раковый маркер и терапевтическая мишень

Формула изобретения

1. Способ получения информации предсказательного или диагностического характера для пациента со злокачественным новообразованием, включающий стадию измерения количества и/или активности рецептора хемокина CCR4, экспрессируемого эпителиальными опухолевыми клетками, в образце солидной опухоли или в образце негематологических опухолевых клеток, взятом от пациента, где количество и/или активность CCR4 дает информацию предсказательного или диагностического характера, где информацию предсказательного или диагностического характера получают путем сравнения количества и/или активности CCR4 в образце солидной опухоли или в образце негематологических опухолевых клеток со стандартным количеством и/или уровнем активности CCR4 и где увеличенный уровень CCR4, продуцируемого упомянутыми эпителиальными опухолевыми клетками, идентифицирует злокачественный рак или перспективно злокачественный рак.

2. Способ по п.1, где увеличенный уровень или активность CCR4 в упомянутом образце является показателем пациента, для которого благоприятно лечение противораковым агентом.

3. Способ по п.1, где стандартное количество и/или уровень активности CCR4 измеряют в одном или более чем одном неопухолевом образце.

4. Способ по п.3, где неопухолевый образец или по меньшей мере один неопухолевый образец берут от пациента.

5. Способ по п.3, где один или более чем один неопухолевый образец берут не от пациента.

6. Способ по п.1, где информацию используют для предсказания того, будет ли солидная опухоль или опухоль негематологических клеток пациента чувствительна к противораковой терапии.

7. Способ по п.1, где пациент получил противораковую терапию, и измерения количества и/или активности CCR4, экспрессируемого эпителиальными опухолевыми клетками, в образце солидной опухоли или в образце негематологической опухоли пациента проводят до и после начала лечения, и полученную информацию используют, чтобы определить наличие ответа солидной опухоли или опухоли негематологических клеток пациента на противораковую терапию.

8. Способ по п.1, где информацию используют при диагностике солидной опухоли или опухоли негематологических клеток.

9. Способ по п.1, где информацию используют для стадирования солидной опухоли или опухоли негематологических клеток.

10. Способ по любому из пп.1-9, где солидная опухоль или негематологическая опухоль представляет собой рак шейки матки.

11. Способ по любому из пп.1-9, где солидная опухоль или негематологическая опухоль представляет собой рак пищевода.

12. Способ по любому из пп.1-9, где солидная опухоль или негематологическая опухоль представляет собой рак почки.

13. Способ по любому из пп.1-9, где солидная опухоль или негематологическая опухоль представляет собой рак головного мозга.

14. Способ по любому из пп.1-9, где солидная опухоль или негематологическая опухоль представляет собой рак молочной железы.

15. Способ по любому из пп.1-9, где солидная опухоль или негематологическая опухоль представляет собой рак яичника.

16. Способ по любому из пп.1-9, где солидная опухоль или негематологическая опухоль представляет собой рак простаты.

17. Способ по любому из пп.1-9, где солидная опухоль или негематологическая опухоль желудка.

18. Способ по любому из пп.1-9, где солидная опухоль или негематологическая опухоль представляет собой поджелудочной железы.

19. Применение антитела, реактивного против рецептора хемокина CCR4, для обнаружения присутствия или измерения количества CCR4, экспрессируемого эпителиальными опухолевыми клетками солидной опухоли или негематологической опухоли у пациента со злокачественным новообразованием, где присутствие или количество CCR4, экспрессируемого опухолью, при его обнаружении или измерении дает информацию диагностического характера, где информацию предсказательного или диагностического характера получают путем сравнения количества и/или активности CCR4 в образце солидной опухоли или в образце негематологических опухолевых клеток со стандартным количеством и/или уровнем активности CCR4 и где увеличенный уровень CCR4, продуцируемого упомянутыми эпителиальными опухолевыми клетками, идентифицирует злокачественный рак или перспективно злокачественный рак.

20. Применение по п.19, где информацию используют для предсказания того, будет ли солидная опухоль или опухоль негематологических клеток пациента чувствительна к противораковой терапии.

21. Применение по п.19, где пациент получил противораковую терапию, и измерения количества и/или активности CCR4 проводят до и после начала лечения, и полученную информацию используют, чтобы определить наличие ответа солидной опухоли или опухоли негематологических клеток пациента на противораковую терапию.

22. Применение по п.19, где информацию используют для диагностики солидной опухоли или опухоли негематологических клеток.

23. Применение по п.19, где информацию используют для стадирования солидной опухоли или опухоли негематологических клеток.

24. Применение олигонуклеотидного праймера или зонда, способного к гибридизации в жестких условиях с SEQ ID NO:1, для обнаружения присутствия или измерения количества экспрессии CCR4 эпителиальными клетками солидной опухоли или негематологической опухоли, где присутствие или количество CCR4, экспрессируемого опухолью, при его обнаружении или измерении дает информацию диагностического характера, где информацию предсказательного или диагностического характера получают путем сравнения количества и/или активности CCR4 в образце солидной опухоли или в образце негематологических опухолевых клеток со стандартным количеством и/или уровнем активности CCR4 и где увеличенный уровень CCR4, продуцируемого упомянутыми эпителиальными опухолевыми клетками, идентифицирует злокачественный рак или перспективно злокачественный рак.

25. Применение по п.24, где информацию используют для предсказания того, будет ли солидная опухоль или опухоль негематологических клеток пациента чувствительна к противораковой терапии.

26. Применение по п.24, где пациент получил противораковую терапию, и измерения количества и/или активности CCR4 проводят до и после начала лечения, и полученную информацию используют, чтобы определить наличие ответа солидной опухоли или опухоли негематологических клеток пациента на противораковую терапию.

27. Применение по п.24, где информацию используют для диагностики солидной опухоли или опухоли негематологических клеток.

28. Применение по п.24, где информацию используют для стадирования солидной опухоли или опухоли негематологических клеток.

29. Применение по любому из пп.19-28, где солидная опухоль или негематологическая опухоль представляет собой рак шейки матки.

30. Применение по любому из пп.19-28, где солидная опухоль или негематологическая опухоль представляет собой рак пищевода.

31. Применение по любому из пп.19-28, где солидная опухоль или негематологическая опухоль представляет собой рак почки.

32. Применение по любому из пп.19-28, где солидная опухоль или негематологическая опухоль представляет собой рак головного мозга.

33. Применение по любому из пп.19-28, где солидная опухоль или негематологическая опухоль представляет собой рак молочной железы.

34. Применение по любому из пп.19-28, где солидная опухоль или негематологическая опухоль представляет собой рак яичника.

35. Применение по любому из пп.19-28, где солидная опухоль или негематологическая опухоль представляет собой рак простаты.

36. Применение по любому из пп.19-28, где солидная опухоль или негематологическая опухоль представляет собой рак желудка или поджелудочной железы.

37. Применение по любому из пп.19-28, где солидная опухоль или негематологическая опухоль представляет собой рак поджелудочной железы.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к онкологии и к способам диагностики, стратификации, стадирования заболевания и лечения рака. Область изобретения, таким образом, касается маркеров прогностического или клинического значения в диагностике и лечении рака и применения лекарств для лечения рака. Изобретение также касается скрининговых анализов для идентификации активных противораковых агентов.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Рецепторы хемокинов и их лиганды направляют направленную миграцию клеток при нормальном гомеостазе ткани и при заболевании, влияя на подвижность, инвазивность и выживание клеток [1]. При воспалении и при раке хемокины в больных тканях вносят вклад в возобновление, прикрепление и инвазию лейкоцитов из кровеносных сосудов через базальную мембрану эндотелиальных клеток и в паренхиму [2].

CCR4 является одним из 18 известных рецепторов хемокинов. Рецепторы хемокинов, как правило, экспрессируются на иммунных клетках, и в микросреде опухоли ряд рецепторов и их лигандов присутствуют в инфильтрате иммунных клеток.

При многих раках злокачественные клетки также экспрессируют некоторые рецепторы хемокинов, которые обычно не обнаруживают на их нормальных аналогах. Считают, что метастатические раковые клетки приобретают характеристики лейкоцитов, экспрессирующих рецепторы хемокинов, используя хемокины, чтобы способствовать их миграции и выживанию в сайтах, отдаленных от исходной опухоли [3, 4, 5]. Неправильное присутствие на раковых клетках рецепторов хемокинов, которые обычно обладают очень ограниченной схемой экспрессии, дополнительно подтверждает гипотезу о том, что специфичные рецепторы хемокинов могут способствовать распространению и/или выживанию клеток в различных метастатических сайтах [8]. При карциномах, меланомах и гематологических злокачественных опухолях экспрессия рецепторов хемокинов, в частности CXCR4 и CCR7, на злокачественных клетках при прогрессирующем заболевании коррелирует с повышенным метастазом лимфатических узлов, более высокой диссеминацией заболевания, более низкой выживаемостью при свободе от заболевания и/или общей выживаемостью [6, 7, 8]. CXCR5 обычно ограничен В клетками и некоторыми подтипами Т-клеток, но также экспрессируется раковыми клетками поджелудочной железы, когда они вовлечены в закрепление метастазов печени; где печень является сайтом продуцирования лиганда CXCR5, CXCL13 [9]. Клетки меланомы, которые метастазировали в кишечнике, экспрессируют CCR9 [10]. При гомеостазе лиганд CCR9, CCL25 рекрутирует некоторые подгруппы Т-клеток в кишечнике. При раке поджелудочной железы пронаблюдали экспрессию CCR6 [38] [39]. Об экспрессии CCR6 также сообщено при карциноме почки человека, вместе с CCR3 и CXCR2 [40].

Таким образом, продемонстрировано, что известно небольшое количество рецепторов хемокинов, которые претерпевают повышающую регуляцию в опухолевых эпителиальных клетках при канцерогенезе поздней стадии, включая CXCR4, и считают, что они играют роль в инвазии и метастазе. Напротив, только недавно сообщили, что CCR4 претерпевает повышающую регуляцию при некоторых раках крови, в частности при Т-клеточных лимфомах.

Как описано выше, CXCR4 обычно обнаруживают на злокачественных клетках при многих прогрессирующих раках человека. Кроме того, Woerner et al. обнаружили, что CXCR4 также присутствовал на ранних стадиях заболевания при глиобластоме [20]. Однако, используя фосфо-специфическое антитело против CXCR4, они обнаружили, что при злокачественных поражениях меньшей степени стадии 1 уровень активации рецептора был намного ниже.

Хотя в целом описано, что экспрессия рецепторов хемокинов злокачественных клеток связана с прогрессирующим заболеванием, в данной области техники также есть несколько других сообщений об экспрессии рецептора хемокина на злокачественных клетках на ранних и преинвазивных стадиях рака, но все они касаются CXCR4. В обширном исследовании тканевых матриц (более 2000 образцов) рака молочной железы цитоплазматическая/мембранная экспрессия CXCR4 была описана в 67% дуктальных карцином in situ, DCIS [21]. Это было подтверждено в исследовании авторов Schmid et al., которые показали, что как CXCR4, так и его лиганд CXCL12 экспрессировались в DCIS [22]. Авторы изобретения также обнаружили CXCR4 на эпителиальных опухолевых клетках неинвазивной паранеоплазии яичника (Kulbe et al., рукопись, подготовленная к печати), и об этом также сообщили авторы Pils et al [23].

Доступные данные по экспрессии других рецепторов хемокинов на эпителиальных клетках при ранних раках отсутствуют, но есть свидетельство, что онкогенные биохимические пути могут индуцировать экспрессию рецепторов хемокинов на эпителиальных клетках. Онкоген RET/PTC 1 необходим и достаточен для злокачественной трансформации первичных тиреоцитов [24]. Этот онкоген индуцирует провоспалительную программу в тиреоцитах, которая включает индукцию функционального CXCR4. Альвеолярная рабдомиосаркома является высокоагрессивной опухолью, характеризующейся рекуррентными слияниями генов РАХ3 и PAX7-FKHR. Перенос PAX3-FKHR в клетки эмбриональной рабдомиосаркомы также активирует экспрессию CXCR4 [Libura, 2002 #9346].

Заключением всех этих исследований является то, что приобретение некоторых рецепторов хемокинов злокачественными клетками, по-видимому, является относительно поздним событием в злокачественном прогрессировании, и в случае CCR4 экспрессия не описана ни на одной стадии развития солидной опухоли.

Экспрессия CCR4, как правило, ограничена иммунной системой и известна в качестве маркера Th2 и регуляторных Т-клеток. В окружении опухоли эти клетки действуют таким образом, что подавляют созревание цитотоксических Т-клеток и дендритных клеток, подавляя, следовательно, противоопухолевые иммунные ответы. Кроме того, показано, что CCR4 экспрессируется при гематологических злокачественных опухолях, включая высокую долю Т-клеточных лимфом взрослых (ATL), и является значимым прогностическим фактором, связанным с метастазами в коже [35], [41]. Как таковой CCR4 представляет интерес в качестве терапевтической мишени при ATL [37], [42]. Экспрессия CCR4 при Т-клеточном лейкозе взрослых связана с кожными метастазами; его лиганды CCL17 и CCL22 продуцируются как злокачественными клетками, так и микросредой опухоли кожи [36]. Авторами Ishida et al. разработано моноклональное антитело против CCR4, терапевтическое для лечения Т-клеточной лимфомы взрослых, которое индуцирует активность АЗКЦ (антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности) против опухолевых клеток и может также действовать на иммуносупрессивные злокачественные клетки Treg, обнаруживаемые при этом заболевании [37].

Единственным сообщением в научной литературе о положительной по CCR4 клеточной линии солидной опухоли является клеточная линия рака легких человека SBC-5 [34]. Эти клетки мигрировали в направлении градиентов CCL22, и в ксенотрансплантатах костных метастазов SBC-5 существовала близкая совместная локализация остеокластов, экспрессирующих CCL22, и клеток SBC-5, экспрессирующих CCR4. Отсутствуют сообщения об экспрессии CCR4 в первичных опухолевых клетках человека.

В WO 05106471 (BAYER HEALTHCARE AG) раскрыты способы скрининга на агенты потенциального применения при лечении широкого ряда заболеваний; конкретно состоящего из сердечно-сосудистых заболеваний, желудочно-кишечных и печеночных заболеваний, воспалительных заболеваний, метаболических заболеваний, гематологических расстройств, раковых расстройств, неврологических расстройств, респираторных заболеваний и половых расстройств у млекопитающего. Этот способ скрининга определяет степень связывающего или иного действия агентов-кандидатов на CCR4. Имеется также описание скрининга широкого ряда клеток и тканей человека на уровень экспрессии ими CCR4 относительно экспрессии конститутивного гена. Клетки и ткани были получены из разрозненных источников, и только немногие были выделены из раковых клеток/тканей; например раковые клетки щитовидной железы, подвздошной кишки, HeLa, Jurkat, легкого и молочной железы. Результаты по относительной экспрессии CCR4 не проявляют какой-либо отличимой схемы, связанной с каким-либо конкретным заболеванием. Действительно, среди протестированных опухолевых клеток, например щитовидной железы и подвздошной кишки, были низкие уровни относительной экспрессии CCR4, а другие неопухолевые клетки проявляли более высокие уровни относительной экспрессии CCR4.

В WO 9623068 (GLAXO GROUP LIMITED) раскрыт рецептор хемокина, способный связываться с моноцитарным хемотаксическим фактором-1 (МСР-1/CCL2), воспалительным белком макрофагов Ia (MIPIa/CCL3) и/или 'RANTES' (регулируемым при активации, экспрессируемым нормальными Т-клетками и секретируемым/CCL5). Раскрыты нуклеотидная и аминокислотная последовательности для CCR4 (CC-CKR-4/K5.5, K5.5 и CC-CKR-4 являются альтернативными названиями для CCR4). Экспрессия CCR4 открыта в относительно ограниченном диапазоне нормальных тканей человека и в ряде Т-клеточных образцов. Имеется также общее описание скрининговых анализов на агенты, способные к активации Т-лимфоцитов или к блокированию связывания лигандов МСР-1, MIP-loc и/или RANTES с рецептором хемокина. Существует некоторое предположение, что активные агенты, полученные посредством скрининга, могут быть полезны, например, при лечении аллергий.

В WO 0041724A1 (LELAND STANFORD/LEUKOSITE) предложено модулирование направленной миграции системных Т-клеток памяти путем введения агентов, модулирующих CCR4. Его подразумевают в качестве лечения воспалительного кожного заболевания. Вещества, способные к модулированию связывания CCR4 с его лигандами, используют в тестах in vitro, чтобы показать, как оно влияет на миграцию Т-клеток.

Известны антитела, реактивные против CCR4. В WO 0164754 (Kyowa Hakko Kogyo) раскрыто рекомбинантное антитело или его фрагмент, предположительно специфично реагирующее с внеклеточным доменом CCR4. Описана также полипептидная последовательность такого антитела. Также раскрыто антитело, которое реагирует с CCR4-положительными клетками и является цитотоксическим или вызывает антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЗКЦ). Эти антитела предложены для применения при лечении Th2-опосредованных иммунных заболеваний или рака крови, конкретно лейкоза.

