модифицированные сахариды, их конъюгаты и их изготовление

Формула изобретения

1. Модифицированный капсулярный сахарид, включающий часть, представленную формулой (I):



где:

А представляет собой -C(O)- или -OC(O)-

R¹ выбран из H или C₁-C ₆алкила;

L представляет собой группу С₁ -С₁₂алкилена;

М представляет собой замаскированную альдегидную группу, выбранную из



или

где:

R² выбран из Н, C ₁-C₁₂алкила, C₃-C₁₂циклоалкила, C₅-C₁₂арила или C₅-C₁₂ арил-C₁-C₆ алкила;

X и Y являются одинаковыми или разными и независимо выбраны из О или S;

R³ и R⁴ независимо выбраны из C₁ -C₁₂алкила, C₃-C₁₂циклоалкила, C₅-C₁₂арила или C₅-C₁₂ арил-C₁-C₆алкила; R³ и R ⁴ соединены с образованием C₃, C₄ , C₅, C₆, C₇ или C₈ циклоалкильного кольца, содержащего гетероатомы X и Y;

R⁵ и R⁶ независимо выбраны из H, C ₁-C₁₂алкила, C₃-C₁₂циклоалкила, C₅-C₁₂арила или C₅-C₁₂ арил-C₁-C₆алкила; или R⁵ и R ⁶ соединены с образованием C₃ или C₁₂ циклоалкильного кольца;

R⁹ и R¹⁰ независимо выбраны из H, C₁-C₁₂алкила, C₃-C₁₂циклоалкила, C₅-C ₁₂арила или C₅-C₁₂арил-C₁ -C₆алкила; или R⁹ и R¹⁰ соединены с образованием C₃-₁₂ циклоалкильного кольца; и

R⁷ и R⁸ независимо выбраны из C₁-C₁₂алкильной или C₃-C ₁₂ циклоалкильной групп.

2. Модифицированный капсулярный сахарид, включающий часть, представленную формулой (II):



где A, R¹ и L имеют значения, определенные в п.1.

3. Сахарид формулы:



где:

Т имеет формулу (А) или (В):



n представляет собой целое число от 1 до 100;

каждая группа Z независимо выбрана из -OH, -OAc, OC(O)N(R ¹)-L-M или -OC(O)N(R¹)-L-C(O)H;

каждая группа Q независимо выбрана из -OH, -OAc, OC(O)N(R¹ )-L-M или -OC(O)N(R¹)-L-C(O)H;

W выбрана из -OH, -OAc, -OC(O)N(R¹)-L-M или -OC(O)N(R¹ )-L-C(O)H;

V представляет собой -N(R¹)-L-M или -N(R¹)-L-C(О)Н;

где R1, L и М имеют значения, определенные в п.1, и при условии, что сахарид включает по меньшей мере одну часть формулы -N(R¹)-L-M, -N(R¹ )-L-C(O)H, -ОС(О)N(R¹)-L-M или -ОС(О)N(R¹ )-L-С(О)Н.

4. Способ модификации капсулярного сахарида, включающий стадии:

(a) получения капсулярного сахарида, имеющего гидроксильную группу;

(b) взаимодействия гидроксильной группы с бифункциональным реагентом в органическом растворителе;

(c) взаимодействия продукта стадии (b) с амино-соединением формулы (III):



где R¹, L и M имеют значения, определенные в п.1, причем бифункциональный реагент выбран из 1,1 -карбонилдиимидазола, карбонилди-1,2,4-триазола, карбонилди-1,2,3-бензотриазола, дифенилкарбоната, бромида цианогена, фосгена или трифосгена.

5. Способ модификации сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, включающий стадии:

(a) получения сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А;

(b) взаимодействия гидроксильной группы на сахариде с 1,1 -карбонилдиимидазолом (CDI) в растворителе диметилсульфоксиде (DMSO);

(c) взаимодействия продукта стадии (b) с H ₂N(CH₂)₃CH(OH)СН₂ОН.

(d) расщепления продукта стадии (с) перйодатом, с получением, таким образом, альдегидного соединения; и

(e) связывания альдегидного соединения стадии (d) с бактериальным токсином или токсоидом реакцией восстановительного аминирования с использованием NaBH₃CN.

6. Конъюгат сахарида-белка, где сахаридная и белковая части связаны посредством группы формулы (IV):



где A, R¹ и L имеют значения, определенные в п.1.

7. Конъюгат сахарида-белка по п.6, где R1 представляет собой Н, А представляет собой -ОС(О)- и L представляет собой -(СН₂)₄-.

8. Фармацевтическая композиция для усиления реакции антител, включающая (а) конъюгат сахарида-белка по любому из пп.6 или 7 и/или модифицированный сахарид по любому из пп.1 или 2, и (b) фармацевтически приемлемый носитель.

9. Способ усиления реакции антител у млекопитающего, включающий введение млекопитающему фармацевтической композиции по п.8.

10. Применение конъюгата по любому из пп.6 или 7 при изготовлении лекарственного средства для профилактики или лечения заболевания, вызванного одной или несколькими инкапсулированными бактериями.

Описание изобретения к патенту

Все приведенные в настоящем описании документы полностью включены в него в качестве ссылки.

Область техники

Изобретение лежит в области химии сахаридов и относится к модифицированным сахаридам, способам их получения и конъюгированным производным. В частности, оно относится к модифицированным сахаридам, имеющим часть линкера, которую можно использовать для соединения сахарида с белком.

Предшествующий уровень техники

Полисахариды представляют собой важные биологические молекулы, и они широко использовались в фармацевтической промышленности для профилактики и лечения заболеваний. Например, капсулярные полисахариды использовались в течение многих лет в вакцинах против инкапсулированных бактерий, таких как менингококк (Neisseria meningitides), пневмококк (Streptococcus pneumoniae) и Hib (Haemophilus influenzae типа В).

Для усиления иммуногенности этих полисахаридов, в частности, у детей были разработаны конъюгатные вакцины. Они включают капсулярные полисахариды, конъюгированные с белком-носителем [например, патенты США № № 4711779, 4761283 и 4882317]. Конъюгированная молекула может включать полисахарид и белок, связанные непосредственно, или полисахарид и белок могут быть связаны посредством части линкера.

Хотя были разработаны различные типы частей линкера, существует необходимость в новых типах линкера, которые являются разносторонними, и которые можно соединить с полисахаридом и белком с использованием простого, надежного химического способа. Кроме того, существует необходимость в новых линкерах, которые являются нетоксичными и которые могут быть образованы в мягких условиях, без использования грубых реагентов, таких как сильные кислоты и основания.

