эпитопные пептиды rab6kifl/kif20a и содержащие их вакцины

Формула изобретения

1. Выделенный олигопептид, который способен индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты в комплексе с HLA-A*0201, где олигопептид выбран из группы, состоящей из:

(а) олигопептида, состоящего из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 3 и 5; и

(b) олигопептида, состоящего из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 3 и 5, в которой замещены 1 или 2 аминокислоты, где (i) замена во второй аминокислоте от N-конца представляет собой лейцин или метионин и/или (ii) замена С-концевой аминокислоты представляет собой валин или лейцин.

2. Фармацевтическая композиция для уничтожения клеток, экспрессирующих RAB6KIFL и HLA-A*0201, где композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель и от 0,001 мг до 1000 мг одного или более олигопептида по п.1, или вектор, включающий полинуклеотид, кодирующий олигопептид по п.1, где композиция составлена для введения субъекту, антиген HLA которого представляет собой HLA-A*0201.

3. Фармацевтическая композиция по п.2, где клетки выбраны из группы, состоящей из клеток рака мочевого пузыря, клеток рака молочной железы, клеток холангиоцеллюлярной карциномы, клеток рака пищевода, клеток немелкоклеточного рака легких (NSCLC), клеток рака поджелудочной железы, клеток рака простаты, клеток карциномы почек и клеток мелкоклеточного рака легких (SCLC).

4. Экзосома, которая индуцирует CTL, где экзосома презентирует на своей поверхности комплекс, содержащий олигопептид по п.1 и HLA-A*0201.

5. Способ индукции антиген-презентирующей клетки, несущей HLA-A*0201, где способ включает стадию, выбранную из группы, состоящей из:

(а) приведения антиген-презентирующей клетки, несущей HLA-А*0201, в контакт с олигопептидом по п.1, и

(b) введения вектора, включающего полинуклеотид, кодирующий олигопептид по п.1, в антиген-презентирующую клетку.

6. Способ индукции CTL, где способ включает стадию приведения CD8-позитивной Т-клетки в контакт с антиген-презентирующей клеткой и/или экзосомой, которая презентирует на своей поверхности комплекс олигопептида по п.1 и HLA-A*0201.

7. Выделенная антиген-презентирующая клетка, обладающая способностью индцировать CTL, где антиген-презентирующая клетка презентирует на своей поверхности комплекс HLA-A*0201 и олигопептида по п.1.

8. Антиген-презентирующая клетка по п.7, которая индуцирована способом по п.5.

9. Способ уничтожения клеток, экспрессирующих RAB6KIFL и HLA-A*0201 у субъекта, антиген HLA которого представляет собой HLA-A*0201, включающий стадию введения указанному субъекту вакцины, которая содержит по меньшей мере один активный ингредиент, выбранный из группы, состоящей из:

(a) одного или более олигопептидов по п.1;

(b) одного или более векторов, включающих полинуклеотид, кодирующий олигопептид по п.1;

(c) одного или более выделенных CTL, которые способны связываться с комплексом олигопептида по п.1 и HLA-A*0201 на поверхности антиген-презентирующей клетки, где CTL получены у субъекта и индуцированы способом по п.6; и

(d) одной или более выделенных антиген-презентирующих клеток по п.7 или 8, где антиген-презентирующие клетки получены у субъекта.

10. Фармацевтическая композиция для индукции CTL, где композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель и от 0,001 мг до 1000 мг одного или более олигопептидов по п.1, вектор, включающий полинуклеотид, кодирующий олигопептид по п.1, или выделенную антиген-презентирующую клетку по п.7 или 8.

11. Применение активного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из:

(а) одного или более олигопептидов по п.1; и

(b) одного или более векторов, включающих полинуклеотид, кодирующий олигопептид по п.1,

для получения фармацевтической композиции для лечения рака.

12. Применение активного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из:

(а) одной или более антиген-презентирующих клеток, которые презентируют комплекс олигопептида по п.1 и HLA-A*0201; и

(b) одного или более CTL, которые способны связываться с комплексом олигопептида по п.1 и HLA-A*0201 на поверхности антиген-презентирующей клетки, которые индуцированы способом по п.6,

для получения фармацевтической композиции для лечения рака у субъекта, где указанный субъект является субъектом, у которого получены антиген-презентирующие клетки или CTL.

