пептиды ттк и вакцины, их содержащие

Формула изобретения

1. Выделенный пептид из менее 15 аминокислот, обладающий способностью индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), где пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.

2. Выделенный пептид из менее 15 аминокислот, обладающий способностью индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), причем пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, в которой 1 или 2 аминокислоты замещены или добавлены.

3. Выделенный пептид по п.2, который обладает одной или обеими из следующих характеристик:

(a) вторая аминокислота с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3 модифицирована так, что представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из лейцина и метионина; и

(b) C-концевая аминокислота аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3 модифицирована так, что представляет собой аминокислоту лейцин.

4. Выделенный пептид по любому из пп.1-3, который представляет собой нонапептид.

5. Выделенный полинуклеотид, кодирующий пептид по любому из пп.1-4.

6. Средство для индукции CTL, которое содержит один или несколько пептидов по любому из пп.1-4 или один или несколько полинуклеотидов по п.5.

7. Фармацевтическое средство для лечения и/или профилактики рака и/или предупреждения его послеоперационного рецидива, которое содержит в качестве активного вещества один или несколько пептидов по любому из пп.1-4 или один или более полинуклеотидов по п.5 в подходящей дозе.

8. Фармацевтическое средство по п.7, которое получено для введения индивидууму, у которого HLA-A-антиген представляет собой HLA-A2.

9. Фармацевтическое средство по п.8, где HLA-A2 представляет собой HLA-A*0201.

10. Фармацевтическое средство по п.7 или п.8, которое получено для лечения рака.

11. Способ индукции антигенпрезентирующей клетки (АРС), обладающей способностью индуцировать CTL, включающий стадию, выбранную из группы, состоящей из:

a) приведения АРС в контакт с пептидом по любому из пп.1-4 in vitro, ex vivo или in vivo, и

b) введения полинуклеотида, кодирующего пептид по любому из пп.1-4, в АРС.

12. Способ индукции CTL, включающий стадию, выбранную из группы, состоящей из:

(a) совместного культивирования CD8-позитивных Т-клеток с АРС, которые презентируют на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по любому из пп.1-4;

(b) совместного культивирования CD8-позитивных Т-клеток с экзосомами, которые презентируют на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по любому из пп.1-4;

(c) введения в Т-клетку полинуклеотида, кодирующего полипептид субъединицы T-клеточного рецептора (TCR), способный связываться с пептидом по любому из пп.1-4.

13. Выделенная АРС, которая презентирует на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида любому из пп.1-4.

14. АРС по п.13, которая индуцирована способом по п.11.

15. Выделенная CTL, которая индуцирована способом по п.12.

16. Способ индукции иммунного ответа против рака у индивидуума, включающий введение индивидууму средства, содержащего один или несколько пептидов по любому из пп.1-4.

17. Диагностический набор для оценки эффективности вакцины, который содержит пептид по любому из пп.1-4 или нуклеотид по п.5.

18. Применение по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из (a)-(d) для получения фармацевтического средства или композиции для лечения или профилактики рака или опухоли:

(a) пептида по любому из пп.1-4;

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид по любому из пп.1-4 в экспрессируемой форме;

(c) АРС или экзосомы, презентирующей пептид по любому из пп.1-4; или

(d) CTL по п.15.

Описание изобретения к патенту

Область техники

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США № 61/216017, поданной 11 мая 2009 г., включенной в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

Настоящее изобретение относится к области биологической науки, конкретнее к области терапии рака. В частности, настоящее изобретение относится к новым пептидам, которые крайне эффективны в качестве вакцин против рака и в качестве лекарственных средств для лечения и предупреждения опухолей.

Предшествующий уровень техники

Показано, что CD8-позитивные CTL распознают эпитопные пептиды, происходящие из опухоль-ассоциированных антигенов (TAA), обнаруживаемых на молекулах класса I главного комплекса гистосовместимости (MHC), и затем уничтожают клетки опухоли. С момента открытия семейства антигенов меланомы (MAGE) в качестве первого примера TAA было открыто множество других антигенов TAA, в первую очередь, с помощью иммунологических исследований (NPL 1: Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; NPL2: Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3):725-9). Некоторые из указанных TAA в настоящее время проходят клинические испытания в качестве иммунотерапевтических мишеней.

Идентификация новых ТАА, способных вызывать сильные и специфические иммунные ответы против опухолей, служит основанием для дальнейшего развития клинического применения стратегий пептидной вакцинации для различных типов рака

К сожалению, многие из противораковых вакцин, проходящих в настоящее время испытания, показывают лишь низкую частоту объективных ответов

Соответственно, сохраняется потребность в новых ТАА в качестве мишеней для иммунотерапии.

С этой целью был идентифицирован ряд генов, активированных при мелкоклеточном раке легких (SCLC) (PTL 1/WO2007/013665) и раке пищевода (PTL 2/WO2007/013671), посредством исследований профилей экспрессии генов с использованием масштабных геномных кДНК-микрочипов. Эти гены широко изучаются с целью определения среди них приемлемых кандидатов в качестве мишеней для иммунотерапии. Для специфического нацеливания на раковые клетки при иммунотерапии предпочтительные ТАА должны экспрессироваться, в первую очередь, раковыми клетками при ограниченной или при отсутствии экспрессии нормальными здоровыми тканями.

Предпочтительными ТАА в качестве мишеней иммунотерапии являются ТАА, которые необходимы для пролиферации и выживания раковых клеток. Такие ТАА могут минимизировать хорошо описанный риск ускользания от иммунного ответа раковых клеток, вызванный делецией, мутацией или подавлением ТАА, как следствие терапевтически управляемой иммунной селекции.

Используя анализ профиля экспрессии генов масштабным геномным микрочипированием кДНК, содержащим 23040 генов, определили ТТК-протеинкиназу (ТТК) в качестве одного из генов, активированных при раке легких (NPL3/Kikuchi et al., Int. Oncol. 2006 Apr; 28(4):799-805). Экспрессия ТТК специфически активирована в опухолевых клетках у более чем 80% пациентов с раком легких и раком пищевода. В то же время ТТК не экспрессирована в других нормальных органах, за исключением яичек. Совокупность данных фактов позволяет предположить, что ТТК могут применяться в качестве мишени иммунотерапии рака у пациентов с опухолями, при которых активированы ТТК. Пептиды, полученные из ТТК, которые обладают способностью индуцировать CTL против раковых клеток, экзогенно экспрессирующих ТТК и HLA-A*0201 предварительно раскрыты (см. WO2008/102557 (PTL3), результаты которой воспроизведены в настоящем описании в виде фиг.4).

Список литературы

Патентная литература

Непатентная литература

Сущность изобретения

Настоящее изобретение, по крайней мере, частично, основано на открытии новых пептидов, которые могут служить в качестве мишеней иммунотерапии. Так как в общем случае ТАА воспринимаются иммунной системой как «собственные» и, следовательно, не обладают иммуногенностью, обнаружение соответствующих мишеней является крайне важным. Как уже отмечалось, ТТК (типичная аминокислотная последовательность и генная последовательность показаны в SEQ ID NO:40 и SEQ ID NO:39, соответственно, но не ограничены перечисленным, и типичная генная последовательность также доступна, например, из GenBank Accession No. NM_003318) идентифицирована как сверхэкспрессированная при раке, включая, но не ограничиваясь перечисленным, рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек. Таким образом, настоящее изобретение сфокусировано на ТТК как на соответствующем маркере рака и кандидате мишени иммунотерапии.

Настоящее изобретение относится к идентификации специфических эпитопных пептидов генного продукта ТТК, которые обладают способностью индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), специфические для ТТК. Как обсуждается подробно далее, периферические мононуклеарные клетки крови (PBMC), полученные от здорового донора, стимулировали, используя HLA-A*0201-связывающие кандидатные пептиды, полученные из ТТК. Затем были установлены линии CTL со специфической цитотоксичностью против HLA-A2-позитивных клеток-мишеней, подвергшихся воздействию в импульсном режиме каждого из испытуемых пептидов. Среди линий CTL, линии CTL, индуцированные пептидами, имеющими аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, демонстрируют значительную специфическую цитотоксичность против клеток, экспрессирующих HLA-А*0201 и ТТК. Данные результаты демонстрируют, что указанные пептиды (особенно пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3) представляют собой HLA-A2-ограниченные эпитопные пептиды, которые могут вызывать сильный и специфический иммунный ответ против клеток, экспрессирующих ТТК. Дополнительно, полученные результаты показывают, что ТТК высоко иммуногенны и их эпитопы представляют собой эффективные мишени для иммунотерапии опухоли/рака.

Соответственно, цель настоящего исследования представить выделенные пептиды, которые связывают HLA-антиген, в частности пептиды, которые включают аминокислотную последовательность ТТК (например, SEQ ID NO:40) или их иммунологически активные фрагменты. Указанные пептиды, как ожидают, обладают способностью индуцировать CTL и, таким образом, могут быть использованы для индуцирования CTL ex vivo, или могут быть введены индивидууму для вызова иммунных ответов против рака, такого как рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярная карцинома, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфома, остеосаркома, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек. Предпочтительные пептиды представляют собой пептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.

Пептиды по настоящему изобретению охватывают пептиды, в которых одна, две или более аминокислот замещены, удалены и/или добавлены, до тех пор, пока модифицированные пептиды сохраняют исходную способность индуцировать CTL.

Настоящее изобретение также представляет выделенные полинуклеотиды, кодирующие любые пептиды по настоящему изобретению. Указанные полинуклеотиды, также как и пептиды по настоящему изобретению, могут быть использованы для индуцирования или получения APC со способностью индуцировать CTL, или могут быть введены индивидууму для вызова иммунных ответов против рака.

При введении индивидууму пептиды по настоящему изобретению предпочтительно презентированы на поверхности АРС, для того, чтобы индуцировать CTL, нацеленные на соответствующие пептиды. Соответственно, дополнительная цель настоящего изобретения представить средства или композиции, которые индуцируют CTL, такие средства или композиции включают один или несколько пептидов по настоящему изобретению, или полинуклеотиды, кодирующие такие пептиды. Настоящее изобретение дополнительно охватывает фармакологические средства или композиции, включающие один или несколько пептидов по настоящему изобретению, или полинуклеотидов, кодирующих такие пептиды, приготовленные для лечения и/или профилактики рака, а также для предупреждения его послеоперационного рецидива, где указанные виды рака включают, но не ограничиваются перечисленным, рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рака желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек. Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут включать АРС или экзосомы, которые презентируют любые пептиды по настоящему изобретению вместо/в добавление к пептидам по настоящему изобретению или полинуклеотидам в качестве активных ингредиентов.

Пептиды или полинуклеотиды по настоящему изобретению могут индуцировать АРС, которые презентируют на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению, например, контактированием АРС, полученного от индивидуума, с пептидом по настоящему изобретению или введением полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в АРС. Указанные АРС обладают высокой способностью индуцировать CTL против целевых пептидов и применяются для иммунотерапии рака. Соответственно, настоящее изобретение включает как способы индуцирования АРС со способностью индуцировать CTL, так и АРС, полученные указанными способами.

Настоящее изобретение представляет способы индуцирования CTL, которые включают стадию совместного культивирования CD8-позитивных Т-клеток с АРС или экзосомами, презентирующими один или несколько пептидов по настоящему изобретению на своей поверхности, или стадию введения гена, который включает полинуклеотид, кодирующий полипептид субъединицы Т-клеточного рецептора (TCR), способный связываться с пептидом по настоящему изобретению. CTL, полученные указанными способами, находят применение в лечении и предупреждении рака, примеры которого включают, но не ограничиваются перечисленным, рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек. Таким образом, настоящее изобретение включает CTL, полученные способами по настоящему изобретению.

Еще одна цель настоящего изобретения представить способы для вызова иммунной реакции против рака у индивидуума, который нуждается в указанном лечении, включающие стадию введения индивидууму средства или композиции, которая содержит полипептид ТТК или его иммунологически активный фрагмент, полинуклеотиды, кодирующие полипептид ТТК, и экзосомы или АРС, презентирующие полипептид ТТК.

Применимость настоящего изобретения распространяется на ряд заболеваний, относящихся или возникающих из-за сверхэкспрессии ТТК, таких как рак, примеры которого включают, но не ограничиваются перечисленным, рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек.

В частности, настоящее изобретение обеспечивает следующее с [1] по [21]:

[1] Выделенный пептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.

[2] Выделенный пептид, обладающий способностью индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), причем пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, в которой 1, 2 или несколько аминокислот замещены, удалены или добавлены.

[3] Выделенный пептид по [2], который обладает одной или обеими из следующих характеристик:

(а) вторая аминокислота с N-конца представляет собой или модифицирована таким образом, чтобы представлять собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из лейцина и метионина; и

(b) С-концевая аминокислота представляет собой или модифицирована таким образом, чтобы представлять собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из валина и лейцина.

[4] Выделенный пептид по любому из пп.[1]-[3], в которых пептид представляет собой нонапептид.

[5] Выделенный полинуклеотид, кодирующий пептид по любому из пп.[1]-[4].

[6] Средство для индуцирования CTL, которое содержит один или несколько пептидов по любому из пп.[1]-[4], или один или несколько полинуклеотидов по п.[5].

[7] Фармацевтическое средство для лечения и/или профилактики рака и/или предупреждения его послеоперационного рецидива, которое содержит один или несколько пептидов по любому из пп.[1]-[4] или один или несколько полинуклеотидов по п.[5].

[8] Фармацевтическое средство по п.[7], приготовленное для введения индивидууму, у которого антиген HLA-A представляет собой HLA-A2.

[9] Фармацевтическое средство по п.[8], где HLA-A2 представляет собой HLA-A*0201.

[10] Фармацевтическое средство по п.[7] или [8], которое приготовлено для лечения рака.

[11] Способ для индуцирования антигенпрезентирующих клеток (АРС), обладающих способностью индуцировать CTL, включающий стадию, выбранную из группы, состоящей из:

(а) контактирования АРС с пептидом по любому из пп.[1]-[4] in vivo, ex vivo или in vitro, и

(b) введения полинуклеотида, кодирующего пептид по любому из пп.[1]-[4] в АРС.

[12] Способ индуцирования CTL, включающий стадию, выбранную из группы, состоящей из:

(а) совместного культивирования CD8-позитивных Т-клеток с АРС, которые презентируют на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по любому из пп.[1]-[4],

(b) совместного культивирования CD8-позитивных Т-клеток с экзосомами, которые презентируют на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по любому из пп.[1]-[4], и

(с) введения в Т-клетку гена, который содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид субъединицы Т-клеточного рецептора (TCR), способный связываться с пептидом по любому из пп.[1]-[4].

[13] Выделенная АРС, которая презентирует на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по любому из пп.[1]-[4].

[14] АРС по п.[13], которая индуцирована способом по п.[11].

[15] Выделенный CTL, который нацелен на пептид по любому из пп.[1]-[4].

[16] CTL по п.[15], который индуцирован способом по п.[12].

[17] Способ вызова иммунной реакции против рака у индивидуума, который включает введение индивидууму средства, содержащего один или несколько пептидов по любому из пп.[1]-[4], один или несколько их иммунологически активных фрагментов или один или несколько полинуклеотидов, кодирующих пептиды или их фрагменты.

[18] Антитело или его фрагмент против пептидов по любому из пп.[1]-[4].

[19] Вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид по любому из пп.[1]-[4].

[20] Клетка-хозяин, трансформированная или трансфицированная вектором по п.[19].

[21] Диагностический набор, содержащий пептид по любому из пп.[1]-[4], нуклеотид по п.[5] или антитело по п.[18].

В добавление к вышесказанному, другие цели и особенности настоящего изобретения станут более понятными из последующего подробного описания в сочетании с сопутствующими примерами и чертежами. Таким образом, должно быть понятно, что и вышеизложенная сущность изобретения, и последующее подробное описание, и иллюстрирующие варианты осуществления не ограничивают настоящее изобретение и другие альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения. В частности, хотя настоящее изобретение раскрыто в настоящем описании со ссылкой на ряд специфических вариантов осуществления, очевидно, что описание является иллюстрацией изобретения и не предназначено для его ограничения. Могут встречаться различные модификации и способы использования, известные специалисту в области техники, которые находятся в рамках настоящего изобретения, как описано в формуле изобретения. Таким образом, другие цели, особенности, преимущества и эффекты настоящего изобретения станут понятны из сущности и некоторых вариантов осуществления, описанных далее, и будут ясны специалистам в области техники. Указанные цели, особенности, преимущества и эффекты настоящего изобретения станут понятны из описанного ранее в сочетании с примерами, данными, чертежами отдельно или в сочетании со ссылками, включенными в настоящее описание.

Краткое описание чертежей

Различныеаспекты и применения настоящего изобретения станут понятными специалистам в области техники при рассмотрении краткого описания чертежей, а также подробного описания настоящего изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления, изложенных далее.

[фиг.1] Фиг.1 содержит серии фотографий (a)-(j), изображающих результаты IFN-гамма ELISPOT анализа CTL, которые индуцируют пептидами, происходящими из ТТК. CTL в нижеперечисленных пронумерованных лунках демонстрируют сильную продукцию гамма-IFN по сравнению с контролем: в лунке #1 и #4 стимулированные TTK-A02-9-462 (SEQ ID NO:1) (a), #7 TTK-A02-9-630 (SEQ ID NO:2) (b), #5 TTK-A02-9-593 (SEQ ID NO:3) (c), #4, #5, #6 и #7 TTK-A02-9-719 (SEQ ID NO:6) (d), #5 и #7 TTK-A02-9-142 (SEQ ID NO:15) (e), #7 TTK-A02-9-146 (SEQ ID NO:19) (f), #5, #7 и #8 TTK-A02-9-564 (SEQ ID NO:20) (g), #1, #2 и #5 TTK-A02-10-462 (SEQ ID NO:22) (h), #2 TTK-A02-10-542 (SEQ ID NO:34) (i), и #2 TTK-A02-10-661 (SEQ ID NO:35) (j). Клетки в лунках, обозначенных прямоугольником, размножают для создания линий CTL. На чертежах «+» обозначает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, подвергнутых обработке соответствующим пептидом в импульсном режиме, и «-» обозначает, что отсутствует продукция IFN-гамма против клеток-мишеней, не подвергнутых обработке каким-либо пептидом в импульсном режиме.

