводящая к нарушению сплайсинга
W1282X	Замена нуклеотида в 20 экзоне, приводящая к образованию стоп-кодона
N1303K	Замена нуклеотида в 21 экзоне, приводящая к замене аспарагина на лизин

Праймеры

Для осуществления изобретения был разработан набор олигонуклеотидных праймеров, обеспечивающих наработку в ходе двухстадийной мультиплексной ПЦР преимущественно одноцепочечных продуктов, представляющих собой аллель-специфические меченые зонды.

Праймеры для проведения первой стадии мультиплексной ПЦР имеют последовательности SEQ ID NO: 1-24. Праймеры для проведения второй стадии мультиплексной ПЦР имеют последовательности SEQ ID NO: 25-51.

Праймеры синтезированы с использованием стандартного амидофосфитного метода на автоматическом синтезаторе (типа 394 DNA/RNA synthesizer, Applied Biosystem, США).

В таблице 3 показано соответствие пар праймеров участку гена CFTR и диагностируемой мутации, а также указана длина образуемого ПЦР-продукта (для праймеров первой стадии ПЦР).

Таблица 3
Соответствие праймеров по изобретению региону гена CFTR.
Пара праймеров	Регион гена CFTR	Мутация в гене CFTR	Длина ПЦР-продукта (п.н.)
SEQ ID NO: 1 /SEQ ID NO: 2	E11		425
SEQIDNO:3/SEQIDNO:4	E20		315
SEQ ID NO: 5 /SEQ ID NO: 6	E4		290
SEQ ID NO: 7 /SEQ ID NO: 8	E21		388
SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 10	11-3		261
SEQ ID NO: 11 /SEQ ID NO: 12	ЕЮ		244
SEQ ID NO: 13 /SEQ ID NO: 14	E19		454
SEQ ID NO: 15 /SEQ ID NO: 16	I14b		374
SEQ ID NO: 17/SEQ ID NO: 18	E7		386
SEQ ID NO: 19 /SEQ ID NO: 20	119		325
SEQ ID NO: 21 /SEQ ID NO: 22	ЕЗ		449
SEQ ID NO: 23 /SEQ ID NO: 24	Е13		417
SEQ ID NO: 25 /SEQ ID NO: 26	11-3	Dele2-3
SEQ ID NO: 27 /SEQ ID NO: 28	E11S	1717-1G>A, G542X
SEQ ID NO: 29 /SEQ ID NO: 30	E20	W1282X
SEQ ID NO: 31 /SEQ ID NO: 32	E7	1078delT, R334W, R347P, R347H
SEQ ID NO: 33 /SEQ ID NO: 34	ЕЮ	F508del, 1677delTA
SEQ ID NO: 35 /SEQ ID NOs:	E19	R1162X,
36, 37		S1196X, 3732delA, 3821delT
SEQ ID NO: 38 /SEQ ID NO: 39	119	3849+10kbC>Т
SEQIDNO:40/SEQIDNO:41	ЕЗ	G85E
SEQ ID NO: 42 /SEQ ID NO: 43	E21	N1303K
SEQ ID NO: 44 /SEQ ID NO: 45	E4	621+10T
SEQ ID NO: 46 /SEQ ID NO: 47	114	2789+5G>A
SEQ ID NO: 48 /SEQ ID NO: 49	Е13	2143delT, 2183AA-G, 2184insA
SEQ ID NO: 50/SEQ ID NO: 51	E11f	G551D, R553X

Праймеры для проведения амплификации выбирают таким образом, чтобы они фланкировали целевые участки гена CFTR, причем один из праймеров в каждой паре для проведения второй стадии мультиплексной ПЦР является флюоресцентно меченным. При подборе праймеров избегают таких последовательностей, которые способны формировать вторичные структуры (шпильки) с высокими температурами плавления. Праймеры для проведения второй стадии ПЦР подбираются с учетом приведенных выше требований, а также с учетом того, что Праймеры должны отжигаться внутри последовательности ПЦР-продукта, полученного на первой стадии ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 1-24. При подборе праймеров также учитывалось, что в результате проведения второй стадии мультиплексной ПЦР образуются преимущественно одноцепочечные флуоресцентно меченные продукты, которые будут комплементарны олигонуклеотидным последовательностям, иммобилизованным на биочипе по изобретению. Поэтому в каждой паре праймер, содержащий флуоресцентную метку и добавляемый в молярном избытке (например, в 3-10-кратном количестве) по отношению ко второму праймеру, составляющему ту же пару, выбирается из той цепи, последовательность которой комплементарна последовательностям иммобилизованных на биочипе олигонуклеотидных мишеней.