13. Полинуклеотид, кодирующий олигопептид по п.1.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Приоритет

Настоящая заявка утверждает преимущество предварительной заявки США № 61/197106, поданной 22 октября 2008 года, содержание которой полностью включено в настоящий документ в качестве ссылки.

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биологической науки, более конкретно, к области терапии рака. В частности, настоящее изобретение относится к новым олигопептидам и их применению.

Предшествующий уровень техники

Было продемонстрировано, что CD8-позитивные ЦТЛ распознают эпитопные пептиды, полученные из опухоль-ассоциированных антигенов (ОАА) и находящиеся на молекуле главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I, а затем убивают опухолевые клетки. С момента открытия семейства антигенов меланомы (MAGE), как первого примера ОАА, было обнаружено много других ОАА, главным образом, с помощью иммунологических подходов (NPL 1: Boon T, Int J Cancer 1993 мая 8, 54(2): 177-80; NPL 2: Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9). Некоторые из этих ОАА в настоящее время проходят клинические исследования в качестве мишеней для иммунотерапии.

Выявление новых ОАА, способных индуцировать мощный и специфический противоопухолевый иммунный ответ, требует дальнейшего развития и применения в клинике стратегий пептидной вакцинации для различных типов рака. (NPL 3: Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; NPL 4: Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; NPL 5: Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; NPL 6: van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; NPL 7: Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; NPL 8: Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; NPL 9: Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; NPL 10: Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94. До настоящего времени было несколько сообщений о клинических испытаниях c применением таких пептидов, полученных из опухоль-ассоциированных антигенов. К сожалению, до сих пор в этих исследованиях противоопухолевых вакцин наблюдали только низкую частоту объективных ответов (NPL 11: Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; NPL 12: Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; NPL 13: Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15).

В настоящее время последовательность пептида, связывающегося с HLA класса I, можно предсказать с использованием алгоритмов (NPL 14: Journal of Immunological Methods, (1995), Vol.185, pp.181-190, NPL 15: J. Immunol., (1994), Vol.152, pp.163-175, NPL 16: protein science, (2000), Vol.9, pp.1838-1846). Однако трудно сказать, будет ли предсказанный эпитопный пептид процессироваться естественным образом в клетках-мишенях и экспрессироваться на поверхности клетки-мишени с молекулой HLA. Кроме того, алгоритм, например BIMAS (http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform) (NPL 17: Parker KC, et al., (1994) J Immunol.; 152(1):163-75.; NPL 18: Kuzushima K, et al., (2001) Blood.; 98(6):1872-81) может предложить пептид, связывающийся с молекулой HLA, но предложенный пептид не является точным (NPL 19: Bachinsky MM, et al., Cancer Immun. 2005 Mar 22;5:6). Таким образом, в скрининге ОАА по-прежнему остается много проблем и трудностей.

Рак поджелудочной железы имеет неблагоприятный прогноз с общей пятилетней частотой выживания приблизительно 5% (1). Хирургическая резекция остается единственным вариантом для долгосрочного выживания, но пациенты с резектабельным раком поджелудочной железы представляют собой меньшинство (9-22%) (NPL 20: Sener S.F. et al. J Am Coll Surg 1999; 189:1-7, NPL 21: Eloubeidi M.A. et al. Am J Surg 2006; 192:322-9, NPL 22: Goonetilleke K.S. et al. Int J Surg 2007; 5:147-51.). Даже у этих пациентов, однако, пятилетняя частота выживания остается приблизительно 20%, несмотря на операцию с лечебной целью (NPL 23: Smeenk H.G. et al. Langenbecks Arch Surg 2005; 390:94-103, NPL 24: Yeo C.J. et al. Ann Surg 1995;221:721-31.). До 80% пациентов представлены местно-распространенным или метастатическим заболеванием, и их средний диапазон выживания составляет от 6 до 9 месяцев (NPL 25: Lockhart A.C. et al. Gastroenterology 2005;128:1642-54). Таким образом, разработка новых терапевтических способов воздействия является вопросом большой важности, и иммунотерапия может быть потенциальным лечением при раке поджелудочной железы.