В WO 05035582 (Kyowa Hakko Kogyo) раскрыто антитело, способное к специфичному связыванию CCR4, а также раскрыто антитело к CCR4, которое имеет комплексное N-сцепленное гликозилирование в Fc области. Также раскрыты антитела к внеклеточным доменам CCR4.

В WO 03018635 (Kyowa Hakko Kogyo) раскрыты 'Человеческие CDR-привитые антитела и фрагменты'. Раскрыта специфичная CDR (область определения комплементарности), которая специфично связывается с CCR4. Антитела предложены для применения при диагностике или лечении Th2-опосредованных иммунных заболеваний и раков, таких как раки крови.

В WO 05053741 (Kyowa Hakko Kogyo) раскрыто лекарство, содержащее рекомбинантное антитело, которое специфично связывает CCR4, в комбинации по меньшей мере с одним другим агентом. Антитело предложено для лечения опухолей, конкретно опухолей гематологических органов.

В WO 0042074 (MILLENIUM PHARMACEUTICALS) раскрыты антитела к CCR4 и антитела, которые могут конкурировать за его связывание. Конкретные диагностические применения не раскрыты. Предложена терапия воспалительных заболеваний.

В данной области техники также известен ряд малых молекул, которые связываются с рецептором CCR4.

В WO 04007472 (ONO PHARMACEUTICAL CO.) раскрыто низкомолекулярное трициклическое соединение с активностью против CCR4.

В WO 05023771 (ONO PHARMACEUTICAL CO.) раскрыты низкомолекулярные азотсодержащие гетероциклические соединения с активностью против CCR4.

В WO 02094264 (TULARIK INC.) раскрыты специфичные соединения с ингибиторными активностями в отношении CCR4.

В WO 0230358 (TULARIK/CHEMOCENTRYX) раскрыты различные CCR4-связывающие соединения и их применения для лечения различных заболеваний, но не включающих рак.

В WO 0230357 (CHEMOCENTRYX) раскрыты соединения, которые являются антагонистами CCR4. В данной заявке описаны их применения для лечения воспалительных заболеваний и состояний.

В WO 051236976 (ASTELLAS PHARMA INC.) раскрыты производные хиназолина в качестве регуляторов CCR4.

В WO 05085212 (YAMANOUCHI PHARMACEUTICAL CO., LTD.) раскрыты производные пиримидина в качестве модуляторов CCR4.

В WO 05082865 (YAMANOUCHI PHARMACEUTICAL CO., LTD.) раскрыты конденсированные бициклические производные пиримидина в качестве агентов, регулирующих функцию CCR4.

В WO 04108717 (ASTRAZENECA АВ) раскрыты соединения сульфонамида, которые модулируют активность рецепторов хемокинов (в частности, CCR4).

В ЕР 1633729 (ASTRAZENECA АВ) раскрыты соединения сульфонамида, которые модулируют активность рецепторов хемокинов (в частности, CCR4).

В WO 03014153 (TOPIGEN PHARMACEUTIQUE INC.) раскрыта другая технология в данной области техники, способ модулирования вирусной инфекции клетки посредством модулирования взаимодействия между рецепторами хемокинов (включая CCR4) и вирусом.

В WO 2004/045526 (Morehouse School of Medicine) раскрыты антитела к конкретным хемокинам и рецепторам хемокинов и их применение при ингибировании роста и метастазов раковых клеток. Антитела были индуцированы против конкретных рецепторов хемокинов и их лигандов, которые не включают CCR4. Также описаны способы тестирования на гиперэкспрессию конкретных хемокинов в опухоли и сделано предположение, что такие опухоли можно лечить путем введения антител против конкретного хемокина или рецептора хемокина, проявляющего гиперэкспрессию.

В WO 99/15666 (Icos Corporation) раскрыты нуклеотидные последовательности и полипептидные последовательности хемокина С-С макрофагального происхождения, названного 'хемокином макрофагального происхождения' (Macrophage Derived Chemokine, MDC). MDC оказался синонимом CCL22. TARC оказался синонимом CCL17. Описаны способы рекомбинантного или синтетического продуцирования белка или полипептидных фрагментов MDC.

Также раскрыты антитела, реагирующие с MDC, а также анализы для идентификации модуляторов активности хемокинов MDC и TARC.

Рак шейки матки является вторым наиболее распространенным типом рака у женщин во всем мире. Симптомы часто отсутствуют до тех пор, пока рак не находится в поздней стадии, и, следовательно, рак шейки матки является предметом программы интенсивного популяционного скрининга с использованием мазков-отпечатков по Папаниколау, который может обнаружить предраковые изменения по гистопатологии. Хотя аномальный мазок-отпечаток по Папаниколау указывает на возможную неоплазию шейки матки, этого недостаточно для диагностики, которую впоследствии проводят путем биопсии и дополнительных инвазивных процедур ('кольпоскопии'). В Великобритании всего отмечают 24000 женщин ежегодно с аномальными мазками-отпечатками по Папаниколау. Мазок-отпечаток по Папаниколау обладает только 70% чувствительностью, следовательно, значительная доля женщин с раком шейки матки или преинвазивными повреждениями остается не диагностированной. Поэтому необходимы более точные способы скрининга, которые i) дают возможность в большей степени автоматизированного и менее субъективного скрининга, ii) улучшают чувствительность скрининга.

Инфекцию HPV (вируса папилломы человека) обнаруживают при большинстве инвазивных карцином шейки матки, и одной из стратегий является скрининг на присутствие маркеров HPV, таких как Е6 и Е7, совместно с мазком-отпечатком по Папаниколау. Однако вследствие высокого уровня инфекции HPV у половозрелого населения (вплоть до 80% инфекции в анамнезе) это также приводит в результате к идентификации большого числа ложноположительных результатов и делает точность теста зависимой от распространенности HPV. Как таковая идентификация новых биомаркеров для рака шейки матки остается областью активного интереса.

Кроме того, новые или альтернативные биомаркеры необходимы для других форм рака, включающих, но не ограниченных ими, приведенные ниже типы рака: бронхов, носоглотки, гортани, мелкоклеточный и немелкоклеточный рак легкого, кожи (например, меланому или базально-клеточную карциному), головного мозга, поджелудочной железы, шеи, легкого, почки, печени, молочной железы, ободочной кишки, мочевого пузыря, пищевода, желудка, шейки матки, яичника, зародышевых клеток и простаты. Биомаркер, характеристический для одного типа рака, может быть общим с другими типами рака, таким образом, использование биомаркера может быть более широким, чем для исходного типа рака, для которого он был обнаружен как связанный с ним.

Существует необходимость в усовершенствованных биомаркерах для ряда раков, которые дают возможность стратификации пациентов, нуждающихся в противораковом лечении.

Стадия рака является дескриптором (обычно номера I-IV) того, насколько распространился рак. Стадия часто учитывает размер опухоли, насколько глубоко она проникла, инвазировала ли она соседние органы, метастазировала ли она в лимфатические узлы и насколько, и распространилась ли на удаленные органы. Стадирование рака важно, поскольку стадия при диагностике является наиболее сильным предсказателем выживания, и часто на основании стадии меняют терапии.

Правильное стадирование является принципиальным, поскольку лечение непосредственно связано со стадией заболевания. Поэтому неправильное стадирование привело бы к неправильному лечению и существенному снижению выживаемости пациента. Правильное стадирование, однако, может быть с трудом достигнуто. Патологическое стадирование, где патолог исследует срезы ткани, может быть особенно проблематичным по двум конкретным причинам: визуальное различение и случайный отбор образцов ткани. "Визуальное различение" означает обладание способностью идентифицировать отдельные раковые клетки, перемешанные со здоровыми клетками, на микроскопическом препарате. Упущение одной клетки может означать ошибочное стадирование и привести к серьезному неожидаемому распространению рака. "Случайный отбор образцов" относится к тому факту, что образцы выбирают из лимфатических узлов пациента и исследуют случайным образом. Если раковые клетки, присутствующие в одном лимфатическом узле, оказываются не присутствующими на наблюдаемых микроскопических препаратах ткани, результатом может быть неверное стадирование и неправильное лечение.

Продолжает существовать необходимость в новых терапиях против рака, которые включают усовершенствованные пути введения существующих противораковых средств, или которые включают идентификацию, тестирование и проверку эффективных новых противораковых средств. Также продолжает существовать необходимость в усовершенствованных способах мониторинга эффективности существующих и любых новых противораковых средств в ходе данной схемы лечения. Необходимы усовершенствованные способы создания данных прогностического значения. Дозировка и частота терапий с применением противораковых средств является важным фактором. Определение времени начала противоракового лечения относительно стадии прогрессирования рака или относительно группы пациентов также являются важными факторами. Усовершенствованные способы мониторинга необходимы с целью поиска оптимальных терапий для пациентов либо как индивидуумов, либо классифицированных на группы на основании генетических, фенотипических или других характеристик.

Примером прогностической функции биомаркера при выборе лечения для пациента является применение противоракового лекарства герцептина (трастузумаба). Ген HER2/neu является протоонкогеном, локализованным в длинном плече хромосомы 17(17ql 1.2-ql2) человека, и амплификация HER2/neu происходит при 25-30% раках молочной железы ранней стадии. При раке нарастание стимулирующих сигналов от HER2/neu конститутивно передается, стимулируя инвазию, выживание и ангиогенез клеток. Кроме того, гиперэкспрессия может также придавать терапевтическую устойчивость к противораковым терапиям. Герцептин (трастузумаб) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, которое связывается с внеклеточным сегментом рецептора HER2/neu (также известного как ErbB-2), и является единственно эффективным при лечении рака молочной железы, где происходит гиперэкспрессия рецептора HER2/neu. В связи с его прогностической ролью, а также способностью к предсказанию ответа пациента на герцептин раки молочной железы рутинно проверяют на гиперэкспрессию HER2/neu с помощью ряда методик, включая иммуногистохимию (ИГХ), хромогенную и флуоресцентную гибридизацию in situ (CISH и FISH соответственно).

Также существует необходимость в более точных и надежных способах диагностики/стадирования раков и необходимость в новых способах скрининга противораковых агентов.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения неожиданно открыли, что при некоторых солидных опухолях экспрессия рецептора хемокина CCR4 является ранним событием в канцерогенезе. Кроме того, авторы изобретения открыли, что экспрессия двух лигандов CCR4, CCL7 и CCL22, повышается в процессе прогрессирования опухоли.

В настоящем изобретении предложен способ получения информации предсказательного или диагностического характера для пациента со злокачественным новообразованием, включающий стадию измерения количества и/или активности рецептора хемокина CCR4, экспрессирующегося в опухолевых клетках в образце солидной опухоли или в образце негематологических опухолевых клеток, взятом от пациента, где количество и/или активность CCR4 дает информацию предсказательного или диагностического характера.

Гематологические опухоли имеют происхождение от клеток крови, включая иммунные клетки, и включают лейкозы и лимфомы различных типов. Следовательно, изобретение не относится к гематологическим опухолям.

В солидных или негематологических опухолях, к которым относится изобретение, CCR4 экспрессируется клетками опухоли. Способы по изобретению, таким образом, относятся к CCR4, экспрессируемому образцами опухолевых клеток пациента (или нормальных клеток) и по существу не экспрессируемому клетками иммунной системы. В той степени, в которой CCR4 появляется в каких-либо образцах опухоли пациента из нежелательного источника, такого как инфильтрирующие иммунные клетки, количество и/или активность CCR4, измеряемые в соответствий с изобретением, либо незначительны, либо их можно контролировать в любых проводимых измерениях.

В предпочтительных формах осуществления стандартное количество и/или уровень активности CCR4 можно измерить в одном или более чем одном неопухолевом образце. Неопухолевый образец, или по меньшей мере один из них, может быть взят от пациента. Когда стандартное количество и/или уровень активности CCR4 определяют из неопухолевых клеток пациента, отдельный образец неопухолевой ткани может быть взят от пациента. Если желательно, множество неопухолевых образцов может быть взято из различных локализаций одного и того же пациента. Стандартное количество, таким образом, может представлять собой среднее значение, определенное из ряда образцов, взятых от пациента.

В других формах осуществления один или более чем один неопухолевый образец необязательно не берут от пациента. Такие образцы могут быть взяты от других пациентов, и они могут включать культивируемые опухолевые клеточные линии.

Информацию можно использовать для предсказания того, будет ли солидная опухоль или опухоль негематологических клеток пациента чувствительной к противораковой терапии. Данный аспект изобретения предпочтительно дает возможность стратификации пациентов со злокачественным новообразованием. Это дает возможность идентифицировать оптимальную противораковую терапию или схему лечения для данного индивидуального пациента.

В предпочтительных формах осуществления пациент получит противораковую терапию, и измерения количества и/или активности CCR4 в образце солидной опухоли или в образце негематологической опухоли пациента можно проводить до и после начала лечения, а затем использовать полученную информацию, чтобы определить, отреагировала ли солидная опухоль или опухоль негематологических клеток пациента на противораковую терапию. Данный аспект изобретения предпочтительно дает возможность мониторинга пациентов со злокачественным новообразованием, чтобы определить, как прогрессирует их индивидуальное лечение. Регулирование схемы лечения можно проводить в свете полученного прогресса.

Информацию можно использовать при диагностике солидной опухоли или опухоли негематологических клеток.

Информацию можно использовать для стадирования солидной опухоли или опухоли негематологических клеток.

В изобретении также предложен способ получения информации предсказательного или диагностического характера для пациента со злокачественным новообразованием, опухолевые клетки которого экспрессируют рецептор хемокина CCR4, включающий стадию измерения количества и/или активности лиганда CCR4, CCL17 и/или CCL22, в образце солидной опухоли или в образце негематологических опухолевых клеток, взятом от пациента, где количество и/или активность CCL17 и/или CCL22 дает информацию предсказательного или диагностического характера.

Информация предсказательного или диагностического характера может быть получена путем сравнения количества и/или активности CCL17 и/или CCL22 в образце солидной опухоли или в образце негематологических опухолевых клеток с стандартным количеством и/или уровнем активности CCL17 и/или CCL22.

Стандартное количество и/или уровень активности CCL17 и/или CCL22 можно измерить в одном или более чем одном неопухолевом образце. Как в предыдущем аспекте изобретения, неопухолевые образцы могут быть взяты от пациента или от другого пациента или источника, включая культивируемые клеточные линии.

Информацию можно использовать для предсказания того, будет ли солидная опухоль или опухоль негематологических клеток пациента чувствительной к противораковой терапии.

В следующих необязательных формах осуществления пациент получил противораковую терапию и измерения количества и/или активности CCL17 и/или CCL22 проводят до и после начала лечения и используют полученную информацию, чтобы определить, отреагировала ли солидная опухоль или опухоль негематологических клеток пациента на противораковую терапию.

Во всех аспектах изобретения конкретная противораковая терапия может содержать агент, который модулирует или ингибирует экспрессию или активность CCR4.

В изобретении также предложено применение антитела, реактивного против рецептора хемокина CCR4, для обнаружения присутствия или измерения количества CCR4, экспрессируемого солидной опухолью или негематологической опухолью, у пациента со злокачественным новообразованием, где присутствие или количество CCR4, экспрессируемого опухолью, и при обнаружении или измерении получения информации диагностического характера.

Далее в изобретении предложено применение олигонуклеотидного праймера или зонда, способного к гибридизации в жестких условиях с нуклеиновой кислотой SEQ ID NO:1, для обнаружения или количественного измерения экспрессии CCR4 клетками солидной опухоли или негематологической опухоли, где присутствие или количество CCR4, экспрессируемого опухолью, при обнаружении или измерении дает информацию диагностического характера.

Вышеупомянутые применения, к которым может быть применено изобретение, являются такими, как определено здесь выше в отношении аспектов способа по изобретению.

Нуклеиновая кислота SEQ ID NO:1 не ограничена конкретной последовательностью, но включает варианты, которые все же кодируют биологически активный белок CCR4. Такие варианты могут включать нуклеотидные последовательности, обладающие по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO:1. Другие варианты могут обладать по меньшей мере 95%, возможно по меньшей мере 90% идентичностью. В данной заявке раскрыт диапазон идентичностей от по меньшей мере 65% до по меньшей мере 99% идентичности с SEQ ID NO:1.