Описание изобретения

Модифицированные сахариды по изобретению

Изобретение относится к модифицированному капсулярному сахариду, включающему часть формулы (I):

-A-N(R ¹)-L-M (I)

где:

А представляет собой связь, -С(О)- или -ОС(О)-

R¹ выбран из Н или С₁-С₆ алкила;

L представляет собой группу С₁-С₁₂ алкилена;

М представляет собой замаскированную альдегидную группу.

Термин «модифицированный капсулярный сахарид» означает сахарид, который можно получить из нативного капсулярного сахарида подходящей модификацией. Следовательно, основная последовательность повторяющихся моносахаридных единиц в нативном капсулярном сахариде сохраняется в модифицированных капсулярных сахаридах согласно настоящему изобретению.

Термин «сахарид» охватывает и олигосахариды (например, содержащие от 2 до 39 моносахаридных единиц) и полисахариды (например, содержащие 40 или более моносахаридных единиц). Как естественно обнаруживаемые в бактериях, нативные капсулярные сахариды в целом принимают форму полисахаридов. Полисахаридами можно манипулировать для получения более коротких олигосахаридов. Олигосахариды можно получить очисткой и/или классификацией по размерам нативного полисахарида (например, гидролизом в слабой кислоте, нагреванием, классифицирующей по размерам хроматографией и т.д.).

Обычно, модифицированные сахариды согласно изобретению представляют собой олигосахариды. Олигосахариды можно получить из полисахаридов любыми способами классификации по размерам, описанным выше.

Модифицированные капсулярные сахариды по изобретению можно получить из нативных капсулярных сахаридов. Однако настоящее изобретение не ограничивается модифицированными сахаридами, полученными из нативных капсулярных сахаридов. Модифицированные капсулярные сахариды по изобретению можно получить другими способами, такими как полный или частичный синтез.

В модифицированных капсулярных сахаридах по изобретению часть формулы (I) можно получить из не концевой гидроксильной группы капсулярного сахарида или из концевой аномерной гидроксильной группы капсулярного сахарида.

Когда часть формулы (I) получена из аномерной гидроксильной группы, она предпочтительно заменяет аномерную гидроксильную группу, например, реакцией восстановительного аминирования. Реакции восстановительного аминирования на концевых гидроксильных группах сахарида хорошо известны в данной области.

Когда часть формулы (I) получена из не концевой гидроксильной группы, она предпочтительно связана с не концевой гидроксильной группой посредством, например, карбаматной группы. Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления модифицированный капсулярный сахарид по изобретению включает часть формулы (Iа):

-OC(O)N(R ¹)-L-M (Ia)

где R¹, L и М имеют значения, определенные выше.

Такие соединения можно получить дериватизацией свободной гидроксильной группы на сахариде, например, CDI, а затем взаимодействием карбаматного промежуточного соединения с амином формулы: HN(R¹)-L-M

Предпочтительно, R¹ представляет собой Н. Предпочтительно, L представляет собой группу С₁ -С₁₂ алкилена. Предпочтительнее, L представляет собой -СН₂СН₂СН₂-. Группа L действует в качестве вставки, когда часть формулы (I) используется для соединения капсулярного сахарида с белком в сахаридно-белковом конъюгате. Обнаружено, что группа вставки между сахаридом и белком улучшает устойчивость конъюгата.

Специалисту должны быть известны множественные различные функциональности, которые можно легко превратить в альдегидную группу. Любая такая функциональность могла бы подойти в виде замаскированной альдегидной группы М. Предпочтительно, замаскированная альдегидная группа М выбрана из

где:

R² выбран из Н, С₁-С₁₂ алкила, С₃-С ₁₂ циклоалкила, С₅-С₁₂ арила или С₅-С₁₂ арил-С₁-С₆ алкила (предпочтительно, R² не представляет собой Н);

Х и Y являются одинаковыми или разными и независимо выбраны из О или S;

R³ и R⁴ независимо выбраны из С₁-С₁₂ алкила, С ₃-С₁₂ циклоалкила, С₅-С₁₂ арила или С₅-С₁₂ арил-С₁-С ₆ алкила; R³ и R⁴ соединены с образованием С₃, С₄, С₅, С₆, С ₇ или С₈ циклоалкильного кольца, содержащего гетероатомы Х и Y;

R⁵ и R⁶ независимо выбраны из Н, С₁-С₁₂ алкила, С₃-С₁₂ циклоалкила, С₅-С ₁₂ арила или С₅-С₁₂ арил-С₁ -С₆ алкила; или R⁵ и R⁶ соединены с образованием С₃ или С₁₂ циклоалкильного кольца;

R⁹ и R¹⁰ независимо выбраны из Н, С₁-С₁₂ алкила, С₃ -С₁₂ циклоалкила, С₅-С₁₂ арила или С₅-С₁₂ арил-С₁-С₆ алкила; или R⁹ и R¹⁰ соединены с образованием С₃-₁₂ циклоалкильного кольца; и

R⁷ и R⁸ независимо выбраны из С₁ -С₁₂ алкильной или С₃-С₁₂ циклоалкильной групп.

Термин «алкил» используется в настоящем описании для обозначения алкильных групп и в прямой, и в разветвленной формах. Алкильная группа может быть прервана 1, 2 или 3 гетероатомами, выбранными из -О-, -NH- или -S-. Алкильная группа может быть также прервана 1, 2 или 3 двойными и/или тройными связями. Однако термин «алкил» обычно относится к алкильным группам, не имеющим гетероатомных прерываний или прерываний двойными или тройными связями. Когда делается ссылка на С₁-С ₁₂ алкил, это значит, что алкильная группа может содержать любое количество атомов углерода от 1 до 12 (например, С ₁, С₂, С₃, С₄, С₅ , С₆, С₇, С₈, С₉, С₁₀, С₁₁, С₁₂). Аналогичными образом, когда делается ссылка на С₁-С₆ алкил, это значит, что алкильная группа может содержать любое количество атомов углерода от 1 до 6 (например, С₁ , С₂, С₃, С₄, С₅, С₆).

Термин «алкилен» используется в настоящем описании для обозначения алкильных групп и в прямой, и в разветвленной формах. Алкиленовая группа может быть прервана 1, 2 или 3 гетероатомами, выбранными из -О-, -NH- или -S-. Алкиленовая группа может быть также прервана 1, 2 или 3 двойными и/или тройными связями. Однако термин «алкилен» обычно относится к алкиленовым группам, не имеющим гетероатомных прерываний или прерываний двойными или тройными связями. Когда делается ссылка на С₁-С₁₂ алкилен, это значит, что алкиленовая группа может содержать любое количество атомов углерода от 1 до 12 (например, С₁, С₂, С₃, С₄, С₅, С₆, С₇, С ₈, С₉, С₁₀, С₁₁, С ₁₂). Аналогичными образом, когда делается ссылка на С ₁-С₆ алкилен, это значит, что алкиленовая группа может содержать любое количество атомов углерода от 1 до 6 (например, С₁, С₂, С₃, С₄, С ₅, С₆).