RAB6KIFL (KIF20A) был впервые выявлен, как играющий роль в динамике аппарата Гольджи посредством прямого взаимодействия с малой ГТФазой Rab6 (NPL 26: Echard A, et al. Science 1998;279:580-5). RAB6KIFL принадлежит к кинезиновому суперсемейству моторных белков, которые обладают важными функциями в движении молекул и органелл (NPL 26: Echard A, et al. Science 1998; 279:580-5, NPL 27: Hirokawa N, et al. Curr Opin Cell Biol 1998; 10:60-73, NPL 28: Allan VJ, и Schroer TA. Curr Opin Cell Biol 1999; 11:476-82). Недавно, Taniuchi K et al. сообщили, что RAB6KIFL сверхэкспрессирован в тканях рака поджелудочной железы (NPL 29: Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005; 65:105-12.).Они обнаружили доказательство важной роли RAB6KIFL в канцерогенезе поджелудочной железы. С помощью анализа профиля экспрессии генов с использованием полногеномного микрочипа кДНК, содержащего 23,040 генов, недавно было показано, что RAB6KIFL (KIF20A) активирован при некоторых видах раков, таких как рак мочевого пузыря (PTL 1: WO 2006/085684), мелкоклеточный рак легких (SCLC) (PTL 2: WO 2007/013665) и устойчивый к гормональной терапии рак предстательной железы (HRPC) (PTL 3: WO 2008/102906), описание которых включено в настоящий документ в качестве ссылки. Более того, были также идентифицированы некоторые эпитопные пептиды продуктов гена KIF20A (PTL 4: WO 2008/102557).

Список литературы

Патентная литература

[PTL 1] WO2006/085684

[PTL 2] WO2007/013665

[PTL 3] WO2008/102906

[PTL 4] WO2008/102557

Непатентная литература

[NPL 1] Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80

[NPL 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9

[NPL 3] Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55

[NPL 4] Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42

[NPL 5] Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9

[NPL 6] van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14

[NPL 7] Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8

[NPL 8] Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72

[NPL 9] Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66

[NPL 10] Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94

[NPL 11] Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80

[NPL 12] Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42

[NPL 13] Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15

[NPL 14] Jounal of Immunological Methods, (1995), Vol.185, pp.181-190

[NPL 15] J. Immunol., (1994), Vol.152, pp.163-175

[NPL 16] protein science, (2000), Vol.9, pp.1838-1846

[NPL 17] Parker KC, et al., (1994) J Immunol.; 152(1):163-75.

[NPL 18] Kuzushima K, et al., (2001) Blood.; 98(6):1872-81.

[NPL 19] Bachinsky MM, et. al., Cancer Immun. 2005 Mar 22; 5:6.

[NPL 20] Sener S F, et al. J Am Coll Surg 1999; 189:1-7.

[NPL 21] Eloubeidi M A, et al. Am J Surg 2006; 192:322-9.

[NPL 22] Goonetilleke K S,et al. Int J Surg 2007; 5:147-51.

[NPL 23] Smeenk H G, et al. Langenbecks Arch Surg 2005; 390:94-103.

[NPL 24] Yeo C J, et al. Ann Surg 1995; 221:721-31.

[NPL 25] Lockhart A C, et al. Gastroenterology 2005; 128:1642-54.

[NPL 26] Echard A, et al. Science 1998; 279:580-5.

[NPL 27] Hirokawa N, et al. Curr Opin Cell Biol 1998; 10:60-73.

[NPL 28] Allan VJ, and Schroer TA. Curr Opin Cell Biol 1999;11:476-82.

[NPL 29] Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005; 65:105-12.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение частично основано на открытии новых мишеней для иммунотерапии. Поскольку ОАА часто не имеют иммуногенности, выявление подходящих мишеней является исключительно важным. В частности, изобретение нацелено на RAB6KIFL (SEQ ID NO:2), который кодируется геном ID GenBank AF153329 или CR598555, также указанным NM_005733 (SEQ ID NO: 1), поскольку было установлено, что RAB6KIFL активирован при некоторых видах рака, таких как рак мочевого пузыря, рак молочной железы, холангиоцеллюлярная карцинома, рак пищевода, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), рак поджелудочной железы, рак простаты, карцинома почек и мелкоклеточный рак легких (SCLC). Настоящее изобретение относится к продуктам гена RAB6KIFL, включающим эпитопные пептиды, которые вызывают на удивление сильный ответ ЦТЛ, который является специфическим по отношению к соответствующим молекулам. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), полученные от здорового донора, были стимулированы с использованием пептидов по настоящему изобретению. Настоящее изобретение далее относится к созданным ЦТЛ, которые специфически распознают HLA-A2 (A*0201) - позитивные клетки-мишени, активированные соответствующими пептидами, и к эпитопным пептидам, ограниченным по HLA-A0201, которые могут индуцировать мощный и специфический иммунный ответ против RAB6KIFL, экспрессирующегося на опухоли. Эти результаты демонстрируют, что RAB6KIFL является высокоиммуногенным, и его эпитопы представляют собой эффективные мишени для иммунотерапии.