[фиг.2a-d] Фиг.2a-d состоит из серий линейных графиков (а)-(d), изображающих результаты анализа IFN-гамма ELISA, демонстрирующие продукцию IFN-гамма линиями CTL, стимулированными TTK-A02-9-462 (SEQ ID NO:1) (a), TTK-A02-9-630 (SEQ ID NO:2) (b), TTK-A02-9-593 (SEQ ID NO:3) (c), и TTK-A02-9-719 (SEQ ID NO:6) (d). Результаты демонстрируют, что CTL линии, созданные стимуляцией каждым пептидом, демонстрируют сильную продукцию интерферона-гамма по сравнению с контролем. На чертежах «+» обозначает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, подвергнутых обработке соответствующим пептидом в импульсном режиме, и «-» обозначает, что отсутствует продукция IFN-гамма против клеток-мишеней, не подвергнутых обработке соответствующим пептидом в импульсном режиме.

[фиг.2e-g] Фиг.2e-g состоит из серий линейных графиков (e)-(g), изображающих результаты анализа IFN-гамма ELISA, демонстрирующие продукцию IFN-гамма линиями CTL, стимулированными TTK-A02-9-142 (SEQ ID NO:15) (e) и TTK-A02-10-462 (SEQ ID NO:22) (f), и продукцию IFN-гамма клонами CTL, полученными из линий CTL, стимулированными TTK-A02-9-593 (SEQ ID NO:3), стимуляцией таким же пептидом (g). Результаты демонстрируют, что CTL линии, созданные стимуляцией пептидами ТТК, демонстрируют сильную продукцию интерферона-гамма по сравнению с контролем. На фигурах «+» обозначает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, подвергнутых обработке соответствующим пептидом в импульсном режиме, и «-» обозначает, что отсутствует продукция IFN-гамма против клеток-мишеней, не подвергнутых обработке соответствующим пептидом в импульсном режиме.

[фиг.3] Фиг.3 состоит из серий линейных графиков (а)-(с), изображающих специфическую CTL активность против клеток-мишеней, которые экзогенно экспрессируют ТТК и HLA-A*0201, и опухолевых клеток, которые HLA-A2-позитивны и сверхэкспрессируют ТТК. COS7-клетки, трансфицированные HLA-A*0201 и непроцессированным геном ТТК, получают в качестве клеток-мишеней в то же время клетки COS7, трансфицированные HLA-A*0201 и непроцессированным геном ТТК, получают в качестве контролей (а) и (b). Также Н1650, опухолевую клеточную линию, которая HLA-A2 позитивна и сверхэкспрессирует ТТК, получают в качестве клеток-мишеней, в то же время опухолевые клеточные линии РС-3 и ТЕ-1, которые HLA-A2-негативны и сверхэкспрессируют ТТК, получают в качестве контролей (с). Линии CTL, созданные ТТК-А02-9-593 (SEQ ID NO:3) (а), и CTL клоны, созданные из линии CTL (b), демонстрируют специфическую CTL-активность против COS7-клеток, трансфицированных и ТТК и HLA-A*0201 (черный ромб). В то же время не определяют специфическую активность CTL против клеток-мишеней, экспрессирующих или только HLA-A*0201 (треугольник), или только ТТК (окружность). Клон CTL также демонстрирует специфическую активность CTL против опухолевой клеточной линии (HLA-A2 ⁺, ТТК⁺):Н1650 клеток (с) (черный прямоугольник). С другой стороны, отсутствует значимая специфическая CTL против клеток-мишеней (HLA-A2^-, ТТК⁺)(треугольник:РС-3, окружность:ТЕ-1).

[фиг.4] Фиг.4 состоит из серии линейных графиков, изображающих специфическое индуцирование активности CTL пептидов, полученных из ТТК, против клеток-мишеней, экзогенно экспрессирующих ТТК и HLA-A*0201 (результаты эндоанализа). Графики соответствуют фиг.8b, с, d и е в заявке WO2008/102557.

Описание вариантов осуществления

Хотя какие-либо способы и вещества, похожие или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, могут быть использованы на практике или в испытаниях вариантов осуществления настоящего изобретения, в данном документе описаны предпочтительные способы, устройства и вещества. Однако, до описания веществ и способов по настоящему изобретению, нужно понять, что настоящее изобретение не ограничено отдельными размерами, формами, величинами, веществами, методиками, протоколами и т.д., приведенными в настоящем описании, так как они могут различаться в соответствии с общепринятыми экспериментами и оптимизацией. Также должно быть понятно, что терминология, использованная в описании, употребляется только для описания отдельных версий или вариантов осуществления и не предназначена для ограничения рамок настоящего изобретения, которое будет ограничено только формулой изобретения.

I. Определения

Формы единственного и множественного числа, использованные в настоящем описании, означают «по меньшей мере, один», если специально не указано иначе.

Термины «полипептид», «пептид» и «белок», использованные в настоящем описании взаимозаменяемо, относятся к полимеру аминокислотных остатков. Термины применяют к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько из аминокислотных остатков представляет собой модифицированный остаток или остаток, полученный искусственным путем, такой как искусственный химический аналог соответствующей природной аминокислоты, а также природные аминокислотные полимеры.

Термин «аминокислота», использованный в настоящем описании, относится к природным и синтезированным аминокислотам, а также к аминокислотным аналогам и аминокислотным миметикам, которые функционально похожи на природные аминокислоты. Аминокислота может быть L-аминокислотой или D-аминокислотой. Природные аминокислоты представляют собой те аминокислоты, которые кодируются генетическим кодом, а также те, которые модифицируются после трансляции в клетках (например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат и О-фосфосерин). Фраза «аминокислотный аналог» относится к соединениям, которые имеют одинаковое химическое строение (альфа-углеродная связь с водородом, карбоксигруппой, аминогруппой и R-группой) с природной аминокислотой, но обладают измененной R-группой или измененными скелетами (например, гомосерин, норлейцин, метионин, сульфоксид, метионинметилсульфоний). Фраза «аминокислотный миметик» относится к химическим соединениям, которые имеют различное строение, но схожие функции с общепринятыми аминокислотами.

Аминокислоты могут быть обозначены в данном описании общепринятым трехбуквенным кодом, рекомендованным IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission.

Термины «ген», «полинуклеотиды», «нуклеотиды» и «нуклеиновые кислоты» используются взаимозаменяемо в настоящем описании и, если не указано иначе, подобно аминокислотам указываются общепринятыми односимвольными кодами.

Термин «композиция», использованный в настоящем документе, включает продукт, содержащий специфические ингредиенты в специфических количествах, а также какой-либо продукт, который получают, напрямую или опосредованно, из комбинаций специфических ингредиентов в специфических количествах. Указанный термин в отношении фармацевтической композиции предназначен охватывать продукт, содержащий активный ингредиент (ингредиенты) и неактивный ингредиент (ингредиенты), который образует носитель, а также продукт, который получают, напрямую или опосредованно, посредством комбинации комплексирования или агрегации одного или нескольких ингредиентов, или посредством других типов реакций или взаимодействия одного или более ингредиентов. Соответственно, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению охватывает любую композицию, образованную смешиванием соединения по настоящему изобретению и фармацевтически или физиологически приемлемого носителя. Фраза «фармацевтически приемлемый носитель» или «физиологически приемлемый носитель», как использовано в настоящем описании, означает фармацевтически или физиологически приемлемый материал, композицию, вещество или носитель, включая, но не ограничиваясь перечисленным, жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент, растворитель или материал, создающий капсулу, вовлеченный в перенос или транспортировку объекта, нагруженного полифармакофорами, через орган или часть тела к другому органу или части тела.

Если не указано иначе, термин «рак» относится к ракам или опухолям с избыточной экспрессией гена ТТК, примеры которых включают, но не ограничены перечисленным, рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек.

Если не оговорено иначе, термины «цитотоксический Т-лимфоцит», «цитотоксическая Т-клетка» и «CTL», используются взаимозаменяемо в настоящем описании и, если не указано иначе, относятся к подгруппе Т-лимфоцитов, которые способны распознавать чужеродные клетки (например, опухолевые клетки, вирусные клетки) и вызывать гибель указанных клеток.

Если не оговорено иначе, термин «HLA-А2» соответственно относится к подтипам, таким как HLA-А*0201 и HLA-А*0206.

Если не указано иначе, термин «набор», использованный в настоящем описании, применяют в отношении сочетания реагентов и других веществ. Предполагается, что набор может включать микрочип, кристалл, маркер и т.п. Не предполагается, что термин «набор» ограничивает отдельное сочетание реактивов и/или веществ.

В тех случаях, когда способы и композиции по настоящему изобретению используют в контексте «лечение» рака, лечение подразумевает «эффективность», если приводит к клиническому эффекту, такому как уменьшение экспрессии гена ТТК, или к уменьшению размера, распространенности или возможного метастазирования рака у индивидуума. Если лечение назначают профилактически, «эффективность» означает замедление развития или предупреждение рака посредством предупреждения или смягчения клинических симптомов рака. Эффективность определяют любым известным способом диагностики или лечения отдельного вида рака.

В тех случаях, когда способы и композиции по настоящему изобретению используют в контексте «предупреждение» или «профилактика» рака, указанные термины взаимозаменяемо используют в настоящем документе для обозначения какого-либо действия, которое уменьшает смертность от заболевания или заболеваемость. Предупреждение и профилактика могут происходить «при первичном, вторичном и третичном уровнях предупреждения». В то время как первичное предупреждение и профилактика предотвращают развитие заболевания, вторичный и третичный уровни предупреждения и профилактики включают действия, направленные на предупреждение и профилактику прогрессирования заболевания и остроты симптомов, а также уменьшают отрицательное влияние уже развившегося заболевания восстановлением функции и уменьшением связанных с болезнью осложнений. В качестве альтернативы, предупреждение или профилактика могут включать широкий диапазон профилактических лекарственных средств, способствующих уменьшению тяжести отдельного расстройства. Например, уменьшению пролиферации и метастазирования опухолей.

В контексте настоящего изобретения, лечение, и/или профилактика рака, и/или предупреждение его послеоперационного рецидива включают любые нижеприведенные этапы, такие как хирургическое удаление раковых клеток, подавление роста раковых клеток, обратное развитие или регресс опухоли, индукция ремиссии и подавление возникновения рака, регресс опухоли и уменьшение или подавление метастазов. Эффективное лечение и/или профилактика рака уменьшает смертность и улучшает прогноз индивидуумов, страдающих раком, уменьшает уровни опухолевых маркеров в крови и ослабляет симптомы, сопутствующие раку. Например, уменьшение или смягчение симптомов на 10%, 20%, 30% или более или стабилизация заболевания составляют эффективное лечение и/или профилактику.

В контексте настоящего изобретения, термин «антитело» относится к иммуноглобулинам и их фрагментам, которые специфически вступают в реакцию с определенным белком или его пептидом. Антитело может включать человеческие антитела, приматизированные антитела, химерные антитела, биспецифические антитела, гуманизированные антитела, антитела, слитые с другими белками или меченные изотопами, и фрагменты антител. Кроме того, антитело использовано в настоящем описании в широком смысле и специфически охватывает интактные моноклональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные из, по меньшей мере, двух интактных антител, и фрагменты антител, если они проявляют необходимую биологическую активность. «Антитело» означает все классы (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM).

Если не оговорено иначе, все технические и специальные термины, использованные в настоящем описании, имеют одинаковое значение, что понятно специалисту в области техники.

II. Пептиды

Для демонстрации того, что пептиды, происходящие из ТТК, действуют как антиген, распознаваемый CTL, пептиды, полученные из ТТК (SEQ ID NO:40), исследуют для определения, являются ли они антигенными эпитопами, ограниченными HLA-А2, которые обычно представляют собой HLA аллели (Date Y et al., Tissue Antigens 47:93-101, 1996; Kondo et al., J Immunol 155:4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152:3913-24, 1994).

Кандидаты HLA-А2 связывающих пептидов, полученных из ТТК, идентифицируют на основании их способностей связываться с HLA-A2. После стимуляции in vitro Т-клеток дендритными клетками (DC), обработанными указанными пептидами в импульсном режиме, CTL могут быть успешно установлены с использованием каждого из перечисленных ниже пептидов:

Перечисленные устойчивые CTL демонстрируют специфическую сильную активность CTL против клеток-мишеней, подвергнутых прерывистому воздействию соответствующих пептидов. Данные результаты демонстрируют, что ТТК представляет собой антиген, распознаваемый CTL, и что исследуемые пептиды представляют собой эпитопные пептиды ТТК, ограниченные HLA-А2.

Далее, CTL, установленные с ТТК-А02-9-593 (SEQ ID NO:3), показали более сильную специфическую CTL-активность против клеток-мишеней, экспрессирующих HLA-А*0201 и ТТК, чем сообщалось ранее. Эти результаты демонстрируют, что ТТК-А02-9-593 (SEQ ID NO:3) является подходящим пептидом для индуцирования сильной специфической CTL-активности против клеток, сверхэкспрессирующих ТТК.

Так как ген ТТК избыточно экспрессирован в раковых клетках, таких как рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярная карцинома, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфома, остеосаркома, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек, и не экспрессирован в большинстве неизмененных органов, он является хорошей целью для иммунотерапии. Таким образом, настоящее изобретение представляет нонапептиды (пептиды, состоящие из девяти аминокислотных остатков) и декапептиды (пептиды, состоящие из десяти аминокислотных остатков), соответствующие CTL-распознаваемым эпитопам ТТК. В качестве альтернативы, настоящее изобретение представляет выделенные пептиды, которые связывают HLA-антигены и индуцируют цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), пептиды состоят из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:40 или из ее иммунологически активного фрагмента. Предпочтительные примеры нонапептидов и декапептидов по настоящему изобретению включают пептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.

В общем случае программное обеспечение, в настоящее время доступное в Интернете, такое как описано в Parker K.C. et al., J Immunol 1 Jan 1994, 152(1):163-75 и Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12:1007-17, может быть использовано для оценки связывающих способностей различных пептидов и HLA-антигенов in silico. Связывающая способность с HLA-антигенами может быть оценена, как описано, например, в ссылках Parker K.C. et al., J Immunol 1 Jan 1994, 152(1):163-75, Kuzushima K. et al., Blood 2001, 98(6):1872-81, Larsen M.V. et al. BMC Bioinformatics 31 Oct 2007; 8:424, Buus S. et al. Tissue Antigens., 62:378-84, 2003, Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12:1007-17 и Nielsen M et al. PLoS ONE 2007; 2:е796, которые суммированы, например, Lafuente E.M. et al., Current Pharmaceutical Design 2009, 15, 3209-3220. Способы для определения аффинности связывания описаны, например, в: Journal of Immunogical Methods, 1995, 185:181-190; Protein Science, 2000, 9:1838-1846. Таким образом, используя указанное программное обеспечение, могут быть выделены иммунологически активные фрагменты, происходящие из ТТК, которые обладают высокой аффинностью связывания с HLA-антигенами. Следовательно, настоящее изобретение охватывает пептиды, состоящие из каких-либо иммунологически активных фрагментов, происходящих из ТТК, которые связываются с HLA-антигенами, определенными, используя описанные известные программы. Пептиды по настоящему изобретению могут быть пептидами, состоящими из полноразмерных ТТК.

Нонапептиды и декапептиды по настоящему изобретению могут быть соединены с дополнительными аминокислотными остатками, если полученный пептид сохраняет способность индуцировать CTL. Аминокислотные остатки, дополненные пептидами по настоящему изобретению, могут быть составлены из любых аминокислот, если они не нарушают способность индуцировать CTL исходного пептида. Следовательно, настоящее изобретение охватывает пептиды, которые получены из ТТК и обладают аффинностью связывания с HLA-антигенами. Указанные пептиды обычно меньше чем приблизительно 40 аминокислот, чаще меньше чем 20 аминокислот, обычно меньше чем 15 аминокислот.

В общем случае изменение одной, двух или нескольких аминокислот в пептиде не будет влиять на функцию пептида, а в некоторых случаях будет даже усиливать требуемое действие исходного белка. На самом деле модифицированные пептиды (т.е. пептиды, составленные из аминокислотных последовательностей, в которых один, два или несколько аминокислотных остатков изменены (т.е. замещены, удалены, добавлены или вставлены в исходную последовательность)) изучили в отношении сохранения биологической активности исходного пептида (Mark et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81:5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10:6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79:6409-13). Таким образом, в одном варианте осуществления пептиды по настоящему изобретению могут обладать и способностью индуцировать CTL, и аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:3, в которой одна, две или даже несколько аминокислот добавлены, вставлены или/и замещены.

Специалистам в области техники понятно, что отдельные добавления или замещения последовательностей аминокислот, которые изменяют единичную аминокислоту или маленький процент аминокислот, обуславливают сохранение свойств исходной аминокислотной последовательности. По существу, они часто называются «консервативные замещения» или «консервативные модификации», когда изменение белка приводит к появлению модифицированного белка, обладающего функцией, аналогичной функции исходного белка. Консервативное замещение представляет функционально схожие аминокислоты, хорошо известные в области техники. Примеры аминокислот с боковыми цепочками, особенности которых требуется сохранить, включают, например, гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, Е, Q, G, Н, К, S, Т), и боковые цепочки, имеющие следующие функциональные группы или характеристики в общем случае: алифатическая боковая цепочка (G, А, V, L, I, Р); боковая цепочка, содержащая гидроксильную группу, (S, Т, Y); боковая цепочка, содержащая атом серы (С, М); боковая цепочка, содержащая карбоксильную группу и амид (D, N, E, Q); боковая цепочка, содержащая основание (R, К, Н); и боковая цепочка, содержащая ароматические соединения (Н, F, Y, W). В добавление, далее перечислены восемь групп, каждая из которых включает аминокислоты, которые подходят в области техники в качестве консервативных замещений друг для друга:

1) аланин (А), глицин (G);

2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е);

3) аспарагин (N), глутамин (Q);

4) аргинин (R), лизин (К);

5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (М), валин (V);

6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W);

7) серин (S), треонин (Т); и

8) цистеин (С), метионин (М) (см., например, Creighton, Proteins 1984).