Термин «циклоалкил» включает циклоалкильную, полициклоалкильную и циклоалкенильную группы, а также комбинации указанных групп с алкильными группами, такими как циклоалкилалкильные группы. Циклоалкильная группа может быть прервана 1, 2 или 3 гетероатомами, выбранными из -О-, -NH- или -S-. Однако термин «циклоалкил» обычно относится к циклоалкильным группам, не имеющим гетероатомных прерываний. Примеры циклоалкильных групп включают циклопентильную, циклогекисльную, циклогексилметильную и адамантильную группы. Когда делается ссылка на С₃-С₁₂ циклоалкил, это значит, что циклоалкильная группа может содержать любое количество атомов углерода от 3 до 12 (например, С₃, С₄, С₅, С₆, С₇, С₈, С₉, С ₁₀, С₁₁, С₁₂).

Термин «арил» используется в настоящем описании для обозначения ароматической группы, содержащей углерод и водород, такой как фенил или нафтил. Когда делается ссылка на С₅-С ₁₂ арил, это значит, что арильная группа может содержать любое количество атомов углерода от 5 до 12 (например, С ₅, С₆, С₇, С₈, С₉ , С₁₀, С₁₁, С₁₂).

Термин «С₅-С₁₂ арил-С₁-С ₆ алкил» относится к таким группам, как бензил, фенилэтил и нафтилметил. Предпочтительно, замаскированный альдегид представляет собой -СН(ОН)СН₂ОН. Предпочтительно, модифицированный капсулярный сахарид по изобретению включает часть формулы -NH(CH ₂)₃CH(OH)CH₂ОH, предпочтительнее, -ОС(О)NH(CH₂)₃CH(OH)CH₂ОH.

Настоящее изобретение относится к соединениям, имеющим замаскированную альдегидную группу. Использование замаскированного альдегида предотвращает нежелательные побочные реакции во время модификации капсулярного сахарида. Более того, когда выявляется альдегидная группа, ее можно использовать для соединения восстановительным аминированием, например, с аминогруппой на белке.

В целом, часть формулы (I) или (Ia) выполняет функцию обеспечения «рукоятки» для последующего взаимодействия с аминогруппой белка. Следовательно, часть формулы (I) или (Ia) обычно используется для образования группы линкера в конъюгате сахарида-белка.

Однако часть формулы (I) или (Ia), предпочтительно (Ia), можно использовать в качестве блокирующей группы для стабилизации сахарида против разложения, особенно разложения кислотным гидролизом. Это дальнейшее использование части формулы (Ia) может осуществляться в качестве альтернативы или дополнения к ее использованию в качестве группы линкера. Использование блокирующих групп для стабилизации капсулярных сахаридов описано в международной патентной заявке PCT/IB03/01436.

Когда часть формулы (Ia) используют в качестве стабилизирующей блокирующей группы, модифицированный сахарид предпочтительно имеет более чем одну из указанных частей для обеспечения стабилизирующего эффекта. Например, все или по существу все моносахаридные единицы в модифицированном сахариде могут иметь блокирующую группу, включающую группу формулы (Ia). Альтернативно, по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% моносахаридных единиц могут иметь блокирующую группу, включающую группу формулы (I). По меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 моносахаридных единиц в модифицированном сахариде могут иметь блокирующие группы.

Аналогичным образом, количество блокирующих групп на каждой моносахаридной единице может варьировать. Например, количество блокирующих групп на каждой моносахаридной единице может составлять 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно, от 1 до 4 и более предпочтительно, 1 или 2.

Предпочтительно, модифицированный сахарид по изобретению включает часть формулы (I) или (Ia), которая затем превращается в альдегид. Следовательно, настоящее изобретение, кроме того, относится к модифицированному сахариду, включающему часть формулы (II) или (IIa):

-A-N(R¹)-L-C(O)H (II)

-OC(O)N(R ¹)-L-C(O)H (IIa)

где А, R¹ и L имеют значения, определенные выше.

Превращение замаскированных альдегидов формулы (I) или (Ia) в альдегиды формулы (II) или (IIa) включает простой синтетический этап. Например, диолы могут быть превращены в альдегиды окислительным расщеплением (например, NaIO₄, Pb(OAc)₄ и т.д.); спирты могут быть превращены в альдегиды окислением (например, окислением Сверна, окислением Десс-Мартина, окислением Cr^VI и т.д.); алкены могут быть превращены в альдегиды окислительным расщеплением двойной связи (например, озонолизисом с последующей восстановительной обработкой, OsO₄/NaIO₄ , OsO₄/Pb(OAc)₄, и т.д.); ацетали могут быть превращены в альдегиды гидролизом кислот; тиоацетали могут быть превращены в альдегиды координацией металлов, алкилированием или окислением (например, Hg^II, Ag^I, Ag ^II, Cu^II, MeI, N-бромсукцинимид и т.д.); сложные карбоновые эфиры, циано соединения и амиды Вайнреба могут быть превращены в альдегиды подходящим восстановлением (например, NaBH₄, DIBAL и т.д.).

Предпочтительно, замаскированный альдегид М имеет формулу -CH(OH)CH₂ ОH. Этот диол может быть преимущественно превращен в соответствующий альдегид с использованием слабого перйодатного окисляющего вещества. Было обнаружено, что перйодатные окислители, такие как NaIO ₄, избирательно образуют альдегид без воздействия на другие чувствительные функциональности на капсулярном сахариде.

Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления модифицированный сахарид включает часть формулы: -NH(CH₂)₃ CH(O)H, более предпочтительно, -ОС(О)NH(CH₂)₃ C(O)H.

Конъюгаты сахарида-белка

Модифицированный сахарид, включающий часть формулы (II) или (IIa), можно использовать для соединения сахарида с белком-носителем. Соединение предпочтительно осуществляется посредством восстановительного аминирования аминогруппы на белке альдегидной группой на модифицированном сахариде, включающем часть формулы (II) или (IIa). Реакции восстановительного аминирования хорошо известны как надежный способ соединения сахаридов и белков. Обычно реакцию выполняют с использованием NaBH ₃CN, хотя можно также использовать подходящие восстановители.