Таким образом, настоящее изобретение относится к олигопептидам, способным индуцировать ЦТЛ, а также - к аминокислотным последовательностям, выбранным из группы SEQ ID NO:3, 4 или 5. В дополнение к этому, в другом варианте осуществления настоящего изобретения одна, две или несколько аминокислот могут быть замещены, удалены, вставлены и/или добавлены, при условии, что полученные модифицированные олигопептиды сохраняют способность исходных пептидов индуцировать ЦТЛ.

При введении пациенту указанные олигопептиды презентируются на поверхности антигенпрезентирующих клеток и затем индуцируют ЦТЛ, нацеливая на соответствующие пептиды. Таким образом, настоящее изобретение относится к антигенпрезентирующим клеткам и экзосомам, которые презентируют любой из указанных пептидов, а также к способам индукции антигенпрезентирующих клеток.

Противоопухолевый иммунный ответ индуцируется введением указанных олигопептидов RAB6KIFL или полинуклеотидов, кодирующих олигопептиды, а также экзосом и антигенпрезентирующих клеток, которые презентируют олигопептиды RAB6KIFL. Таким образом, еще одной задачей настоящего изобретения является создание фармацевтических средств или фармацевтической композиции, содержащих в качестве активных ингредиентов олигопептиды или полинуклеотиды, кодирующие их, а также экзосомы и антигенпрезентирующие клетки. Фармацевтические средства по настоящему изобретению находят применение в качестве вакцин.

Кроме того, еще одной задачей настоящего изобретения является создание способов лечения и/или профилактики (т.е. предупреждения) раков (опухолей), и/или предупреждения их послеоперационных рецидивов, а также способов индукции ЦТЛ, способов индукции противоопухолевого иммунитета; такие способы включают этап введения олигопептидов RAB6KIFL, полинуклеотидов, кодирующих олигопептиды RAB6KIFL, экзосом или антигенпрезентирующих клеток, презентирующих полипептиды RAB6KIFL, или фармацевтических средств по настоящему изобретению. В дополнение к этому, ЦТЛ по настоящему изобретению также находят применение в качестве противоопухолевых вакцин. Примеры раков-мишеней включают в качестве неограничивающих примеров, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, холангиоцеллюлярную карциному, рак пищевода, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), рак поджелудочной железы, рак простаты, карциному почек и мелкоклеточный рак легких (SCLC).

Следует понимать, что как вышеизложенная сущность изобретения, так и последующее подробное описание, представляют собой примеры вариантов осуществления и не ограничиваются изобретением или другими альтернативными вариантами осуществления изобретения.

Краткое описание чертежей

Различные аспекты и применение настоящего изобретения станут очевидны специалистам в данной области после рассмотрения краткого описания рисунков и подробного описания настоящего изобретения и предпочтительных вариантов его осуществления, которые следуют далее:

[Фиг. 1] фигура 1 изображает заметно и часто повышенную экспрессию мРНК RAB6KIFL в тканях рака поджелудочной железы по данным анализа микрочипа с кДНК. A показывает список генов, активированных в клетках рака поджелудочной железы. Эти гены были сверхэкспрессированы в злокачественных клетках по сравнению с их нормальными аналогами. Экспрессия мРНК RAB6KIFL в клетках рака поджелудочной железы была заметно повышена у всех 6 пациентов с раком поджелудочной железы. B показывает относительный показатель экспрессии гена RAB6KIFL в нормальных тканях по данным анализа микрочипа с кДНК. Ген RAB6KIFL слабо экспрессируется только в яичках и тимусе. C показывает, что уровень экспрессии гена RAB6KIFL был также повышен при многих раках легкого и раке мочевого пузыря, а также раке поджелудочной железы по данным проведенного ранее анализа микрочипа с кДНК.