Разнообразие жестких условий гибридизации должно быть знакомо читателю, являющемуся специалистом в данной области техники. Гибридизация молекулы нуклеиновой кислоты происходит, когда две комплементарных молекулы нуклеиновой кислоты претерпевают образование множества водородных связей друг с другом. Жесткость гибридизации может варьировать в соответствии с условиями среды, окружающей нуклеиновые кислоты, от природы способа гибридизации и от состава и длины используемых молекул нуклеиновой кислоты. Вычисления, касающиеся условий гибридизации, необходимых для достижения конкретных степеней жесткости, обсуждены в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001); и Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York, 1993). T_m представляет собой температуру, при которой 50% определенной нити молекулы нуклеиновой кислоты гибридизуется с ее комплементарной нитью. Ниже приведен примерный набор условий гибридизации, и он не является ограничивающим:

Очень высокая жесткость (дает возможность гибридизации последовательностей, обладающих по меньшей мере 90% идентичностью)

Гибридизация: 5× SSC при 65°С в течение 16 часов

Отмывка дважды: 2× SSC при комнатной температуре (КT) в течение 15 минут каждая

Отмывка дважды: 0,5× SSC при 65°С в течение 20 минут каждая

Высокая жесткость (дает возможность гибридизации последовательностей, обладающих по меньшей мере 80% идентичностью)

Гибридизация: 5×-6× SSC при 65°С-70°С в течение 16-20 часов

Отмывка дважды: 2× SSC при КТ в течение 5-20 минут каждая

Отмывка дважды: 1× SSC при 55°С-70°С в течение 30 минут каждая

Низкая жесткость (дает возможность гибридизации последовательностей, обладающих по меньшей мере 50% идентичностью)

Гибридизация: 6× SSC при КТ - 55°С в течение 16-20 часов

Отмывка по меньшей мере дважды: 2×-3× SSC при КТ - 55°С в течение 20-30 минут каждая.

Изобретение включает способ лечения пациента со злокачественным новообразованием, имеющего солидную опухоль или негематологическую опухоль, экспрессирующую CCR4, включающий введение эффективного количества агента, который модулирует или ингибирует экспрессию или активность CCR4.

Агент можно вводить в форме фармацевтической композиции. Пригодные композиции включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Композиции могут дополнительно содержать вспомогательные агенты или эксципиенты, как известно в данной области техники, см., например, Berkow et al., The Merck Manual, 16 edition Merck & Co., Rahman, NJ (1992), Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3^rd edition, ADIS Press, Ltd., Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1987) & Osol (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA 1324-1341 (1980). Фармацевтические композиции, вводимые в соответствии с изобретением, предпочтительно представлены в форме индивидуальных доз (стандартных доз).

Композиция или лекарство, которые используют в способах и применениях по изобретению, могут дополнительно содержать соли, буферы или другие вещества, которые желательны для улучшения эффективности композиции. Введение композиции или лекарства в соответствии с изобретением может быть местным или системным.

Изобретение также включает применение агента, модулирующего или ингибирующего рецептор хемокина CCR4, для лечения или предупреждения солидных опухолей или негематологических опухолей.

Во всех аспектах вышеупомянутого способа и применения по изобретению агент, который модулирует или ингибирует экспрессию или активность CCR4, может представлять собой:

(i) антитело, которое связывается с CCR4; возможно антитело против CCR4, которое раскрыто в любой из заявок WO 0041724, WO 0164754, WO 05035582, WO 03018635, WO 05053741, WO 0042074; либо

(ii) антитело, которое связывается с лигандами CCR4, CCL17 или CCL22; возможно антитела против CCL17 или против CCL22, которые раскрыты в заявке WO 99/15666 или в статье Ishida, Т., et al (2004) Clin Cancer Res 10:7529-7539.

(iii) антагонист CCR4; возможно антагонист CCR4, который раскрыт в любой из заявок WO 04007472, WO 05023771, WO 02094264, WO 0230358, WO 0230357, WO 051236976, WO 05085212, WO 05082865, WO 04108717, EP 1633729, WO 03014153.

Соответствующие композиции и препараты активных агентов включают те, которые описаны в вышеупомянутых публикациях.

Кроме того, в изобретении предложен набор для получения информации предсказательного или диагностического характера для пациента со злокачественным новообразованием на основании образца солидной опухоли или образца негематологической опухоли от пациента, который содержит:

по меньшей мере один реагент, выбранный из антитела, реагирующего с CCR4, антитела, реагирующего с CCL17, антитела, реагирующего с CCL22, и олигонуклеотидного зонда или праймера, способного к гибридизации с SEQ ID NO:1 в жестких условиях; и

указания, направляющие пользователя набора на применение реагента к образцу солидной опухоли или негематологической опухоли от пациента таким образом, чтобы измерить количество и/или активность одного или более чем одного из CCR4, CCL17 и CCL22 в образце.

В некоторых формах осуществления набор может содержать стандартный образец одной или более чем одной неопухолевой клетки и указания представляют собой серию инструкций и направляют пользователя набора на измерение количества и/или уровня активности одного или более чем одного из CCR4, CCL17 и CCL22 как в образце пациента, так и в стандартном образце. Стандартный образец (образцы) может содержать культивируемые опухолевые клетки или клеточные экстракты.

В других формах осуществления указания могут представлять собой серию инструкций и включают стандартные значения для стандартного количества и/или уровня активности одного или более чем одного из CCR4, CCL17 и CCL22. Стандартные значения предпочтительно получают в результате предшествующей работы, проведенной путем снятия измерений количеств и/или активности CCR4, CCL17 или CCL22 в избранных неопухолевых образцах от индивидуумов или пациентов независимо от того, имеют ли они или имели ли они раковое состояние. Такие предшествующие измерения могут быть проведены на культивируемых неопухолевых клеточных линиях человека.

Изобретение также включает способ скрининга на противораковый агент, активный против солидной опухоли или негематологической опухоли, которая экспрессирует рецептор хемокина CCR4, включающий стадии:

i) получение тестируемых клеток, которые экспрессируют CCR4 и способны к проявлению или находятся в процессе проявления биологической активности, выбранной из (а) пролиферации, (б) миграции, (в) секреции белка или сигнальной молекулы или (г) выживания клеток при культивировании в указанных условиях;

ii) воздействие на тестируемые клетки агента-кандидата в течение периода времени,

iii) измерение биологической активности тестируемых клеток, где отсутствие биологической активности или биологическая активность, которая является меньшей, чем ожидаемая активность таких тестируемых клеток в отсутствие агента-кандидата, идентифицирует противораковый агент.

При предпочтительных способах контрольную аликвоту тестируемых клеток не подвергают воздействию агента-кандидата и биологическую активность контрольных клеток измеряют таким образом, чтобы определить ожидаемую биологическую активность.

Биологическую активность тестируемых клеток и любых контрольных клеток можно индуцировать добавлением лиганда рецептора CCR4, предпочтительно CCL17 и/или CCL22.

Во всех аспектах изобретения солидная опухоль или негематологическая опухоль может представлять собой рак, выбранный из рака шейки матки, пищевода, почки, головного мозга, молочной железы, яичника, простаты, желудка или поджелудочной железы. Изобретение может обладать особым преимуществом в отношении раков шейки матки, пищевода, почки, головного мозга, молочной железы и яичника.

В изобретении, таким образом, предложен способ определения пригодности для пациента со злокачественным новообразованием лечения агентом, который модулирует экспрессию CCR4 и/или активность CCR4, включающий определение количества или активности CCR4 в образце опухолевых клеток пациента.

Далее в изобретении предложен способ определения пригодности для пациента со злокачественным новообразованием лечения агентом, который модулирует уровни активности CCL17 и/или CCL22, включающий определение количества или активности CCL17 и/или CCL22 в образце опухолевых клеток пациента.

Таким образом, в изобретении предложено применение CCR4, CCL17 и/или CCL22 в качестве биомаркера для стратификации пациентов со злокачественным новообразованием в соответствии с пригодностью для них лечения агентами, модулирующими или ингибирующими CCR4, CCL17 и/или CCL22, включая агенты, раскрытые в данной заявке.

Пригодность для пациента со злокачественным новообразованием лечения конкретным терапевтическим агентом направлена множеством факторов, некоторые из которых взаимосвязаны. Возраст пациента, пол, стадия рака, тип рака, генотип пациента, факторы образа жизни, такие как режим питания или курение, могут все воздействовать на потенциальный исход данной схемы лечения. Стратификацию обычно предпринимают с целью группировки пациентов на основании множества выбранных параметров, которые могут дать возможность сделать предсказания в отношении клинического исхода для группы пациентов или для индивидуального пациента, попадающего в группу.

Как правило, повышенный уровень активности одного или более чем одного из CCR4, CCL17 и/или CCL22 в образце опухоли пациента является показателем пациента, для которого благоприятно лечение противораковыми агентами, раскрытыми в данной заявке.

Изобретение также включает способ мониторинга эффективности противораковой терапии у пациента, включающий определение количества или активности CCR4 в образце опухолевых клеток от пациента.

Далее изобретение включает способ мониторинга эффективности противораковой терапии у пациента, включающий определение количества или активности CCL17 и/или CCL22 в образце опухолевых клеток от пациента.

При вышеупомянутых способах взятие образцов опухолевых клеток можно осуществлять до, во время и/или после введения противоракового агента.

В изобретении также предложены способы предупреждения или лечения некоторых солидных опухолей, как описано в данной заявке, включающие введение агента, выбранного из:

(а) агентов, модулирующих CCR.4, например, как раскрыто в WO 0041724А1 (LELAND STANFORD/LEUKOSITE);

(б) антител против CCR4, например, как раскрыто в WO 0164754 (Kyowa Hakko Kogyo), WO 05035582 (Kyowa Hakko Kogyo), WO 03018635 (Kyowa Hakko Kogyo), WO 05053741 (Kyowa Hakko Kogyo) или WO 0042074 (MILLENIUM PHARMACEUTICALS); или

(в) антагонистов CCR4, например, как раскрыто в WO 04007472 (ONO PHARMACEUTICAL CO.), WO 05023771 (ONO PHARMACEUTICAL CO.), WO 02094264 (TULARIK INC.), WO 0230358 (TULARIK/CHEMOCENTRYX), WO 0230357 (CHEMOCENTRYX), WO 051236976 (ASTELLAS PHARMA INC.), WO 05085212 (YAMANOUCHI PHARMACEUTICAL CO., LTD.), WO 05082865 (YAMANOUCHI PHARMACEUTICAL CO., LTD.), WO 04108717 (ASTRAZENECA AB), EP 1633729 (ASTRAZENECA AB) или WO 03014153 (TOPIGEN PHARMACEUTIQUE INC.).

Таким образом, в изобретении также предложен способ диагностики солидной опухоли у индивидуума, чувствительного к лечению агентами, модулирующими CCR4, антителами против CCR4 или антагонистами CCR4, включающий определение уровня активности и/или экспрессии CCR4, CCL17 и/или CCL22 в образце опухоли от пациента. Повышенные уровни активности и/или экспрессии либо в абсолютном отношении на стандартизованной основе по отношению к стандартным значениям, либо на относительной (стандартизованной) основе, как между (а) опухолевыми/неопухолевыми клетками или (б) опухолевыми клетками со временем, как правило, являются показателем опухоли, чувствительной к лечению агентами против CCR4, раскрытыми в данной заявке.

Изобретение включает способ предоставления информации диагностической релевантности для диагностики или лечения солидных опухолей, который включает определение количества или активности CCR4, CCL17 и/или CCL22 в образце клеток от пациента, подозреваемого на рак.

В настоящем изобретении также предложен способ идентификации или стадирования рака у индивидуума, включающий определение уровня одного или более чем одного из рецептора хемокина CCR4 или его лигандов CCL22 или CCL17 в образце опухолевых клеток, полученном от индивидуума, где рак представляет собой солидную опухоль.

Предпочтительно способы по изобретению обеспечивают более надежный и более точный путь идентификации или стадирования рака у индивидуума или стратификации индивидуумов для выбора соответствующих терапий, в частности, в отношении солидных опухолей, более конкретно раков шейки матки и пищевода, но также включающих раки, выбранные из группы, состоящей из рака бронхов, носоглотки, гортани, мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легкого, кожи (например, меланомы или базально-клеточной карциномы), головного мозга, поджелудочной железы, шеи, легкого, почки, печени, молочной железы, ободочной кишки, мочевого пузыря, пищевода, желудка, шейки матки, яичника, зародышевых клеток и простаты.

Образцы, полученные от пациентов, предпочтительно представляют собой образцы биопсии. Биопсия представляет собой диагностический тест, включающий удаление клеток или тканей для исследования. Ткань обычно исследует под микроскопом патолог и/или ее можно проанализировать химически, используя методики, хорошо известные в данной области техники для оценки уровней белка или РНК. Когда удаляют меньший образец ткани, процедуру называют инцизионной биопсией или толстоигольной биопсией. Когда удаляют опухоль целиком или подозрительную область, процедуру называют эксцизионной биопсией. Когда образец ткани или жидкости удаляют иглой, процедуру называют тонкоигольной прицельно-аспирационной биопсией.

В альтернативных формах осуществления образцы могут быть получены от пациентов другими способами, хорошо известными в данной области техники, включающими, но не ограниченными ими, образцы крови, сыворотки, мочи, мокроты, асцитов, внутрибрюшинных жидкостей и образцы клеток, взятые путем мазка со слизистой оболочки шейки матки.

Образцы крови могут быть взяты посредством венепункции (например, с помощью вакуумной пробирки для сбора образцов или шприца), катетера, канюли, либо путем прокола пальца или прокола пятки в соответствии с нуждами пациента и необходимым количеством крови. Как только образец крови взят, его можно обработать перед анализом (например, цитратом натрия, ЭДТА, этанолом или гепарином) в целях консервации или в целях максимального повышения точности и/или надежности сигнала, полученного в результате анализа образца.

Способы обработки (например, центрифугирование и/или фильтрование) можно использовать для разделения образца крови на фракции, каждую из которых можно тестировать независимо. Например, образец сыворотки крови получают, давая возможность образцу цельной крови свернуться при контакте с воздухом, где свернувшуюся фракцию удаляют центрифугированием, чтобы оставить сыворотку в виде надосадочной жидкости.

Образцы мочи предпочтительно собирают путем мочеиспускания или катетеризации.

Образцы мокроты можно собирать от пациента путем откашливания и/или отделения мокроты "полным ртом", либо путем экстракции образца аспирационной трубкой или иглой, введенной в дыхательные пути. Предпочтительно образцы мокроты должны иметь минимальный контакт со слюной во избежание загрязнения.

Мазок со слизистой оболочки шейки матки (например, мазок-отпечаток по Папаниколау, также называемый мазком Рар или влагалищным мазком) можно использовать для взятия образца клеток от пациента. В случае влагалищного мазка тестируемые клетки собирают и удаляют с поверхности ткани, исследуемой с помощью физического контакта шпателем Эйлсбери, щеточкой с пластмассовыми волосками или другим инструментом.

Клетки и/или жидкость, собранные в образце, взятом от пациента, можно обработать сразу или сохранить в подходящей среде для хранения для последующей обработки. Например, в случае влагалищного мазка клетки часто сохраняют в среде для хранения на основе этанола для последующей обработки и анализа. Образец можно обработать в целях консервации или для максимального повышения точности и/или надежности сигнала, полученного в результате анализа образца. Способы обработки (например, центрифугирование и/или фильтрование) можно использовать для разделения образца на фракции, каждую из которых можно тестировать независимо.

При всех способах и применениях по изобретению, определенных или описанных либо здесь выше, либо здесь ниже, раки представляют собой те, которые вызывают солидные опухоли. Рак предпочтительно представляет собой рак, выбранный из группы, состоящей из рака бронхов, носоглотки, гортани, мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легкого, кожи (например, меланомы или базально-клеточной карциномы), головного мозга, поджелудочной железы, шеи, легкого, почки, печени, молочной железы, ободочной кишки, мочевого пузыря, пищевода, желудка, шейки матки, яичника, зародышевых клеток и простаты. Более предпочтительно раки представляют собой раки шейки матки, пищевода, почки, головного мозга, молочной железы и яичника.

В других формах осуществления рак может представлять собой карциному, предпочтительно чешуйчато-клеточную карциному (SCC) или аденокарциному, предпочтительно выбранную из раков шейки матки, пищевода, почки, головного мозга, молочной железы и яичника.

В предпочтительных формах осуществления повышенный уровень CCR4 и/или CCL17 и/или CCL22, продуцируемых опухолевыми клетками, идентифицирует злокачественный рак или перспективно злокачественный рак.

Можно определить уровень одного или более чем одного из CCR4 и/или CCL17 и/или CCL22, продуцируемых в неопухолевых клетках, и сравнить уровень в опухолевых и в неопухолевых клетках.

В предпочтительных формах осуществления определяют уровень одного CCR4. В других формах осуществления определяют уровень одного CCL17 или CCL22.

Уровень CCR4 и/или CCL17 и/или CCL22 в опухолевых клетках можно сравнить с предопределенными уровнями. Предопределенные уровни можно вывести из нормальной нераковой ткани, раковой ткани ранней стадии, данных, полученных из баз данных, либо непосредственно из доступного биологического материала или образцов.