Соответственно, настоящее изобретение относится к конъюгату сахарида-белка, где сахаридная и белковая части связаны посредством группы формулы (IV) или, предпочтительно, (IVa):

-A-N(R¹)-L-NH- (IV)

-OC(O)N(R ¹)-L-NH- (IVa)

где А, R¹ и L имеют значения, определенные выше. Предпочтительно, L представляет собой -(СН₂)₄- в конъюгатах по изобретению. В предпочтительном варианте осуществления сахаридная и белковая части связаны группой формулы -OC(O)NH-(CH₂)₄ -NH-. -NH обычно получают из существующей аминогруппы на белке, например, в лизиновом остатке.

В конъюгате сахарида-белка по изобретению белок представляет собой предпочтительно бактериальный токсин или токсоил, предпочтительнее, дифтерийный или столбнячный токсин или токсоид. Они обычно используются в конъюгатных вакцинах. Особенно предпочтителен дифтерийный токсоид CRM₁₉₇ [1]. Другие подходящие белки-носители включают белок наружной оболочки N.meningitidis [2], синтетические пептиды [3,4], белки теплового шока [5,6], белки коклюшного возбудителя [7, 8], белок D из H.influenzae [9], цитокины [10], лимфокины [10], гормоны [10], ростовые факторы [10], токсин А или В из C.difficile [11], захватывающие железо белки [12] и т.д. Возможно использование смесей белков-носителей.

После конъюгации свободные и конъюгированные сахариды можно разделить. Существует много подходящих способов, включая гидрофобную хроматографию, тангенциальную ультрафильтрацию, диафильтрацию и т.д. [см. также ссылки 13, 14 и т.д.].

Один белок-носитель может нести множество различных сахаридов [15].

Модифицированные сахариды Neisseria meningitidis серогруппы А

Во всех описанных выше вариантах осуществления модифицированный капсулярный сахарид представляет собой предпочтительно сахарид Neisseria meningitidis. Более предпочтительно, модифицированный капсулярный сахарид представляет собой модифицированный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы А.

Сахарид Neisseria meningitidis серогруппы А имеет следующую структуру:

Соответственно, настоящее изобретение относится к сахариду формулы:

где:

Т имеет формулу (А) или (В):

n представляет собой целое число от 1 до 100;

каждая группа Z независимо выбрана из -OH, -OAc, -OC(O)N(R¹)-L-M или -OC(O)N(R¹ )-L-C(O)H;

каждая группа Q независимо выбрана из -OH, -OAc, -OC(O)N(R¹)-L-M или -OC(O)N(R¹ )-L-C(O)H;

W выбрана из -OH, -OAc, -OC(O)N(R ¹)-L-M или -OC(O)N(R¹)-L-C(O)H (предпочтительно, W представляет собой ОН);

V представляет собой -N(R¹)-L-M или -N(R¹)-L-C(O)H;

где R¹, L и М имеют значения, определенные выше, и при условии, что сахарид включает по меньшей мере одну часть формулы -N(R¹)-L-M, -N(R¹)-L-C(O)H, -OC(O)N(R ¹)-L-M или -OC(O)N(R¹)-L-C(O)H.

Предпочтительно, n представляет собой целое число от 15 до 25.

Предпочтительно, Т имеет формулу (А). Предпочтительно, сахарид включает по меньшей мере одну часть формулы -OC(O)N(R ¹)-L-M или -OC(O)N(R¹)-L-C(O)H.

Предпочтительно, Q и Z представляют собой смесь групп ОН и ОАс по существу в таких же пропорциях как в нативном сахариде Neisseria meningitidis серогруппы А, за исключением того, что одна из групп Q или Z, предпочтительно, одна из групп Q, представляет собой-OC(O)N(R ¹)-L-M или -OC(O)N(R¹)-L-C(O)H.

Способ получения модифицированных сахаридов

Изобретение, кроме того, относится к способу модификации капсулярного сахарида, включающему стадии:

(а) получения капсулярного сахарида, имеющего гидроксильную группу;

(b) взаимодействия гидроксильной группы с бифункциональным реагентом в органическом растворителе;

(с) взаимодействия продукта этапа (b) с амино соединением формулы (III):

HN(R ¹)-L-M (III)

где R¹, L и М имеют значения, определенные выше.

Капсулярный сахарид может представлять собой нативный капсулярный сахарид (олигосахарид или полисахарид). Альтернативно, капсулярный сахарид может представлять собой, например, де-О-ацетилированный капсулярный сахарид, блокированный капсулярный сахарид (как описано в PCT/IB03/01436) или капсулярный сахарид, имеющий концевую аминогруппу (например, полученный восстановительным аминированием).

Термин «бифункциональный реагент» означает любой реагент, который способен выполнять двойные функции (i) предоставления первого электрофильного атома углерода для соединения с гидроксильной группой (группами) на сахариде; и (ii) предоставления второго электрофильного атома углерода для соединения с аминогруппой на этапе (b20. В целом, второй электрофильный атом углерода регенерируется из первого электрофильного атома углерода в течение этапа (b). Бифункциональный реагент предоставляет связь -С(О)- между полисахаридом и амино соединением.

Бифункциональные реагенты для использования в настоящем изобретении включают, но не ограничиваются, 1,1'-карбонилдиимидазол (CDI), карбонилди-1,2,4-триазол (CDT), карбонилди-1,2,3-бензотриазол (CDB), дифенилкарбонат, бромид цианогена, фосген или трифосген. Специалисту известны другие бифункциональные реагенты, которые могут выполнять такую же функцию, как указанные реагенты. Предпочтителен CDI, потому что он представляет собой особенно слабый реагент и не вызывает генерации сильно кислотных газов, таких как HCl или HBr.

Предпочтительно, органический растворитель представляет собой апротонный растворитель. Апротонные растворители хорошо известны специалисту в данной области, и они не содержат никаких ионизируемых атомов водорода. Указанные растворители имеют преимущество, потому что они содействуют взаимодействию гидроксильной группы (групп) на сахариде с бифункциональным реагентом усилением нуклеофильности гидроксильной группы (групп). Подходящие апротонные растворители включают, но не ограничиваются, диметилсульфоксид (DMSO), диметилформамид (DMF), формамид, гексаметилфосфорамид (HMPA), гексаметилфосфортриамид (HMPT), 1,3-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2(1Н)-пиримидинон (DMPU) или диметилацетамид (DMAC). Предпочтителен DMSO.

На указанной выше стадии (с) промежуточное карбаматное соединение, генерированное после стадии (b), взаимодействует с амином формулы (III). Предпочтительно, амин формулы (III) представляет собой трис-нуклеофильный H₂N (CH₂)₃ CH(OH)CH₂ОH.