[Фиг. 2] Фигура 2 показывает анализ мРНК RAB6KIFL, экспрессирующейся в нормальных тканях человека, линиях злокачественных клеток и раковых тканях. A показывает экспрессию мРНК RAB6KIFL, которая была исследована в различных нормальных тканях с использованием ОТ-ПЦР. мРНК RAB6KIFL слабо экспрессировалась только в яичках. B показывает ОТ-ПЦР анализ экспрессии RAB6KIFL в различных линиях злокачественных клеток. C показывает ОТ-ПЦР анализ экспрессии RAB6KIFL в тканях рака поджелудочной железы (T) и их нормальных аналогах (N). Экспрессия гена RAB6KIFL была выявлена в 5 из 8 образцов тканей рака поджелудочной железы. Напротив, в их нормальных аналогах была выявлена незначительная экспрессия.

[Фиг. 3] фигура 3 показывает специфическую для рака поджелудочной железы сверхэкспрессию белка RAB6KIFL, выявленную при помощи Вестерн-блоттинга. A показывает, что белок RAB6KIFL не был выявлен в восьми нормальных тканях, в то время как яички показали очень слабую полосу с мобильностью, сходной с той, которую наблюдали в лизате клеток PANC1. B показывает, что у двух пациентов с раком поджелудочной железы белок RAB6KIFL был выявлен в раковых тканях (T), но не в прилежащих нормальных тканях (N). Также проводили анти-бета-актиновый блоттинг для контроля одинакового нанесения белка.

[Фиг. 4] Фигура 4 показывает иммуногистохимический анализ белка RAB6KIFL при раке поджелудочной железы (A) и в различных нормальных тканях (B). A показывает, что сильное окрашивание RAB6KIFL наблюдали в основном в цитоплазме и ядрах злокачественных клеток в 6 из 9 случаев, в то время как наблюдали очень слабое окрашивание ацинарных клеток и нормального эпителия протоков в нормальных прилежащих тканях поджелудочной железы. Сходное сильное окрашивание наблюдали в метастатических очагах в брюшине. Незначительное окрашивание наблюдается при опухолеподобном панкреатите. B показывает, что RAB6KIFL не был окрашен в нормальном головном мозге, легком, печени, почке, желудке, тонком кишечнике, толстом кишечнике, селезенке, скелетной мышце, коже и тимусе. Возможное слабое окрашивание наблюдалось в яичках. Позитивные сигналы окрашивания показаны коричневым цветом. Масштабная полоска представляет 100 микрометров.

[Фиг. 5] фигура 5 показывает выявление ограниченных по HLA-A2 эпитопов человеческого RAB6KIFL для ЦТЛ мыши с использованием мышей HLA-A2,1 (HHD) Tgm. A показывает, что HLA-A2,1 (HHD) Tgm были иммунизированы in vivo на 7 и 14 дни при помощи 5×10 ⁵ сингенных BM-DC, которые были активированы посредством двенадцати наборов из смеси трех типов пептидов, выбранных из 36 кандидатных пептидов. На 21 день клетки селезенки CD4-, изолированные от иммунизированных мышей, стимулировали при помощи BM-DC, активированных каждым пептидом в течение 6 дней. IFN-гамма, который вырабатывали ЦТЛ, определяли при помощи анализа ELISPOT. Было показано, что пептиды RAB6KIFL-A2-9-12 (SEQ ID NO: 3), RAB6KIFL-A2-9-809 (SEQ ID NO: 4) и RAB6KIFL-A2-10-284 (SEQ ID NO: 5) индуцируют пептид-реактивные ЦТЛ. Эти анализы делали дважды со сходными результатами. B показывает иммуногистохимическое окрашивание с mAb против CD4 или CD8 в образцах ткани от HLA-A2 (HHD) Tgm, иммунизированных пептидом RAB6KIFL-A2-9-809. После двухкратной вакцинации производили резекцию и анализ образцов.