Предпочтительно, флуоресцентно меченными являются праймеры, имеющие нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 36, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51.

В качестве флуоресцентной метки в настоящем изобретении может быть использован любой флуоресцентный краситель, известный в данной области техники. Такой краситель может быть химически присоединен к 5'-концу праймера и не будет препятствовать прохождению ПЦР. Спектр таких красителей включает хорошо известные красители, какие как Су3®, Су5®, Су5.5®, Су7®, TAMRA®, ROX®, JOE®, Texas Red®, FAM®, FITC®, ALEXA 488®, HEX® и прочие. Предпочтительно использовать циановые красители, наиболее предпочтителен Су5®.

Праймеры по изобретению позволяют проводить мультиплексную ПЦР, то есть возможно использовать в одной реакции амплификации сразу несколько пар праймеров, что значительно упрощает и удешевляет способ диагностики.

Соответствующие праймеры на каждой стадии ПЦР могут быть использованы вместе в одной реакции либо разделены на отдельные пулы. В одном из воплощений праймеры по изобретению используются отдельными пулами:

A1-SEQ ID NOs:1-6

A2-SEQ ID NOs:7-10

A3-SEQ ID NOs:11-16

A4-SEQ ID NOs:17-20

A5-SEQ ID NOs:21-24

B1-SEQ ID NOs: 25-30

B2-SEQ ID NOs: 31-34

B3-SEQ ID NOs: 35-39

B4-SEQ ID NOs: 40-43

B5-SEQ ID NOs: 44-47

B6-SEQ ID NOs: 48-51

Однако возможно использовать и другие сочетания пар праймеров в пулах, комбинируя праймеры, уменьшая или увеличивая их количество в каждом пуле.

Биочип

Для осуществления изобретения также разработан биочип для идентификации мутаций в гене CFTR человека, вызывающих муковисцидоз, содержащий иммобилизованные на твердой подложке олигонуклеотидные мишени, имеющие последовательности SEQ ID NO: 52-98.

Олигонуклеотидные мишени синтезированы с использованием стандартного амидофосфитного метода на автоматическом синтезаторе (типа 394 DNA/RNA synthesizer, Applied Biosystem, США).

Биочип по изобретению может быть получен любым известным и традиционно используемым в данной области техники способом, например, описанным в [8].

В качестве твердой подложки при изготовлении биочипа по изобретению могут использоваться любые традиционно применяемые материалы, такие как стекло, кремниевые материалы, пластик, металлические материалы, мембраны и пр.

В одном из воплощений в качестве подложки для иммобилизации олигонуклеотидных мишеней используется стандартное предметное стекло. Для ковалентной иммобилизации органических молекул на стекле необходимо провести химическую активацию поверхности реактивными группами. Формирование реактивного альдегидного слоя на поверхности носителя производится с использованием органосилановых соединений, выступающих в роли линкера между неорганическим субстратом и реактивной органикой, или посредством CVD-процесса (химическое парофазное осаждение).

Ковалентная иммобилизация мишеней выполняется путем формирования оснований Шиффа между амино-модифицированными с 5'-конца (например, с помощью S'-Amino-Modifier 5, Glen Research, США) олигонуклеотидами-мишенями и альдегидными группами твердой фазы.

Печать микрочипов выполняется бесконтактным способом с использованием такого оборудования, как, например, станции Piezorray (Perkin Elmer) или sciFLEXARRAYER 8100 (Scienion AG).

В качестве мишеней для поиска мутаций в гене CFTR используются специально выбранные участки ДНК, несущие искомую мутацию, либо нормальный вариант гена. 25 пар синтетических олигонуклеотидов роботизированным способом наносятся на поверхность активированного субстрата согласно выбранной схеме, формируя микроструктуру биочипа. Линейные размеры области одной мишени составляют около 200-300 мкм, с шагом в 800 мкм. С целью повышения надежности детекции каждую олигонуклеотидную мишень на биочипе дублируют.

Раствор с продуктами ПЦР наносится на биочип, который после гибридизации в водяной бане либо гибридизационной станции, отмывается от несвязавшихся компонентов. Выбор температуры гибридизации может быть обусловлен удобством практического применения биочипа. Температура, при которой проводят гибридизацию, может составлять от 30 до 70°С, предпочтительно от 40 до 60°С, наиболее предпочтительно от 50 до 55°С.