Данные консервативно модифицированные пептиды также считаются пептидами по настоящему изобретению. Однако пептиды по настоящему изобретению не ограничиваются ими и могут включать неконсервативные модификации, если модифицированный пептид сохраняет способность исходного пептида индуцировать CTL. Кроме того, модифицированные пептиды не исключают полиморфные варианты пептидов, способных индуцировать CTL, их межвидовые гомологи и аллели ТТК.

Для сохранения способности индуцировать CTL может быть изменено (вставлено, удалено, добавлено и/или замещено) небольшое число (например, 1, 2 или несколько) или маленькое процентное содержание аминокислот. Термин «несколько» в настоящем описании означает 5 или меньше аминокислот, например 4, 3 или меньше. Процентное содержание модифицированных аминокислот составляет предпочтительно 20% или менее, более предпочтительно 15% или менее, еще более предпочтительно 10% или менее или от 1 до 5%.

При использовании в иммунотерапии пептиды по настоящему изобретению должны быть презентированы на поверхности клетки или экзосомы, предпочтительно как комплекс с HLA-антигеном. Таким образом, предпочтительно выбирать пептиды, которые не только индуцируют CTL, но также обладают высокой аффинностью связывания с HLA-антигеном. С этой целью пептиды могут быть модифицированы замещением, вставкой и/или добавлением аминокислотного остатка для получения модифицированного пептида, имеющего улучшенную аффинность связывания. В добавление к пептидам, которые презентированы в природе, так как порядок последовательностей пептидов, продемонстрированный связыванием с HLA-антигенами, хорошо известен (J Immunol 1994, 152:3913; Immunogenetics 1995, 41:178; J Immunol 1994, 155:4307), модификации, основанные на указанном порядке, могут быть включены в иммуногенные пептиды по изобретению.

Например, может быть необходимым заместить вторую аминокислоту на N-конце лейцином или метионином, и/или аминокислоту на С-конце валином или лейцином для увеличения аффинности связывания HLA-А2. Следовательно, пептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, в которой вторая аминокислота на N-конце замещена лейцином или метионином и/или в которой С-конец замещен валином или лейцином, входят в настоящее изобретение.

Замещения могут быть проведены не только на концевых аминокислотах, но и также в положении возможного Т-клеточного рецептора (TCR) распознавания пептидов. Несколько исследований продемонстрировали, что пептиды с аминокислотными замещениями могут быть такими же или лучше, чем исходный пептид, например САР1, р53_(264-272), Her-2/neu_(369-377) или gp100_(209-217)

Настоящее изобретение также рассматривает добавление одной, двух или нескольких аминокислот к N- и/или С-концу описываемых пептидов. Такие модифицированные пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с HLA-антигеном и сохраняющие способность индуцировать CTL, также включены в настоящее изобретение.

Однако если пептидная последовательность идентична части аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка, имеющего другую функцию, могут быть вызваны побочные эффекты, такие как аутоиммунные нарушения и/или симптомы аллергии против специфических веществ. Следовательно, предпочтительно сначала выполнять исследование гомологов, используя базу данных для того, чтобы избежать ситуаций, при которых последовательность пептида одинакова с аминокислотной последовательностью другого белка. Если становится понятно из исследования гомологов, что не существует пептид даже с 1 или 2 различиями аминокислот по сравнению с целевым пептидом, целевой пептид может быть модифицирован для повышения аффинности связывания с HLA-антигенами, и/или для повышения его способности индуцировать CTL без опасности возникновения указанных побочных эффектов.

Хотя пептиды, имеющие высокую аффинность связывания с HLA-антигенами, которые описаны выше, предположительно являются высокоэффективными, кандидатные пептиды, которые выбраны в зависимости от наличия высокой аффинности связывания в качестве индикатора, дополнительно исследуют в отношении способности индуцировать CTL. В настоящем описании «способность индуцировать CTL» указывает на способность пептида индуцировать CTL, если он презентирован на антигенпрезентирующих клетках (APC). Кроме того, «способность индуцировать CTL» включает способность пептида индуцировать активацию CTL, пролиферацию CTL, способствует лизису CTL клеток-мишеней и увеличивает продукцию CTL гамма-интерферона.

Подтверждение способности индуцировать CTL сопровождается индукцией АРС, несущих антигены человеческого МНС (например, В-лимфоциты, макрофаги и дендритные клетки (DC)), а именно DC, происходящие из человеческих мононуклеарных лейкоцитов периферической крови, и, после стимуляции пептидами, смешиванием с CD8-позитивными клетками, и затем измерением гамма-интерферона, произведенного и высвобожденного CTL против клеток-мишеней. В качестве реакционной системы могут быть использованы трансгенные животные, которые получены для экспрессии человеческого HLA-антигена (например, описанные в BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8):764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenice mice: dependent on MHC (HLA) class II restricted T(H) response). Например, клетки-мишени могут быть мечены изотопом ⁵¹Cr и т.п., и цитотоксическое действие может быть вычислено, исходя из радиоактивности, высвобожденной из клеток-мишеней. В качестве альтернативы, способность индуцировать CTL может быть оценена измерением интерферона-гамма, произведенного и высвобожденного CTL в присутствии АРС, которые несут иммобилизованные пептиды, и визуализацией зоны подавления в среде, используя анти-интерферон-гамма моноклональные антитела.

В результате исследования способности индуцировать CTL пептидов, как описано ранее, было открыто, что нонапептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, демонстрирует особенно высокую способность индуцировать CTL, а также высокую аффинность связывания к HLA-антигену. Таким образом, указанный пептид представлен в качестве предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения.

Кроме того, результат анализа гомологов демонстрирует, что указанный пептид не обладает значительной гомологией с пептидами, произведенными из каких-либо других известных человеческих генных продуктов. Данное обстоятельство уменьшает возможность неизученных или нежелательных иммунных ответов при применении для иммунотерапии. Следовательно, из данного аспекта следует, что описываемые пептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, находят применение для получения иммунитета у онкологических пациентов против ТТК. Таким образом, пептиды по настоящему изобретению являются предпочтительно пептидами, состоящими из аминокислотной последовательности из SEQ ID NO:3.

В добавление к модификациям пептидов по настоящему изобретению, обсуждаемым ранее, описываемые пептиды могут быть дополнительно связаны с другими пептидами, если они сохраняют способность индуцировать CTL исходного пептида. Примеры подходящих других пептидов включают: пептиды, способные индуцировать CTL, полученные из ТТК (например, пептиды, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:1, 2, 6, 15 и 22), или пептиды, способные индуцировать CTL, полученные из других ТАА. Линкеры между пептидами хорошо известны в области техники, например AAY (P.M. Daftarian et al., J. Trans Med 2007, 5:26), ААА, NKRK (R.P.M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165:7308-7315) или К (S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, K.S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168:5709-5715).

Например, не относящиеся к ТТК опухоль-ассоциированные антигенные пептиды также могут быть использованы, преимущественно одновременно, для повышения иммунной реакции посредством HLA класса I и/или класса II. Хорошо известно, что раковые клетки могут экспрессировать более чем один опухоль-ассоциированный ген. Для специалиста в области техники к обычной практике относится определение, экспрессированы ли у определенного индивидуума дополнительные опухоль-ассоциированные гены, и затем включение связывающих пептидов HLA класса I и/или класса II, полученных из продуктов экспрессии указанных генов, в вакцины или композиции, содержащие ТТК.

Примеры связывающих пептидов HLA класса I и/или класса II известны специалисту в области техники (например, см. Coulie, Stem Cells 13:393-403, 1995) и могут быть использованы таким же образом, как раскрыто в настоящем описании. Специалист в области техники может получить полипептиды, включающие один или несколько ТТК пептидов и один или несколько пептидов, не относящихся к ТТК, или нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные полипептиды, в соответствии со стандартными методиками молекулярной биологии.

Вышеуказанные связанные пептиды, в настоящем описании упоминающиеся как «политопы», т.е. группы двух или более потенциально иммуногенных или стимулирующих иммунную реакцию пептидов, могут быть объединены в различных средствах (например, связаны, перекрещены). Политоп (или нуклеиновая кислота, кодирующая политоп) может быть введен в стандартный протокол иммунизации, например, животным, для исследования эффективности политопа в стимулировании, повышении и/или вызове иммунных реакций.

Пептиды могут быть объединены непосредственно или посредством использования фланкирующих последовательностей для образования политопов, а применение политопов в качестве вакцин хорошо известно в области техники (см., например, Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13):5845-5849; Gilbert et al., Nature Biotechnol. 15(12):1280-1284, 1997; Thomson et al., J Immunol. 157(2):822-826, 1996; Tarn et al., J Exp. Med. 171(1):299-306, 1990). Политопы, содержащие различные количества и сочетания эпитопов, могут быть получены и исследованы в отношении их распознавания CTL и их эффективности в повышении иммунного ответа.

Кроме того, пептиды по настоящему изобретению могут быть дополнительно связаны с другими веществами, если они сохраняют способность индуцировать CTL исходного пептида. Данные вещества могут включать: пептиды, липиды, сахар и цепи сахаров, ацетилгруппы, природные или искусственные полимеры и т.п. Пептиды могут включать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковой цепочки или фосфорилирование и т.д.; если модификации не нарушают биологическую активность исходного пептида. Перечисленные виды модификаций могут представлять дополнительные функции (например, функцию нацеливания и функцию доставки) или стабилизировать пептиды.

Например, для повышения in vivo стабильности полипептида, в области техники известно введение D-аминокислот, миметиков аминокислот или искусственных аминокислот; указанная концепция может быть также адаптирована для полипептидов по настоящему изобретению. Стабильность полипептидов может быть исследована разным образом. Например, пептидазы и различные биологические среды, такие как человеческая плазма и сыворотка, могут быть использованы для исследования стабильности (см., например, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11:291-302).

Кроме того, как замечено ранее, среди модифицированных пептидов, в которых замещены, удалены или добавлены один, два или несколько аминокислотных остатков, могут быть определены и отобраны те пептиды, которые обладают такой же или более высокой активностью по сравнению с исходными пептидами. Настоящее изобретение дополнительно представляет способ определения или отбора модифицированных пептидов, обладающих такой же или более высокой активностью по сравнению с исходными пептидами. Например, способ может включать следующие стадии:

а: замещение, удаление или добавление, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка пептида по настоящему изобретению;

b: определение активности пептида, полученного на стадии (а), и

c: выбор пептида, обладающего такой же или более высокой активностью по сравнению с исходным пептидом.

В настоящем описании указанная активность может включать МНС связывающую активность, способность индуцировать АРС или CTL и цитотоксическую активность. Предпочтительно, исследуемая активность является способностью индуцировать CTL и может быть изучена, используя способы, описанные в «Примерах».

В настоящем описании пептиды по настоящему изобретению могут быть также описаны как «ТТК пептид (пептиды) или ТТК полипептид (полипептиды)».

III. Получение ТТК пептидов

Пептиды по настоящему изобретению могут быть получены, используя хорошо известные методики. Например, пептиды могут быть получены искусственно, используя методику рекомбинантной ДНК или химический синтез. Пептиды по изобретению могут быть синтезированы по отдельности или как более длинные пептиды, составленные из двух или более пептидов. Пептиды могут быть выделены, например очищены или выделены, чтобы быть по существу свободными от других природных белков клетки-хозяина и их фрагментов, или от любых других химических веществ.

Пептиды по настоящему изобретению могут включать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковой цепочки и/или фосфорилирование, если модификации не нарушают биологическую активность исходного пептида. Другие модификации включают введение в состав D-аминокислот или других миметиков аминокислот, которые могут быть использованы, например, для увеличения периода полужизни пептидов.

Пептиды по настоящему изобретению могут быть получены химическим синтезом исходя из выбранной аминокислотной последовательности. Например, общепринятые способы синтеза пептидов, которые могут быть адаптированы к синтезу, включают:

Academic Press, New York, 1980, 100-118.

В качестве альтернативы, пептиды по настоящему изобретению могут быть получены адаптацией любых известных способов генной инженерии для получения пептидов (например, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132:349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101:347-62). Например, во-первых, подходящий вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий целевой пептид в экспрессируемой форме (например, по ходу транскрипции регуляторной последовательности, соответствующей промоутерной последовательности), получают и трансформируют в подходящей клетке-хозяине. Такие векторы и клетки-хозяева также представлены настоящем изобретением. Клетку-хозяина затем культивируют для получения интересующего пептида. Пептид может быть также получен in vitro в адаптированной системе трансляции.

IV. Полинуклеотиды

Настоящее изобретение также представляет полинуклеотиды, которые кодируют любые из вышеописанных пептидов по настоящему изобретению. Они включают полинуклеотиды, полученные из существующего в природе гена ТТК (GeneBank Accession No. NM_003318 (SEQ ID NO:39), а также имеющие их консервативно модифицированные нуклеотидные последовательности. В настоящем описании фраза «консервативно модифицированная нуклеотидная последовательность» означает последовательности, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности. В результате вырожденности генетического кода большое количество функционально идентичных нуклеиновых кислот кодирует данный белок. Например, все кодоны GCA, GCC, GCG и GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, в котором аланин задается кодоном, кодон может быть изменен любым описанным соответствующим кодоном без изменения кодируемого полипептида. Указанные вариации нуклеиновых кислот представляют собой «молчащие вариации», которые представляют собой разновидности консервативно модифицированных вариаций. Каждая последовательность нуклеиновых кислот, в настоящем описании кодирующая пептид, также описывает каждую возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Специалист в области техники представляет, что каждый триплет в нуклеиновой кислоте (исключая AUG, который обычно представляет собой только триплет для метионина, и TGG, который представляет собой триплет только для триптофана) может быть модифицирован для получения функционально идентичной молекулы. Соответственно, каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует пептид, неявно описана в каждой раскрытой последовательности.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может быть составлен из ДНК, РНК и их производных. Как хорошо известно в области техники, молекула ДНК состоит из оснований, таких как существующие в природе основания А, Т, С и G, и Т замещен на U в РНК. Специалист в области техники должен понимать, что также и искусственные основания могут быть включены в полинуклеотид.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может кодировать множество пептидов, которые содержат пептид по настоящему изобретению и другие эпитопные пептиды при наличии или без интрона. Например, интрон может обеспечивать сайт расщепления (например, ферментативно распознаваемая последовательность) полинуклеотида или транслируемого пептида. Кроме того, полинуклеотид может включать какие-либо дополнительные последовательности для кодирования последовательности, кодирующей пептид по настоящему изобретению. Например, полинуклеотид может быть рекомбинантным полинуклеотидом, который включает регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии пептида, или может быть экспрессирующим переносчиком (плазмидой) с маркерными генами и т.д. В общем случае описываемые полинуклеотиды могут быть получены манипуляцией с полинуклеотидами посредством общепринятых рекомбинантных методик, используя, например, полимеразы и эндонуклеазы.

Методики и рекомбинантного, и химического синтеза могут быть использованы для получения полинуклеотидов по настоящему изобретению. Например, полинуклеотид может быть получен инсерцией в соответствующий вектор, который может быть экспрессирован при трансфекции в компетентную клетку. В качестве альтернативы, полинуклеотид может быть амплифицирован, используя методики PCR или экспрессию в подходящем хозяине (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк, 1989). В качестве альтернативы, полинуклеотид может быть синтезирован, используя твердофазные методики, как описано в Beaucage S.L. & Iyer R.P., Tetrahedron 1992, 48:223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3:801-5.

V. Экзосомы

Настоящее изобретение дополнительно представляет внутриклеточные везикулы, названные экзосомами, которые представляют собой комплексы, образованные пептидами по настоящему изобретению и HLA-антигенами на их поверхности. Экзосомы могут быть получены, например, используя способы, подробно описанные в Японской Патентной заявке Kohyo Publications № Hei 11-510507 и Международном патенте 99/03499, и могут быть получены, используя APC, полученные от пациентов, которые подвергались лечению и/или профилактике. Экзосомы по настоящему изобретению могут быть привиты в качестве вакцин, таким же образом, как и пептиды по настоящему изобретению.

Тип HLA-антигенов, содержащихся в комплексах, должен быть согласован с тем, какому индивидууму требуется лечение и/или профилактика. Например, среди населения Японии преобладают HLA-A2 (в частности А*0201, а также А*0206), и, следовательно, они будут подходить для лечения японских пациентов. Применение типа А24 или А2, которые в высокой степени экспрессированы среди населения Японии и Кавказа, является предпочтительным для получения эффективных результатов, и подтипы, такие как А*0201 и А*0206, также находят применение. Обычно, в клинической практике, тип HLA-антигена пациента, нуждающегося в лечении, определяют заранее, что делает возможным выбор пептидов с высокой аффинностью связывания к отдельному антигену, или обладающих способностью индуцировать CTL презентацией антигена. Кроме того, для получения пептидов, имеющих высокую аффинность связывания и способность индуцировать CTL, может быть выполнено замещение, инсерция, удаление и/или добавление 1, 2 или нескольких аминокислот, исходя из аминокислотной последовательности природного ТТК неполного пептида.

В настоящем изобретении пептиды, обладающие аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, могут быть предпочтительно использованы в качестве пептидов, представленных экзосомами, и такие пептиды имеют высокую аффинность связывания с HLA-A2, такими как HLA-А*0201. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления экзосомы по настоящему изобретению образуют комплексы между пептидом, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, и HLA-антигеном на своей поверхности.

VI. Антигенпрезентирующие клетки (APC)

Настоящее изобретение также представляет выделенные АРС, которые презентируют комплексы, образованные между HLA-антигенами и пептидами по настоящему изобретению, на своей поверхности. АРС могут быть получены от индивидуумов, которые подвергались лечению и/или профилактике, и могут быть введены в виде вакцин самостоятельно или в сочетании с другими лекарственными средствами, включая пептиды по изобретению, экзосомы или CTL.

АРС не ограничены отдельным видом клеток и включают DC, клетки Лангерганса, макрофаги, В-клетки и активированные Т-клетки, о которых известно, что они презентируют белковые антигены на своей клеточной поверхности, так что они могут быть распознаны лимфоцитами. Так как DC являются типичными представителями АРС, обладающими сильнейшей способностью индуцировать CTL среди АРС, они находят применение в качестве АРС по настоящему изобретению.