Предпочтительный способ согласно изобретению проиллюстрирован на схеме 1 ниже:

На схеме 1 сахарид (например, полисахарид или олигосахарид Men A) сначала активируется посредством одной из его гидроксильных групп с использованием растворителя CDI в DMSO. Полученный карбамат имидазола захватывается трис-нуклеофильным H₂N(CH₂)₃CH(OH)CH₂ ОH для получения модифицированного сахарида, имеющего замаскированную альдегидную функциональность. На фиг. 2 показана стадия активации для сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А.

Модифицированные сахариды могут альтернативно получены в одностадийном способе взаимодействием одной или нескольких гидроксильных групп на капсулярном сахариде с реагентом формулы XC(O)N(R¹ )-L-M, где Х представляет собой уходящую группу, а R¹ , L и М представляют собой, как определено выше. Подходящие уходящие группы включают, но не ограничиваются, -Cl, -Br, -CF₃ , -OC₆H₅ или -CCl₃.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу модификации сахарида, как описано выше, который дополнительно включает стадии (d) демаскировки замаскированной альдегидной группы М, с получением, таким образом, альдегидного соединения; и (е) соединения альдегидного соединения с белком реакцией восстановительного аминирования. В этом способе замаскированная альдегидная группа М представляет собой предпочтительно -СН(ОН)СН₂ОН, стадия демаскировки представляет собой предпочтительно расщепление перйодата, а восстанавливающее вещество в реакции восстановительного аминирования представляет собой предпочтительно NaBH₃ CN. Предпочтительный вариант осуществления показан на фиг. 1. На фиг. 1 PS представляет полисахарид или олигосахарид, полученный из нативного сахарида Neisseria meningitides серогруппы А.

Фармацевтические композиции и способы

Изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей (а) модифицированный сахарид по изобретению и/или конъюгат по изобретению и (b) фармацевтически приемлемый носитель.

Когда присутствует конъюгат, композиция может также включать свободный белок-носитель [16].

«Фармацевтически приемлемые носители» включают любой носитель, который сам не вызывает продукцию антител, вредных для отдельного получения композиции. Подходящие носители представляют собой обычно крупные, медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, трегалозно- [17] липидные агрегаты (такие как масляные капельки или липосомы) и неактивные вирусные частицы. Такие носители хорошо известные специалистам в данной области. Вакцины могут также содержать растворители, такие как вода, солевой раствор, глицерин и т.д. Кроме того, могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие вещества, буферные вещества, стабилизирующие рН, и им подобные вещества. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых эксципиентов имеется в Remington^,s Pharmaceutical Sciences e.g. the 2000 edition (ISBN:0683306472).

Обычно композиции получают в виде средств для инъекций, или в виде жидких растворов, или суспензий; можно также получать твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Препарат может также эмульгироваться или инкапсулироваться в липосомы для усиления адъювантного эффекта. Прямая доставка композиций в целом будет осуществляться парентерально (например, инъекцией, или подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно или внутримышечно, или доставлено в интерстициальное пространство ткани). Композиции можно также вводить в очаг поражения. Другие пути введения включают пероральное и легочное введение, ректальное (суппозитории), и трансдермальные или чрескожные пути применения [например, ссылка 18], иглы и гипоспреи. Курсовые дозы лечения могут представлять собой схему с введением одной дозы или множественных доз (например, включая дозы повторной вакцинации).

Композиция по изобретению является предпочтительно стерильной, забуференной и/или свободной от пирогенов.

Композиция представляет собой иммуногенную композицию (например, вакцину). Вакцины, основанные на сахаридах или сахаридно-белковых конъюгатах, хорошо известны в данной области.

Иммуногенные композиции включают иммунологически эффективное количество сахаридного антигена, а также любой другой из других определенных компонентов, если необходимо. Под «иммунологически эффективным количеством» подразумевается, что введение указанного количества индивидууму или в одной дозе, или в виде части серии, эффективно для лечения или профилактики заболевания. Это количество варьирует в зависимости от здоровья и физического состояния пациента, возраста, таксономической группы пациента (например, не человекообразного примата, примата и т.д.), способности иммунной системы пациента синтезировать антитела, степени необходимой защиты, состава вакцины, оценки медицинской ситуации лечащим врачом и других релевантных факторов. Ожидается, что количество подпадет под относительно широкий диапазон, который можно определить посредством обычных испытаний. Дозировка лечения может представлять собой схему с однократной дозой или схему с множеством доз (например, включая повторные иммунизации). Вакцину можно вводить в сочетании с другими иммунорегуляторными средствами.