Олигонуклеотидные мишени биочипа по изобретению подобраны таким образом, чтобы обеспечить специфичное связывание (гибридизацию) с флюоресцентно меченным ПЦР-продуктом, полученным после второй стадии ПЦР с праймерами по изобретению, причем наличие такой гибридизации свидетельствует о полной комплементарности последовательности ПЦР-продукта и мишени биочипа, в результате чего может быть сделан вывод, содержит ли указанный ПЦР-продукт соответствующую мутацию или нет.

В одном из воплощений биочипа по изобретению (см. Фиг.1) в зоне А1-Е5 иммобилизованы мишени, соответствующие последовательности дикого типа в конкретном сайте гена CFTR человека ("wt"), в зоне F1-J5 иммобилизованы мишени, соответствующие мутантной последовательности в конкретном сайте гена CFTR человека ("mut"), а в зоне К содержится флуоресцентный контроль для позиционирования строк биочипа. В таблице 4 приведено соответствие олигонуклеотидных мишеней диагностируемым мутациям в гене CFTR и их расположение на биочипе, приведенном на Фиг.1.

Таблица 4 Соответствие мишеней мутациям в гене CFTR и их расположение на биочипе по изобретению
Олигонуклеотидная мишень	Мутация в гене CFTR	Ячейка биочипа
SEQ ID NO: 52	Dele2-3-mut	F1
SEQ ID NO: 53	Dele2-3-wt	A1
	G85E-wt	A2
SEQ ID NO: 54	G85E-mut	F2
SEQ ID NO: 55	621+1G>T-wt	A3
SEQ ID NO: 56	621+1G>T-mut	F3
SEQ ID NO: 57	1078delT-wt	B2
SEQ ID NO: 58	1078delT-mut	G2
SEQ ID NO: 59	R334W-wt	A4
SEQ ID NO: 60	R334W-mut	F4
SEQ ID NO: 61	R347P-wt	A5
	R347H-wt	B1
SEQ ID NO: 62	R347P-mut	F5
SEQ ID NO: 63	R347H-mut	G1
SEQ ID NO: 64	I507del-wt	B5
SEQ ID NO: 65	I507del-mut	G5
SEQ ID NO: 66	F508del-wt	B3
SEQ ID NO: 67	F508del-mut	G3
SEQ ID NO: 68	1677delTA-wt	B4
SEQ ID NO: 69	1677delTA-mut	G4
SEQ ID NO: 70	1717-1G>A-wt	C1
SEQ ID NO: 71	1717-1G>A-mut	H1
SEQ ID NO: 72	G542X-wt	C2
SEQ ID NO: 73	G542X-mut	H2
SEQ ID NO: 74	G551D-wt	C3
SEQ ID NO: 75	G551D-mut	H3
SEQ ID NO: 76	R553X-wt	C4
SEQ ID NO: 77	R553X-mut	H4
SEQ ID NO: 78	2143delT-wt	C5
SEQ ID NO: 79	2143delT-mut	H5
SEQ ID NO: 80	2183AA-G-wt	D1
	2184insA-mut	12
SEQ ID NO: 81	2183AA-G-mut	11
SEQ ID NO: 82	2184insA-wt	D2
SEQ ID NO: 83	2789+5G>A-wt	D3
SEQ ID NO: 84	2789+5G>A-mut	13
SEQ ID NO: 85	R1162X-wt	D4
SEQ ID NO: 86	R1162X-mut	14
SEQID NO: 87	S1196X-wt	D5
SEQ ID NO: 88	S1196X-mut	15
SEQ ID NO: 89	3732delA-wt	E1
SEQ ID NO: 90	3732delA-mut	Л
SEQ ID NO: 91	3821delT-wt	Е2
SEQ ID NO: 92	3821 delT-mut	J2
SEQ ID NO: 93	3849+10kbOT-wt	ЕЗ
SEQ ID NO: 94	3849+10kbOT-mut	J3
SEQ ID NO: 95	W1282X-wt	Е4
SEQ ID NO: 96	W1282X-mut	J4
SEQ ID NO: 97	N1303K-wt	E5
SEQ ID NO: 98	N1303K-mut	J5

Способ идентификации мутаций

Способ по изобретению включает следующие стадии:

(а) мультиплексная ПЦР для амплификации фрагментов гена CFTR с использованием геномной ДНК пациента в качестве матрицы и набора праймеров для первой стадии ПЦР, имеющих последовательности SEQ ID NO: 1-24,

(б) асимметричная мультиплексная ПЦР для амплификации фрагментов гена CFTR с использованием ПЦР-продуктов, полученных на стадии (а), в качестве матрицы и набора праймеров для второй стадии ПЦР, имеющих последовательности SEQ ID NO: 25-51, где праймеры, имеющие последовательности SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 36, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, являются флуоресцентно меченными, с получением преимущественно одноцепочечных флуоресцентно меченных ПЦР-продуктов,

(в) гибридизация флуоресцентно меченных ПЦР-продуктов, полученных на стадии (б), на биочипе по изобретению,

(г) регистрация результатов указанной гибридизации, и

(д) анализ и интерпретация результатов указанной гибридизации с установлением отсутствия или наличия мутаций в гене CFTR.

В одном из частных воплощений геномную ДНК пациента выделяют из материала клинического образца, представляющего собой цельную кровь, сухое пятно крови или слюну. Для проведения анализа достаточно одной пробы клинического материала.

В другом воплощении на стадии (б) с целью получения преимущественно одноцепочечных флуоресцентно меченных ПЦР-продуктов указанные флуоресцентно меченные праймеры используют в молярном избытке по отношению ко второму праймеру, составляющему ту же пару.

В еще одном воплощении на стадии (г) для регистрации результатов гибридизации используют сканер для биочипов.

В еще одном воплощении на стадии (д) результаты гибридизации анализируют визуально или с помощью программного обеспечения.

Для выделения геномной ДНК из клинического образца может быть использована любая известная специалисту традиционная методика. Например, выделение геномной ДНК возможно с использованием коммерческого набора, такого как "Экстра-ДНК-Био" ( № 400-20) (Алкор Био) или DNA Box 500 (Protrans).

Стандартным материалом для получения геномной ДНК человека является венозная кровь, которую отбирают из локтевой вены. Рутинная процедура взятия крови у новорожденных заключается в отборе небольшого количества образца из пятки на фильтровальную бумагу.

Геномную ДНК пациента используют в качестве матрицы на первой стадии мультиплексной ПЦР для амплификации фрагментов гена CFTR с праймерами SEQ ID NO: 1-24.

Образовавшиеся в результате ПЦР-продукты используют на второй стадии в качестве матрицы для асимметричной мультиплексной ПЦР с праймерами SEQ ID NO: 25-51. При этом, праймеры, имеющие последовательности SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 36, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, являются флуоресцентно меченными. В результате образуются преимущественно одноцепочечные флуоресцентно меченные ПЦР-продукты.

Далее проводят гибридизацию на биочипе преимущественно одноцепочечных флуоресцентно меченных ПЦР-продуктов, полученных на второй стадии ПЦР.

Регистрацию результатов гибридизации можно проводить на любом сканере для биочипов, таком как, например, ScanArray Gx (PerkinElmer), MArS (Ditabis) и PowerScanner (Tecan) стандартного размера. Настройки сканера (мощность лазера, коэффициент усиления, разрешение) устанавливают согласно инструкциям производителя.

Результаты сканирования биочипа можно анализировать визуально или с помощью программного обеспечения. Таким программным обеспечением (ПО) является любое стандартное ПО, идущее в комплекте к сканерам для биочипов, например ArrayScan, Array-Pro Analyzer и пр.

Вывод о наличии мутации основывается на сравнении интенсивности сигналов топографически сходных точек в полях А-Е (1-5) и F-J (1-5) (см. Фиг.1). Например, А1 и F1, А2 и F2 и т.п.

Положительным считается сигнал, интенсивность которого не менее чем в три раза отличается от интенсивности топографически соответствующей точки в другом поле. Интенсивность сигнала определяется визуально либо с использованием ПО.

Возможны следующие три варианта результатов (на примере полей А1 и F1):

1. Наличие сигнала в А1, но не в F1. Вывод: гомозигота дикого типа по сайту мутации Dele2-3.

2. Наличие сигналов в А1 и в F1. Вывод: гетерозигота по мутации Dele2-3.

3. Отсутствие сигнала в А1 и его присутствие в F1. Вывод: гомозигота по мутации Dele2-3.