Например, АРС по настоящему изобретению могут быть получены индукцией DC моноцитов периферической крови и затем их контактированием (стимуляцией) с пептидами по настоящему изобретению in vitro, ex vivo или in vivo. При введении пептидов по настоящему изобретению индивидуумам АРС, которые представляют пептиды по настоящему изобретению, индуцируются в организме индивидуума. Следовательно, АРС по настоящему изобретению могут быть получены сбором АРС от индивидуума после введения пептидов по настоящему изобретению индивидууму. В качестве альтернативы, АРС по настоящему изобретению могут быть получены контактированием АРС, полученных от индивидуума, с пептидами по настоящему изобретению.

АРС по настоящему изобретению могут быть введены индивидууму самостоятельно или в сочетании с другими пептидами, экзосомами или CTL по настоящему изобретению для вызова иммунного ответа против рака у индивидуума. Например, ex vivo введение может включать следующие этапы:

а: получение АРС от первого индивидуума,

b: контактирование АРС с этапа а) с пептидами, и

с: введение АРС с этапа b) второму индивидууму.

Первый индивидуум и второй индивидуум могут быть одним и тем же индивидуумом или могут быть различными индивидуумами. В качестве альтернативы, в соответствии с настоящим изобретением, представлено использование пептидов по настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции, содержащей антигенпрезентирующие клетки. В добавление, настоящее изобретение представляет способ или методику производства фармацевтической композиции, содержащей антигенпрезентирующие клетки. Кроме того, настоящее изобретение также представляет пептиды по настоящему изобретению для индуцирования антигенпрезентирующих клеток. АРС, полученные на этапе b, могут быть введены в качестве вакцины для лечения и/или предупреждения рака, включая рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек.

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения АРС имеют высокий уровень способности индуцировать CTL. В термине «высокий уровень способности индуцировать CTL» высокий уровень является относительным к уровню АРС, не контактирующих с пептидами или контактирующих с пептидами, которые не могут индуцировать CTL. Указанные АРС, имеющие высокий уровень способности индуцировать CTL, могут быть получены способом, который включает стадию переноса полинуклеотида, кодирующего пептид по изобретению in vitro APC, а также способ, описанный ранее. Вводимые гены могут быть в форме ДНК или РНК. Примеры способов для введения включают, не ограничиваясь перечисленным, различные способы, общепринятые в области техники, такие как липофекция, электропорация и фосфатно-кальциевый способ. В частности, он может быть выполнен, как описано в Cancer Res 1996, 56:5672-7; J Immunol 1998, 161:5607-13; J Exp Med 1996, 184:465-72; Published Japanese Translation of International Publication No. 2000-509281. Переносом гена в АРС ген подвергается транскрипции, трансляции в клетке, и затем полученный белок обрабатывают МНС класса I или класса II, и переходят через презентацию к неполным пептидам по настоящему изобретению.

В предпочтительных вариантах осуществления АРС по настоящему изобретению могут быть АРС, которые презентируют комплексы, образованные между HLA-антигенами и пептидами, обладающими аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, на своей поверхности. Более предпочтительно, АРС несут HLA-A2-антиген, такой как HLA-A*0201, и комплексы по настоящему изобретению образованы с HLA-A2-антигенами и пептидами по настоящему изобретению (например, пептидами, имеющими аминокислотную последовательностью SEQ ID NO:3) на своей поверхности.

VII. Цитотоксические Т-лимфоциты (CTL)

CTL, индуцированные против каких-либо пептидов по настоящему изобретению, усиливают иммунную реакцию, направленную против раковых клеток in vivo, и, следовательно, могут быть использованы в качестве вакцин таким же образом, как и пептиды по настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение также представляет выделенные CTL, которые специально индуцируют или активируют какими-либо пептидами по настоящему изобретению. Описываемые CTL могут быть получены (1) введением пептида (пептидов) по настоящему изобретению индивидууму; или (2) контактированием (стимуляцией) полученными от пациента АРС или CD8-позитивными клетками, или мононуклеарными лейкоцитами периферической крови in vitro c пептидом (пептидами) по настоящему изобретению; или (3) контактированием CD8-позитивных клеток или мононуклеарных лейкоцитов периферической крови in vitro c АРС или экзосомами, презентирующими комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению на своей поверхности; или (4) введением гена, содержащего полинуклеотиды, кодирующие субъединицу Т-клеточного рецептора (TCR), связывающую пептид по настоящему изобретению. Вышеуказанные АРС и экзосомы могут быть получены способами, описанными ранее, и способом (4), подробно описанным в разделе «VIII. Т-клеточный рецептор (TCR)».

CTL по настоящему изобретению могут быть получены от пациента, который подвергался лечению и/или профилактике, и могут быть введены самостоятельно или в сочетании с другими лекарственными средствами, включая пептиды по изобретению, экзосомы для управляемого действия. Полученные CTL действуют специфически против клеток-мишеней, презентирующих пептиды по изобретению, например вышеупомянутые пептиды, использованные для индукции. Клетки-мишени могут быть клетками, которые эндогенно экспрессируют ТТК, такие как раковые клетки, или клетками, которые трансфицированы геном ТТК; и клетки, которые представляют пептид по настоящему изобретению на клеточной поверхности, вследствие стимуляции пептидом также могут служить в качестве мишеней атак активированных CTL.

VIII. Т-клеточный рецептор (TCR)

Настоящее изобретение также представляет композицию, содержащую нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, которые способны образовывать субъединицу Т-клеточного рецептора (TCR), и способы их использования. TCR-субъединицы обладают способностью образовывать TCR, которые предоставляют специфичность Т-клеткам, направленную против опухолевых клеток, экспрессирующих ТТК. Используя способы, известные в области техники, может быть определена последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая альфа- и бета-цепочки TCR субъединиц, которые переносят CTR, индуцированные одним или несколькими пептидами по настоящему изобретению (Международный Патент 2007/032255 и Morgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)). Например, способ PCR предпочтителен для анализа последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих TCR-субъединицы. Праймеры PCR для анализа могут быть, например, 5 -R праймерами (5 -gtctaccaggcattcgcttcat-3 ), как 5 -боковыми праймерами (SEQ ID NO:41) и 3-TRa-C праймерами (5 -tcagctggaccacagccgcagcgt-3 ), специфичными для области С альфа цепочки TCR (SEQ ID NO:42), 3-TRb-С1 праймерами (5 -tcagaaatcctttctcttgac-3 ), специфичными для области С1 бета цепочки TCR (SEQ ID NO:43), или 3-TRбeтa-С2 праймерами (5 -ctagcctctggaatcctttctctt-3 ), специфичными для области С2 бета цепочки TCR (SEQ ID NO:44) в качестве 3 -боковой цепочки, но не ограничиваются перечисленным. Производные TCR могут связывать клетки-мишени, обнаруживающие пептид ТТК с высокой авидностью, и необязательно опосредовать эффективное уничтожение клеток-мишеней, представляющих ТТК пептид in vivo и in vitro.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие субъединицы TCR, могут быть введены в подходящие векторы, например ретровирусные векторы. Указанные векторы известны в области техники. Нуклеиновые кислоты или содержащие их векторы могут быть перенесены в Т-клетку, например Т-клетку пациента. Преимущественно настоящее изобретение представляет имеющуюся в готовом виде композицию, допускающую быструю модификацию собственных Т-клеток человека (или другого млекопитающего) для быстрого и легкого получения модифицированных Т-клеток, обладающих превосходными свойствами уничтожать раковые клетки.

Специфичный TCR представляет собой рецептор, способный специфически распознавать комплекс пептида по настоящему изобретению и молекулу HLA, представляющую специфическое действие против клетки-мишени, если TCR представлены на поверхности Т-клетки. Описываемое специфическое распознавание может быть подтверждено любыми известными способами, и предпочтительный способ включает, например, тетрамерный анализ, используя молекулу HLA и пептид по настоящему изобретению, и ELISPOT анализ. Выполнением ELISPOT анализа можно установить, что Т-клетка, трансдуцируемая нуклеиновой кислотой, кодирующей субъединицу TCR, распознает клетку, экспрессирующую HLA-молекулу и ТТК, и сигнал передается внутрь клетки. Цитотоксическое действие Т-клетки против клеток-мишеней может быть исследовано, используя способы, хорошо известные в области техники. Предпочтительный способ включает, например, анализ высвобождения хрома, используя HLA-позитивные клетки, экспрессирующие ТТК, в качестве клеток-мишеней.

Также настоящее изобретение представляет CTL, которые получают трансдукцией нуклеиновых кислот, кодирующих субъединицы TCR, которые связывают комплекс, образованный между пептидом по настоящему изобретению и молекулой HLA-A2, такой как HLA-A*0201.

Трансдуцированные CTL способны нацеливаться на раковые клетки in vivo, и могут быть размножены хорошо изученными способами культивирования in vivo (например, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). CTL по настоящему изобретению могут быть использованы в виде иммуногенной композиции, успешной в лечении или предупреждении рака у пациента, нуждающегося в данном лечении или защите (Международный патент 2006/031221).

IX. Фармацевтические средства или композиции

Так как экспрессия ТТК специфически повышена при раке, включая рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек, по сравнению с нормальной тканью, пептиды по настоящему изобретению или полинуклеотиды, кодирующие указанные пептиды, могут быть использованы для лечения, и/или профилактики рака, и/или предупреждения его послеоперационного рецидива. Следовательно, настоящее изобретение представляет фармацевтическое средство или композицию для лечения, и/или предупреждения рака, и/или предупреждения его послеоперационного рецидива, которое содержит один или несколько пептидов по настоящему изобретению или полинуклеотидов, кодирующих пептиды, в качестве активного ингредиента. В качестве альтернативы, пептиды по настоящему изобретению могут быть экспрессированы на поверхности любых вышеописанных экзосом или клеток, таких как АРС, для применения в качестве фармацевтических средств или композиций. В добавление, вышеуказанные CTL, которые нацеливают любой из пептидов по изобретению, могут быть также использованы в качестве активного ингредиента композиций или фармацевтических средств по настоящему изобретению.

Фармацевтические средства и композиции по настоящему изобретению также находят применение в качестве вакцин. В контексте настоящего изобретения фраза «вакцина» (также обозначенная как «иммуногенная композиция») относится к веществу, которое обладает функцией индуцировать противоопухолевый иммунитет при прививке животным.

Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения, и/или предупреждения рака, и/или предупреждения его послеоперационного рецидива у пациентов или индивидуумов, включая человека и других млекопитающих, включая, но не ограничиваясь перечисленным, мышь, крысу, морскую свинку, кролика, кошку, собаку, овцу, козу, свинью, крупный рогатый скот, лошадь, мартышку, бабуина и шимпанзе, особенно коммерчески важных животных или домашних животных.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение также представляет применение активного ингредиента, выбранного из следующего:

(а) пептид по настоящему изобретению;

(b) нуклеиновая кислота, кодирующая указанный пептид, который раскрыт в настоящем описании, в экспрессируемой форме;

(с) АРС или экзосомы, презентирующие пептид по настоящему описанию на своей поверхности; и

(d) цитотоксические Т-клетки по настоящему описанию;

в получении фармацевтического средства или композиции для лечения рака или опухоли.

В качестве альтернативы, настоящее изобретение дополнительно представляет активный ингредиент, выбранный из:

(а) пептида по настоящему изобретению;

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный пептид, в соответствии с раскрытым в настоящем описании, в экспрессируемой форме;

(с) АРС или экзосомы, презентирующих пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(d) цитотоксических Т-клеток по настоящему описанию;

для применения в лечении или предупреждении рака или опухоли.

В качестве альтернативы, настоящее изобретение дополнительно представляет способ или методику для производства фармацевтической композиции или средства для лечения или предупреждения рака или опухоли, где способ или методика включает стадию формирования фармацевтически или физиологически приемлемого носителя с активным ингредиентом, выбранным из:

(а) пептида по настоящему изобретению;

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный пептид, который раскрыт в настоящем описании, в экспрессируемой форме;

(с) АРС или экзосом, презентирующих пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(d) цитотоксической Т-клетки по настоящему описанию;

в качестве активных ингредиентов.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение также представляет способ или методику для производства фармацевтической композиции или средства для лечения или предупреждения рака или опухоли, где способ или методика включает стадию смешивания активного ингредиента с физиологически или фармацевтически приемлемым носителем, в котором активный ингредиент выбран из:

(а) пептида по настоящему изобретению;

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный пептид, который раскрыт в настоящем описании, в экспрессируемой форме;

(с) АРС или экзосом, презентирующих пептид по настоящему описанию на своей поверхности; и

(d) цитотоксической Т-клетки по настоящему описанию.

В соответствии с настоящим изобретением обнаружено, что пептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, являются HLA-А2 ограниченными эпитопными пептидами или кандидатами, которые вызывают сильную и специфическую иммунную реакцию. Таким образом, фармацевтические средства или композиции, которые содержат по меньшей мере один из указанных пептидов, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, особенно подходят для введения индивидуумам, у которых HLA-антиген представляет собой HLA-А2. Таким же образом действуют фармацевтические средства и композиции, которые содержат полинуклеотиды, кодирующие какие-либо из перечисленных пептидов (т.е. полинуклеотиды по настоящему изобретению).

Виды рака, которые лечат фармацевтическими средствами или композициями по настоящему изобретению, не ограничены и включают все виды рака или опухолей, при которых задействован ТТК, включая, но не ограничиваясь, рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек.

Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут содержать дополнительно к вышеперечисленным активным ингредиентам другие пептиды, которые обладают способностью индуцировать CTL против раковых клеток, другие полинуклеотиды, кодирующие другие пептиды, другие клетки, которые представляют данные пептиды, и т.д. В настоящем описании примером других пептидов, которые обладают способностью индуцировать CTL против раковых клеток, являются специфические раковые антигены (например, определенные ТАА), но не ограничены указанным.

При необходимости фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут необязательно содержать другие терапевтические вещества в качестве активного ингредиента, если вещество не подавляет противоопухолевое действие активного ингредиента, например какого-либо из пептидов по настоящему изобретению. Например, композиции могут включать противовоспалительные средства, анальгетики, химиотерапевтические средства и т.д. В дополнение к содержанию других лекарственных веществ лекарственное средство по настоящему изобретению может быть также введено последовательно или одновременно с одним или более другим фармакологическим средством. Количества лекарственного или фармакологического средства зависят, например, от типа применяемого средства (средств), заболевания, которое подвергают лечению, и схемы и пути введения.

Должно быть понятно, что в дополнение к ингредиентам, отдельно обозначенным в настоящем описании, фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут включать другие средства, общепринятые в области техники, подходящие к типу рассматриваемой композиции.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут быть включены в изделия или наборы, содержащие вещества, используемые для лечения симптомов заболевания, которое подвергают лечению, например рака. Изделие может включать контейнер каких-либо фармацевтических средств или композиций по настоящему изобретению с этикеткой. Подходящие контейнеры включают бутыли, флаконы и пробирки. Контейнеры могут быть выполнены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Этикетка на контейнере должна указывать вещество или композицию, использованные для лечения или предупреждения одного или более состояний заболевания. Этикетка также содержит указания по введению и т.п.

В дополнение к контейнеру, описанному ранее, набор, включающий фармацевтическое средство или композицию по настоящему изобретению, может дополнительно включать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый разбавитель. Он может дополнительно включать другие вещества, имеющиеся в продаже, и средства для удобства потребителя, включая буферные растворы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы, и упаковку с инструкцией по применению.

Фармацевтические средства или композиции при необходимости могут быть представлены в упаковке или в распределяющем устройстве, которое может содержать одну или более готовых лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Упаковка может, например, включать металлическую или пластиковую пластину, такую как блистер. Упаковка или распределяющее устройство может сопровождаться инструкциями по применению.

(1) Фармацевтические средства или композиции, содержащие пептиды в качестве активного ингредиента

Пептиды по настоящему изобретению могут быть введены непосредственно в качестве фармацевтического средства или композиции, или, при необходимости, могут быть сформованы общепринятыми способами получения композиций. В последнем случае, в добавление к пептидам по изобретению, могут быть включены носители, эксципиенты и другие вспомогательные вещества, которые обычно используют для лекарственных средств, которые не ограничены определенными рамками. Примеры указанных носителей включают стерильную воду, физиологический раствор, фосфатный буфер, культуральную жидкость и т.п. Кроме того, фармацевтические средства или композиции могут содержать при необходимости стабилизаторы, суспензии, консерванты, поверхностно-активные вещества и т.п. Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут быть использованы против рака.

Пептиды по настоящему изобретению могут быть получены в виде сочетания, составленного из двух или более пептидов по настоящему изобретению или других эпитопных пептидов (например, пептидов, полученных из других ТАА), для индукции CTL in vivo. Сочетание пептидов можно взять в форме смеси или пептиды могут быть соединены друг с другом, используя общепринятые методики. Например, пептиды могут быть химически связаны или экспрессированы в виде единого слияния полипептидной последовательности, которая может иметь одну или несколько аминокислот в качестве линкера (например, лизиновый линкер: K.S. Kawamura et al., J. Immunol. 2002, 168:5709-5715). Пептиды в сочетании могут быть одинаковыми или различными. При введении пептидов по настоящему изобретению пептиды презентируются при высокой плотности антигенами HLA на АРС, а затем индуцируют CTL, которые специфически вступают в реакцию с комплексом, образованным указанными пептидами и HLA. В качестве альтернативы, АРС (например, DC) получают от индивидуума и затем стимулируют пептидами по настоящему изобретению для получения АРС, которые презентируют какой-либо из пептидов по изобретению на своей клеточной поверхности. Указанные АРС вновь вводят индивидуумам для индуцирования CTL индивидуумов, и в результате может повышаться агрессивность против эндотелия опухоли.

Фармацевтические средства или композиции для лечения и/или предупреждения рака, содержащие пептид по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, могут также содержать вспомогательное вещество для эффективного вызова клеточного иммунитета. В качестве альтернативы, фармацевтические средства или композиции могут быть введены с другими активными ингредиентами или введены композицией в гранулы. «Вспомогательное вещество» относится к соединению, которое усиливает иммунную реакцию против белка при совместном введении (или последовательно) с белком, обладающим иммунологической активностью. Вспомогательные вещества, рассматриваемые в настоящем описании, включают вещества, описываемые в литературе (Clin Microbiol Rev 1994; 7:277-89). Примеры приемлемых вспомогательных веществ включают фосфат алюминия, гидроксид алюминия, квасцы, холерный токсин, неполный адъювант Фрейнда (IFA), полный адъювант Фрейнда (CFA), IS-COMatrix, GM-CSF, CpG, эмульсию O/P и т.п.