Иммуногенная композиция может включать адъювант. Предпочтительные адъюванты для усиления эффективности композиции включают, но не ограничиваются: (А) соединения алюминия (например, гидроокись алюминия, фосфат алюминия, гидроксифосфат алюминия, оксигидроокись, ортофосфат, сульфат и т.д. [например, главы 8 и 9 ссылки 19]), или смеси соединений алюминия с соединениями, принимающими любую подходящую форму (например, гелевую, кристаллическую, аморфную и т.д.) и с предпочтительным поглощением; (В) MF59 (5% Squalene, 0,5% Tween 80 и 0,5% Span 85, составленные в субмикронные частицы с использованием микрофлюидизаторов) [см. главу 10 ссылки 19; см. также ссылку 20]; (С) липосомы [см. главы 13 и 14 ссылки 19]; (D) ISCOM [см. главу 23 ссылки 19], которые могут быть лишены дополнительного детергента [21]; (E) SAF, содержащий 10% Squalane, 0,4% Tween 80, 5% плюроник-блокполимер L121 и thr-MDP, или микрофлюидизированный в субмикронную эмульсию, или перемешанный в вихревой мешалке для создания эмульсии с частицами большего размера [см. главу 12 ссылки 19]; (F) систему адъюванта Ribi^TM (RAS), (Ribi Immunochem), содержащую 2% Squalane, 0,2% Tween 80, и один или несколько компонентов стенок бактериальных клеток из группы, состоящей из монофосфорилипида А (MPL), димиколата трегалозы (TDM) и каркаса клеточной стенки (CWS), предпочтительно, MPL+CWS (Detox^TM); (G) адъюванты сапонина, такие как QuilA или QS21 [см. главу 22 ссылки 19], также известные как Stimulon ^TM; (H) хитосан [например, 22]; (I) полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA); (J) цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 и т.д.), интерфероны (например, интерферон- ), фактор, стимулирующий колонии макрофагов, фактор опухолевого некроза и т.д. [см. главы 27 и 28 ссылки 19]; (К) микрочастицы (т.е., частицы диаметром от ~100 нм до ~150 мкм, предпочтительнее, диаметром от ~200 нм до ~30 мкм, а наиболее предпочтительно, диаметром от ~500 нм до ~10 мкм), образованные из материалов, которые являются биологически разлагаемыми и нетоксичными (например, поли( -гидроксикислота), полигидроксимасляная кислота, сложный полиортоэфир, полиангидрид, поликапролактон и т.д.); (L) монофосфориллипид А (MPL) или 3-О-деацилированный MPL (3dMPL) [например, глава 21 ссылки 19]; (М) комбинации 3dMPL, например, с QS21 и/или эмульсиями масла в воде [23]; (N) олигонуклеотиды, включающие мотивы CpG [24], т.е., содержащие по меньшей мере один динуклеотид CG при 5-метилцитозине, необязательно используемом вместо цитозина; (О) простой полиоксиэтиленовый эфир или сложный полиоксиэтиленовый эфир [25]; (P) поверхностно-активный сложный полиоксиэтиленовый эфир сорбитана в комбинации с октоксинолом [26] или поверхностно-активный простой или сложный полиоксиэтиленалкиловый эфир в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным не ионным поверхностно-активным веществом, таким как октоксинол [27]; (Q) иммуностимулирующий олигонуклеотид (например, олигонуклеотид CpG) и сапонин [28]; (R) иммуностимулятор и частицу соли металла [29]; (S) сапонин и эмульсию масла в воде [30]; (Т) сапонин (например, QS21)+3dMRL+ IL-12 (необязательно + стерин) [31}; (U) термолабильный энтеротоксин E.coli ( LT ) или его детоксифицированные мутанты, такие как мутанты К63 или R72 [например, глава 5 ссылки 32]; (V) холерный токсин («СТ») или его детоксифицированные мутанты [например, глава 5 ссылки 32]; (W) двухнитевую РНК; (X) имитаторы монофосфорилового липида А, такие как производные фосфата аминоалкилглюкозаминида, например, RC-529 [33]; (Y) полифосфазен (РСРР); или (Z) биоадгезивное вещество [34], такое как микросферы эстерифицированной гиалуроновой кислоты [35] или мукоадгезивное вещество, выбранное из группы, состоящей из поперечно сшитых производных поли(акриловой кислоты), поливинилового спирта, поливинилпирролидона, полисахаридов и карбоксиметилцеллюлозы. Можно также использовать другие вещества, которые действуют в качестве иммуностимулирующих средств для усиления эффективности композиции [например, см. главу 7 ссылки 19]. Соли алюминия (особенно, фосфаты и/или гидроокиси алюминия) представляют собой предпочтительные адъюванты для парентеральной иммунизации. Мутантные токсины представляют собой адъюванты слизистой оболочки.

Мурамилпептиды включают N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетилнормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин MTP-PE) и т.д.

После составления композиции по изобретению можно вводить непосредственно пациенту. Пациенты могут представлять собой животных; в частности, можно лечить людей. Вакцины особенно полезны для вакцинации детей и подростков.

Вакцины в соответствии с изобретением могут быть или профилактическими (т.е. для предотвращения инфекции), или терапевтическими (т.е. для лечения заболевания после инфекции), но обычно являются профилактическими.

Так же, как модифицированные сахариды, композиция может включать дополнительные антигенные компоненты. Например, композиция может включать один или несколько дополнительных сахаридов (или модифицированных в соответствии с изобретением, или нет). Например, композиция может включать сахариды из серогрупп С, W135 и Y N.meningitidis (например, в дополнение к модифицированному сахариду MenA). Они обычно должны быть конъюгированы с белками-носителями, и сахариды из различных серогрупп N.meningitidis могут быть конъюгированы с одними и теми же или разными белками-носителями. Когда смесь включает капсулярные сахариды из обеих серогрупп А и С, предпочтительно, чтобы соотношение (масс./масс.) сахарида MenA:сахарида MenC составляет более чем 1 (например, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 или выше). Улучшенная иммуногенность компонента MenA наблюдалась, когда он присутствовал в избытке (масса/доза) относительно компонента MenC.

Композиция может также включать белковые антигены.

Антигены, которые могут быть включены в композицию по изобретению, включают:

- антигены из Helicobacter pylori, такие как CagA [36 to 39], VacA [40, 41], NAP [42, 43, 44], HopX [e.g.45], Hop Y [e.g. 45] и/или уреаза.

- белковый антиген из N.meningitidis серогруппы В, такой как антигены в ссылках 46-52, причем особенно предпочтителен белок '287' (см. ниже) и производные (например, ' G287').

- препарат пузырьков наружной оболочки (OMV) из N.meningitidis серогруппы В, таких как описанные в ссылках 53, 54, 55, 56 и т.д.

- сахаридный антиген из N.meningitidis серогруппы С, такой как олигосахарид, раскрытый в ссылке 57 из серогруппы С [см. также ссылку 58].

- сахаридный антиген из Streptococcus pneumoniae [например, 59, 60, 61].

- антиген из вируса гепатита А, такой как инактивированный вирус [например, 62, 63].

- антиген из вируса гепатита В, такой как поверхностные и/или сердцевинные антигены [например, 63, 64].

- антиген из вируса гепатита С [например, 65].

- антиген из Bordetella pertussis, такой как коклюшный голотоксин (РТ) и нитевидный гемагглютинин (FHA) из B.pertussis, необязательно также в комбинации с пертактином и/или агглютиногенами 2 и 3 [например, ссылки 66 и 67].

- дифтерийный антиген, такой как дифтерийный токсоид [например, глава 3 ссылки 68], например, мутант CRM₁₉₇ [например, 69].

- столбнячный антиген, такой как столбнячный токсоид [например, глава 4 ссылки 68].

- сахаридный антиген из Haemophilus influenzae B [например, 58].

- антиген из N.gonorrhoeae [например, 46, 47, 48].

- антиген из Chlamydia pneumoniae [например, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76].

- антиген из Chlamydia trachomatis [например, 77].

- антиген из Porphyromonas gingivalis [например, 78].

-антиген(ы) полиомиелита [например, 79, 80], такой как IPV или OPV.

- антиген(ы) бешенства [например, 81], такой как лиофилизированный инактивированный вирус [например, 82, RabAvert ^TM].

- антигены вирусов кори, эпидемического паротита и/или краснухи [например, главы 9, 10 и 11 ссылки 68].