В способах по изобретению можно использовать различные пути определения уровня CCR4, и/или CCL17, и/или CCL22. Предпочтительно уровень и/или активность белка CCR4, и/или CCL17, и/или CCL22 можно использовать в качестве меры генных продуктов CCR4, и/или CCL17, и/или CCL22 в образце.

В следующей предпочтительной форме осуществления уровень белка CCR4, и/или, CCL17 и/или CCL22 измеряют с использованием антитела, реактивного против CCR4, CCL17 и CCL22 соответственно, предпочтительно специфичного антитела, например моноклонального антитела.

Локализацию и количество специфичных белков можно определить с помощью микроскопии и гистологических методик. Используя методики приготовления препарата образца, окрашивания и зондирования, хорошо известные в данной области техники, можно показать структуру клеток и можно обнаружить специфичные белки, связанные с ними, и их локализацию внутри обнаруженного образца.

Гистологические красители хорошо известны в данной области техники, и их можно использовать, чтобы показать морфологию клеток и/или более специфичных клеточных компонентов. Обычно используемые красители включают гематоксилин (который окрашивает нуклеиновые кислоты и эргастоплазму, синий) и эозин (который окрашивает эластические и ретикулярные волокна, розовый).

Иммуногистохимия представляет собой методику, где антитела к специфичным белкам используют для обнаружения указанных белков в образцах. Связывание антигена с антителом в образце можно обнаружить разнообразными путями.

Наиболее стандартным способом является конъюгация фермента, который катализирует реакцию изменения цвета (например, щелочной фосфатазы, пероксидазы хрена), с антителом, таким образом, использование подходящего хромогенного субстрата позволяет визуализировать локализацию антигена под световым микроскопом. Вариацией данного способа является иммунофлуоресценция, где антитело конъюгируют с флуорофором (например, ФИТЦ, родамином, техасским красным), который испускает обнаружимый сигнал при возбуждении подходящим источником энергии. Обычно он представляет собой свет определенной длины волны. Иммунофлуоресценция обладает преимуществом, поскольку использование множественных флуорофоров, присоединенных к различным антителам, дает возможность обнаружения множественных мишеней внутри образца, и особенно пригодна для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, которая является высокочувствительной и может быть также использована для визуализации взаимодействий между множественными белками.

Часто обнаружение специфичного антигена осуществляют многостадийным непрямым способом. Немеченое или неконъюгированное 'первое' антитело, индуцированное против антигена, на который проводят тестирование, используют для связывания указанного антигена. Затем это 'первое' антитело может быть обнаружено посредством 'второго' антитела, конъюгированного с обнаружимым маркером и индуцированного таким образом, чтобы оно реагировало с иммуноглобулином вида, в котором было индуцировано 'первое' антитело.

При измерении уровней белка с использованием антител можно использовать методики, такие как ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), RIA (радиоиммунологический анализ), EMIT (иммуноанализ с ферментативным усилением), анализ белковой микроматрицы, проточная цитометрия, Вестерн-блоттинг, дот-блоттинг или слот-блоттинг, предпочтительно методология является количественной.

Проточная цитометрия представляет собой методику для подсчета, исследования и сортировки микроскопических частиц, суспендированных в потоке жидкости. Она дает возможность одновременного многопараметрического анализа физических и/или химических характеристик отдельных клеток, протекающих через аппарат оптического и/или электронного обнаружения.

Сортировка клеток с возбуждением флуоресценции (FACS) является специализированным типом проточной цитометрии. Она обеспечивает способ сортировки гетерогенной смеси биологических клеток в два или более чем два контейнера, одна клетка одновременно, основанный на специфичном светорассеянии и флуоресцентных характеристиках каждой клетки. Она является полезным научным инструментом, поскольку обеспечивает быструю, объективную и количественную регистрацию флуоресцентных сигналов от индивидуальных клеток, а также физическое разделение клеток, представляющих особый интерес.

Популяция клеток в образце обычно гетерогенна. С целью обнаружения различий между клетками их обрабатывают с помощью химических или иммунохимических методик, подобных методикам гистохимии. Иммунохимическое обнаружение антигенов можно осуществлять, используя антитела, меченные флуорофорами, такими как ФИТЦ, Су5 и GFP. Окрашивание клеток красителями (такими как ДНК-связывающие красители, такие как SYBR-Green и DAPI) можно использовать для обнаружения различий, таких как размер клетки или стадия клеточного цикла, внутри образца или между образцами. Использование этих методик в комбинации дает возможность различным клеткам среди гетерогенных давать специфичные профили флуоресценции, которые различимы проточным цитометром. Таким образом, можно обнаружить клетки, экспрессирующие определенные антигены или связанные с конкретными профилями светорассеяния, и измерить их преобладание в популяции образца.

Альтернативно уровень CCR4, и/или CCL17, и/или CCL22 можно определить путем измерения уровня мРНК, кодирующей CCR4, и/или CCL17, и/или CCL22, как меры уровня генных продуктов CCR4, и/или CCL17, и/или CCL22 в образце.

В следующих предпочтительных формах осуществления изобретения уровень мРНК измеряют способом количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР), предпочтительно способом кПЦР, где матрицей является продукт обратнотранскриптазной реакции (ОТ-кПЦР).

В предпочтительных формах осуществления мРНК экстрагируют из образца и подвергают обратной транскрипции с получением кДНК перед кПЦР.

В других предпочтительных формах осуществления уровень транскрипции CCR4, и/или CCL17, и/или CCL22 измеряют, используя анализ защиты от нуклеаз, где предпочтительно используемый зонд специфичен к CCR4, и/или CCL17, и/или CCL22.

В других предпочтительных формах осуществления изобретения уровень мРНК измеряют, используя микроматрицу ДНК.

Микроматрица ДНК (также известная как генный или геномный чип, ДНК чип или анализатор экспрессии с генной матрицей) представляет собой коллекцию микроскопических пятен ДНК, обычно представляющих отдельные гены, расположенных на твердой поверхности путем ковалентного присоединения к химически пригодным матрицам. Качественные или количественные измерения с помощью микроматриц ДНК используют селективную природу ДНК-ДНК или ДНК-РНК гибридизации в условиях высокой жесткости. Обнаружение на основе флуорофоров можно использовать для определения степени гибридизации, на основании которой можно вычислить количественную меру.

В предпочтительных формах осуществления рак представляет собой злокачественный рак. Альтернативно рак может представлять собой предраковое поражение. Способ по изобретению может предпочтительно идентифицировать стадию, до которой прогрессировал рак у пациента, позволяя посредством этого идентифицировать наиболее подходящий курс лечения.

В соответствии со способом по изобретению, описанным здесь выше, включая все субсидиарные аспекты, в изобретении также предложено применение рецептора CCR4 в качестве маркера для идентификации и/или стадирования рака. Рецептор CCR4 может быть обнаружен с помощью антитела, предпочтительно специфичного антитела, например моноклонального антитела.

Подобным образом в изобретении также предложено применение лиганда CCL17 в качестве маркера для идентификации и/или стадирования рака. Лиганд CCL17 может быть обнаружен с помощью антитела, предпочтительно специфичного антитела, например моноклонального антитела.

В изобретении также предложено применение лиганда CCL22 в качестве маркера для идентификации и/или стадирования рака. Лиганд CCL22 может быть обнаружен с помощью антитела, предпочтительно специфичного антитела, например моноклонального антитела.

Изобретение включает способ лечения или предупреждения злокачественного заболевания у индивидуума, страдающего раком, включающий лечение индивидуума эффективным количеством антител, реактивных против CCR4, и/или CCL17, и/или CCL22. В изобретении, таким образом, предложено применение антител, реактивных против CCR4, и/или CCL17, и/или CCL22, для получения лекарства для лечения или предупреждения рака у индивидуума, страдающего раком.

В следующей форме осуществления изобретения антитела, реактивные против CCR4, и/или CCL17, и/или CCL22, можно применять при получении лекарства для лечения или предупреждения рака.

В предпочтительной форме осуществления лекарство содержит антитело, специфичное к CCR4, которое может представлять собой моноклональное антитело.

Формами осуществления данного аспекта изобретения являются, например, антитела, раскрытые в WO 0164754 (Kyowa Hakko Kogyo), WO 05035582 (Kyowa Hakko Kogyo), WO 03018635 (Kyowa Hakko Kogyo), WO 05053741 (Kyowa Hakko Kogyo) или WO 0042074 (MILLENIUM PHARMACEUTICALS).

В дополнительной предпочтительной форме осуществления лекарство содержит антитело, специфичное к CCL17, которое может представлять собой моноклональное антитело.

В дополнительной предпочтительной форме осуществления лекарство содержит антитело, специфичное к CCL22, которое может представлять собой моноклональное антитело.

В другой форме осуществления лекарство содержит антитело, которое может представлять собой Fab фрагмент, где указанный Fab фрагмент может быть выбран из группы, состоящей из: scFv, F(ab')2, Fab, Fv и Fd фрагментов или CDR3 области.

Фрагмент, связывающий антиген (Fab фрагмент), представляет собой область на антителе, которая связывается с антигенами. Он состоит из одного константного и одного вариабельного домена от каждой из тяжелой и легкой цепи. Эти домены имеют общий паратоп - антигенсвязывающий сайт - на аминоконце мономера. Два вариабельных домена связывают эпитоп на их специфичных антигенах.

Fc и Fab фрагменты могут быть получены. Фермент папаин можно использовать для расщепления мономера иммуноглобулина на два Fab фрагмента и Fc фрагмент. Фермент пепсин расщепляет ниже шарнирной области, так что может образоваться F(ab')₂ фрагмент и Fc фрагмент. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей могут быть слиты вместе с образованием одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), который составляет только половину размера Fab фрагмента и все же сохраняет исходную специфичность родительского иммуноглобулина.

Область определения комплементарности (CDR) представляет собой короткую аминокислотную последовательность, находящуюся в вариабельных доменах белков-рецепторов антигена (например, иммуноглобулина и рецептора Т-клеток), которые комплементируют антиген и, таким образом, обеспечивают рецептор с его специфичностью к данному конкретному антигену. Большая часть вариаций последовательности, связанных с иммуноглобулинами и рецепторами Т-клеток, находится в CDR областях, где эти области иногда называют гипервариабельными доменами. Среди них CDR3 проявляет наибольшую вариабельность, поскольку она кодируется в результате рекомбинации VJ областей.

В другой форме осуществления лекарство содержит антитела, которые могут представлять собой гуманизированные или химерные антитела.

Гуманизированные антитела или химерные антитела представляют собой тип моноклонального антитела, которое синтезируют, используя технологию рекомбинантных ДНК, чтобы обойти клиническую проблему иммунного ответа на чужеродные антигены. Стандартная методика получения моноклональных антител дает мышиные антитела. Хотя мышиные антитела очень сходны с человеческими антителами, различия являются достаточно значительными, чтобы иммунная система человека распознавала мышиные антитела как чужеродные, быстро удаляя их из кровообращения и вызывая системные воспалительные эффекты.

Гуманизированные антитела могут быть получены путем объединения ДНК, которая кодирует связывающий участок моноклонального мышиного антитела, с ДНК, продуцирующей человеческое антитело. Затем культуры клеток млекопитающих используют для экспрессии этой ДНК и продуцируют эти частично мышиные и частично человеческие антитела, которые не являются настолько иммуногенными, как чисто мышиный вариант.

Могут быть получены модификации моноклональных антител, которые связываются только с клеточно-специфичными антигенами и предпочтительно индуцируют иммунологический ответ против раковой клетки-мишени. Такие моноклональные антитела предпочтительно модифицируют для доставки токсина, радиоактивного изотопа, цитокина или другого активного конъюгата.

В другом аспекте технологии антител можно сконструировать биспецифические антитела, которые могут связываться своими Fab областями как с антигеном-мишенью, так и с конъюгатом или эффекторной клеткой. Также все интактные антитела могут связываться с клеточными рецепторами или другими белками своей Fc областью.

Получение рекомбинантных моноклональных антител может также включать технологии, называемые репертуарным клонированном или фаговым дисплеем/дрожжевым дисплеем. Эти технологии могут включать использование для создания антител скорее вирусов или дрожжей, чем мышей. Эти методы основаны на быстром клонировании сегментов гена иммуноглобулина для создания библиотек антител с несколько различными аминокислотными последовательностями, из которых могут быть выбраны антитела с желаемыми специфичностями. Это способ можно использовать для усиления специфичности, с которой антитела распознают антигены, изменения их стабильности в различных условиях окружающей среды, повышения их терапевтической эффективности и модулирования возможности их обнаружения при диагностических применениях.

Изобретение включает способ лечения или предупреждения злокачественного заболевания у индивидуума, страдающего раком, включающий лечение индивидуума эффективным количеством низкомолекулярного ингибитора CCR4, и/или CCL17, и/или CCL22. Таким образом, в изобретении предложено применение низкомолекулярного ингибитора CCR4, и/или CCL17, и/или CCL22 для получения лекарства для лечения или предупреждения рака у индивидуума, страдающего раком.

Формами осуществления данного аспекта изобретения являются, например, низкомолекулярные ингибиторы, раскрытые в WO 04007472 (ONO PHARMACEUTICAL CO.), WO 05023771 (ONO PHARMACEUTICAL CO.), WO 02094264 (TULARIK INC.), WO 0230358 (TULARIK/CHEMOCENTRYX), WO 0230357 (CHEMOCENTRYX), WO 051236976 (ASTELLAS PHARMA INC.), WO 05085212 (YAMANOUCHI PHARMACEUTICAL CO., LTD.), WO 05082865 (YAMANOUCHI PHARMACEUTICAL CO., LTD.), WO 04108717 (ASTRAZENECA AB), EP1633729 (ASTRAZENECA AB) или WO 03014153 (TOPIGEN PHARMACEUTIQUE INC.).

Изобретение также включает способ лечения или предупреждения злокачественного заболевания у индивидуума, страдающего раком, включающий лечение индивидуума эффективным количеством агента, который модулирует активность CCR4, и/или CCL1,7 и/или CCL22. Таким образом, в изобретении предложено применение агента, который модулирует активность CCR4, и/или CCL17, и/или CCL22, для получения лекарства для лечения или предупреждения рака у индивидуума, страдающего раком.

Формами осуществления данного аспекта изобретения являются, например, агенты, модулирующие CCR4, которые раскрыты в WO 0041724A1 (LELAND STANFORD/LEUKOSITE).

В предпочтительных аспектах способ и применение по изобретению предназначены для лечения рака, предпочтительно выбранного из группы, состоящей из рака бронхов, носоглотки, гортани, мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легкого, кожи (например, меланомы или базально-клеточной карциномы), головного мозга, поджелудочной железы, шеи, легкого, почки, печени, молочной железы, ободочной кишки, мочевого пузыря, пищевода, желудка, шейки матки, яичника, зародышевых клеток и простаты. Более предпочтительно раки представляют собой раки шейки матки, пищевода, почки, головного мозга, молочной железы и яичника.

При особенно предпочтительных терапиях рак представляет собой рак шейки матки, предпочтительно чешуйчато-клеточную карциному (SCC).

При особенно предпочтительных терапиях рак представляет собой рак пищевода, предпочтительно чешуйчато-клеточную карциному пищевода.

В другом аспекте в изобретении предложен способ скрининга на противораковые агенты, включающий стадии:

(а) получение тестируемых клеток, которые экспрессируют рецептор CCR4 и которые способны к пролиферации или находятся в процессе пролиферации,

(б) воздействие на тестируемые клетки агента-кандидата в течение периода времени,

(в) измерение пролиферации тестируемых клеток, где снижение какой-либо пролиферации тестируемых клеток идентифицирует противораковый агент и/или повышенная или непрерывная пролиферация тестируемых клеток идентифицирует слабый или неактивный противораковый агент.

В других аспектах в изобретении предложен способ скрининга на противораковые агенты, включающий стадии:

(а) получение тестируемых клеток, которые экспрессируют рецептор CCR4 и которые способны к пролиферации или находятся в процессе пролиферации,

(б) получение по меньшей мере первой и второй аликвоты указанных клеток,

(в) воздействие на первую аликвоту агента-кандидата в течение периода времени,

(г) отсутствие воздействия на вторую аликвоту агента-кандидата в течение периода времени;

(д) измерение степени пролиферации клеток в первой и второй аликвоте, где снижение какой-либо пролиферации клетки(ок) в первой аликвоте относительно клетки(ок) во второй аликвоте идентифицирует противораковый агент и/или повышенная или непрерывная пролиферация клетки(ок) в первой аликвоте относительно клетки(ок) во второй аликвоте идентифицирует слабый или неактивный противораковый агент.

В некоторых предпочтительных формах осуществления в тестируемых клетках индуцируют пролиферацию, предпочтительно до воздействия агента-кандидата.

В других предпочтительных формах осуществления в тестируемых клетках индуцируют пролиферацию добавлением лиганда рецептора CCR4.