В случае дикого типа по всем анализируемым мутациям все точки в зоне А-Е (1-5) должны давать положительные сигналы. В случае наличия мутаций должно появиться не более двух точек в зоне F-J (1-5). В противном случае анализ рекомендуется повторить.

Если в зоне А-Е (1-5) отсутствует более одной пары точек, то результаты анализа считаются недействительными. В этом случае рекомендуется повторение ПЦР.

Исключение составляют следующие ситуации:

отсутствие А1 и А2 в случае присутствия сигнала F1;

отсутствие А1 и А2 в случае присутствия сигнала F2;

отсутствие D1 и D2 в случае присутствия сигнала 11;

отсутствие D1 и D2 в случае присутствия сигнала 12;

отсутствие В3 и В5 в случае присутствия G3;

отсутствие В3 и В5 в случае присутствия G5.

Тест-система

Тест-система для идентификации мутаций в гене CFTR человека, вызывающих муковисцидоз, включает:

- набор для проведения мультиплексной ПЦР, содержащий праймеры SEQ ID NO: 1-51 и

- набор для гибридизации, содержащий биочип с иммобилизованными на твердой подложке олигонуклеотидными мишенями, имеющими последовательности SEQ ID NO: 52-98.

В одном из воплощений настоящего изобретения набор для проведения мультиплексной ПЦР включает смесь праймеров для первой стадии ПЦР (А1 -А5), смесь праймеров для второй стадии ПЦР (В1-В6), амплификационный буфер с dNTPs и Taq-полимеразу. Набор для гибридизации включает биочип по изобретению в пластиковой гибридизационной камере, герметично запаянный в металлизированную пластиковую упаковку с инертной средой, блокирующий буфер и гибридизационный буфер. Указанные амплификационный буфер, блокирующий буфер и гибридизационный буфер являются традиционно используемыми.

Далее изобретение проиллюстрировано примерами, которые не ограничивают объем настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1. ПЦР

Осуществляют двухстадийную мультиплексную ПЦР, причем на второй стадии ПЦР является асимметричной:

- на первой стадии для каждого тестируемого образца используют пулы А1-А5,

- на второй стадии используют пулы В1 - В6.

Первая стадия ПЦР

Для каждого анализируемого образца готовят по 5 пробирок.

Для каждого образца готовят рабочую смесь по протоколу (119,8 мкл):

Буфер для ПЦР с 3 мМ Мg²⁺ и 0,2 мМ каждого dNTP - 107 мкл, HS Taq-ДНК-полимераза-2,8 мкл (все реактивы от Евроген, Россия), тестируемая геномная ДНК - 10 мкл.

Затем рабочую смесь делят на аликвоты по 22 мкл и добавляют в соответствующие 5 пробирок, после чего добавляют по 3 мкл каждой смеси праймеров А1-А5 (конечная концентрация 100 мМ) в пробирки с рабочими смесями.

Проводят ПЦР по следующей программе:

денатурация 95°С - 3 мин; 6 циклов по 96°С - 5 с, 49°С - 20 с, 70°С - 10 с; 29 циклов по 96°С - 2 с, 53°С --10 с, 68°С - 10 с; элонгация 72°С - 5 мин.

Полученные ПЦР-продукты объединяют в 1,5 мл пробирку следующим образом: 2 мкл из всех пяти ПЦР-смесей добавляют к 700 мкл воды.

Вторая стадия ПЦР

Для каждого образца готовят рабочую смесь по протоколу (140,3 мкл):

Буфер для ПЦР с 3 мМ Мg²⁺ и 0,2 мМ каждого dNTP - 127 мкл, HS Taq-ДНК-полимераза - 3,3 мкл (все реактивы от Евроген, Россия), объединенные продукты ПЦР первой стадии - 10 мкл

Для каждого анализируемого образца готовят по 6 пробирок. В каждую соответствующую пробирку добавляют 22 мкл аликвоту рабочей смеси, по 3 мкл каждой смеси праймеров В1 - В6 (конечная концентрация праймеров без флюоресцентной метки - 10 нМ, с флюоресцентной меткой - 100 мМ).

Проводят ПЦР по следующей программе:

денатурация 95°С - 1 мин; 40 циклов по 96°С - 2 с, 55°С - 10 с, 68°С - 5 с; элонгация 72°С - 5 мин.