[Фиг. 6A-B] Фигура 6 показывает индукцию RAB6KIFL-специфических ЦТЛ человека, полученных из PBMC от HLA-A2-позитивных здоровых доноров. A показывает, что ЦТЛ, реагирующие на пептиды RAB6KIFL, были получены из PBMC от HLA-A2-позитивных здоровых доноров. После трех стимуляций аутологичными моноцитарными DC, активированными пептидом RAB6KIFL-A2-9-12 (SEQ ID NO: 3), RAB6KIFL-A2-9-809 (SEQ ID NO:4) и RAB6KIFL-A2-10-284 (SEQ ID NO:5), измеряли цитотоксичность ЦТЛ против T2-клеток (HLA-A2 ⁺, TAP дефицитные), активированных каждым пептидом или против не активированных пептидом T2-клеток, при помощи стандартного анализа высвобождения ⁵¹Cr. Эти ЦТЛ демонстрировали цитотоксичность по отношению к Т2-клеткам, активированным пептидом RAB6KIFL-A2-9-12 (слева), RAB6KIFL-A2-9-809 (посередине) и RAB6KIFL-A2-10-284 (справа), но не по отношению к Т2-клеткам, активированным неподходящим пептидом ВИЧ, или не активированным пептидом. B показывает, что эти ЦТЛ показывали цитотоксичность в отношении RAB6KIFL⁺ HLA-A2 (A*0201)⁺ клеточной линии рака поджелудочной железы человека PANC1 и клеточной линии рака толстого кишечника CaCo-2, но не в отношении RAB6KIFL+ HLA-A2 (A*0201)^- клеточной линии рака поджелудочной железы человека PK8.

[Фиг. 6C-D] показывает, что цитотоксичность этих ЦТЛ была RAB6KIFL-специфической. Эти ЦТЛ убили SKHep1/RAB6KIFL, RAB6KIFL^low HLA-A2 ⁺ линию злокачественных клеток печени человека SKHep1, трансфицированную человеческим геном RAB6KIFL, но не убили SKHep1/Mock. D показывает ингибирование цитотоксичности при помощи mAb против HLA класса I. После того как клетки-мишени PANC1 инкубировали с mAb против HLA-class I (W6/32, IgG_2a) или mAb против HLA-DR (H-DR-1, IgG_2a) соответственно в течение 1 часа, к ним добавляли ЦТЛ, созданные из PBMC здорового донора посредством стимуляции пептидом RAB6KIFL-A2-9-12 (сверху), RAB6KIFL-A2-9-809 (посередине), и RAB6KIFL-A2-10-284 (снизу). Выработка IFN-гамма была заметно ингибирована W6/32, но не H-DR-1.

Описание вариантов осуществления

Хотя можно использовать в практическом осуществлении или тестировании вариантов осуществления настоящего изобретения любые способы и материалы, сходные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, предпочтительные способы, приборы и материалы описаны здесь. Однако перед тем как настоящие материалы и способы будут описаны, следует иметь в виду, что настоящее изобретение не ограничено конкретными величинами, формами, размерами, материалами, методиками, протоколами и т.д., описываемыми в настоящем документе, поскольку они могут варьировать в соответствии с рутинными экспериментами и оптимизацией. Следует также понимать, что терминология, которая использована при описании, применяется только с целью описания конкретных версий или вариантов осуществления и не имеет целью ограничить объем настоящего изобретения, который ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

Раскрытие каждой публикации, патента или патентной заявки, упомянутой в данном описании конкретным образом, в полном объеме включено в настоящий документ в качестве ссылки. Однако ничто в настоящем документе не должно истолковываться как признание того, что изобретение не имеет права датировать более ранним числом такое раскрытие в силу предшествующего изобретения.

В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущество. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстрирующими и неограничивающими.

I. Определения

Формы единственного числа, как используют в настоящем документе, означают "по меньшей мере, один", если не указано иное.

Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используют в данном документе взаимозаменяемо по отношению к полимеру из аминокислотных остатков. Термины употребляют по отношению к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой модифицированный остаток или неприродный остаток, такой как искусственный химический миметик соответствующей природной аминокислоты, а также по отношению к природным аминокислотным полимерам.

Термин "олигопептид", иногда используемый в настоящем описании обычно относится к пептидам по настоящему изобретению, которые содержат 20 или менее остатков, обычно 15 или менее остатков в длину и обычно содержат приблизительно от 8 и приблизительно до 11 остатков, часто 9 или 10 остатков.

Как применяют в настоящем документе, термин "аминокислота" относится к природным и синтетическим аминокислотам, а также к аминокислотным аналогам и миметикам аминокислот, которые функционируют сходно с природными аминокислотами. Природными аминокислотами являются те, которые кодированы генетическим кодом, а также те, которые модифицированы в клетках после трансляции (например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат и O-фосфосерин). Фраза "аминокислотный аналог" относится к соединениям, которые имеют такую же основную химическую структуру (альфа-углерод, связанный с водородом, карбоксигруппу, аминогруппу и R-группу), что и природная аминокислота, но с модифицированной R-группой или модифицированным остовом (например, гомосерин, норлейцин, метионин, сульфоксид, метионин метилсульфония). Фраза "аминокислотный миметик" относится к химическим соединениям, которые имеют различные структуры, но сходные функции с основными аминокислотами.