Кроме того, могут быть использованы липосомные композиции, гранулярные композиции, в которых пептид связан с шариками диаметром в несколько микрометров, и композиции, в которых липид связан с пептидом.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, пептиды по настоящему изобретению могут быть также введены в форме фармацевтически приемлемой соли. Использованное в настоящем описании выражение «фармацевтически приемлемая соль» относится к тем солям, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства соединения и которые получают реакцией с неорганическими кислотами или основаниями, такими как хлористоводородная, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, салициловая кислота и т.п. Примеры предпочтительных солей включают соли щелочных металлов, соли металлов, соли органических оснований, соли органических кислот и соли неорганических кислот.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут дополнительно включать компонент, который праймирует CTL. Липиды определяют как вещества, способные праймировать CTL in vivo против вирусных антигенов. Например, остаток пальмитиновой кислоты может быть присоединен к эпсилон- и альфа-аминогруппам остатка лизина и затем связан с пептидом по настоящему изобретению. Связанный с липидом пептид может быть затем введен или непосредственно в мицеллу, или в частицу, включенную в липосому, или эмульгирован во вспомогательном веществе. В качестве другого примера липидного прайминга реакций CTL, липопротеины Е.coli, такие как трипальмитоил-S-глицерилцистеинил-серил-серин (P3CSS), могут быть использованы для прайма CTL, если ковалентно связаны с соответствующим пептидом (см., например, Deres et al., Nature 1989, 342:561-4).

Способ введения может быть пероральным, внутрикожной, подкожной, внутривенной инъекцией и т.п., и быть системным или местным введением для приближения к намеченной области. Введение может быть выполнено однократным введением или усилено многократным введением. Доза пептидов по изобретению может быть скорректирована в соответствии с заболеванием, подвергаемым лечению, возрастом пациента, массой, способом введения и т.п., и обычно составляет от 0,001 мг до 1000 мг, например от 0,001 мг до 1000 мг, например от 0,1 мг до 10 мг, и может быть введена однократно в период от нескольких дней до нескольких месяцев. Специалист в области техники может соответственно выбирать подходящую дозу.

(2) Фармацевтические средства или композиции, содержащие полинуклеотиды в качестве активного ингредиента

Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут также содержать нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды, раскрытые в настоящем описании, в экспрессируемой форме. В настоящем описании фраза «в экспрессируемой форме» означает, что полинуклеотиды при введении в клетку будут экспрессированы in vivo в виде полипептида, который вызывает противоопухолевый иммунитет. В примерном варианте осуществления последовательность нуклеиновых кислот интересующего полипептида включает регуляторные элементы, необходимые для экспрессии полинуклеотида. Полинуклеотид (полинуклеотиды) может быть приспособлен для достижения устойчивой инсерции в геном клетки-мишени (см., Thomas K.R. & Capecchi M.R., Cell 1987, 51:503-12 в отношении описания гомологичных рекомбинантных кассетных векторов). См., например, Wolf et al., Science 1990, 247:1465-8; патенты США № № 5580859; 5589466; 5804566; 5739118; 5736524; 5679647 и Международный патент 98/04720. Примеры методик доставки, основанных на ДНК, включают «депротеинизированную ДНК», облегченную доставку (бупивакаин, полимеры), опосредованную пептидами, катионные липидные комплексы и опосредованную частицами («генная пушка») или опосредованную давлением доставку (см., например, патент США № 5922687).

Пептиды по настоящему изобретению могут быть также экспрессированы вирусными или бактериальными векторами. Примеры экспрессирующих векторов включают ослабленные вирусы, такие как вирус коровьей или куриной оспы. Данный подход охватывает использование вируса коровьей оспы, например, в качестве вектора для экспрессии нуклеотидной последовательности, которая кодирует пептид. При введении в хозяина рекомбинантный вирус коровьей оспы экспрессирует иммуногенный пептид и, следовательно, вызывает иммунную реакцию. Векторы коровьей оспы и способы, применяемые в протоколах иммунизации, описаны, например, в патенте США № 4722848. Другой вектор представляет собой BCG (Bacille Camette Guerin). BCG векторы описаны в Stover et al., Nature 1991, 351:456-60. Широкий спектр других векторов, применяемых для терапевтического введения или иммунизации, например адено и аденоассоциированные вирусные векторы, ретровирусные векторы, векторы Salmonella typhy, векторы обезвреженного токсина сибирской язвы и т.п., может быть использован. См., например, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6:66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68:793-806; Hipp et al., In vivo 2000, 14:571-85.

Доставка полинуклеотида пациенту может быть или непосредственной, в данном случае пациент непосредственно подвергается воздействию вектора, несущего полинуклеотид, или опосредованно, в данном случае сначала трансформируют in vitro клетки интересующим полинуклеотидом, затем клетки пересаживают пациенту. Перечисленные подходы изучены, соответственно, в качестве in vivo и in vitro генной терапии.

Для общего обзора способов генной терапии см., например,

Способы, в общем случае известные в области методики рекомбинантной ДНК, которые также могут быть использованы для настоящего изобретения, описаны в Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; и Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990.

Способ введения может быть пероральным, внутрикожной, подкожной, внутривенной инъекцией и т.п. и быть системным или местным введением для приближения к намеченной области. Введение может быть выполнено однократным введением или усилено многократным введением. Доза пептидов по изобретению в подходящем носителе или клетках, трансформированных полинуклеотидом, кодирующим пептиды по изобретению, может быть скорректирована в соответствии с заболеванием, подвергаемым лечению, возрастом пациента, массой, способом введения и т.п. и обычно составляет от 0,001 мг до 1000 мг, например от 0,001 мг до 1000 мг, например от 0,1 мг до 10 мг, и может быть введена однократно в период от нескольких дней до нескольких месяцев. Специалист в области техники может соответственно выбирать подходящую дозу.

Х.Способы применения пептидов, экзосом, АРС и CTL

Пептиды и полинуклеотиды по настоящему изобретению могут быть использованы для индуцирования АРС и CTL. Экзосомы и АРС по настоящему изобретению могут быть также применены для индуцирования CTL. Пептиды, полинуклеотиды, экзосомы и АРС могут быть также использованы в сочетании с любыми другими соединениями, если соединения не подавляют их способность индуцировать CTL. Следовательно, любые вышеописанные фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут быть использованы для индуцирования CTL, и, в добавление, вышеописанные фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению, которые содержат пептиды и полинуклеотиды также могут быть использованы для индуцирования АРС, как обсуждается далее.

(1) Способ индуцирования антигенпрезентирующих клеток (АРС)

Настоящее изобретение представляет способ индуцирования АРС с высокой способностью индуцировать CTL, используя пептиды и полинуклеотиды по настоящему изобретению.

Способы по настоящему изобретению включают стадию контактирования АРС с пептидами по настоящему изобретению in vitro, ex vivo или in vivo. Например, способ контактирования АРС с пептидами ex vivo или in vitro может включать стадии:

а: получения АРС от индивидуума; и

b: контактирования АРС со стадии а) с пептидом.

АРС не ограничиваются отдельными видами клеток и включают DC, клетки Лангерганса, макрофаги, В-клетки и активированные Т-клетки, которые представляют белковые антигены на своей клеточной поверхности, для распознавания лимфоцитами. DC могут быть использованы предпочтительно вследствие их наибольшей способности индуцировать CTL среди АРС. Любые пептиды по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве пептидов стадии b) самостоятельно или в сочетании с другими пептидами.

В качестве альтернативы, пептиды по настоящему изобретению могут быть введены индивидууму для контактирования АРС с пептидом in vivo, следовательно, АРС с высокой способностью индуцировать CTL могут быть индуцированы в организме индивидуума. Таким образом, настоящее изобретение также охватывает способ введения пептидов по изобретению индивидууму. Также подходят для введения пациенту полинуклеотиды, кодирующие пептиды по изобретению, в экспрессибельной форме, так что пептиды по настоящему изобретению экспрессированы и контактируют с АРС in vivo, последовательно индуцируя АРС с высокой способностью индуцировать CTL в организме индивидуума. Таким образом, настоящее изобретение рассматривает способ введения полинуклеотидов по настоящему изобретению индивидууму. Фраза «экспрессибельная форма» определена ранее в разделе «IX. Фармацевтические средства. 2) Фармацевтические средства или композиции, содержащие полинуклеотиды в качестве активного ингредиента».

Настоящее изобретение включает введение полинуклеотидов по настоящему изобретению в АРС для индуцирования АРС со способностью индуцировать CTL. Например, способ может включать стадии:

а: получение АРС от индивидуума; и

b: введение полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению.

Стадия b может быть выполнена так, как описано ранее в разделе «VI. Антигенпрезентирующие клетки».

В качестве альтернативы, настоящее изобретение представляет способ получения антигенпрезентирующей клетки (АРС), которая специфически индуцирует активность CTL против ТТК, который может включать следующие стадии:

(а) контактирование АРС с пептидом по настоящему изобретению in vivo, ex vivo и in vitro; и

(b) введение полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в АРС.

(2) Способ индуцирования CTL

Настоящее изобретение представляет способы индуцирования CTL, используя пептиды, полинуклеотиды, экзосомы или АРС по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также представляет способы индуцирования CTL, используя полинуклеотид, кодирующий полипептид, который способен образовывать субъединицу Т-клеточного рецептора, распознающую комплекс пептидов по настоящему изобретению и HLA-антигенов. Предпочтительно, способы индуцирования CTL могут включать, по меньшей мере, одну стадию, выбранную из группы, состоящей из:

(а) контактирования CD8-позитивной Т-клетки с антигенпрезентирующей клеткой и/или экзосомой, которая представляет на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению; и

(b) введения полинуклеотида, кодирующего полипептид, который способен образовывать субъединицу Т-клеточного рецептора, распознающую комплекс пептидов по настоящему изобретению и HLA-антигенов, в CD8-позитивную клетку.

При введении пептидов, полинуклеотидов, АРС или экзосом по настоящему изобретению индивидууму CTL индуцируются в организме индивидуума, и сила иммунной реакции, нацеленной на раковые клетки, возрастает. Следовательно, настоящее изобретение также рассматривает способ, который включает стадию введения пептидов, полинуклеотидов, АРС или экзосом по настоящему изобретению индивидууму.

В качестве альтернативы, CTL также могут быть индуцированы их применением ex vivo или in vitro, и после индукции CTL активированные CTL будут возвращены индивидууму. Например, способ может включать стадии:

а) получения АРС от индивидуума;

b) контактирования АРС со стадии а) с пептидом; и

с) совместного культивирования АРС со стадии b) с CD8-позитивными клетками.

АРС, культивированные совместно с CD8-позитивными клетками на вышеуказанной стадии с), также могут быть получены переносом гена, который включает полинуклеотиды по настоящему изобретению в АРС, как описано ранее в разделе «VI. Антигенпрезентирующие клетки»; но не ограничены описанным, и любые АРС, которые эффективно представляют на своей поверхности комплекс HLA-антиген и пептид по настоящему изобретению, могут быть использованы для данного способа.

Вместо описанных АРС могут быть также использованы экзосомы, которые представляют на своей поверхности комплекс HLA-антиген и пептид по настоящему изобретению. А именно настоящее изобретение также рассматривает способ, в котором экзосомы, представляющие на своей поверхности комплекс HLA-антиген и пептид по настоящему изобретению, совместно культивируют с CD8-позитивными клетками. Указанные экзосомы могут быть получены способами, описанными ранее в разделе «V. Экзосомы».

Кроме того, CTL могут быть индуцированы введением гена, который содержит полинуклеотид, кодирующий субъединицу TCR, связывающую пептид по изобретению, в CD8-позитивные клетки. Указанная трансдукция может быть выполнена в соответствии с описанным ранее в разделе «VIII. Т-клеточный рецептор (TCR)».

В добавление, настоящее изобретение представляет способ или методику производства фармацевтического средства или композиции, индуцирующих CTL, который включает стадию смешивания или составления смеси пептида по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем.

(3) Способ вызова иммунной реакции

Кроме того, настоящее изобретение представляет способы вызова иммунной реакции против заболеваний, относящихся к ТТК. Подходящие заболевания включают рак, примеры которого включают, но не ограничены перечисленным, рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек.

Способы по настоящему изобретению могут включать стадию введения средств или композиций, содержащих какие-либо пептиды по настоящему изобретению или полинуклеотиды, их кодирующие. Способы по настоящему изобретению также рассматривают введение экзосом или АРС, представляющих какие-либо пептиды по настоящему изобретению. Более подробно см. раздел «IX. Фармацевтические средства или композиции», в частности часть, описывающую применение фармацевтических средств и композиций по настоящему изобретению в качестве вакцин. В добавление, экзосомы и АРС, которые могут быть использованы в способах по настоящему изобретению для вызова иммунных реакций, подробно описаны в разделе «V. Экзосомы», «VI. Антигенпрезентирующие клетки (АРС)» и (1) и (2) «X. Способы, использующие пептиды, экзосомы, АРС и CTL», выше.

Настоящее изобретение также представляет способ или методику производства фармацевтического средства или композиции, вызывающего иммунную реакцию, который включает стадию смешивания или составления смеси пептида по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем.

В качестве альтернативы, способ по настоящему изобретению включает стадию введения вакцины или фармацевтического средства или композиции, которые содержат:

(а) пептид по настоящему изобретению;

(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный пептид, раскрываемый в настоящем описании, в экспрессируемой форме;

(с) АРС или экзосому, представляющую пептид по настоящему описанию на своей поверхности; и

(d) цитотоксическую Т-клетку по настоящему описанию.

В настоящем изобретении рак, при котором отмечается избыточная экспрессия ТТК, может быть подвергнут лечению указанными активными ингредиентами. Рак включает, но не ограничивается перечисленным, рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек. Соответственно, перед введением вакцин или фармацевтических средств или композиций, содержащих активные ингредиенты, предпочтительно подтвердить, повышен ли уровень экспрессии ТТК в раковых клетках или тканях, подвергаемых воздействию, по сравнению с обычными клетками тех же самых органов. Следовательно, в одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ лечения рака co сверхэкспрессией ТТК, который может включать следующие стадии:

i) определение уровня экспрессии ТТК в раковых клетках или тканях, полученных от индивидуума, подвергаемого лечению, страдающего раком;

ii) сравнение уровня экспрессии ТТК с контролем; и

iii) введение по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из перечисленного ранее в пп. с (а) по (d), индивидууму, страдающему раком, сверхэкспрессирующим ТТК, по сравнению с контролем.

В качестве альтернативы, настоящее изобретение также представляет вакцину или фармацевтическую композицию, содержащую, по меньшей мере, один компонент, выбранный из группы, состоящей из перечисленного ранее в пп. с (а) по (d) для введения пациенту, страдающему раком, сверхэкспрессирующим ТТК. Другими словами, настоящее изобретение дополнительно представляет способ идентификации пациента, который может быть подвергнут лечению полипептидом ТТК по настоящему изобретению, включающий стадию определения уровня экспрессии ТТК в полученных от индивидуума раковых клетках или ткани, когда данный уровень повышен по сравнению с обычным контрольным уровнем гена, что показывает, что индивидуум страдает раком, который может быть подвергнут воздействию полипептида ТТК по настоящему изобретению. Способы лечения рака по настоящему изобретению описаны более подробно далее.

Любая полученная от индивидуума клетка или ткань может быть использована для определения экспрессии ТТК, если он содержит продукт транскрипции или трансляции гена ТТК. Примеры подходящих образцов включают, но не ограничиваются перечисленным, ткани и жидкости организма, такие как кровь, слюна или моча. Предпочтительно, полученные от индивидуума клеточные или тканевые образцы содержат популяцию клеток, включающую эпителиальные клетки, более предпочтительно раковые эпителиальные клетки или эпителиальные клетки, полученные из ткани, подозрительной на рак. Кроме того, при необходимости клетка может быть выделена из полученных тканей и жидкостей организма и затем использована как биологический образец.

В контексте настоящего изобретения контрольный уровень, определенный из биологического образца, который не является раковым, определяется как «нормальный контрольный уровень». С другой стороны, если контрольный уровень определяют из ракового биологического образца, он обозначается как «раковый контрольный уровень». Различие между уровнями экспрессии исследуемых биологических образцов и контрольным уровнем может быть нормализовано до уровня экспрессии контрольных нуклеиновых кислот, например конститутивных генов, уровни экспрессии которых заведомо не различаются в зависимости от ракового или не ракового состояния клетки. Примеры контрольных генов включают, но не ограничиваются перечисленным, бета-актин, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу и рибосомальный белок Р1.

Индивидуум, подвергаемый диагностике способом по настоящему изобретению, может быть, но не ограничивается перечисленным, например, человеком, нечеловекообразным приматом, мышью, крысой, собакой, кошкой, лошадью и коровой.

В соответствии с настоящим изобретением определяют уровень экспрессии ТТК в раковых клетках или тканях, полученных от индивидуума. Уровень экспрессии может быть определен по уровню продукта транскрипции (мРНК), используя способы, известные в области техники. Например, мРНК ТТК может быть количественно определена, используя способы гибридизации (например, норзерн-гибридизацию). Определение может быть выполнено на чипе или наборе. Применение набора предпочтительнее для определения уровня экспрессии множества генов (например, генов, специфичных для различных видов рака), включая ТТК. Специалист в области техники может получить данные пробы, используя информацию о последовательности ТТК. Например, кДНК ТТК может быть использована в качестве зонда. При необходимости зонд может быть мечен подходящей меткой, такой как контрасты, флуоресцентные вещества и изотопы, и уровень экспрессии гена может быть определен как интенсивность гибридизированных меток.

Кроме того, продукт транскрипции ТТК (например, SEQ ID NO:39) может быть количественно определен, используя праймеры, способами определения, основанными на амплификации (например, RT-PCR). Данные праймеры можно получить исходя из доступной информации о генной последовательности.