Пример 2. Гибридизация

Помещают биочип в блокирующий буфер (100 мМ 2-[N-морфолино]этансульфоновая кислота, 0,9 М NaCl, 20 мМ /Nа₂ЭДТА, 0,01% (об/об) Твин-20, 1% БСА; все реактивы от Sigma-Aldrich, США) в емкость Хеллендаля при+50°С на 10 мин, не допуская высыхания биочипа на всех последующих этапах работы с ним. В 1,5 мл пробирку вносят 1 мл гибридизационного буфера (1М GuSCN, 50 мМ HEPES, рН 7,5, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0; все реактивы от Sigma-Aldrich, США) и указанное ниже количество меченых зондов из смесей продуктов второй стадии ПЦР (В1-В6): В1 - 7 мкл, В2 - 10 мкл, В3-4 мкл, В4 - 21 мкл, В5 - 17 мкл, В6 - 17 мкл.

Смесь перемешивают и центрифугируют. Переносят гибридизационный буфер с зондами в гибридизационную камеру. Извлекают биочип из блокирующего буфера, вставляют его в гибридизационную камеру, помещают камеру с биочипом в водяную баню (термостат) и инкубируют при +50°С в течение 90 мин. После окончания гибридизации извлекают биочип из камеры и промывают дистиллированной водой в течение 1 мин при комнатной температуре, затем высушивают центрифугированием.

Пример 3. Регистрация результатов гибридизации

Биочип после гибридизации вставляют в сканер ScanArray Gx (PerkinEImer) рабочей поверхностью вверх и маркировкой наружу. Результат сканирования биочипа сохраняют в формате.jpg.

Пример 4. Анализ результатов гибридизации

Результаты теста анализируют визуально или с помощью программы МВ25-СКАН.

Пример 5. Верификация

Определение аналитических свойств тест-системы по изобретению было выполнено на референсных образцах ДНК. Для 16-ти из 25-ти мутаций были использованы образцы из генетического банка. Оставшиеся 9 вариантов были проанализированы с использованием искусственно синтезированных генных конструкций, содержащих мутантные аллели, и геномной ДНК дикого типа.

Анализ результатов тестирования показал полное совпадение результатов анализа с использованием тест-системы по изобретению с генотипами референсных образцов.

Пример 6. Апробация

Проведение апробации тест-системы по изобретению было выполнено на сторонних охарактеризованных образцах. Всего было проанализировано 72 "слепых" образца, из них: 68 образца - выделенная ДНК, 1 образец - сухое пятно крови, 3 образца - замороженная кровь. Для всех тестируемых образцов имелись данные о генотипе, полученные другими молекулярно-генетическими методами. В результате апробации тест-системы по изобретению генотипы были подтверждены для всех 72 образцов.

Источники информации

1. Иващенко Т.Э., Баранов B.C. Биохимические и молекулярно-генетические основы патогенеза муковисцидоза. // СПб. :Интермедика, 2002, 256 с.

2. Капранов Н.И., Шабалова Л.А., Каширская Н.Ю. и др. Муковисцидоз (современные достижения и проблемы). Методические рекомендации // -М.: Медпрактика-М, 2001, 76 с.

3. The molecular genetic epidemiology of cystic fibrosis. // Report of the joint meeting of WHO/ECFTN/ICF(M)A/ECFS. 2004. 24 p.

4. Schwarz М., Gardner A., Jenkins L. et al. Testing Guidelines for molecular diagnosis of Cystic Fibrosis // Clin Mol Genet Soc. 2009. Currently provisional.

5. Castellani С., Cuppens H., Macek M. Jr. et al. Consensus on the use and interpretation of cystic fibrosis mutation analysis in clinical practice. // J Cyst Fibr. 2008. V. 7. PP. 179-196.

6. Dequeker E., Stuhrmann M., Morris MA. et al. Best practice guidelines for molecular genetic diagnosis of cyctic fibrosis and CFTR-related disorders-updated European recommendations. // Eur J Hum Genet. 2009. V. 17. PP. 51-65.

7. Estivill E., Bancells C., Ramos C. et al. Geographic distribution and regional origin of 272 cystic fibrosis mutations in European populations. // Hum Mutat. 1997. V. 10. PP. 135-154.

8. Kirn J, Seidler P, Wan LS, Fill C. Formation, structure, and reactivity of amino-terminated organic films on silicon substrates.// J Colloid Interface Sci. 2009 Jan 1;329(1):114-9.

9. 32nd European CF Conference, 10-13 June 2009. Brest, France.