Аминокислоты могут быть обозначены в данном документе общеизвестными трехбуквенными символами или однобуквенными символами, рекомендованными Комиссией по Химической Номенклатуре IUPAC-IUB.

Термины "ген", "полинуклеотиды", "нуклеотиды" и "нуклеиновые кислоты" используются в данном документе взаимозаменяемо, если конкретно не указано иное, и подобно аминокислотам обозначаются своими общепринятыми однобуквенными кодами.

Если не определено иное, термин "рак" относится к ракам со сверхэкспрессией гена RAB6KIFL. Примеры раков со сверхэкспрессией гена RAB6KIFL включают в качестве неограничивающих примеров, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, холангиоцеллюлярную карциному, рак пищевода, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), рак поджелудочной железы, рак простаты, карциному почек и мелкоклеточный рак легких (SCLC).

Если не определено иное, термины "цитотоксический T-лимфоцит", "цитотоксическая T-клетка" и "ЦТЛ" используют в данном документе взаимозаменяемо и, если конкретно не указано иное, по отношению к подгруппе T-лимфоцитов, которые способны распознавать чужеродные клетки (например, опухолевые клетки, вирус-инфицированные клетки) и индуцировать гибель этих клеток.

Если не определено иное, все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют то же самое значение, в котором их обычно понимает специалист в области, к которой относится изобретение.

II. Пептиды

Для того чтобы продемонстрировать, что пептиды, полученные из RAB6KIFL, функционируют как антигены, распознающиеся цитотоксическими T-лимфоцитами (ЦТЛ), были исследованы пептиды, полученные из RAB6KIFL (SEQ ID NO:2), для того чтобы установить, являются ли они антигенными эпитопами, ограниченными по HLA-A2 (A*0201), которые являются часто встречающимися аллелями HLA (Date Y et al., Tissue Antigenes 47: 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994). Кандидатные HLA-A2-связывающие пептиды, полученные из RAB6KIFL, были выявлены на основании информации об их связывающей способности по отношению к HLA-A2. После стимуляции Т-клеток in vitro с помощью дендритных клеток (DC), нагруженных этими пептидами, были успешно созданы ЦТЛ с использованием каждого из пептидов, в частности, следующих пептидов:

RAB6KIFL-A2-9-12 (SEQ ID NO: 3),

RAB6KIFL-A2-9-809 (SEQ ID NO: 4),

и

RAB6KIFL-A2-10-284 (SEQ ID NO: 5).

Эти полученные ЦТЛ показывают мощную специфическую цитотоксическую активность против клеток-мишеней, активированных соответствующими пептидами. Результаты в настоящем документе демонстрируют, что RAB6KIFL представляет собой антиген, распознающийся ЦТЛ, и что эти пептиды могут быть эпитопными пептидами RAB6KIFL, ограниченными по HLA-A2 (A*0201).

Поскольку ген RAB6KIFL сверхэкспрессируется в большинстве раковых тканей, таких как рак мочевого пузыря, рак молочной железы, холангиоцеллюлярная карцинома, рак пищевода, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, карцинома почек и мелкоклеточный рак легких (SCLC), он представляет собой хорошую мишень для иммунотерапии. Таким образом, настоящее изобретение относится к олигопептидам, таким как нонапептиды (пептиды, содержащие девять аминокислотных остатков) и декапептиды (пептиды, содержащие десять аминокислотных остатков), которые соответствуют эпитопам RAB6KIFL, распознающимся ЦТЛ. В частности, предпочтительные примеры олигопептидов по настоящему изобретению включают пептиды с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NOs: 3, 4 и 5.

Как правило, программное обеспечение, доступное в Интернет, такое как описано у Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75, можно использовать для расчета связывающей способности различных пептидов и антигенов HLA in silico. Аффинность связывания с антигенами HLA можно измерить, как описано, например, у Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75; и Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81. Способы для определения аффинности связывания описаны, например, в Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190.; Protein Science, 2000, 9: 1838-1846. Таким образом, настоящее изобретение относится к пептидам RAB6KIFL, для которых с помощью таких известных программ установлено связывание с антигенами HLA.