В другом аспекте в изобретении предложен способ скрининга на противораковые агенты, включающий стадии:

(а) получение тестируемых клеток, которые экспрессируют CCR4,

(б) воздействие на тестируемые клетки агента-кандидата в течение периода времени,

(в) измерение уровня секретируемого белка или сигнальной молекулы тестируемых клеток, где сниженный уровень секретируемого белка или сигнальной молекулы идентифицирует противораковый агент и/или отсутствие снижения или повышенный уровень секретируемой молекулы или сигнальной молекулы идентифицирует слабый или неактивный противораковый агент.

В других аспектах в изобретении предложен способ скрининга на противораковые агенты, включающий стадии:

(а) получение тестируемых клеток, экспрессирующих CCR4,

(б) получение по меньшей мере первой и второй аликвоты указанных клеток,

(в) воздействие на первую аликвоту агента-кандидата в течение периода времени,

(г) отсутствие воздействия на вторую аликвоту агента-кандидата в течение периода времени,

(д) измерение уровня секретируемого белка или сигнальной молекулы тестируемых клеток в первой и второй аликвоте, где сниженный уровень секретируемого белка или сигнальной молекулы в клетке(ах) в первой аликвоте относительно клетки(ок) во второй аликвоте идентифицирует противораковый агент и/или отсутствие снижения или повышенный уровень секретируемой молекулы или сигнальной молекулы из клетки(ок) в первой аликвоте относительно клетки(ок) во второй аликвоте идентифицирует слабый или неактивный противораковый агент.

В предпочтительных формах осуществления секретируемый белок или сигнальная молекула представляет собой цитокин или хемокин.

В других предпочтительных формах осуществления уровень секретируемого белка или сигнальной молекулы измеряют в любое время до, во время или после воздействия на тестируемые клетки агента-кандидата.

В некоторых предпочтительных формах осуществления в тестируемых клетках индуцируют секрецию конкретного белка или другой сигнальной молекулы, предпочтительно хемокина или цитокина, предпочтительно до воздействия агента-кандидата.

В других предпочтительных формах осуществления в тестируемых клетках индуцируют секрецию конкретного белка или другой сигнальной молекулы, предпочтительно хемокина или цитокина, добавлением лиганда рецептора CCR4.

В другом аспекте в изобретении предложен способ скрининга на противораковые агенты, включающий стадии:

(а) получение тестируемых клеток, которые экспрессируют рецептор CCR4 и которые способны к миграции или находятся в процессе миграции.

(б) воздействие на тестируемые клетки агента-кандидата в течение периода времени.

(в) одновременно или последовательно с периодом воздействия обеспечение условий, пригодных для миграции клеток, и измерение какой-либо миграции клеток, подвергнутых воздействию, где сниженная или отсутствующая миграция клеток, подвергнутых воздействию, идентифицирует противораковый агент и/или повышенная или непрерывная миграция тестируемых клеток идентифицирует слабый или неактивный противораковый агент.

Способ скрининга на противораковые агенты, включающий стадии:

(а) получение тестируемых клеток, которые экспрессируют рецептор CCR4 и которые способны к миграции или находятся в процессе миграции,

(б) получение по меньшей мере первой и второй аликвоты указанных клеток,

(в) воздействие на первую аликвоту агента-кандидата в течение периода времени,

(г) отсутствие воздействия на вторую аликвоту агента-кандидата в течение периода времени,

(д) одновременно или последовательно с периодом воздействия обеспечение условий, пригодных для миграции клеток, и измерение степени миграции клетки(ок) в первой аликвоте относительно клетки(ок) во второй аликвоте, где сниженная или отсутствующая миграция идентифицирует противораковый агент и/или повышенная или непрерывная миграция клетки(ок) в первой аликвоте относительно клетки(ок) во второй аликвоте идентифицирует слабый или неактивный противораковый агент.

Хемотаксис представляет собой явление, при котором клетки организма, бактерии и другие одноклеточные или многоклеточные организмы направляют свое движение в соответствии с некоторыми химическими веществами в их окружающей среде. Это важно для бактерий, чтобы найти пищу (например, глюкозу) путем плавания в направлении самой высокой концентрации пищевых молекул или чтобы спастись от ядов (например, фенола). В многоклеточных организмах хемотаксис и миграция клеток являются критическими как для развития, так и для нормального функционирования. Кроме того, в данной области техники известно, что механизмы, которые дают возможность хемотаксиса и миграции клеток у животных, могут быть нарушены в процессе метастазов рака.

Хемотаксис называют положительным, если движение осуществляется в направлении более высокой концентрации интересующего химического вещества, и отрицательным, если направление противоположно.

При гаптотаксисе градиент хемоаттрактанта выражен или связан на поверхности в противоположность классическому пути хемотаксиса, когда градиент развивается в пространстве раствора.

Некротаксис включает тип хемотаксиса, когда молекулы хемоаттрактанта высвобождаются из некротических или апоптических клеток. В зависимости от химического характера высвобождаемых веществ некротаксис может аккумулировать или отталкивать клетки, что подчеркивает патофизиологическую значимость этого явления.

В некоторых предпочтительных формах осуществления в тестируемых клетках индуцируют миграцию, предпочтительно до воздействия агента-кандидата.

В других предпочтительных формах осуществления в тестируемых клетках индуцируют миграцию добавлением лиганда рецептора CCR4.

Анализы клеточной миграции и клеточной инвазии измеряют способность некоторых типов клеток двигаться через пористую мембрану или матрикс в направлении хемоаттрактанта или фактора роста. Клеточная миграция и инвазия могут быть критическими процессами в ангиогенезе и метастазе опухоли. Клеточную инвазию можно измерить в одном или более чем одном направлении путем использования подходящих условий культивирования и подходящего пористого матрикса для клеток, через который они движутся.

В соответствии с предпочтительными способами скрининга клеточную инвазию можно измерить, предпочтительно используя камеру с матригелем Boyden.

В аспектах определенного здесь способа по изобретению лиганд может представлять собой CCL17 и/или лиганд может представлять собой CCL22.

В другом аспекте в изобретении предложен способ скрининга на противораковые агенты, включающий стадии:

(а) получение раковых клеток, которые экспрессируют рецептор CCR4,

(б) культивирование раковых клеток в условиях, которые приводят в результате к гибели по меньшей мере некоторых раковых клеток,

(в) воздействие на тестируемые клетки агента-кандидата в течение периода времени,

(г) измерение гибели тестируемых раковых клеток, где отсутствие или отсутствие значимого повышения клеточной гибели в тестируемых клетках идентифицирует слабый или неактивный противораковый агент и/или повышенная клеточная гибель идентифицирует противораковый агент.

В других аспектах в изобретении предложен способ скрининга на противораковые агенты, включающий стадии:

(а) получение раковых клеток, которые экспрессируют рецептор CCR4,

(б) получение по меньшей мере первой и второй аликвоты указанных клеток,

(в) культивирование раковых клеток в условиях, которые приводят в результате к гибели по меньшей мере некоторых раковых клеток,

(г) воздействие на первую аликвоту агента-кандидата в течение периода времени,

(д) отсутствие воздействия на вторую аликвоту агента-кандидата в течение периода времени,

(е) измерение гибели тестируемых раковых клеток в первой и второй аликвоте, где отсутствие или отсутствие значимого повышения клеточной гибели в первой аликвоте относительно клетки(ок) во второй аликвоте идентифицирует слабый или неактивный противораковый агент и/или повышенная клеточная гибель в первой аликвоте относительно клетки(ок) во второй аликвоте идентифицирует противораковый агент.

В других предпочтительных формах осуществления воздействие на тестируемые клетки или раковые клетки агента-кандидата может быть до или после изменения условий культивирования.

В предпочтительных формах осуществления или способах скрининга на противораковые агенты тестируемые клетки или раковые клетки способны к пролиферации или находятся в процессе пролиферации.

В способах скрининга на противораковые агенты клетка или клетки могут быть получены из образца биопсии опухоли или могут представлять собой раковую клетку (клетки) шейки матки, например С-41 (АТСС, Rockville MD, USA), или другую клеточную линию, эндогенно экспрессирующую CCR4.

Теперь изобретение будет подробно описано включительно с помощью экспериментальных примеров и со ссылкой на графические материалы, в которых:

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1 - Экспрессия мРНК CCR4 повышена в злокачественных биопсиях шейки матки по сравнению с нормальными тканями.

(A) Суммирование процента образцов, экспрессирующих мРНК рецептора хемокина СС и СХС в неопухолевой (белые столбики) и злокачественной (черные столбики) ткани шейки матки после анализа защиты от рибонуклеазы (RPA) на экспрессию мРНК.

(Б) RPA образцов неопухолевой ткани 1-14 и злокачественных тканей:

биопсий аденокарциномы, образцы 1-4, и биопсий чешуйчато-клеточной карциномы (SCC), образцы 1-11. Стадии тканей аденокарциномы были: 1-3, 1В1; 4, 1В2. Стадии SCC были: 1, 1А2; 2 - 8-11, 1В1; 9,1В2 и 10,2А.

(B) Повышающая регуляция экспрессии гена CCR4 в эпителиальных и стромальных компартментах по сравнению с их неопухолевыми аналогами. Экспрессию мРНК в неопухолевой ткани шейки матки использовали в качестве базового уровня для сравнения с мРНК злокачественной ткани, и она представлена как значение "1".

Фиг.2 - Иммуногистохимия для CCR4 во время злокачественного прогрессирования рака шейки матки.

Экспрессия белка CCR4 в строме (А) неопухолевой ткани шейки матки, 200×; (Б) CIN (внутриэпителиальная неоплазия шейки матки) 200×; (В) инвазивной ткани шейки матки, 200×. Экспрессия белка CD68+ в (Г) нормальной ткани, 400×; (Д) CIN, 200×; и (Е) инвазивном раке шейки матки, 400×. Окрашивание белка FoxP3+ в (Ж) неопухолевой ткани шейки матки, 200×; (3) CIN, 400×; и (И) инвазивном раке шейки матки, 400×. Эпителиальная экспрессия белка CCR4 в (К) неопухолевой ткани, 200×; (Л) CIN, 400× и (М) инвазивном раке шейки матки, 400×.

Фиг.3 - Иммуногистохимический балл для клеток, положительных по CCR4, CD68 и FoxP3, во время злокачественного прогрессирования рака шейки матки.

(А) Суммарный балл для окрашивания эпителиальных клеток (черные столбики) и стромальных клеток (белые столбики) на CCR4, вычисленный на основании 'интенсивности' Х 'положительности" в нормальных тканях (11=23), CIN (n=63) и SCC (n=45), рецидивном раке (n=15), метастазах лимфатических узлов (n=10) и аденокарциноме (n=10). (Б) Средний балл CD68+ (+СО, стандартная ошибка) интра- и перитуморальной инфильтрации макрофагов в нормальных тканях (n=11), CIN (n=16), аденокарциномах (n=16), рецидивном раке (n=24) и метастатических отложениях в лимфатических узлах (n=11); ** p<0,001; * p<0,005. (В) Средний балл FoxP3+(+СО) интра- и перитуморальной инфильтрации клеток Treg в нормальных тканях (n=11), CIN (n=16), SCC (n=44), аденокарциномах (n=16), рецидивных раках (n=24) и метастатических отложениях в лимфатических узлах (n=11), * p<0,01. (Г) Суммарный балл CCR4 на эпителиальных клетках (черные столбики) и стромальных клетках (белые столбики), вычисленный на основании 'интенсивности' Х 'положительности' в CIN I (n=26), CIN II (n=19) и CIN III (n=17).

Фиг.4 - Экспрессия мРНК и белка лиганда CCR4 CCL22 в нормальной шейке матки, CIN и SCC.

(А) Уровни экспрессии мРНК CCL22 по оценкам с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени в нормальных (n=14) и SCC (n=11) биопсиях шейки матки (Р=0,43). Экспрессия белка CCL22 в (Б) неопухолевой, 200×; (В) CIN, 200× и (Г) SCC, 200× тканях шейки матки. (Д) Суммарный балл CCL22 эпителиальных клеток (черные столбики) и стромальных клеток (белые столбики), вычисленный на основании 'интенсивности' Х 'положительности' в нормальных образцах шейки матки (n=16), CIN (n=17), SCC (n=19) и аденокарциномах (n=5).

Фиг.5 - Экспрессия мРНК и белка лиганда CCR4 CCL17 в нормальной шейке матки, CIN и SCC.

(А) Уровни экспрессии мРНК CCL17 по оценкам с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени в нормальных биопсиях (n=7) по сравнению с SCC (n=11) биопсиями шейки матки (Р=0,02). Экспрессия белка CCL17 в (Б) неопухолевой, 200×; (В) CIN, 200× и (Г) SCC, 200× тканях шейки матки. (Д) Суммарный балл CCL17 эпителиальных клеток (черные столбики) и стромальных клеток (белые столбики), вычисленный на основании 'интенсивности' Х 'положительности' в нормальных образцах шейки матки (n=21), CIN (n=33), SCC (n=20) и аденокарциномах (n=4).

Фиг.6 - CCR4 функционален на клеточной линии рака шейки матки С-41

(А) Экспрессию белка CCR4, CCL17 и CCL22 (синие кривые) измеряли в клеточной линии рака шейки матки С-41 путем использования проточной цитометрии. Экспрессию/интернализацию CCR4 клетками С-41 исследовали после стимуляции 100 нг/мл (Б) CCL17 и (В) CCL22 (синяя кривая представляет собой контроль CCR4 при 0 минутах; оранжевая кривая показывает экспрессию белка CCR4 после стимуляции соответствующим лигандом). (Г) Миграция клетки рака шейки матки С-41 в ответ на CCL17 и CCL22. Значения представляют собой среднее ± СО 10 определений, * Р<0,05, ** Р<0,01. (Д и Е) Рост С-41 в субоптимальных условиях после стимуляции 1 нг/мл, 10 нг/мл и 100 нг/мл CCL17 и CCL22 в течение 2, 4 и 6 суток. После 6 суток С-41 показывали значимое увеличение роста после стимуляции 10 нг/мл CCL17; (Р=0,017) и 100 нг/мл CCL17 (Р=0,044), но не 1 нг/мл CCL17 (Р=0,383). Стимуляция 1 нг/мл CCL22 и 100 нг/мл CCL22 также показывала значимое увеличение роста: 1 нг/мл CCL22; (Р=0,026) и 100 нг/мл CCL22 (Р=0,043), но не 10 нг/мл CCL22 (Р=0,195).

Фиг.7 - Экспрессия CCR4 при канцерогенезе пищевода

Экспрессия CCR4 в нормальных (А, ×40; Г, ×40), гиперпластических (Б, ×100), диспластических (В, ×40; Г, ×40) эпителиальных клетках пищевода и инвазивных раковых клетках (3, ×200).

Экспрессия CCR4 в строме во время канцерогенеза пищевода: Д, нормальный пищевод (×200); Е, дисплазия I (×200); Ж, дисплазия III (×200); 3, инвазивный рак (×200).

Фиг.8 - Результаты иммуногистохимической оценки положительных по CCR4 стромальных клеток в процессе злокачественного прогрессирования рака шейки матки.

Баллы оценивали по числу клеток, положительных по CCR4, и по интенсивности окрашивания CCR4. Число клеток измеряли как среднее 15 HPF: 0 = отсутствие экспрессии белка CCR4; +1=1-10 положительных клеток по CCR4 на HPF; +2=10-20 положительных клеток на HPF; +3 (21-30 клеток на HPF); +4 (>30 клеток). Интенсивность измеряли как: 0=отсутствие экспрессии; 1+ = слабая экспрессия; 2++ = умеренная экспрессия; 3+++ = сильная экспрессия.

Фиг.9 - Результаты иммуногистохимической оценки положительных по CCR4 эпителиальных клеток в процессе злокачественного прогрессирования рака шейки матки.

Баллы оценивали по числу клеток, положительных по CCR4, и по интенсивности окрашивания CCR4. 0 = отсутствие экспрессии белка CCR4 на эпителиальных клетках; +1 = менее чем на 25% среза была экспрессия CCR4; +2=26-50% положительных клеток; +3=51-75% положительных клеток; +4 более чем 76% клеток, положительных по CCR4. Интенсивность измеряли как: 0 = отсутствие экспрессии; 1+ = слабая экспрессия; 2++ = умеренная экспрессия; 3+++ = сильная экспрессия.

Фиг.10 - Результаты скрининга на экспрессию CCR4 в более широком ряде опухолей с использованием кДНК библиотеки происхождения из тканей человека (Cancer Research UK). Библиотека содержит кДНК, полученные с РНК, выделенной из 5-10 образцов опухолей и 2-5 нормальных образцов для 11 различных типов опухолей: легкого, ободочной кишки, мочевого пузыря, желудка, поджелудочной железы, кожи, молочной железы, головного мозга, пищевода, яичника и простаты. Уровни экспрессии мРНК CCR4 измеряли, используя количественную ОТ-ПЦР в реальном времени.