- антиген(ы) вируса гриппа [например, глава 19 ссылки 68], такие как гемагглютинин и/или поверхностные белки нейраминидазы.

- антиген из Moraxella catarrhalis [например, 83].

- антиген из Streptococcus agalactiae (стрептококк группы В) [например, 84, 85].

- сахаридный антиген из Streptococcus agalactiae (стрептококк группы В).

- антиген из Streptococcus pyrogenes (стрептококк группы А) [например, 85, 86, 87].

- антиген из Streptococcus aureus [например, 88].

- антиген из Bacillus anthracis [например, 89, 90, 91].

- антиген вируса семейства Flaviviridae (род Flavivirus), такого как вирус желтой лихорадки, вирус японского энцефалита, 4 серотипа вируса Денге, вируса клещевого энцефалита, вируса западного Нила.

- антиген пестивируса, такого как классический вирус свиной лихорадки, вирус коровьей вирусной диареи и/или вирус пограничного заболевания.

- антиген парвовируса, например, из парвовируса В19.

- белок приона (например, белок приона CJD).

- амилоидный белок, такой как бета пептид [92].

- раковый антиген, такой антигены, перечисленные в табл. 1 ссылки 93, или в табл. 3 и 4 ссылки 94.

Композиция может включать один или несколько из указанных дополнительных антигенов.

Токсические белковые антигены можно при необходимости детоксифицировать (например, детоксификация коклюшного токсина химическими и/или генетическими средствами [67]).

Когда дифтерийный антиген включается в композицию, предпочтительно также включить столбнячный антиген и коклюшный антиген. Аналогичным образом, когда включен столбнячный антиген, предпочтительно также включить дифтерийный и коклюшный антигены. Аналогичным образом, когда включен коклюшный антиген, предпочтительно также включить дифтерийный и столбнячный антигены.

Антигены предпочтительно адсорбированы на соли алюминия.

Антигены в композиции должны обычно присутствовать в концентрации по меньшей мере 1 мкг/мл каждый. В целом, концентрация любого данного антигена должна быть достаточной для того, чтобы вызвать иммунную реакцию против указанного антигена.

В качестве альтернативы использованию белковых антигенов, в композиции по изобретению можно использовать нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген [например, ссылки 95-103]. Таким образом, белковые компоненты композиций по изобретению можно заменить нуклеиновой кислотой (предпочтительно, ДНК, например, в форме плазмиды), которая кодирует белок.

Изобретение также относится к способу усиления иммунного ответа у млекопитающего, включающему введение млекопитающему фармацевтической композиции по изобретению. Млекопитающее представляет собой предпочтительно человека. Человек может представлять собой взрослого или, предпочтительно, представляет собой ребенка. Реакция антитела является предпочтительно защитной против инфекции N.meningitidis серогруппы А.

Изобретение также относится к способу иммунизации млекопитающего, включающему введение фармацевтической композиции по изобретению млекопитающему.

Настоящее изобретение также относится к модифицированному сахариду по изобретению или конъюгату по изобретению для применения в качестве лекарственного средства.

Изобретение также относится к применению модифицированного сахарида по изобретению или конъюгата по изобретению при изготовлении лекарственного средства для профилактики или лечения заболевания, вызванного инкапсулированными бактериями. Заболевания, вызванные H.influenzae, включают средний отит, бронхит, пневмонию, целлюлит, перикардит и менингит. Заболевания, вызванные пневмококком, включают менингит, сепсис и пневмонию. Таким образом, предпочтительна профилактика и/или лечение бактериального менингита.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показан синтез конъюгата сахарида-белка из сахарида, активированного CDI.

На фиг. 2 показано взаимодействие гидроксильной группы на сахариде Neisseria meningitidis серогруппы А с CDI.

На фиг. 3 показаны результаты сравнительных исследований иммуногенности. График показывает величины GMT для 5 различных сахаридных иммуногенов от (А) до (Е), и в таблице показаны сывороточные бактерицидные титры против штамма F8238 серогруппы А.

Способы осуществления изобретения

Сравнительные исследования иммуногенности

Настоящее изобретение предоставляет улучшенный тип связи между сахаридом и белком. Кроме того, было обнаружено, что конъюгаты сахарида-белка в соответствии с настоящим изобретением имеют улучшенную иммуногенность, по сравнению с другими типами конъюгатов сахарида-белка.

В целях сравнения, был получен конъюгат сахарида-белка, имеющий альтернативную связь. Модифицированный полисахарид Neisseria meningitidis серогруппы А получали активацией CDI гидроксильной группы на сахариде с последующим гашением реакции карбаматного промежуточного соединения CDI с NH₂-(CH₂ )₅-CO₂H. Этот модифицированный полисахарид использовали для получения конъюгата сахарида-белка активированным EDAC соединением карбоксильной группы с CRM₁₉₇. Следовательно, полисахарид и CRM₁₉₇ соединялись посредством группы линкера -OC(O)NH-(CH₂)₅-C(O)NH-. В целях этого сравнительного исследования, этот способ получения конъюгата сахарида-белка называется «карбодиимидным способом».

Конъюгат сахарида-белка, полученный карбодиимидным способом, сравнивали с конъюгатом сахарида-белка в соответствии с настоящим изобретением. Следовательно, модифицированный полисахарид Neisseria meningitidis серогруппы А получали активацией CDI гидроксильной группы на полисахариде с последующим гашением реакции карбаматного промежуточного соединения CDI с трис-нуклеофильным NH₂ -(CH₂)₃-CH(OH)CO₂OH. После расщепления перйодата для выявления альдегида модифицированный полисахарид соединяли с CRM₁₉₇ восстановительным аминированием (как проиллюстрировано на фиг. 1). Следовательно, полисахарид и CRM₁₉₇ соединялись посредством группы линкера -OC(O)NH-(CH ₂)₄-NH-. В целях этого сравнительного исследования, этот способ получения конъюгата сахарида-белка называется «способом восстановительного аминирования».

Иммуногенность конъюгатов, полученных карбодиимидным способом и способом восстановительного аминирования (в двух различных соотношениях) определяли у мышей Balb/c. Конъюгаты вводили в виде двух доз )) и 14 д) по 2 мкг/дозу (выраженную в виде массы сахарида). Кровопускание проводили на 25-й д и определяли титры IgG (GMT). Кроме того, оценивали титры сывороточных бактерицидных антител (SBA) против штамма F8238 MenA. Для сравнения тестировали также олигосахаридный конъюгат по изобретению и неконъюгированный полисахарид.