В частности, зонд или праймер, используемый для способа по настоящему изобретению, гибридизуется с мРНК ТТК в строгих, умеренно строгих или недостаточно строгих условиях. Использованная в настоящем описании фраза «строгие условия (гибридизации)» относится к условиям, при которых зонд или праймер будут гибридизоваться с последовательностью-мишенью, но не с другими последовательностями. Строгие условия зависят от последовательности и будут различаться при различных условиях. Специфическая гибридизация более длинных последовательностей достигается при более высокой температуре, чем более короткой. В общем случае температуру строгих условий выбирают приблизительно на 5 градусов Цельсия ниже, чем температура плавления (Тп) для специфической последовательности при определенной ионной силе и рН. Тп представляет собой температуру (при определенной ионной силе, рН и концентрации нуклеиновых кислот), при которой 50% зондов, комплементарных к своей последовательности-мишени, гибридизируются с последовательностью-мишенью при равновесии. Обычно строгие условия будут представлять собой те условия, при которых концентрация соли меньше чем 1,0 М ионов натрия, обычно приблизительно от 0,01 до 1,0 М ионов натрия (или другой соли) при рН от 7,0 до 8,3, а температура, по меньшей мере, приблизительно 30 градусов Цельсия для коротких зондов или праймеров (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и, по меньшей мере, 60 градусов Цельсия для более длинных зондов или праймеров. Строгие условия могут быть также достигнуты добавлением дестабилизирующих веществ, таких как формамид.

В качестве альтернативы, для определения уровня экспрессии ТТК может быть оценен продукт трансляции (т.е. белок). Например, может быть определено количество белка ТТК (например, SEQ ID NO:40) или его иммунологически активного фрагмента. Способы определения количества белка в качестве продукта трансляции включают способы иммуноанализа, которые используют антитело, специфически распознающее белок. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Кроме того, для определения может быть использован какой-либо фрагмент или модификация (например, химерное антитело, scFv, Fab, F(ab )₂, Fv и т.п.) антитела, в том случае, если фрагмент или модифицированное антитела сохраняет свою способность связываться с ТТК белком. Такие антитела против пептидов по изобретению и их фрагментов также представлены настоящим изобретением. Способы получения данных видов антител для определения белков хорошо известны в области техники, и любой способ может быть рассмотрен в настоящем изобретении для получения указанных антител и их эквивалентов.

В качестве еще одного способа определения уровня экспрессии гена ТТК исходя из продукта трансляции, интенсивность окрашивания может быть оценена с помощью иммуногистохимического анализа, используя антитело против белка ТТК. А именно в данном исследовании сильное окрашивание свидетельствует о повышенном количестве/уровне белка и, в тоже время, высоком уровне экспрессии гена ТТК.

Уровень экспрессии гена-мишени, например, ТТК, в раковых клетках может быть определен как повышенный, если уровень выше контрольного (например, уровень в обычных клетках) уровня гена-мишени, например, на 10%, 25% или на 50%; или повышен более чем в 1,1 раз, более чем в 1,5 раза, более чем в 2,0 раза, более чем в 5,0 раз, более чем в 10,0 раз или более.

Контрольный уровень может быть определен в одно время с уровнем в раковых клетках, используя пробы (пробу), заранее полученные и сохраненные от индивидуума(ов), у которого установлено онкологическое или неонкологическое заболевание. В качестве альтернативы, контрольный уровень может быть определен статистическим способом, основанным на результатах, полученных анализом предварительно определенного уровня экспрессии гена ТТК в пробах от индивидуумов с установленным заболеванием. Кроме того, контрольный уровень может быть выведен из данных экспрессии из предварительно исследованных клеток. Кроме того, в соответствии с аспектом настоящего изобретения, уровень экспрессии гена ТТК в биологическом образце может быть сравнен с контрольными уровнями, которые определяют из различных контрольных образцов. Предпочтительно использование контрольного уровня, определенного из контрольной пробы, полученного из типа ткани, схожего с типом ткани, полученной от пациента биологической пробы. Кроме того, предпочтительно применение стандартной величины уровней экспрессии гена ТТК в популяции с установленным заболеванием. Стандартная величина может быть получена любым способом, известным в области техники. Например, средняя величина +/-2 S.D. или +/- 3 S.D. может быть использована в качестве стандартного значения.

Если уровень экспрессии гена ТТК повышен по сравнению с нормальным контрольным уровнем, или схожий/равный раковому контрольному уровню, индивидуум может считаться пациентом, страдающим от рака или в группе риска по развитию рака.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ (i) установления, есть ли у индивидуума рак, который подвергают лечению, и/или (ii) выбора индивидуума для лечения рака, который включает стадии:

а) определения уровня экспрессии ТТК в раковых клетках или ткани (тканях), полученных от индивидуума, предположительно страдающего раком, подвергаемым лечению;

b) сравнения уровня экспрессии ТТК с нормальным контрольным уровнем;

с) определения индивидуума как индивидуума, страдающего раком, подвергаемым лечению, если уровень экспрессии ТТК повышен по сравнению с нормальным контрольным уровнем; и

d) выбора индивидуума для лечения рака, если его определяют как индивидуума, страдающего раком, подвергаемым лечению на стадии с).

В качестве альтернативы, данный способ включает стадии:

а) определения уровня экспрессии ТТК в раковых клетках или ткани (тканях), полученных от индивидуума, предположительно страдающего раком, подвергаемым лечению;

b) сравнения уровня экспрессии ТТК с раковым контрольным уровнем;

с) определения индивидуума как индивидуума, страдающего раком, подвергаемым лечению, если уровень экспрессии ТТК повышен по сравнению с раковым контрольным уровнем; и

d) выбора индивидуума для лечения рака, если его на стадии с) определяют как индивидуума, страдающего раком, подвергаемым лечению на стадии с).

Настоящее изобретение также представляет набор для определения или диагностики индивидуума, страдающего раком, который может быть подвергнут лечению полипептидом ТТК по настоящему изобретению, который также может использовать оценку и/или мониторинг эффективности иммунотерапии рака. Предпочтительно, рак включает, но не ограничивается перечисленным, рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек. В частности, набор содержит, по меньшей мере, один реактив для определения уровня экспрессии гена ТТК в полученных от индивидуума раковых клетках, который может быть выбран из группы:

(а) реактив для определения мРНК ТТК гена;

(b) реактив для определения белка ТТК или его биологически активного фрагмента; и

(с) реактив для определения биологической активности белка ТТК.

Примеры приемлемых реактивов для определения мРНК гена ТТК включают нуклеиновые кислоты, которые специфически связывают или определяют мРНК ТТК, такие как олигонуклеотиды, которые имеют комплементарную последовательность к части мРНК ТТК. Указанные виды олигонуклеотидов, например, представлены праймерами и зондами, которые специфичны к мРНК ТТК. Указанные виды олигонуклеотидов могут быть получены, основываясь на способах, хорошо известных в области техники. При необходимости реактив для определения мРНК ТТК может быть иммобилизован на твердой матрице. Кроме того, более чем один реактив для определения мРНК ТТК может быть включен в набор.

С другой стороны, приемлемые реактивы для определения белка ТТК или его иммунологически активного фрагмента могут включать антитела к белку ТТК или его иммунологически активные фрагменты. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Кроме того, для определения может быть использован какой-либо фрагмент или модификация (например, химерное антитело, scFv, Fab, F(ab )₂, Fv и т.п.) антитела, в том случае, если фрагмент или модифицированное антитело сохраняет свою способность связываться с ТТК белком или его иммунологически активным фрагментом. Способы получения данных видов антител для определения белков хорошо известны в области техники, и любой способ может быть рассмотрен в настоящем изобретении для получения указанных антител и их эквивалентов. Кроме того, антитело может быть мечено сигнальными молекулами прямой связью или методикой непрямого мечения. Метки и способы нанесения меток на антитела и определение связывания антител с их мишенями хорошо известны в области техники, и любые метки и способы могут рассматриваться настоящим изобретением. Кроме того, более чем один реактив для определения белка ТТК может быть включен в набор.

Набор может содержать более чем один из вышеуказанных реактивов. Набор может дополнительно включать твердую матрицу и реактив для связывания зонда против гена ТТК или антитело против пептида ТТК, среду и контейнер для культивирования клеток, реактивы позитивного и негативного контроля, и вторичное антитело для определения антитела против пептида ТТК. Например, образцы тканей, полученные от индивидуума, страдающего или не страдающего раком, могут служить в качестве контрольных реактивов. Набор по настоящему изобретению может дополнительно включать другие материалы, необходимые с коммерческой или потребительской точек зрения, включая буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку (например, листок-вкладыш, кассета, компакт-диск и т.п.) с инструкциями по применению. Данные реактивы и т.п. могут быть сохранены в контейнере с этикеткой. Подходящие контейнеры включают бутылки, флаконы и пробирки. Контейнеры могут быть сделаны из различных материалов, таких как стекло или пластик.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, если реактив представляет собой зонд против мРНК ТТК, он может быть иммобилизован на твердой матрице, такой как пористая полоска, для образования, по меньшей мере, одного места определения. Измеряющая или распознающая область пористой полоски может включать различные места, каждое содержащее нуклеиновую кислоту (зонд). Тестовая полоска может также содержать места для отрицательного и/или положительного контролей. В качестве альтернативы, контрольные места могут располагаться на полоске, отдельной от тестовой полоски. Необязательно различные места определения могут содержать различные количества иммобилизованных нуклеиновых кислот, т.е. большее количество в первом месте определения и меньшие количества в последующих местах. При добавлении тестового образца количество мест, демонстрирующих различимый сигнал, обеспечивает количественное определение мРНК ТТК, представленной в образце. Места определения могут быть сконфигурированы в любой подходящей для определения форме и обычно представлены в форме полосы или пунктирной линии, идущей по ширине тестовой полоски.

Набор по настоящему изобретению может дополнительно включать позитивный контрольный образец или стандартный образец ТТК. Позитивный контрольный образец по настоящему изобретению может быть получен сбором позитивных образцов ТТК и затем исследованием уровней ТТК в них. В качестве альтернативы, беспримесный белок ТТК или полинуклеотид могут быть добавлены к клеткам, которые не экспрессируют ТТК для образования позитивного образца или стандартного образца ТТК. В настоящем изобретении беспримесный ТТК может быть рекомбинантным белком. ТТК уровень позитивного контроля, например, больше, чем малозначимая величина.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение дополнительно представляет диагностический набор, включающий белок или неполноценный белок, способный специфически распознавать антитело по настоящему изобретению или его фрагмент.

Примеры составляющих пептидов или иммуногенных фрагментов белка по настоящему изобретению включают полипептиды, состоящие, по меньшей мере, из 8, предпочтительно 15 и более предпочтительно 20 заменимых аминокислот в аминокислотной последовательности белка по настоящему изобретению. Рак может быть диагностирован определением антитела в пробе (например, крови, ткани), используя белок или пептид (полипептид) по настоящему изобретению. Способы получения белка по настоящему изобретению и пептидов описаны ранее.

Способ диагностики рака по настоящему изобретению может быть выполнен определением разницы между количеством анти-ТТК антител в пробе и в контрольной пробе, как описано ранее. Индивидуум считается страдающим раком, если клетки или ткани пациента содержат антитела против продуктов экспрессии (ТТК) гена и количество анти-ТТК антител определяют большим, чем малозначимый уровень по сравнению с нормальным контролем.

В другом варианте осуществления диагностический набор по настоящему изобретению может включать пептид по настоящему изобретению и молекулу HLA, связывающую его. Способ определения антиген-специфичных CTL, используя антигенные пептиды и HLA-молекулы, уже открыт (например, Altman J.D. et al., Science 1996, 274(5284):94-6). Таким образом, комплекс пептида по настоящему изобретению и молекулы HLA может быть использован для определения опухолевых антиген-специфичных CTL, таким образом, делая возможной раннюю диагностику рака, его рецидива и/или метастазов. Кроме того, он может быть использован для выбора индивидуумов, к которым могут быть применены фармацевтические средства, включающие пептиды по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, или оценки лечебного эффекта фармацевтических средств.

В частности, в соответствии с известным способом (см., например, Altman J.D. et al., Science 1996, 274(5284):94-6) может быть получен олигомерный комплекс, такой как тетрамер, меченной изотопом молекулы HLA и пептида по настоящему изобретению. Применяя комплекс, может быть выполнена диагностика, например, количественным определением пептид-антиген специфичных CTL в лимфоцитах периферической крови, полученных от индивидуума, предположительно страдающего раком.

Настоящее изобретение дополнительно представляет способ или диагностические средства для оценки иммунологических реакций индивидуума, используя пептидные эпитопы, как описано в настоящем документе. В одном варианте осуществления пептиды, ограниченные HLA А-24, как описано в настоящем документе, используют в качестве реактивов для оценки или прогнозирования иммунной реакции индивидуума. Оцениваемую иммунную реакцию вызывают контактом иммуногена с иммунокомпетентными клетками in vitro и in vivo. В некоторых вариантах осуществления любые вещества или композиции, которые могут вызывать продукцию антиген-специфичных CTL, которые распознают и связывают пептидный эпитоп (эпитопы), могут быть использованы в качестве реактива. Пептидный реактив нельзя использовать в качестве иммуногена. Аналитические системы, которые применяют для данных исследований, включают относительно недавние технические разработки, такие как тетрамеры, окрашивание для внутриклеточных лимфокинов и анализ высвобождения интерферона, или анализ ELISPOT. В предпочтительном варианте осуществления иммунокомпетентные клетки, вступающие в контакт с пептидным реактивом, могут быть антигенпрезентирующими клетками, включая дендритные клетки.

Например, пептиды по настоящему изобретению могут быть использованы в анализах окрашивания тетрамеров для оценки мононуклеарных клеток периферической крови в отношении наличия антиген-специфичных CTL, для воздействия на антиген опухолевой клетки или иммуноген. HLA тетрамерный комплекс может быть использован для непосредственной визуализации антиген-специфичных CTL (см., например, Ogg et al., Science 279:2103-2106, 1998; и Altman et al., Science 174:94-96, 1996) и определения частоты встречаемости популяции антиген-специфичных CTL в пробе мононуклеарных клеток периферической крови. Тетрамерный реактив, использующий пептид по изобретению, может быть получен в соответствии с изложенным далее.

Пептид, который связывает молекулу HLA, подвергают рефолдингу в присутствии тяжелой цепи соответствующей HLA и бета-2-микроглобулина для образования тримолекулярного комплекса. В указанном комплексе карбоксильный конец тяжелой цепи биотинилируют в области, которую предварительно создают в белке. Затем стрептавидин добавляют к комплексу для образования тетрамера, состоящего из тримолекулярного комплекса и стрептавидина. С помощью флуоресцентно меченного стрептавидина тетрамер может быть использован для окрашивания антиген-специфичных клеток. Клетки могут быть затем идентифицированы, например, проточной цитометрией. Указанные исследования могут быть использованы для целей диагностики и прогнозирования. Клетки, определенные данной методикой, могут быть также применены для терапевтических целей.

Настоящее изобретение также представляет реактивы для оценки иммунных повторных реакций (см., например, Bertoni et al., J. Clin. Invest. 100:503-513, 1997 и Penna et al., J. Exp. Med. 174:1565-1570, 1991), содержащие пептиды по настоящему изобретению. Например, образцы РВМС от пациентов, страдающих раком, подвергаемым лечению, исследуют в отношении наличия антиген-специфичных CTL, используя специфические пептиды. Проба крови, содержащая мононуклеарные клетки, может быть оценена культивированием РВМС и стимуляцией клеток пептидами по настоящему изобретению. После соответствующего периода культивирования расширенная клеточная популяция может быть исследована, например, в отношении CTL активности.

Пептиды также могут быть использованы для оценки эффективности вакцины. РВМС, полученные от пациента, вакцинированного иммуногеном, могут быть исследованы, используя, например, любой из способов, описанных ранее. Определяют тип HLA пациента и выбирают для анализа пептидные эпитопные реактивы, которые распознают аллель-специфические молукулы, представленные у пациента. Иммуногенность вакцины может быть выявлена наличием эпитоп-специфических CTL в пробе. Пептиды по изобретению могут быть также использованы для получения антител, применяя методики, хорошо известные в области техники (см., например, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Green, NY; и Antibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), которые могут быть использованы в качестве реактивов для диагностики и наблюдения рака. Указанные антитела могут включать антитела, которые распознают пептид в составе молекулы HLA, т.е. антитела, которые связывают комплекс пептид-МНС.

Пептиды и композиции по настоящему изобретению имеют ряд дополнительных применений, некоторые из которых описаны в настоящем документе. Например, настоящее изобретение представляет способ диагностики или определения заболевания, характеризующегося экспрессией иммуногенного полипептида ТТК. Данные способы включают определение экспрессии ТТК HLA связывающего пептида или комплекса ТТК HLA связывающего пептида и HLA-молекулы класса I в биологической пробе. Экспрессия пептида или комплекса пептида и HLA-молекулы класса I может быть определена или выявлена исследованием партнера связывания для пептида или комплекса. В предпочтительном варианте осуществления партнер связывания для пептида или комплекса представляет собой антитело, распознающее и специфически связывающее пептид. Экспрессия ТТК в биологической пробе, такой как биопсия опухоли, может быть также исследована стандартным протоколом амплификации, применяя ТТК праймеры. Пример опухолевой экспрессии представлен в настоящем описании и дополнительно раскрыт условиями примеров, а праймеры для ТТК амплификации могут быть найдены в WO2003/27322.

Предпочтительно, диагностические способы включают контактирование биологической пробы, выделенной от индивидуума, с веществом, специфичным для ТТК связывающего пептида для определения наличия ТТК HLA связывающего пептида в биологической пробе. В соответствии с приведенным в настоящем описании «контактирование» означает расположение биологической пробы в непосредственной близости к веществу и при определенных условиях, например концентрации, температуре, времени, ионной силе, для возникновения специфического взаимодействия между веществом и ТТК HLA связывающим пептидом, который представлен в биологической пробе. В общем случае специалисту в области техники известны условия контактирования вещества с биологической пробой, облегчающие специфическое взаимодействие между молекулой и ее когнатом (например, белком и его рецепторным когнатом, антителом и белковым антигенным когнатом, нуклеиновой кислотой и ее комплементарным когнатом в последовательности) в биологической пробе. Примерные условия для облегчения взаимодействия между молекулой и ее когнатом описаны в патенте США № 5108921, обсуждаемом Low et al.