На Фиг.11 показаны результаты анализа FACS на экспрессию CCR4 на клеточных линиях шейки матки (С41, С33А) и клеточных линиях рака почки (786, А498, CAKI). Пунктирная кривая: родственное по изотипу контрольное антитело; серая кривая: экспрессия CCR4.

На Фиг.12 показаны результаты анализа FACS на экспрессию CCR4 на клетках С41 после 24 ч стимуляции ИЛ-10, TGF- и FGF. Пунктирная кривая: контроль изотипа; серая кривая: экспрессия CCR4; полужирная кривая: экспрессия CCR4 после стимуляции цитокином.

На Фиг.13 показана последовательность кДНК CCR4. Эта последовательность представляет собой SEQ ID NO:1, на которую ссылаются в данной заявке.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения открыли, что экспрессия рецептора хемокина CCR4 является очень ранним событием в канцерогенезе при некоторых типах опухолей. Эпителиальная экспрессия рецептора для гомеостатических хемокинов, обычно присутствующих в ткани, может придавать преимущество выживания инициированной клетке.

Рецептор хемокина CCR4 присутствовал на диспластических неинвазивных повреждениях шейки матки и пищевода. Это было особенно убедительно в некоторых из образцов рака пищевода, где положительные по CCR4 диспластические области были четко видны по соседству с нормальными областями эпителия в том же срезе (например, Фиг.7 В и Г).

Рецептор хемокина CCR4 увеличивался при злокачественном прогрессировании рака шейки матки. Это было следствием не только повышенной инфильтрации CCR4-положительных макрофагов и клеток Treg, но также приобретением экспрессии CCR4 эпителиальными клетками. Неожиданно было обнаружено, что CCR4 сильно экспрессировался на неинвазивных эпителиальных клетках во внутриэпителиальных (CIN) повреждениях, а также в инвазивных раковых клетках. Прогрессирование от CIN до инвазивного заболевания было связано с повышенной экспрессией стромальными клетками лигандов CCR4, CCL17 и 22, и эти хемокины стимулировали рост и миграцию CCR4-положительной клеточной линии рака шейки матки (например, Фиг.4 и Фиг.6). CCR4 был также обнаружен как на диспластических, так и на инвазивных эпителиальных клетках при раке пищевода, причем снова уровни CCL17 и CCL22 повышались во время злокачественного прогрессирования. Изменения в градиентах CCL17 и 22 способствуют переходу от неинвазивного к инвазивному заболеванию и привлекают лейкоциты, стимулирующие опухоль, которые помогают инициированным клеткам избежать иммунного надзора.

Два CCR4-связывающих хемокина, CCL17 и CCL22, были также обнаружены на поверхности кровеносных и лимфатических сосудов в биопсиях опухоли. Это было невозможно определить количественно, но предварительные наблюдения показывают повышение интенсивности окрашивания при злокачественном прогрессировании.

Другим элементом системы CCR4 является рецептор несигнального хемокина D6, который обладает высоким сродством к CCL17 и CCL22 [18]; следовало бы ожидать, что его присутствие в тканях влияет на градиенты этих хемокинов [19].

На Фиг.6 показано, что рецептор CCR4 функционален на клеточной линии рака шейки матки С-41. CCR4 может претерпевать повышающую регуляцию микросредой. Положительные и отрицательные клетки по CCR4 подвергали воздействию ряда цитокинов (TNF- , TGF- , ИФН- , ИЛ-4 и ИЛ-10), известных как присутствующие в микросреде шейки матки, и вероятно присутствие этих рецепторов на опухолевых клетках. Ни один из них не влиял на экспрессию CCR4. Однако уровни мРНК CCR4, но не уровни белка, претерпевали повышающую регуляцию совместным культивированием клеток С-41 с макрофагами.

CCR4 и D6 локализованы на хромосоме 3p вблизи области, где, как считают, локализованы критические опухолевые супрессорные гены для рака шейки матки с описанными сложными аберрациями (потерей гетерозиготности, гомозиготности и амплификацией гена) [25, 26, 27]. Хотя ни CCR4, ни D6 непосредственно не вовлечены в эти изменения [26], генетические изменения вблизи них могут воздействовать на их регуляцию.

EBV-иммортализованные В-клетки секретируют как CCL22, так и CCL3 и CCL4 [28]. Стабильная экспрессия онкогена EBV LMP1 также индуцировала CCL17 и CCL22 в В-клеточной линии, и индуцированная LMP1 экспрессия CCL17 и CCL22 регулировалась NF-kB. Предположили, что индукция этих двух хемокинов EBV помогает злокачественным клеткам избежать иммунного надзора за счет привлечения клеток Th2 и Treg. Другие онкогенные изменения могут индуцировать продуцирование CCL17 и CCL22 эпителиальными клетками.

Авторы изобретения предприняли подробный количественный анализ двух компонентов мононуклеарного инфильтрата при раке шейки матки, конкретно CD68+ макрофагов и FoxP3+ клеток Treg. Плотность CCR4-положительных инфильтрирующих клеток повышается в CIN по сравнению с нормальной шейкой матки и, кроме того, повышается как в SCC, так и в аденокарциномах. CD68+ макрофаги следуют такой же схеме, и авторы изобретения обнаружили, что они были положительными по CCR4. Перекрестные помехи между макрофагами и злокачественными клетками являются критическими на всех стадиях прогрессирования рака, влияя на выживание злокачественных клеток, способствуя ангиогенному переключению, поляризуя лейкоциты и способствуя инвазии злокачественных клеток [29, 30, 31]. При раках шейки матки и пищевода хемокины CCL17 и CCL22 играют роль в рекрутменте макрофагов, тогда как при других раках, например при раке яичника, хемокины, такие как CCL2, являются критическими [32].

CCL17 и CCL22 также важны в рекрутменте клеток Treg, которые повышаются параллельно клеткам CD68+ в биопсиях шейки матки. Рекрутмент клеток Treg в предраковых и раковых повреждениях способствует иммунным преимуществам. Например, при лимфоме Ходжкина, HL, злокачественные клетки окружены большим числом CCR4+ FoxP3+ лимфоцитов [33]. Эти клетки, рекрутируемые злокачественными клетками HL, создают благоприятную окружающую среду для злокачественных клеток, чтобы избежать иммунной системы хозяина. Авторы изобретения считают, что это также имеет место в случае рака шейки матки и пищевода. Поэтому изменения в градиентах CCL17 и CLL22 не только непосредственно стимулируют выживание и распространение опухолевых клеток, но они привлекают лейкоциты, которые могут также обеспечить факторы выживания для опухолевых клеток и внести вклад в иммунное преимущество/иммуносупрессию, что предотвращает эффективные ответы хозяина против опухоли.

Эти данные демонстрируют, что присутствие эпителиального CCR4 является как высокочувствительным, так и высокоспецифичным биомаркером как для предраковой, так и для раковой неоплазии шейки матки. Роль экспрессии CCR4 в прогрессировании рака шейки матки все еще не ясна, хотя данные авторов изобретения позволяют предположить, что CCR4 может обеспечивать клеткам защиту от апоптических стимулов внутри окружающей среды опухоли, а также необходим для инвазии опухолевыми клетками базальной мембраны. Вследствие его высокой чувствительности и селективности для CCR4 существует потенциал применения в качестве диагностического биомаркера для всех стадий рака шейки матки.

Впоследствии авторы изобретения также протестировали экспрессию CCR4 в 31 образце опухолей пищевода, другого типа опухоли, который имеет сильную связь с воспалением. С помощью ИГХ они обнаружили, что CCR4 был не обнаружим ни в одной нормальной ткани пищевода, но присутствовал в эпителиальных клетках всех преинвазивных и инвазивных повреждений. Вследствие его высокой чувствительности и селективности для CCR4 существует потенциал применения в качестве диагностического биомаркера для всех стадий рака пищевода.

В заключение, рецептор хемокина CCR4 и его лиганды повышаются во время злокачественного прогрессирования раков шейки матки, пищевода, почки, головного мозга, яичника или молочной железы. Изменения в CCR4 и градиентах его лиганда играют несколько проопухолевых ролей. Во-первых, стимуляция CCR4 увеличивает рост и выживание инициированных и инвазивных раковых клеток; во-вторых, изменения в градиентах хемокинов способствует инвазии базальной мембраны и последующего движения злокачественных клеток в кровеносные сосуды или лимфатическую систему. Наконец, CCL17 и CCL22 привлекают типы клеток, включающие макрофаги М2 и клетки Treg FoxP3, которые стимулируют рост опухоли и дают возможность инициированным клеткам избежать иммунного надзора. CCR4 и его лиганды могут быть полезными диагностическими маркерами и терапевтическими мишенями при эпителиальной неоплазии.

Изобретение частично описано с помощью экспериментальной работы и примеров, в которых использовали описанные ниже материалы и методы:

ПРИМЕРЫ

Образцы ткани шейки матки и образцы пищевода

Для исследований мРНК пятнадцать биопсий опухоли от пациентов с раком шейки матки (11 чешуйчато-клеточной карциномы, S1-S11, и 4 аденокарциномы, А1-А4) и 14 образцов неопухолевой ткани шейки матки (N1-N14) были получены во время операции и быстро заморожены в жидком азоте. Диагноз был поставлен патологическим отделением Barts and The London NHS Trust. Образцы от пациентов делили в соответствии с классификацией МФГА (Международной федерации гинекологии и акушерства) (стадия I, II, III, IV), и биопсии опухоли классифицировали в соответствии с возрастающей степенью ядерной атипии (1, 2, 3) или также с умеренной или слабой дифференциацией.

Для иммуногистохимии образцы, заключенные в парафин (n=166), от 150 различных пациентов были получены от Barts and The London NHS Trust и Clinical Centre of Serbia, Belgrade. Доступ к свежим и заключенным в парафин человеческим образцам удовлетворял требованиям East London and City Health Authority Research Ethics Subcommittee (LREC № T/02/046).

Резецированные образцы от тридцати одного пациента с первичной чешуйчато-клеточной карциномой пищевода также включали в данный документ. Эти пациенты находились в области высокого риска карциномы пищевода в г.Аньян, провинция Хэнань, Китай. Все пациенты получали хирургическое лечение в хирургическом отделении центральной больницы г.Аньян. Ни один из этих пациентов не получал химиотерапию, радиотерапию или иммуномодуляторную терапию до операции. Образцы были взяты из раковых и соответствующих нормальных областей на основании макроскопического исследования одного и того же ракового пациента. Ткани фиксировали в ФСБ, содержащем 10% нейтрально забуференный формалин.

Выделение ДНК и анализ защиты от РНКазы (RPA}

Биопсии ткани шейки матки гомогенизировали, используя мельницу для жидкостей с азотным охлаждением 6750 (Glen Creston Ltd, Stanmore), а затем солюбилизировали в Tri Reagent (Sigma, Poole, UK). Экстрагированную РНК обрабатывали 10 ед. ДНКазы (Pharmacia, St Albans, UK), следуя инструкциям изготовителей. Анализ RPA проводили, используя наборы матриц hCR5 и hCR6 Riboquant® (BD Pharmingen, Oxford, UK) и [ ³²P] UTP (Amersham International plc, Aylesbury, UK). Фрагменты, защищенные от РНКазы, разгоняли в полиакриламидном секвенирующем геле с мочевиной (BioRad Laboratories Ltd, Hemel Hempstead, UK), абсорбировали на фильтровальной бумаге и высушивали в вакууме. Авторадиографию проводили, используя пленку Kodak Biomax MS с усилительным экраном Transcreen LE (Sigma).

Микродиссекция и генная матрица

Заключенные в парафин ткани шейки матки резали в свободных от РНКазы условиях и закрепляли на обработанных УФ светом мембранных пленках PALM® (PALM, Microlaser Technologies, Germany). Затем их депарафинизировали в ксилоле и регидратировали через набор спиртов повышающейся концентрации. Образцы окрашивали в течение 1 мин раствором гематоксилина Майера, дегидратировали и высушивали на воздухе перед обработкой. Срезы подвергали лазерной микродиссекции, следуя инструкциям изготовителя. Кратко, интересующие области подвергали лазерной микродиссекции и выбрасывали в микроцентрифужную чашечку, содержащую буфер для протеинкиназы (PK). Примерно 500-5000 клеток улавливали в каждом сеансе. Клетки после лазерной микродиссекции растворяли в 100 мкл PK буфера, смешанного с 5 мкл PK. Затем суммарную РНК экстрагировали, используя набор для выделения РНК из парафиновых блоков (1902, Ambion, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя. кДНК амплифицировали, как описано выше, и анализировали, используя изготовленные на заказ микроструйный анализатор экспрессии с картами генных матриц (РЕ Applied Biosystems) в соответствии с инструкциями изготовителя.

Профиль генной экспрессии индивидуальных генов в семи образцах опухоли шейки матки сравнивали с пятью нормальными образцами шейки матки. Уровни генной экспрессии в образцах нормальных эпителиальных или стромальных клеток использовали в качестве базового значения "1" и сравнивали со средним значением либо опухолевых эпителиальных клеток, либо опухолевых стромальных клеток соответственно. Образцы опухоли, подвергнутые лазерной микродиссекции, состояли из одного образца стадии 1А2 и 2В и пяти образцов стадии 1В1.

Иммуногистохимия

Срезы, заключенные в парафин (4 мкм), окрашивали на CCR4, CCL17 и CCL22. Кратко, срезы депарафинизировали в ксилоле и дегидратировали через градиент этанола. После отмывки ФСБ антиген экспонировали, используя буфер для демаскировки (SI700, DAKO) при 95°С в течение 20 мин или раствор для демаскировки антигена (Н-3300, Vector) в течение 9 мин в микроволновой печи. Срезы блокировали нормальной сывороткой кролика или козы в течение 30 мин и инкубировали в течение ночи при 4°C с первым антителом: CCR4 (1:300, ab1669, AbCam, Cambridge), CCL17 (1:50, ab9816-50, AbCam, Cambridge) и CCL22 (1:20, 500-P107, Peprotech). После инкубации с биотинилированным вторым антителом (IgG против козы или против кролика, 1:200, Vector) в течение 30 мин при комнатной температуре антигены выявляли 3,3'-диаминобензидином (DAB; Sigma). Затем стекла докрашивали гематоксилином, дегидратировали и закрепляли. Отсутствие первого антитела использовали в качестве отрицательного контроля. Для проверки специфичности антитела CCR4 некоторые CCR4-отрицательные клетки трансфицировали кДНК для данного рецептора хемокина. Антитело к CCR4 обнаруживало поверхностный белок только на успешно трансфицированных клетках.

Двойное окрашивание, CD68, FoxP3, SR-A: Способы оценки и категории

Для оценки экспрессии CCR4, CCL17 и CCL22 на незлокачественных и злокачественных эпителиальных клетках каждый образец оценивали полуколичественно по следующей системе баллов: 0 (отсутствие положительной экспрессии белка), +1 (<25% среза в среднем имело положительную экспрессию), +2 (26-50%), +3 (51-75%), +4 (>76%). Интенсивность положительных клеток анализировали следующим образом: 0 (нет экспрессии), 1 (слабая экспрессия), 2 (умеренная экспрессия), 3 (сильная экспрессия). Оценку экспрессии CCR4, CCL17 и CCL22 в строме опухоли (внутриопухолевые инфильтрирующие клетки) и инвазивных бордюрных клетках опухоли (перитуморальные инфильтрирующие клетки) проводили на основе метода 'скользящего среднего' [43]. Некротических областей избегали. Суммарно считали 15 полей зрения при большом увеличении (HPF, high-power fields) (увеличение ×400). Пятибалльные шкалы были установлены следующим образом: 0 = отсутствие экспрессии белка CCR4; +1=1-10 клеток, положительных по CCR4, на HPF; +2=10-20 положительных клеток на HPF; +3 (21-30 клеток на HPF); +4 (>30 клеток). Общий результат окрашивания был получен путем вычисления 'процента' Х 'интенсивности'. Оценка ИГХ на опухолевых и инфильтрирующих клетках проводилась патологом, получившим профессиональную сертификацию (YW).

Культура клеточной линии рака шейки матки

Клеточную линию рака шейки матки С-41 (АТСС, Rockville, MD, USA) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% ФСТ. В некоторых экспериментах клетки стимулировали 1, 10, 100 или 1000 нг/мл CCL17 или CCL22 (PeproTech, London, UK). Пролиферацию и миграцию оценивали, используя способы, описанные ранее [11].

Статистический анализ

Статистическую значимость оценивали, используя непарный t-критерий с коррекцией Welch (программное обеспечение Instat, San Diego, СА). Значение Р<0,05 считали значимым.