Результаты показаны на фиг. 3. Олигосахаридный конъюгат (С) дал наилучшую величину GMT и титр SBA 1024. Напротив, простой полисахарид (F) дал низкий титр GMT (по сравнению с солевым контролем) и низкий титр SBA (<4). При конъюгации с CRM197 с использованием карбодиимидного способа (D) оба титра увеличились (SBA: 128). При конъюгации с CRM197 с использованием восстановительного аминирования (А и В), титры SBA увеличились (SBA: от 512 до 1024). Титр SBA, достигнутый конъюгатом, полученным с использованием восстановительного аминирования, соответствовал титру конъюгированного олигосахарида.

Схема сравнительного ELISA с использованием модели у морской свинки подтвердила результаты, полученные у мышей Balb/C.

Следует понимать, что изобретение было описано только в качестве примера, и модификации могут производиться без выхода за пределы объема и сущности изобретения.

Ссылки (содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки)

[1] Research Disclosure, 453077 (Jan 2002)

[2] EP-A-0372501

[3] EP-A-0378881

[4] EP-A-0427347

[5] WО 93/17712

[6] WО 94/03208

[7] WО 98/58668

[8]EP-A-0471177

[9] WO 00/56360

[10] WО 91/01146

[II] WO 00/61761

[12] WО 01/72337

[13] Lei et al. (2000) Dev Biol (Basel) 103:259-264

[14]WO 00/38711

[15] WО 99/42130

[16] WO 96/40242

[17] WO 00/56365

[18] WО 98/20734

[19] Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press

1995 (ISBN 0-306-44867-X).

[20] WO 90/14837.

[21]WO 00/07621.

[22]WO 99/27960.

[23] European patent applications 0835318,0735898 and 0761231.

[24] Krieg (2000) Vaccine 19:618-622; Krieg (2001) Curr opin Mol Ther 2001 3:15-24;

WO 96/02555, WO 98/16247, WO 98/18810, WO 98/40100, WO 98/55495, WO 98/37919 and WO 98/52581 etc.

[25] WO 99/52549.

[26] WO 01/21207.

[27]WO 01/21152.

[28] WO 00/62800.

[29]WO 00/23105.

[30] WO 99/11241.

[31] WO 98/57659.

[32] Del Giudice et al. (1998) Molecular Aspects of Medicine, vol. 19, number 1.

[33] Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278.

[34] International patent application WO00/50078.

[35] Singh et al. (2001)J. Cont. Rele. 70:267-276.

[36] Covacci & Rappuoli (2000) J. Exp. Med. 19:587-592.

[37] WO 93/18150.

[38] Covacci et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5791-5795.

[39] Tummuru et al. (1994) Infect. Immun. 61:1799-1809.

[40] Marchetti et al. (1998) Vaccine 16:33-37.

[41] Telford et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1653-1658.

[42] Evans et al. (1995) Gene 153:123-127.

[43] WO 96/01272 & WO96/01273, especially SEQ ID N0:6.

[44] WO 97/25429.

[45] WO 98/04702.

[46] WO 99/24578.

[47] WO 99/36544.

[48] WO 99/57280.

[49] WO 00/22430.

[50] Tettelin et al. (2000) Science 287:1809-1815.

[51] WO 96/29412.

[52] Pizza et al. (2000) Science 287:1816-1820.

[53] WO 01/52885.

[54] Bjune et al. (1991) Lancet 338(8775):1093-1096.

[55] Fukasawa et al. (1999) Vaccine 17:2951-2958.

[56] Rosenqvist et al. (1998) Dev. Biol. Stand. 92:323-333.

[57] Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691-698.

[58] Costantino et al. (1999) Vaccine 17:1251-1263.

[59] Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331-332.

[60] Rubin (2000) Pediatr Clin North Am 47:269-285, v.

[61] Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207.

[62] Bell (2000) Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188.

[63] Iwarson (1995) APMIS 103:321-326.

[64] Gerlich et al. (1990) Vaccine 8 Suppl:S63-68 & 79-80.

[65] Hsu et al. (1999) Clin Liver Dis 3:901-915.

[66] Gustafsson et al. (1996) N. Engl. J. Med. 334:349-355.

[67] Rappuoli et al. (1991) TIBTECH 9:232-238 .

[68] Vaccines (1988) eds. Plotkin & Mortimer. ISBN 0-7216-1946-0.

[69] Del Guidice et al. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70.

[70] WО 02/02606.

[71] Kalman et al. (1999) Nature Genetics 21:385-389.

[72] Read et al. (2000) Nucleic Acids Res 28:1397-406.

[73] Shirai et al. (2000) J. Infect. Dis. 181(Suppl 3):S524-S527.

[74] WO 99/27105.

[75] WO 00/27994.

[76] WO 00/37494.

[77] WO 99/28475.

[78] Ross et al. (2001) Vaccine 19:4135-4142.

[79] Sutter et al. (2000) Pediatr Clin North Am 47:287-308.

[80] Zimmerman & Spann (1999) Am Fam Physician 59:l13-118,125-126.

[81] Dreesen (1997) Vaccine 15 Suppl:S2-6.

[82] MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1998 Jan 16;47(1):12,19.

[83] McMichael (2000) Vaccine 19 Suppi 1:S101-107.

[84] Schuchat (1999) Lancet 353(9146):51-6.

[85]WO02/34771.

[86] Dale (1999) Infect Dis Clin North Am 13:227-43, viii.

[87] Ferretti et al. (2001) PNAS USA 98:4658-4663.

[88] Kuroda et al. (2001) Lancet 357(9264):1225-1240; see also pages 1218-1219.

[89] J Toxicol Clin Toxicol (2001) 39:85-100.

[90] Demicheli et al. (1998) Vaccine 16:880-884.

[91] Stepanov et al. (1996) J Biotechnol 44:155-160.

[92] Ingram (2001) Trends Neurosci 24:305-307.

[93] Rosenberg (2001) Nature 411:380-384.

[94] Moingeon (2001) Vaccine 19:1305-1326.

[95] Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunology 9:271-283.

[96] Donnely et al. (1997) Annu Rev Immunol 15:617-648.

[97] Scott-Taylor & Dalgleish (2000) Expert Opin Investig Drugs 9:471-480.

[98] Apostolopoulos & Plebanski (2000) Curr Opin Mol Ther 2:441-447.

[99] Ilan (1999) Curr Opin Mol Ther 1:116-120.

[100] Dubensky et al. (2000) Mol Med 6:723-732.

[101] Robinson & Pertmer (2000) Adv Virus Res 55:1-74.

[102] Donnelly et al. (2000) Am J Respir Crit Care Med 162(4 Pt 2):S190-193.

[103] Davis (1999) Mt. Sinai J. Med. 66:84-90.