Диагностический способ по настоящему изобретению может быть выполнен и in vivo и in vitro. Например, биологическая проба может быть тканью in vivo, и вещество, специфичное для ТТК иммуногенного полипептида, может быть использовано для определения наличия указанных молекул в ткани. В качестве альтернативы, биологическая проба может быть получена или выделена in vitro (например, проба крови, опухолевая биопсия, тканевый экстракт). В отдельном предпочтительном варианте осуществления, биологическая проба может быть пробой, содержащей клетки, более предпочтительно пробой, содержащей клетки опухоли, полученные от индивидуума, которого подвергают лечению или диагностике.

В качестве альтернативы, диагностика может быть выполнена способом, который позволяет непосредственное количественное определение антиген-специфических Т-клеток окрашиванием мультимерных комплексов HLA с флуоресцентной меткой (например, Altman, J.D. et al., 1996, Science 274:94; Altman, J.D. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10330). Также может быть представлено окрашивание для внутриклеточных лимфокинов и анализ ELISPOT высвобождения гамма-интерферона. Окрашивание мультимеров, окрашивание внутриклеточных лимфокинов и анализ ELISPOT обладают чувствительностью, по меньшей мере, более чем в 10 раз превосходящей общепринятые исследования (Murali-Krishna, K. et al. 1998, Immunity 8:177; Lalvani, А. et al. 1997, J Exp. Med. 186:859; Dunbar, P.R. et al., 1998, Curr. Biol 8:413). Также могут быть использованы пентамеры (например, US 2004-209295А), декстрамеры (например, WO 02/072631) и стрептамеры (например, Nature medicine 6.631-637(2002)).

XIV. Антитела

Настоящее изобретение дополнительно представляет антитела, которые связывают пептиды по настоящему изобретению. Предпочтительные антитела специфически связывают пептид по настоящему изобретению и не будут связывать (или будут связывать слабо) пептиды, не относящиеся к настоящему изобретению. В качестве альтернативы, антитела связывают пептид по изобретению так же, как и их гомологи. Антитела против пептидов по изобретению могут быть использованы в диагностике рака и прогнозировании, и визуализирующих методиках. Также указанные антитела могут найти применение в лечении, диагностике и/или прогнозировании других видов рака, при которых у пациентов также экспрессирован или сверхэкспрессирован ТТК. Кроме того, антитела, экспрессированные внутриклеточно (например, одноцепочечные антитела), применяют в терапии рака, при котором отмечается экспрессия ТТК, такого как, например, рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярная карцинома, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, диффузный тип рака желудка, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфома, остеосаркома, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек.

Настоящее изобретение также представляет различные иммунологические исследования для определения и/или количественного определения белка ТТК (SEQ ID NO:40) или его фрагментов, включая полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 2, 3, 6, 15 и 22. Данные исследования могут включать одно или несколько анти-ТТК антител, способных распознавать и связывать ТТК-белок или его фрагменты, соответственно. В контексте настоящего изобретения анти-ТТК антитела, связывающиеся с ТТК-полипептидами, предпочтительно распознают полипептид, состоящий из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 2, 3, 6, 15 и 22. Специфичность связывания антитела может быть подтверждена тестом подавления. Если связывание между антителом, подвергаемым исследованию, и полноразмерным ТТК-полипептидом подавляется в присутствии какого-либо фрагмента полипептида, состоящего из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 2, 3, 6, 15 и 22, то указанное подавление демонстрирует, что антитело специфически связывается с фрагментом. В настоящем изобретении указанные иммунологические исследования могут быть выполнены в рамках иммунологического исследования различного объема, хорошо известного в области техники, включая, но не ограничиваясь перечисленным, различные типы радиоиммунологического анализа, иммунохроматографию, энзим-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA), энзим-связанный иммунофлуоресцентный анализ (ELIFA) и т.п.

Относящиеся к иммунологическим, но не связанные с антителами исследования по изобретению также включают исследования иммуногенности Т-клеток (подавление или стимуляцию), а также связывания главного комплекса гистосовместимости (МНС). В добавление, настоящим изобретением также представлены иммунологические способы визуализации, способные определять рак, экспрессирующий ТТК, включая, но не ограничиваясь перечисленным, способы радиосцинтиграфии, использующие меченые антитела по настоящему изобретению. Указанные исследования клинически успешны в диагностике, наблюдении и/или прогнозировании видов рака, при которых экспрессирован ТТК, таких как рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярная карцинома, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфома, остеосаркома, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек.

Настоящее изобретение представляет антитело, которое связывает пептид по изобретению. Антитело по изобретению может быть использовано в какой-либо форме, такой как моноклональные или поликлональные антитела, и включает антисыворотку, полученную иммунизацией животного, такого как кролик, пептидом по изобретению, все классы моноклональных или поликлональных антител, человеческие антитела и гуманизированные антитела, полученные генной рекомбинацией.

Пептид по настоящему изобретению, используемый в качестве антигена для получения антитела, может быть произведен различными видами животных, но предпочтительно выделен от млекопитающего, такого как человек, мышь или крыса, более предпочтителен человек. Пептид, полученный от человека, может быть представлен нуклеотидом или аминокислотными последовательностями, раскрытыми в настоящем описании.

В соответствии с настоящим изобретением пептид, используемый в качестве иммунизирующего антигена, может быть полноценным белком или отдельным пептидом белка. Отдельный пептид может содержать, например, амино(N)-концевой или карбокси(С)-концевой фрагмент пептида по настоящему изобретению.

В настоящем описании антитело определяют как белок, который вступает в реакцию или с полноразмерным или фрагментом ТТК-пептида. В предпочтительном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению распознает фрагмент пептидов ТТК, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 2, 3, 6, 15 и 22. Способы синтеза олигопептида хорошо известны в области техники. После синтеза пептиды могут быть необязательно очищены перед применением в качестве иммуногена. В настоящем изобретении олигопептид (например, 9- или 10-мер) может быть конъюгирован или связан с носителем для повышения иммуногенности. Гемоцианин фисурелла (KLH) хорошо известен в качестве носителя. Способ конъюгирования KHL и пептида также хорошо известен в области техники.

В качестве альтернативы, ген, кодирующий пептид по изобретению или его фрагмент, может быть вставлен в известный вектор экспрессии, который затем используют для трансформации клетки-хозяина, как описано в настоящем документе. Требуемый пептид или его фрагмент может быть извлечен снаружи или изнутри клеток-хозяев любым стандартным способом, и может быть затем использован в качестве антигена. В качестве альтернативы, как антиген могут быть использованы целые клетки, экспрессирующие антиген, или их лизаты, или химически синтезированный пептид.

Любые млекопитающие могут быть иммунизированы антигеном, но предпочтительными считаются совместимые с родительскими клетками, использованными для клеточного слияния. В общем случае используют животных Rodentia, Lagomorpha или Primates. Животные Rodentia включают, например, мышей, крыс и хомяков. Животные Lagomorpha включают, например, кроликов. Животные Primates включают, например, макак Catarrhini (устаревшее название мартышка), таких как Macaca fascicularis, макака-резус, бабуин и шимпанзе.

Способы иммунизации животных антигенами известны в области техники. Внутрибрюшная инъекция или подкожная инъекция антигена является стандартным способом иммунизации млекопитающих. В частности, антиген может быть разведен и суспендирован в соответствующем количестве забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), физиологического раствора и т.п. При необходимости суспензия антигена может быть смешана с соответствующим количеством стандартного вспомогательного вещества, такого как полный адъювант Фрейнда, образованным в форме эмульсии, и затем введена млекопитающим. Предпочтительно, последовательными несколькими введениями антигена, смешанного с соответствующим количеством неполного адъюванта Фрейнда каждые от 4 до 21 дня. Соответствующий носитель также может быть использован для иммунизации. После иммунизации в соответствии с описанным ранее сыворотку исследуют стандартным способом в отношении повышения количества описываемых антител.

Поликлональные антитела против пептидов по настоящему изобретению могут быть получены сбором крови от иммунизированного млекопитающего, проверенного в отношении повышения количества требуемых антител в сыворотке, и отделением сыворотки крови общепринятым способом. Поликлональные антитела включают сыворотку, содержащую поликлональные антитела, а также фракция, содержащая поликлональные антитела, может быть выделена из сыворотки. Из фракции может быть получен иммуноглобулин G или М, который распознает только пептид по изобретению, используя, например, колонку для проведения аффинной хроматографии с иммобилизованным пептидом по настоящему изобретению, и дополнительным очищением данной фракции, используя колонку с белком А или С.

Для получения моноклональных антител иммунные клетки собирают от млекопитающего, иммунизированного антигеном и проверенного в отношении повышенного уровня требуемых антител в сыворотке, в соответствии с описанным ранее, и подвергают клеточному слиянию. Иммунные клетки, подвергаемые клеточному слиянию, предпочтительно получают из селезенки. Другие предпочтительные родительские клетки, подвергаемые слиянию с вышеуказанным иммуноцитом, включают, например, миеломные клетки млекопитающих, и более предпочтительно миеломные клетки, имеющие свойства, приобретенные под воздействием лекарственных средств, для отбора клеток для слияния.

Вышеуказанный иммуноцит и миеломные клетки могут быть слиты в соответствии с известными способами, например способом Milstein et al. (Calfre и Milstein, Methods Enzymol 73:3-46(1981)).

Результирующие гибридомы, полученные клеточным слиянием, могут быть отобраны культивированием в стандартной селекционной среде, такой как среда НАТ (среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Клеточная культура обычно остается в среде НАТ в течение времени от нескольких дней до нескольких недель, время, достаточное для гибели всех других клеток за исключением требуемой гибридомы (неслившиеся клетки). Затем выполняют стандартное ограниченное разведение для отбора и клонирования гибридомной клетки, продуцирующей антитело.

В добавление к указанному выше способу, в котором нечеловекообразное животное иммунизируют антигеном для получения гибридомы, лимфоциты человека, такие как инфицированные вирусом ЕВ, могут быть иммунизированы пептидом, экспрессирующими пептид клетками или их лизатами in vitro. Затем могут быть получены иммунизированные лимфоциты, слитые с миеломными клетками человека, которые способны неограниченно делится, такие как U266, для получения гибридомы, производящей требуемые человеческие антитела, которые способны связывать пептид (Нерассмотренная опубликованная патентная заявка Японии Sho 63-17688).

Полученные гибридомы затем пересаживают в брюшную полость мыши и экстрагируют асцитную жидкость. Полученные моноклональные антитела могут быть очищены, например, фракционированием сульфатом аммония, колонкой с иммобилизованным белком G или А, DEAE ионообменной хроматографией или колонкой для проведения хроматографии по сродству с иммобилизованным пептидом по настоящему изобретению. Антитело по настоящему изобретению может быть использовано не только для очистки и определения пептида по настоящему изобретению, но также в качестве кандидата агонистов и антагонистов пептида по настоящему изобретению.

В качестве альтернативы, иммунная клетка, такая как иммунизированный лимфоцит, продуцирующая антитела, может быть иммортализована онкогеном и использована для получения моноклональных антител.

Моноклональные антитела могут быть также получены рекомбинантно, применяя методики генной инженерии (см., например, Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, опубликованный в Великобритании MacMillan Publishers LTD (1990)). Например, ДНК, кодирующая антитело, может быть клонирована из иммунной клетки, такой как гибридома или иммунизированный лимфоцит, продуцирующий антитело, вставлена в соответствующий вектор и введена в клетки-хозяева для получения рекомбинантного антитела. Настоящее изобретение также представляет рекомбинантные антитела, полученные в соответствии с описанным ранее.

Кроме того, антитело по настоящему изобретению может быть фрагментом антитела или модифицированным антителом, если оно связывает один или несколько пептидов по настоящему изобретению. Например, фрагмент антитела может быть Fab, F(ab )₂, Fv или одноцепочечным Fv (scFv), в котором Fv-фрагменты из Н или L цепей сшиты соответствующим линкером (Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-83 (1988)). В частности, фрагмент антитела может быть получен обработкой антитела ферментом, таким как папаин или пепсин. Альтернативно, ген, кодирующий фрагмент антитела, может быть сконструирован вставкой в вектор экспрессии и экспрессирован в соответствующей клетке-хозяине

Антитело может быть модифицировано конъюгацией с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (PEG). Настоящее изобретение представляет указанные модифицированные антитела. Модифицированное антитело может быть получено химической модификацией антитела. Данные способы модификации общеприняты в области техники.

В качестве альтернативы, антитело по настоящему изобретению может быть получено в виде химерного антитела, между вариабельной областью, полученной из антитела, не относящегося к человеческому, и константной областью, полученной из человеческого антитела, или в виде гуманизированного антитела, содержащего гипервариабельную область (CDR), полученную из антитела, не относящегося к человеческому, каркасную область (FR) и константную область, полученную из человеческого антитела. Указанные антитела могут быть получены в соответствии с известной методикой. Гуманизация может быть выполнена замещением последовательностей CDR или CDR грызунов соответствующими последовательностями человеческого антитела (см., например, Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)). Соответственно, указанные гуманизированные антитела представляют собой химерные антитела, которые существенно меньше, чем интактный человеческий вариабельный домен, замещенный соответствующей последовательностью из видов, не относящихся к человеку.

Могут быть использованы полноразмерные человеческие антитела, содержащие человеческие вариабельные области в добавление к каркасным областям и константным областям. Указанные антитела могут быть получены, используя различные методики, известные в области техники. Например, способы in vitro включают использование библиотеки рекомбинантных фрагментов человеческих антител, выявляемых на бактериофаге (например, Hoogenboon & Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991)). Также человеческие антитела могут быть получены введением локуса человеческого иммуноглобулина в трансгенных животных, например мышей, в которых гены эндогенного иммуноглобулина частично или полностью инактивированы. Указанный подход описан, например, в патентах США № № 6150584, 5545807, 5545806, 5625126, 5633425, 5661016.

Антитела, полученные таким образом, могут быть очищены до гомогенности. Например, выделение и очистка антител могут быть выполнены в соответствии со способами выделения и очистки, применяемыми, в общем случае, для белков. Например, антитело может быть отделено и выделено, соответственно, избирательным и сочетанным использованием колонок для хроматографии, таких как аффинная хроматография, фильтром, ультрафильтрацией, высаливанием, диализом, SDS электрофорезом в полиакриламидном геле и изоэлектрофокусированием (Antibodies Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)), но не ограничены перечисленным. Колонки с иммобилизованным белком А и с иммобилизованным белком G могут быть использованы в качестве колонки для аффинной хроматографии. Типичные используемые колонки с иммобилизованным белком А включают, например, Hyper D, POROS и Sepharose F.F. (Pharmacia).

Типичная хроматография, за исключением аффинной хроматографии, включает, например, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию, хроматографию с обращенной фазой, адсорбционную хроматографию и т.п. (Strategies for protein Purification and Characterization: A Laboratory Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Методики хроматографии могут быть выполнены жидкофазной хроматографией, такой как HPLC и FPLC.

Например, измерение абсорбции, твердофазный иммуносорбентный анализ (ELISA), иммуноферментный анализ (EIA), радиоиммунологический анализ (RIA) и/или иммунофлуоресцентный анализ могут быть использованы для измерения антиген-связывающей способности антитела по настоящему изобретению. В ELISA антитело по настоящему изобретению иммобилизовано на планшете, пептид по настоящему изобретению наносят на планшету и затем наносят пробу, содержащую требуемое антитело, такую как культура супернатанта клеток, продуцирующих антитела или очищенные антитела. Затем наносят вторичное антитело, которое распознает первичное антитело и мечено ферментом, таким как щелочная фосфатаза, и планшету инкубируют. Затем, после промывки, ферментный субстрат, такой как п-нитрофенилфосфат, добавляют на планшету, и измеряют абсорбцию для оценки антигенсвязывающей активности пробы. Фрагмент пептида, такой как С-концевой или N-концевой фрагмент, может быть использован в качестве антигена для оценки связывающей активности антитела. BIAcore (Pharmacia) может быть использован для оценки активности антитела по настоящему изобретению.

Вышеизложенные способы предусматривают определение или оценку пептида по изобретению воздействием антитела по изобретению на пробу, предположительно содержащую пептид по изобретению, и определение или оценку иммунного комплекса, образованного антителом и пептидом.

Так как способ определения и оценки пептида по изобретению может специфически определять и оценивать пептид, способ может быть использован в различных экспериментах, в которых применяют пептид.

XV. Векторы и клетки-хозяева

Настоящее изобретение также представляет вектор и клетку-хозяина, в которую вводят нуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению. Вектор по настоящему изобретению используют для хранения нуклеотида, особенно ДНК, по настоящему изобретению в клетке-хозяине, для экспрессии пептида по настоящему изобретению, или введения нуклеотида по настоящему изобретению для генной терапии.

Если Е. coli представляет собой клетку-хозяина и вектор амплифицирован и продуцирован в большом количестве в Е. coli (например, JM109, DH5 альфа, НВ101 или XL1Blue), вектор, амплифицированный в Е. coli, должен быть «ori» и маркерным геном для отбора трансформированной Е. coli (например, ген устойчивости к воздействию лекарственных средств, выбранный лекарственным средством, таким как ампициллин, тетрациклин, канамицин, хлорамфеникол и т.п.). Например, векторы серии М13, векторы серии pUC, pBR322, pBluescript, pCR-Script и т.п. В добавление, также могут быть использованы для субклонирования и для извлечения ДНК pGEM-T, pDIRECT и рТ7, а также векторы, описанные ранее. Если вектор используют для продукции белка по настоящему изобретению, особенно успешен вектор экспрессии. Например, вектор экспрессии, экспрессированный в Е. coli, будет обладать вышеуказанными характеристиками, будучи амплифицированным в Е. coli. Если в качестве клетки-хозяина использовали Е. coli, такую как JM109, DH5 альфа, НВ101 или XL1Blue, вектор будет иметь промотор, например lacZ промотор (Ward et al., Nature 341:544-6 (1989); FASEB J 6:2422-7 (1992)), araB промотор (Better et al., Science 240:1041-3 (1988)), Т7 промотор и т.п., которые эффективно экспрессируют требуемый ген в Е. coli. В данном отношении вместо перечисленных векторов могут быть использованы, например, pGEX-5X-1 (Pharmacia), «QIAexpress system» (Qiagen), pEGFP и pET (в таком случае хозяином является предпочтительно BL21, которая экспрессирует Т7 РНК полимеразу). Дополнительно, вектор может также содержать последовательность для секреции пептидов. Например, сигнальная последовательность, которая заставляет пептид секретироваться к периплазме Е. coli, представляет собой pelB сигнальную последовательность (Lei et al., J Bacteriol 169:4379 (1987)). Способы для ввода векторов в целевые клетки-мишени включают, например, способ, применяющий хлорид кальция, и способ электропорации.