Эксперимент 1 - Анализ защиты от рибонуклеазы для рецепторов хемокинов

Анализы защиты от рибонуклеазы (RPA) использовали для скрининга 13 мРНК рецепторов хемокинов в свежезамороженных биопсиях ткани шейки матки человека. Как видно на основании итогового графика на фиг.1А, ряд мРНК рецепторов хемокинов был обнаружен в экстрактах ткани шейки матки с некоторыми дискретными различиями между неопухолевыми и злокачественными биопсиями. Особый интерес представлял рецептор хемокина CCR4, который присутствовал в злокачественной шейке матки, но отсутствовал в экстрактах из неопухолевых биопсий шейки матки (Фиг.1Б).

Поскольку экспрессию рецепторов хемокинов исследовали на экстрактах цельной ткани, содержащей смешанную популяцию стромальных клеток и эпителиальных клеток, далее авторы изобретения исследовали клеточный источник мРНК CCR4. мРНК экстрагировали из областях стромальных и эпителиальных клеток нормальных и злокачественных биопсий шейки матки, подвергнутых лазерной микродиссекции, и полуколичественную ОТ-ПЦР в реальном времени использовали для анализа экспрессии CCR4 с 18S рРНК в качестве контроля. Как показано на фиг.1В, мРНК CCR4 претерпевала повышающую регуляцию в стромальных областях из злокачественных тканей, когда их сравнивали с их неопухолевыми аналогами. Кроме того, что неожиданно, мРНК CCR4 также претерпевала повышающую регуляцию в экстрактах из областей злокачественных эпителиальных клеток по сравнению с нормальным эпителием.

Для дальнейшего исследования этих наблюдений, относящихся к мРНК CCR4, авторы изобретения окрашивали когорту биопсий на CCR4, используя иммуногистохимию, ИГХ. Авторы изобретения оценивали экспрессию белка CCR4 в 166 образцах заключенных в парафин тканей шейки матки от 150 различных пациентов: неопухолевых, n=23; CIN I, n=30; CIN II, n=17; CIN III, n=16; SCC, n=45; рецидивный рак, n=15; метастазы лимфатических узлов (LN met), n=10; аденокарцинома, n=10. Как лейкоциты, так и эпителиальные клетки экспрессировали белок CCR4. Для количественного исследования результатов авторов изобретения баллы ИГХ вычисляли путем умножения 'положительности' и 'интенсивности' (более подробно см. описание способов и фиг.8 и 9).

Эксперимент 2 - Белок CCR4 обнаружен на инфильтрирующих лейкоцитах в биопсиях шейки матки человека

Как показано на фиг.2 (А-В), лейкоциты в стромальных областях биопсий были положительно окрашены на CCR4. Балл ИГХ для положительности по CCR4 в стромальных областях суммирован на фиг.3А (белые столбики). Неопухолевые ткани были отрицательными по CCR4 лейкоцитам (фиг.2А, 3А). Больше экспрессирующих CCR4 стромальных клеток было в образцах CIN (Фиг.2Б, 3А), и их число еще больше возрастало в инвазивных неопластических образцах шейки матки (Фиг.2В, 3А). Интенсивность экспрессии CCR4 на инфильтрирующих лейкоцитах также увеличивалась при злокачественном прогрессировании. В неопухолевых тканях она была слабой; интенсивность была от умеренной до сильной в образцах CIN и аденокарцином, и интенсивность была сильной в инвазивной SCC, рецидивных раках и метастазах лимфатических узлов (фиг.8).

Строма состоит из различных типов клеток, и тесты проводили, чтобы убедиться, какие из инфильтрирующих клеток вносят вклад в экспрессию CCR4. Поскольку макрофаги и клетки Treg экспрессируют CCR4, экспрессию белка CCR4 исследовали в этих двух типах клеток, а также считали число CD68+ макрофагов и FoxP3+ клеток Treg в биопсиях ткани.

Эксперимент 3 - Положительные по CCR4 макрофаги и клетки Tree возрастают при злокачественном прогрессировании

Число CD68+ макрофагов и FoxP3+ клеток Treg возрастало при злокачественном прогрессировании рака шейки матки. Как показано на фиг.2Г-И, в биопсиях нормальной шейки матки было немного клеток CD68 и FoxP3, но их число возрастало в CIN, и оба типа клеток были выражены при инвазивных раках.

Затем число клеток CD68+ и FoxP3+ считали в 122 и 33 биопсиях соответственно. Как показано на фиг.3Б, увеличение числа клеток CD68+ было статистически значимым (p<0,001) в повреждениях CIN по сравнению с нормальной шейкой матки. Число 13 CD68+клеток дополнительно увеличилось в SCC, аденокарциноме, рецидивных раках и метастазах лимфатических узлов (Р 0,001, и для LN met P<0,05, по сравнению с нормальной шейкой матки). Подобное увеличение числа FoxP3+ клеток встречалось при злокачественном прогрессировании при SCC, аденокарциномах и метастазах лимфатических узлов, где все проявляют значимое увеличение FoxP3+ инфильтрата по сравнению с нормальной шейкой матки (p<0,01).

Для исследования фенотипа инфильтрирующих, экспрессирующих CCR4 клетках проводили оценку экспрессии CCR4 на клеточной поверхности макрофагами и клетками Treg, используя двойное иммуногистохимическое окрашивание на CD68 и FoxP3. Это подтверждало, что CD68+ и FoxP3+ клетки также экспрессируют белок CCR4 (данные не представлены). Подгруппу из 33 заключенных в парафин тканей также окрашивали на белок фагоцитарного рецептора-А (SR-A) (неопухолевые = 10, CIN=10, SCC=10, аденокарцинома = 3). SR-А является маркером клеточной поверхности для альтернативно активируемых макрофагов М2 [12]. SR-A было невозможно обнаружить на стромальных клетках в неопухолевых повреждениях, но в CIN и инвазивном раке часто клеток CD-68+ экспрессировала SR-A (данные не представлены).

Эти исследования показывают, во-первых, что злокачественное прогрессирование рака шейки матки связано с увеличением числа CD68+ макрофагов и FoxP3+ клеток Treg. Эти клетки могли бы обеспечивать проопухолевые факторы роста для злокачественных клеток, а также способствовать созданию иммуносупрессивной микросреды, которая помогает трансформированным клеткам избежать иммунного надзора. Во-вторых, эти результаты показали, что исходное наблюдение увеличения мРНК CCR4 при раке шейки матки по сравнению с нормой является следствием, по меньшей мере частично, повышенному инфильтрату лейкоцитов, экспрессирующих CCR4, включая макрофаги и клетки Treg.

Однако результат лазерной микродиссекции показал, что мРНК CCR4 была также повышена в эпителиальных областях опухолей, и при оценке белка CCR4 на инфильтрирующих лейкоцитах было понятно, что рецептор хемокина также присутствовал на некоторых эпителиальных клетках (см. фиг.2Б и В). Это было неожиданно и обосновывало дальнейшее исследование.

Эксперимент 4 - Эпителиальные клетки в биопсиях шейки матки также экспрессируют CCR4

В неопухолевых биопсиях шейки матки нормальные эпителиальные клетки не экспрессировали CCR4 (фиг.2А). Однако эпителиальные клетки более чем в 90% случаев CIN экспрессировали CCR4 (фиг.2Б и 2Д). 96% образцов SCC имело CCR4-положительные эпителиальные клетки (фиг.2В и 2Е), и эпителиальные клетки 90% образцов аденокарциномы были положительными по CCR4 (фиг.2Ж). Злокачественные эпителиальные клетки во всех рецидивных раках и метастазах лимфатических узлов экспрессировали белок CCR4. Полные подробности результатов ИГХ для белка CCR4 на эпителиальных клетках показаны на фиг.9 и суммированы на фиг.2Г (черные столбики). Экспрессия CCR4 была не ограничена меньшинством эпителиальных клеток. На фиг.2Д-Ж и 9 показано, что большинство злокачественных эпителиальных клеток в биопсиях шейки матки CIN и инвазивного рака было положительным по CCR4.

Дополнительные подробности в отношении ИГХ оценки для различных стадий CIN показаны на фиг.23. Таким образом, показано, что эпителиальная экспрессия CCR4 была по существу не изменена на протяжении прогрессирования от CIN I до III, но что стромальные уровни CCR4 повышались от CIN I до III

Эксперимент 5 - Статистический анализ экспрессии CCR4 во время прогрессирования рака шейки матки

Статистический анализ данных на фиг.8 и 9 показал, что повреждения CIN проявляют значимую повышающую регуляцию белка CCR4 как в эпителиальном (Р=0,0001), так и в стромальном (Р=0,0001) компартменте по сравнению с неопухолевыми тканями шейки матки. Экспрессия CCR4 в инвазивной SCC была также значимо повышена как в эпителиальном (Р=0,0001), так и в стромальном (Р=0,0001) компартменте по сравнению с неопухолевыми тканями. В образцах аденокарциномы CCR4 также претерпевал повышающую регуляцию на эпителиальных (Р=0,0006) и стромальных клетках (Р=0,0050) по сравнению с неопухолевой тканью шейки матки.

Эксперимент 6 - Уровни мРНК и белка CCL22 изменяются при злокачественной экспрессии

В нормальных тканях CCL22 является продуктом макрофагов, моноцитов, DC, В и Т-клеток [13, 14]. Его также обнаруживают в эпителиальных тканях; например, кишечный эпителий конститутивно продуцирует CCL22, который может далее претерпевать повышающую регуляцию воспалительными цитокинами, такими как TNF- [15]. мРНК была выделена из 14 биопсий нормальной шейки матки, 11 SCC и 4 аденокарцином, и уровни CCL22 оценивали с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Как показано на фиг.4А, уровни мРНК CCL22 были более низкими в злокачественных тканях по сравнению с нормальными биопсиями, но это не было значимым (Р=0,43). Суммарно 52 образца заключенных в парафин тканей шейки матки от 50 различных пациентов оценивали на белок CCL22: неопухолевые, n=16; CIN, n=17; SCC, n=19. Во всех биопсиях шейки матки CCL22 был обнаружен в эпителиальных клетках (Фиг.4Б-Г). Четырнадцать из 16 нормальных образцов, 15/17 CIN, 14/19 SCC имели положительные по CCL22 эпителиальные клетки. Инфильтрирующие лейкоциты во всех биопсиях содержали CCL22 (Фиг.4В-Г). Эпителиальный балл ИГХ несколько отклонялся между повреждениями CIN и SCC (Фиг.4Д, черные столбики). Однако стромальный балл для CCL22 повышался от нормальных к CIN и SCC (Фиг.4Д, белые столбики).

Эксперимент 7 - Уровни мРНК и белка CCL17 изменяются при злокачественной экспрессии

В нормальных тканях CCL17 экспрессируется эндотелиальными клетками кровеносных и лимфатических сосудов, но также продуцируется макрофагами, DC и кератиноцитами [16, 17, 55]. мРНК была выделена из 14 биопсий нормальной шейки матки, 11 SCC и 4 аденокарцином, и уровни CCL17 оценивали с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Как показано на фиг.5А, уровни мРНК CCL17 были выше в SCC по сравнению с нормальной шейкой матки. Суммарно 74 образца заключенных в парафин тканей шейки матки от 70 различных пациентов оценивали на белок CCL17: неопухолевые, n=21; CIN, n=33; SCC, n=20. Нормальные биопсии шейки матки имели низкие уровни CCL17 в меньшинстве образцов как эпителия, так и стромы (фиг.5Б). Только 2/19 нормальных образцов имели клетки, положительные по CCL17, в эпителии по сравнению с 23/33 образцами CIN и 13/20 SCC. Число стромальных клеток, которые были положительными по CCL17, увеличивалось в CIN (Фиг.5В) и SCC (Фиг.5Г) по сравнению с нормальными образцами. Шесть из 21 нормальных биопсий имели положительные по CCL17 стромальные клетки по сравнению с 25/33 CIN и 15/20 SCC. Эпителиальный и стромальный балл ИГХ CCL17 увеличивался в CIN и SCC по сравнению с нормальными биопсиями (Фиг.5Д). При анализе баллов ИГХ из индивидуальных биопсий было статистически значимое различие в боле ИГХ CCL17 в строме от CIN (Р=0,001) и SCC (Р=0,002) по сравнению с нормальными биопсиями. Также существовало различие в баллах ИГХ в эпителиальных областях CIN (Р=0,001) и SCC (Р=0,009) по сравнению с нормальными. Эти данные показывают, что градиенты хемокина изменялись с переходом от внутриэпителиальной неоплазии к инвазивному заболеванию.

Эксперимент 8 - CCR4 функционален на раковых клетках шейки матки

Для исследования биологической значимости экспрессии CCR4 на раковых клетках шейки матки ряд клеточных линий рака шейки матки (CaSki, Mel 80, Hela-Ohio, Hela-S3, Siha, С33А, С41-1) подвергали скринингу на экспрессию CCR4. Клеточная линия С-41 конститутивно экспрессировала CCR4 клеточной поверхности (Фиг.6А). Используя анализ FACS, было показано, что клетки С-41 экспрессировали CCR4 клеточной поверхности. Эта клеточная линия также имела внутриклеточный белок CCL22, но другой лиганд CCR4, CCL17, не присутствовал (Фиг.6А). После стимуляции 100 нг/мл CCL22 белок CCR4 клеточной поверхности был интернализован на клетках С-41 через 2 часа и возвращен на клеточную поверхность через 3 часа (Фиг.6Б). После стимуляции 100 нг/мл CCL17 белок CCR4 клеточной поверхности был также интернализован на клетках С-41 через 2 часа и возвращен на клеточную поверхность через 3 часа (Фиг.6В). Клетки С-41 продемонстрировали типичный хемотаксический ответ, соответствующий колоколообразной кривой, в направлении как CCL17, так и CCL22 в анализах миграции клеток через лунку (Фиг.6Г). CCL17 индуцировал значимую миграцию при 10 нг/мл (Р=0,036), а также при 100 нг/мл и 1000 нг/мл (Р=0,0006 и Р=0,0004 соответственно). Подобные результаты наблюдали с CCL22 при 10 нг/мл (Р=0,0081), 10 нг/мл (Р=0,0009) и при 1000 нг/мл (Р=0,0348).

Клетки С-41 проявляли повышенную пролиферацию после стимуляции либо 10 нг/мл (Р=0,017), либо 100 нг/мл (Р=0,044) CCL17. 1 нг/мл CCL22 (Р=0,026), 100 нг/мл CCL22 (Р=0,043), но не 10 нг/мл CCL22 (Р=0,195), также стимулировали клеточный рост С-41 (Фиг.5В и Г). Таким образом, CCR4 является функциональным на данной клеточной линии рака шейки матки, что позволяет предположить, что он может быть также функциональным in vivo.

Эксперимент 9 - CCR4 экспрессируется на эпителиальных и стромальных клетках во время злокачественного прогрессирования рака пищевода

Было неизвестно, являются ли экспрессия CCR4 и изменения в хемокине-лиганде специфичными для рака шейки матки или их можно наблюдать при других эпителиальных злокачественных опухолях, которые имеют связь с воспалением. Рак пищевода является эпителиальным раком, где примеры всех стадий неопластического прогрессирования могут быть легко получены, часто одновременно от одного и того же пациента. Экспрессию CCR4 исследовали в 31 образце от пациентов с раком пищевода. В 27 случаях все стадии канцерогенеза пищевода: нормальная, гиперплазия, дисплазия, карцинома in situ и инвазивный рак, присутствовали в биопсиях от одного и того же пациента. Четыре из 31 случая имели предраковые повреждения без областей инвазивного рака. Как показано на фиг.7А, обнаружимая экспрессия CCR4 отсутствовала в нормальных эпителиальных клетках пищевода, кроме немногих CCR4-положительных клеток вокруг базального слоя гиперпластического эпителия (Фиг.7Б). В 30 из 31 случая белок CCR4 присутствовал на эпителиальных клетках при всех стадиях предраковых повреждений (Фиг.7В, Г), где интенсивность и процент клеток, экспрессирующих CCR4, в диспластических повреждениях был значительно выше, чем в гиперпластических эпителиальных клетках. Эпителиальные клетки при инвазивном раке также были CCR4-положительными (Фиг.73). В некоторых местах происходил резкий переход между нормальной и аномальной слизистой оболочкой (Фиг.7В, Г). Наиболее интересно, что высокие уровни экспрессии CCR4 были в диспластических клетках, но клетки в поверхностных слоях и примыкающей нормальной слизистой оболочке были отрицательными. CCR4-положительные клетки также присутствовали в строме, где схема была такой же, как при раке шейки матки. Как показано на фиг.7Д, было немного CCR4-положительных клеток в нормальной подслизистой оболочке; при злокачественном прогрессировании было большее количество CCR4-положительных клеток, инфильтрирующих строму (Фиг.7Е-3).