В добавление к Е. coli, для продуцирования полипептида по настоящему изобретению могут быть использованы векторы, полученные от млекопитающих (например, pcDNA3 (Invitrogen) и pEGF (Nucleic Acid Res 18(17):5322 (1990)), pEF, pCDM8), векторы экспрессии, полученные из клеток насекомых (например, «Bac-to-BAC бакуловирусная экспрессионная система» (GIBCO BRL), pBacPAK8), векторы экспрессии, полученные из растений (например, рМН1, рМН2), векторы экспрессии, полученные из вирусов животных (например, pHSV, pMV, pAdexLcw), векторы экспрессии, полученные из ретровирусов (например, pZIpneo), векторы экспрессии, полученные из дрожжей (например, «Pichia Expression Kit» (Invitrogen), pNV11, SP-Q01), и векторы экспрессии, полученные из Bacillus subtilis (например, pPL608, рКТН50).

Для экспрессии вектора в животных клетках, таких как СНО, COS или NIH3T3 клетки, вектор должен иметь обязательный промотор в указанных клетках, например SV40 промотор (Mulligan et al., Nature 277:108 (1997)), MMLV-LTR промотор, EF1 альфа промотор (Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18:5322 (1990)), CMV промотор и т.п., и предпочтительно маркерный ген, выбранный из трансформантов (например, устойчивый к лекарственному средству ген, выбранный лекарственным средством (например, неомицином, G418)). Примеры известных векторов с указанными характеристиками включают, например, рМАМ, pDR2, рВК-RSV, pBK-CMV, pOPRSV и pOP13.

Нижеприведенные примеры представлены для иллюстрации настоящего изобретения и помогают специалисту в области техники в его получении и применении. Примеры не предназначены для ограничения рамок изобретения.

ПРИМЕРЫ

Материалы и способы

Клеточные линии

Т2 (HLA-A2), В-лимфобластоидную клеточную линию человека и COS7, клеточную линию почки африканской зеленой мартышки приобретают из АТСС. HLA-A2 позитивную и ТТК позитивную опухолевую клеточную линию, Н1650, приобретают из АТСС. HLA-A2 негативную и ТТК позитивную клеточные линии РС-3 и ТЕ-1 приобретают из JCRB Cell bank и RIKEN Cell bank соответственно.

Синтез пептидов, полученных из ТТК

9-мерные и 10-мерные пептиды, полученные из ТТК, группируют исходя из их предполагаемой связывающей способности в отношении молекулы HLA-А*0201 (SEQ ID NO:1-38). Указанные пептиды синтезирует SIGMA (Саппоро, Япония) в соответствии со стандартным способом твердофазного синтеза и очищают обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографией (HPLC). Очистку (>90%) и определение пептидов выполняют аналитической HPLC и масс-спектрометрией соответственно. Пептиды растворяют в диметилсульфоксиде (DMSO) при 20 мг/мл и хранят при -80°С.

Индукция CTL in vitro

Полученные из моноцитов дендритные клетки (DC) используют в качестве антигенпрезентирующих клеток (АРС) для индукции цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) против пептидов, представленных на антигене лейкоцитов человека (HLA). DC создают in vitro, как описано в литературе (Nakahara S et al., Cancer Res 2003 июль 15, 63(14):4112-8). В частности, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), выделенные от здорового добровольца (HLA-А*0201 позитивные), раствором Ficoll-Plaque (Pharmacia) отделяют адгезией к пластиковой чашке для культивирования (Becton Dickinson), таким образом, делая их фракцией с повышенным содержанием моноцитов. Популяцию с повышенным содержанием моноцитов культивируют в присутствии 1000 ед/мл колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF) (R&D System) и 1000 ед./мл интерлейкина (IL)-4 (R&D System) в среде AIM-V (Invitrogen), содержащей 2% инактивированной нагреванием аутологичной сыворотки (AS). После 7 дней культивирования цитокин-индуцированные DC в импульсном режиме обрабатывают 20 мкг/мл каждым из синтезированных пептидов в присутствии 3 мкг/мл бета-2-микроглобулина в течение 3 часов при 37°С в среде AIM-V. Подтверждают, что образованные клетки экспрессируют DC-связанные молекулы, такие как CD80, CD83, CD86 и HLA класс II, на своей поверхности (данные не приведены). Указанные DC, подвергнутые импульсной обработке пептидами, затем инактивируют рентгеновским облучением (20 Гр) и смешивают в соотношении 1:20 с аутологичными CD8+Т-клетками, полученными положительным отбором с CD8 Positive Isolation Kit (Dynal). Данные культуры высевают в 48-луночные планшеты (Corning); каждая ячейка содержит 1,5×10⁴ DC, подвергнутых в импульсном режиме обработке пептидами, 3×10⁵ CD8+Т-клеток и 10 нг/мл IL-7 (R&D System) в среде AIM-V/2% AS. Спустя 3 дня к указанным культурам добавляют IL-2 (CHIRON) до конечной концентрации 20 МЕ/мл. На 7 и 14 сутки Т-клетки дополнительно стимулируют аутологичными DC, подвергнутыми в импульсном режиме обработке пептидами. DC получают каждый раз таким же образом, как описано ранее. CTL исследуют в отношении их активности против Т2-клеток, подвергнутых в импульсном режиме обработке пептидами после 3-кратной стимуляции пептидов на 21 день (Tanaka H. et al., Br J Cancer 5 января 2001, 84(1):94-9; Umano Y. et al., Br J Cancer, 20 апреля 2001, 84(8):1052-7; Uchida N. et al., Clin Cancer Res 15 декабря 2004, 10(24):8577-86; Suda T. et al., Cancer Sci май 2006, 97(5):411-9; Watanade T. et al., Cancer Sci август 2005, 96(8):498-506).

Методика CTL размножения

CTL размножают в культуре, используя способ, сходный с тем, который описан Riddell et al. (Walter E.A. et al, N Eng J med 19 октября 1995, 333(16):1038-44; Riddell S.R. et al., Nat Med февраль 1996, 2(2):216-23). CTL в общем количестве 5×10⁴ суспендируют в 25 мл среды AIM-V/5% AS с 2 В-лимфобластоидными клеточными линиями человека, инактивируют Митоцином С, в присутствии 40 нг/мл анти-CD3 моноклональных антител (Pharmingen). Через день после инициации культуры в культуру добавляют 120 МЕ/мл IL-2. Культуры подпитывают свежей средой AIM-V/5% AS, содержащей 30 МЕ/мл IL-2, на 5, 8 и 11 дни (Tanaka H. et al., Br J Cancer 5 января 2001, 84(1):94-9; Umano Y. et al., Br J Cancer, 20 апреля 2001, 84(8):1052-7; Uchida N. et al., Clin Cancer Res 15 декабря 2004, 10(24):8577-86; Suda T. et al., Cancer Sci май 2006, 97(5):411-9; Watanade T. et al., Cancer Sci август 2005, 96(8):498-506).

Создание клонов CTL

Выполнили разведения до получения 0,3, 1 и 3 CTL/ячейка в 96-луночных круглодонных микропланшетах для титрования (Nalge Nunc International). CTL культивируют с 1×10⁴ клеток/ячейка 2 В-лимфобластоидными клеточными линиями человека, 30 нг/мл анти-CD3 антител и 125 ед./мл IL-2 в 150 мкл/ячейка AIM-V среде, содержащей 5% AS. 50 микролитров/ячейка IL-2 добавляют к среде 10 дней спустя, чтобы достигнуть конечной концентрации 125 ед./мл IL-2. Активность CTL исследуют на 14 день и создают CTL клоны, используя такой же способ, как описано ранее (Uchida N et al., Clin Cancer Res 15 декабря 2004, 10(24):8577-86; Suda T et al., Cancer Sci май 2006, 97(5):411-9; Watanade T et al., Cancer Sci август 2005, 96(8):498-506).

Специфическая активность CTL

Для исследования специфической CTL-активности выполняют гамма-интерферон (IFN) иммуноферментный спот-анализ (ELISPOT) и гамма-интерферон (IFN) иммуносорбентный ферментный анализ (ELISA). В частности, Т2, подвергнутый обработке пептидом в импульсном режиме (1×10⁴/ячейка), получают в качестве стимулятора клеток. Клетки, культивированные в 48 ячейках, используют в качестве клеток-респондеров. При получении выполняют гамма-интерферон (IFN) иммуноферментный спот-анализ (ELISPOT) и гамма-интерферон (IFN) иммуносорбентный ферментный анализ (ELISA).

Создание клеток, убедительно экспрессирующих один или оба из целевых генов и HLA-A02.

кДНК, кодирующую открытую рамку считывания целевых генов или HLA-A*0201, амплифицируют PCR (ПЦР). Продукты амплификации PCR клонируют в вектор. Плазмиды трансфицируют в COS7, которые представляют собой целевые гены и клеточные линии, не содержащие HLA-А*0201, используя липофектамин 2000 (Invitrogen), в соответствии с рекомендованными методиками получения. Спустя 2 дня после трансфекции трансфицированные клетки умерщвляют версеном (Invitrogen) и используют в качестве клеток-мишеней (5×10⁴ клеток/ячейка) для анализа активности CTL.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Индукция CTL прогнозированными пептидами из ТТК, ограниченными HLA-A*0201.

Индукцию CTL для пептидов, произведенных из ТТК, совершают в соответствии с протоколами, как описано в «Материалах и способах». Активность CTL, специфическую для пептидов, определяют интерферон-гамма ELISPOT анализом Фиг.1(а)-(j). Перечисленный далее ряд ячеек демонстрирует сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контрольными ячейками: ячейки #1 и #4, стимулированные TTK-A02-9-462 (SEQ ID NO:1) (a), #7 TTK-A02-9-630 (SEQ ID NO:2) (b), #5 TTK-A02-9-593 (SEQ ID NO:3) (c), #4, #5, #6 и #7 TTK-A02-9-719 (SEQ ID NO:6) (d), #5 и #7 TTK-A02-9-142 (SEQ ID NO:15) (e), #7 TTK-A02-9-146 (SEQ ID NO:19) (f), #5, #7 и #8 TTK-A02-9-564 (SEQ ID NO:20) (g), #1, #2 и #5 TTK-A02-10-462 (SEQ ID NO:22) (h), #2 TTK-A02-10-542 (SEQ ID NO:34) (i), и #2 TTK-A02-10-661 (SEQ ID NO:35) (j).

Создание линий CTL и клонов против ТТК специфических пептидов

Клетки, которые демонстрируют специфическую в отношении пептидов активность CTL, определяемую гамма-IFN ELISPOT анализом в ячейке #1, стимулированной TTK-A02-9-462 (SEQ ID NO:1) (a), #7 TTK-A02-9-630 (SEQ ID NO:2) (b), #5 TTK-A02-9-593 (SEQ ID NO:3) (c), #5 TTK-A02-9-719 (SEQ ID NO:6) (d), #5 TTK-A02-9-142 (SEQ ID NO:15) (e), и #2 TTK-A02-10-462 (SEQ ID NO:22) (f), размножают и создают линии CTL ограниченным разведением, как описано в «Материалах и способах». Активность CTL указанных линий CTL определяют IFN-гамма ELISA анализом (Фиг.2а-f). Все линии CTL демонстрируют сильную продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, подвергнутых обработке в импульсном режиме соответствующим пептидом.

Кроме того, клоны CTL создают ограниченным разведением из CTL линий, как описывают в «Материалах и способах», и определяют IFN-гамма ELISA анализом продукцию IFN-гамма CTL клонами против клеток-мишеней, подвергнутых обработке в импульсном режиме пептидом. Определяют сильную продукцию IFN-гамма CTL клонами, стимулированными ТТК-А02-9-593 (SEQ ID NO:3)(фиг.2g).

Специфическая активность CTL против клеток-мишеней, экспрессирующих ТТК и HLA-A*0201

Созданные линии CTL и клоны, провоцированные против каждого пептида, исследуют в отношении их способности распознавать клетки-мишени, которые экспрессируют ТТК и HLA-A*0201 молекулы. Специфическую CTL активность против COS7-клеток, которые трансфицируют обоими полноразмерными генами ТТК и HLA-А*0201 (специфическая модель для клеток-мишеней, которые экзогенно экспрессируют ТТК и HLA-A*0201 гены), исследуют, используя CTL линии и клоны, провоцированные соответствующим пептидом, в качестве эффекторных клеток. COS7-клетки трансфицируют или полноразмерными генами ТТК, или HLA-А*0201, получают в качестве контроля. На фиг.3 CTL линии и CTL клоны, стимулированные ТТК-А02-9-593 (SEQ ID NO:3), демонстрируют сильную CTL активность против COS7-клеток, экспрессирующих и ТТК, и HLA-А*0201 (а:линия, b:клон). С другой стороны, отсутствует специфическая активность CTL против контроля. Клон CTL, созданный ТТК-А02-9-593 (SEQ ID NO:3), также демонстрирует специфическую CTL-активность против опухолевой клеточной линии, эндогенно экспрессирующей и ТТК, и HLA-А*0201:Н1650 клетки (с). С другой стороны, отсутствует специфическая активность CTL против контролей: ТЕ1-клеток и РС3-клеток. Следовательно, приведенные данные демонстрируют, что пептиды А02-9-593 (SEQ ID NO:3) подвергаются эндогенной обработке и экспрессируются на клетках-мишенях HLA-A*0201-молекулой. А затем данный комплекс пептид-HLA распознается CTL. Приведенные результаты выявляют, что ТТК-А02-9-593 (SEQ ID NO:3) могут быть применены в качестве вакцин от рака для пациентов с ТТК экспрессирующими опухолями.

Гомологичный анализ пептидов-антигенов

CTL, стимулированные ТТК-А02-9-593 (SEQ ID NO:3), демонстрируют сильную и специфическую CTL-активность. Данный результат может быть следствием того факта, что последовательности ТТК-А02-9-593 (SEQ ID NO:3) являются гомологичными пептидам, произведенным из других молекул, о которых известно, что они сенсибилизируют иммунную систему человека. Для исключения указанной возможности выполняют анализ гомологий для перечисленных последовательностей пептидов, используя в качестве запроса алгоритм BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi), который выявляет отсутствие последовательности со значимой гомологией. Результаты анализа гомологий указывают, что последовательности ТТК-А02-9-593 (SEQ ID NO:3) уникальны, и, следовательно, имеется небольшая возможность, насколько авторам известно, что указанные молекулы вызывают незапланированные иммунологические реакции к некоторым неродственным молекулам.

В заключение, определили новый HLA-А02 эпитопный пептид, произведенный из ТТК, и продемонстрировали его применимость для иммунотерапии рака в качестве вакцин.

Справочный пример

Специфическая активность CTL против клеток-мишеней, экзогенно экспрессирующих ТТК и HLA-A*0201 [WO2008/102557]

Авторы изобретения испрашивают приоритет заявки, опубликованной как WO2008/102557, раскрывающей специфическую активность пептидов, индуцирующую CTL, которые получены из ТТК против клеток-мишеней, экзогенно экспрессирующих ТТК и HLA-A*0201 (фиг.4).

Установленные клоны CTL, выработанные против пептидов, исследуют в отношении их способности распознавать клетки-мишени, которые эндогенно экспрессируют ТТК и HLA-A*0201 молекулы. Специфическую CTL-активность против клеток COS7, трансфицированных обоими полноразмерными генами ТТК и HLA-А*0201, которые представляют собой специфическую модель клеток-мишеней, экзогенно экспрессирующих ТТК и HLA-A*0201 гены, исследуют, используя CTL клоны, выработанные к TTK-A2-9-462 (SEQ ID NO:1), TTK-A02-9-547 (SEQ ID NO:5), TTK-A2-9-719 (SEQ ID NO:6) и TTK-A2-10-462 (SEQ ID NO:22), в качестве эффекторных клеток. Клетки COS7, трансфицированные полноразмерными генами ТТК, но не полноразмерными HLA-А*0201, клетки COS7 трансфицированные HLA-А*0201, но не полноразмерными ТТК (или замещенные полноразмерным геном HIG2), и клетки COS7, трансфицированные HLA-А*0201 и подвергнутые импульсному воздействию различными целевыми эпитопными пептидами, получают в качестве контроля. Результаты демонстрируют, что клоны CTL, провоцированные против указанных пептидов, обладают специфической активностью CTL против клеток COS7, трансфицированных и ТТК, и HLA-А*0201 (фиг.4, соответствующая фиг.8b, c, d и е в WO2008/102557, включенной в настоящее описание ссылкой в полном объеме).

По сравнению с другими пептидами ТТК-А02-9-593(SEQ ID NO:3), идентифицированный в настоящем изобретении, обладает очевидной эффективной активностью, которая увеличена на один или два порядка по величине продукции INF-гамма (фиг.3). Следовательно, пептид по настоящему изобретению представляет собой перспективную цель для лечения, профилактики и/или предупреждения рака, включая, но не ограничиваясь перечисленным, рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рака желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек.

Промышленная применимость

Настоящее изобретение описывает новые ТАА, в частности происходящие из ТТК, которые вызывают сильные и специфические иммунные реакции и применяются при широком спектре типов рака. Указанные ТАА применяют в качестве пептидных вакцин против заболеваний, связанных со сверхэкспрессией ТТК, например при раке, примеры которого включают, но не ограничены перечисленным, рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек.

Хотя изобретение подробно описано и сделаны ссылки на специфические варианты осуществления изобретения, должно быть понятно, что вышеприведенное описание является примерным и пояснительным и предназначено иллюстрировать настоящее изобретение и его предпочтительные варианты осуществления. Специалисты в области техники понимают, что различные изменения и модификации могут быть выполнены, не выходя за рамки изобретения, которые определены формулой изобретения.