Эксперимент 10 - CCL17 и CCL22 в биопсиях пищевода

ИГХ использовали для оценки экспрессии CCL17 и CCL22 в 23 из образцов пищевода, где в каждом образце присутствовали все стадии канцерогенеза. CCL17, как правило, отсутствовал как в эпителиальной, так и в стромальной области нормальных тканей, хотя было немного CCL17-положительных клеток в строме и минорное количество в гиперпластических областях. Число образцов, содержащих CCL17-положительные эпителиальные или стромальные клетки, возрастало при дисплазии и было самым высоким в инвазивных областях, где 10/23 из них проявляли некоторую положительность по CCL17. Особо примечательной была сильная иммунореактивность CCL17 на эндотелиальных клетках или кровеносных/лимфатических сосудах в подслизистой оболочке диспластического, но не нормального эпителия.

Подобно наблюдениям при раке шейки матки уровни стромальной положительности по CCL22 также возрастали при злокачественном прогрессировании. Только в 1/23 образцов были выявлены клетки, положительные по CCL22, в строме нормальных областей, но в диспластических областях и инвазивных областях 20/23 и 18/23 образцов соответственно содержали CCL22-положительные клетки в строме. Положительность по CCL22 стромальных клеток возрастала со степенью дисплазии. Восемь из 23 образцов имели клетки, положительные по CCL22, в строме; это количество возрастало до 19 из 23 образцов дисплазии II и 20/23 образцов дисплазии III. Единственное различие между эпителием шейки матки и пищевода состояло в том, что CCL22 не был обнаружен в нормальном эпителии, хотя сообщили, что он присутствует в нормальном кишечном эпителии [15]. Эпителиальная экспрессия CCL22 возрастала при злокачественном прогрессировании рака пищевода; 0/23 образцов были положительными в нормальных областях, 2/23 гиперплазии, 7/23 дисплазий и 114/23 инвазивных областей имели эпителиальные клетки, положительные по CCL22. Наконец, большее количество эндотелиальных клеток кровеносных сосудов внутри стромы тканей инвазивного рака было положительным по окрашиванию на CCL22 по сравнению с нормальным и диспластическим эпителием.

Эксперимент 11 - Результаты скрининга на экспрессию CCR4 в более широком ряде опухолей

Используя библиотеку опухолевых кДНК (Cancer Research UK), содержащую кДНК, образованные с РНК, выделенной из 5-10 опухолевых образцов и 2-5 нормальных образцов для 11 различных типов опухолей: легкого, ободочной кишки, мочевого пузыря, желудка, поджелудочной железы, кожи, молочной железы, головного мозга, пищевода, яичника и простаты. Уровни экспрессии мРНК CCR4 измеряли, используя количественную ОТ-ПЦР в реальном времени.

Уровни мРНК CCR4 были значимо повышены при раках шейки матки, пищевода, почки, головного мозга, молочной железы и яичника.

Эксперимент 12 - Анализ экспрессии CCR4 в клеточных линиях рака шейки матки и почки

На фиг.11 показаны результаты анализа клеточного сканирования, активируемого флуоресценцией (FACS), на клеточных линиях рака шейки матки (С41, С33А) и почки, используя антитело против CCR4 для обнаружения экспрессии CCR4. Все эти клеточные линии экспрессировали CCR4. Пунктирными кривыми на фиг.11 показаны данные для родственного по изотипу контрольного антитела.

Эксперимент 13 - Эффекты распространенных цитокинов на экспрессию CCR4 опухолевыми клетками

Наиболее распространенными цитокинами, присутствующими в опухоли, являются ИЛ-10, TGF- , FGF, TNF- . Клеточную линию С41 рака шейки матки стимулировали в культуре различными цитокинами (ИЛ-10, TNF- , TGF- , FGF; 20 нг/мл) в течение 24 ч, затем определяли экспрессию CCR4 с помощью анализа FACS. Как показано на фиг.12, CCR4 претерпевал повышающую регуляцию в отношении процента положительных клеток после стимуляции ИЛ-10, TGF- и FGF (синяя кривая) по сравнению с не стимулированными клетками (черная кривая). Пунктирная кривая показывает данные для контроля изотипа. Полужирной кривой показана экспрессия CCR4 после стимуляции. Эти результаты показывают, что микросреда опухоли может индуцировать экспрессию CCR4 на опухолевых клетках.

Ссылки

1. Allen, S.J., Crown, S.E., and Handel, T.M. 2006. Chemokine: receptor structure, interactions, and antagonism. Annu Rev Immunol 25:787-820.

2. Balkwill, F.R. 2004. Cancer and the chemokine network. Nature Reviews Cancer 4:540-550.

3. Muller, A., Homey, В., Soto, H., Ge, N., Catron, D., Buchanan, M.E., McClanahan, Т., Murphy, E., Yuan, W., Wagner, S.N., et al. 2001. Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis. Nature 410:50-56.

4. Scotton, C.J., Wilson, J.L, Milliken, D., Stamp, G., and Balkwill, F.R. 2001. Epithelial cancer cell migration: a role for chemokine receptors? Cancer Res 61:4961-4965.

5. Zeelenberg, I.S., Ruuls-Van Stalle, L., and Roos, E. 2003. The chemokine receptor CXCR4 is required for outgrowth of colon carcinoma micrometastases. Cancer Res 63:3833-3839.

6. Balkwill, F. 2004. The significance of cancer cell expression of CXCR4. Seminars in Cancer Biology 14:171 -179.

7. Burger, J.A., and Kipps, T.J. 2006. CXCR4: a key receptor in the crosstalk between tumor cells and their microenvironment. Blood 107:1761-1767.

8. Zlotnik, A. 2006. Chemokines and cancer. Int J Cancer 119:2026-2029.

9. Meijer, J., Zeelenberg, I.S., Sipos, В., and Roos, E. 2006. The CXCR5 chemokine receptor is expressed by carcinoma cells and promotes growth of colon carcinoma in the liver. Cancer Res 66:9576-9582.

10. Letsch, A., Keilholz, U., Schadendorf, D., G., A., Asemissen, A.M., Thiel, E., and Scheibenbogen, C. 2004. Functional CCR9 expression is associated with small intestinal metastasis. J Invest Dermatol 122:685-690.

11. Scotton, C.J., Wilson, J.L., Scott, K., Stamp, G., Wilbanks, G.D., Fricker, S., Bridger, G., and Balkwill, F.R. 2002. Multiple actions of the chemokine CXCL12 on epithelial tumor cells in human ovarian cancer. Cancer Research 62:5930-5938.

12. Gordon, S. 2003. Alternative activation of macrophages. Nature Reviews Immunol 3:23-35.

13. Godiska, R., Chantry, D., Raport, C.J., Sozzani, S., Allavena, P., Leviten, D., Mantovani, A., and Gray, P.W. 1997. Human macrophage-derived chemokine (MDC), a novel chemoattractant for monocytes, monocyte-derived dendritic cells, and natural killer cells. J Exp Med 185:1595-1604.

14. Mantovani, A., Gray, P.A., Van Damme, J., and Sozzani, S. 2000. Macrophage-derived chemokine (MDC). J Leukoc Biol 68:400-404.

15. Berin, M.C., Dwinell, M.B., Eckmann, L, and Kagnoff, M.F. 2001. Production of MDC/CCL22 by human intestinal epithelial cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 280:G1217-G1226.

16. Imai, K., Kobayashi, M., Wang, J., Shinobu, N., Yoshida, H., Hamada, J., Shindo, M., Higashino, F., Tanaka, J., Asaka, M., et al. 1999. Selective secretion of chemoattractants for haemopoietic progenitor cells by bone marrow endothelial cells: a possible role in homing of haemopoietic progenitor cells to bone marrow. Br J Haematol 106:905-911.

17. Sallusto, F., Palermo, В., Lenig, D., Miettinen, M., Matikainen, S., Julkunen, I., Forster, R., Burgstahler, R., Lipp, M., and Lanzavecchia, A. 1999. Distinct patterns and kinetics of chemokine production regulate dendritic cell function. Eur J Immunol 29:1617-1625.

18. Fra, A.M., Locati, M., Otero, K., Sironi, M., Signorelli, P., Massardi, M.L., Gobbi, M., Vecchi, A., Sozzani, S., and Mantovani, A. 2003. Cutting Edge: Scavenging of inflammatory CC chemokines by the promiscuous putatively silent chemokine receptor D6. J Immunol 170:2279-2282.

19. Graham, G.J., and McKimmie, C.S. 2006. Chemokine scavenging by D6: a movable feast? Trends in Immunol 27:381-386.

20. Woerner, B.M., Warrington, N.M., Kung, A.L, Perry, A., and Rubin, J.B. 2005. Widespread CXCR4 activation in astrocytomas revealed by phospho-CXCR4-specific antibodies. Cancer Res 65:11392-11399.

21. Salvucci, O., Bouchard, A., Baccarelli, A., Deschenes, J., Sauter, G., Simon, R., Bianchi, R., and Basik, M. 2006. The role of CXCR4 receptor expression in breast cancer: a large tissue microarray study. Br Ca Res & Treat 97:275-283.

22. Schmid, B.C., Rudas, M., Rezniczek, G.A., Leodolter, S., and Zeillinger, R. 2004. CXCR4 is expressed in ductal carcinoma in situ of the breast and in atypical ductal hyperplasia. Br Ca Res & Treat 84:247-250.

23. Pils, D., Pinter, A., Reibenwein, J., Alfanz, A., Horak, P., Schmid, B.C., Hefler, L., Horvat, R., Reinthaller, A., Zeillinger, R., et al. 2007. In ovarian cancer the prognostic influence of HER2/neu is not dependent on the CXCR4/SDF-1 signalling pathway. Br J Cancer 96:485-491.

24. Borrello, M.G., Alberti, L., Fischer, A., Degl'innocenti, D., Ferrario, C, Gariboldi, M., Marchesi, F., Allavena, P., Greco, A., Collini, P., et al. 2005. Induction of a proinflammatory program in normal human thyrocytes by the RETVPTC1 oncogene. PNAS 102:14825-14830.

25. Braga, E., Senchenko, V., Bazov, I., Loginov, W., Liu, J., Ermilova, V., Kuzubskaya, Т., Garkavtseva, R., Mazurenko, N., Kisseljov, F.L., et al. 2002. Critical tumor-suppressor gene regions on chromosome 3p in major human epithelial malignancies: allelotyping and quantitative real-time per. Int J Cancer 100:534-541.

26. Senchenko, V., Liu, J., Braga, E., Mazurenko, N., Loginov, W., Seryogin, Y., Bazov, I., Protopopov, A., Kisseljov, F.L., Kashuba, V., et al. 2003. Deletion mapping using quantitative real-time PCR identifies two distinct 3-21.3 regions affected in most cervical carcinomas. Oncogene 22:2984-2992.

27. Acevedo, СМ., Henriquez, M., Emmert-Buck, M.R., and Chuaqui, R.F. 2002. Loss of heterozygosity on chromosome arms 3p and 6q in microdissected 33 adenocarcinomas of the uterine cervix and adenocarcinoma in situ. Cancer 94:793-802.

28. Nakayama, Т., Hieshima, K., Nagakubo, D., Sato, E., Kakayama, M., Kawa, K., and Yoshie, O. 2004. Selective induction of Th2-attracting chemokines CCL17 and CCL22 in human В cells by latent membrane protein 1 of Epstein-Barr virus. J Virol 78:1665-1674.

29. Balkwill, F., Charles, K.A., and Mantovani, A. 2005. Smoldering and polarized inflammation in the initiation and promotion of malignant disease. Cancer Cell 7:211-217.

30. Hagemann, Т., Wilson, J., Burke, F., Kulbe, H., Li, N.F., Pluddemann, A., Charles, K., Gordon, S., and Balkwill, F.R. 2006. Ovarian cancer cells polarize macrophages toward a tumor-associated phenotype. J Immunol 176:5023-5032.

31. Condeelis, J., and Pollard, J.W. 2006. Macrophages: obligate partners for tumor cell migration, invasion, and metastasis. Cell 124:263-266.

32. Negus, R.P.M., Stamp, G.W.H., Relf, M.G, Burke, F., Malik, S.T.A, Bernasconi, S., Allavena, P., Sozzani, S., Mantovani, A., and Balkwill, F.R. 1995. The detection and localization of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in human ovarian cancer. J Clin Invest 95:2391-2396.

33. Ishida, Т., Ishii, Т., Inagaki, A., Yano, H., Komatsu, H., Iida, S., Inagaki, H., and Ueda, R. 2006. Specific recruitment of CC chemokine receptor 4-positive regulatory Т cells in Hodgkin lymphoma fosters immune privilege. Cancer-Res 66:5716-5722.

34. Nakamura, E.S., Koizumi, K., Kobayashi, R., Saitoh, Y., Arita, Y., Nakayama, Т., Sakurai, H., Yoshie, O., and Saiki, I. 2006. RANKL-induced CCL22/macrophage-derived chemokine produced from osteoclasts potentially promotes the bone metastasis of lung cancer expressing its receptor CCR4. Clin Exp Metastasis July 5.

35. Ishida, Т., Inagaki, H., Utsunomiya, A., Takatsuka, Y., Komatsu, H., Iida, S., Takeuchi, G., Eimoto, Т., Nakamura, S., and Ueda, R. 2004. CXC chemokine receptor 3 and CC chemokine receptor 4 expression in T-cell and NK-cell lymphomas with special reference to clinicopathological significance for peripheral T-cell lymphoma, unspecified. Clin Cancer Res 10:5494-5500.

36. Ishida, Т., and Ueda, R. 2006. CCR4 as a novel molecular target for immunotherapy of cancer. Cancer Sci 97:1139-1146.

37. Ishida, Т., Iida, S., Akatsuka, Y., Ishii, Т., Miyazaki, M., Komatsu, H., Inagaki, H., Okada, N., Fujita, Т., Shitara, K., et al. 2004. The CC chemokine receptor 4 as a novel specific molecular target for immunotherapy in adult Tcell leukemia/lymphoma. Clin Cancer Res 10:7529-7539.

38. Kleeff J, Kusama T, Rossi DL, Ishiwata T, Maruyama H, Friess H, Biichler MW, Zlotnik A, Korc M. Detection and localization of Mip-3alpha/LARC/Exodus, a macrophage proinflammatory chemokine, and its CCR6 receptor in human pancreatic cancer. Int J Cancer. 1999 May 17;81(4):650-7.

39. Kimsey TF, Campbell AS, Albo D, Wilson M, Wang TN. Co-localization of macrophage inflammatory protein-3 alpha (Mip-3 alpha) and its receptor, CCR6, promotes pancreatic cancer cell invasion. Cancer J. 2004 Nov-Dec; 10(6):374-80.

40. Johrer K, Zelle-Rieser C, Perathoner A, Moser P, Hager M, Ramoner R, Gander H, Holtl L, Bartsch G, Greil R, Thurnher M. Up-regulation of functional chemokine receptor CCR3 in human renal cell carcinoma. Clin Cancer Res. 2005 Apr 1; II(7):2459-65.

41. Ferenczi, K., Fuhlbrigge, R.C., Pinkus, J.L., Pinkus, G.S. & Kupper, T.S. Increased CCR4 expression in cutaneous T cell lymphoma. J Invest Dermatol 119, 1405-1410(2002).

42. Baatar, D., Olkhanud, P., Newton, D., Sumitomo, K. & Biragyn, A. CCR4-expressing T cell tumors can be specifically controlled via delivery of toxins to chemokine receptors. J Immunol 119, 1996-2004 (2007).

43. Nagtegaal ID, Marijnen CA, Kranenbarg EK, Mulder-Stapel A, Hermans J, van de Velde CJ, van Krieken JH. Local and distant recurrences in rectal cancer patients are predicted by the nonspecific immune response; specific immune response has only a systemic effect - a histopathological and immunohistochemical study. BMC Vital Cancer. 2001; 1:7. Epub 2001 Jul 16.

44. Libura J, Drukala J, Majka M, Tomescu O, Navenot JM, Kucia M, Marquez L, Peiper SC, Barr FG, Janowska-Wieczorek A, Ratajczak MZ. "CXCR4-SDF-1 signalling is active in rhabdomyosarcoma cells and regulates locomotion, chemotaxis, and adhesion." Blood. 2002 Oct 1; 100(7):2597-606.

45. Bange, J; Zwick E, Ullrich A. (2001). "Molecular targets for breast cancer therapy and prevention". Nature Medicine 7:548-552.

46. Menard, S; Pupa SM, Campiglio M, Tagliabue E (2003). "Biologic and therapeutic role of HER2 in cancer". Oncogene 22:6570-6578

47. Kute, T; Lack CM, Willingham M, Bishwokama B, Williams H, Barrett K, Mitchell T, Vaughn JP (2004). "Development of herceptin resistance in breast cancer cells". Cytometry 57A:86-93.

48. Vestergaard С, Bang K, Gesser В, Yoneyama H, Matsushima K, Larsen CG. A Th2 chemokine, TARC, produced by keratinocytes may recruit CLA+CCR4+lymphocytes into lesional atopic dermatitis skin. J Invest Dermatol. 2000 Oct; 1 15(4):640-6.