Кроме того, такие пептиды по настоящему изобретению можно фланкировать дополнительными аминокислотными остатками при условии, что пептид сохраняет свою способность индуцировать ЦТЛ. Такие пептиды со способностью индуцировать ЦТЛ представляют собой, например, менее чем приблизительно 40 аминокислот, часто менее чем приблизительно 20 аминокислот, обычно менее чем приблизительно 15 аминокислот. Аминокислотная последовательность, фланкирующая пептиды, которые включают аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NOs: 3, 4 и 5, не ограничена и может быть составлена из любого типа аминокислот при условии, что это не повлияет на способность исходного пептида индуцировать ЦТЛ. Таким образом, настоящее изобретение также относится к пептидам, которые обладают способностью индуцировать ЦТЛ, и содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 3, 4 и 5.

В основном, модификация одной, двух или более аминокислот в белке не будет влиять на функцию белка или в некоторых случаях даже усилит желаемую функцию исходного белка. Действительно, известны модифицированные пептиды (т.е. пептиды, включающие аминокислотную последовательность, в которой один, два или несколько аминокислотных остатков модифицированы (т.е. замещены, удалены, добавлены и/или вставлены) по сравнению с исходной референсной последовательностью), которые сохраняют биологическую активность исходного пептида (Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller и Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). Таким образом, в одном из вариантов осуществления олигопептиды по настоящему изобретению способны индуцировать ЦТЛ и имеют аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO:3, 4 и 5, где одна, две или даже более аминокислот добавлены, вставлены, удалены и/или замещены.

Специалисты в данной области признают, что единичные добавления или замены в аминокислотной последовательности, которые изменяют одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот, как правило, приводят к сохранению свойств исходной аминокислотной боковой цепи. В связи с этим, они обычно обозначаются как "консервативные замены" или "консервативные модификации", при которых результатом изменения белка является модифицированный белок со свойствами и функциями, аналогичными исходному белку. Таблицы консервативных замен, обеспечивающих получение функционально сходных аминокислот, хорошо известны в данной области. Примеры характеристик аминокислотных боковых цепей, которые желательно сохранить, включают, например, гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), и боковые цепи, имеющие следующие функциональные группы или характеристики, в общем: алифатическая боковая цепь (G, A, V, L, I, P); боковая цепь, содержащая гидроксильную группу (S, T, Y); боковая цепь, содержащая атом серы (C, M); боковая цепь, содержащая карбоновую кислоту и амид (D, N, E, Q); боковая цепь, содержащая основание (R, K, H) и ароматическая боковая цепь (H, F, Y, W). Кроме того, следующие восемь групп, каждая из которых содержит аминокислоты, приемлемые в данной области в качестве консервативных замен друг для друга:

1) Аланин (A), Глицин (G);

2) Аспарагиновая кислота (D), Глутаминовая кислота (E);

3) Аспарагин (N), Глутамин (Q);

4) Аргинин (R), Лизин (K);

5) Изолейцин (I), Лейцин (L), Метионин (M), Валин (V);

6) Фенилаланин (F), Тирозин (Y), Триптофан (W);

7) Серин (S), Треонин (T); и

8) Цистеин (C), Метионин (M) (см., например, Creighton, Proteins 1984).

Такие консервативно модифицированные пептиды также рассматриваются в качестве пептидов по настоящему изобретению. Однако пептиды по настоящему изобретению этим не ограничиваются и могут включать не консервативные модификации при условии, что пептид сохраняет способность исходного пептида индуцировать ЦТЛ. Кроме того, модифицированные пептиды не должны исключать ЦТЛ-индуцирующих пептидов из полиморфных вариантов, межвидовых гомологов и аллелей RAB6KIFL.

Для сохранения необходимой способности индуцировать ЦТЛ, можно модифицировать (добавить или заместить) небольшое число (например, 1, 2 или несколько) или небольшой процент аминокислот. В настоящем документе, термин "несколько" означает 5 или менее аминокислот, например, 3 или менее. Процент модифицированных аминокислот может быть 20% или меньше, например, 15% или меньше, например 10% или от 1 до 5%.

При использовании в контексте иммунотерапии пептиды по настоящему изобретению должны быть презентированы на поверхности клетки или экзосомы, предпочтительно в виде комплекса с антигеном HLA. Таким образом, предпочтительно выбирать пептиды, которые не только индуцируют ЦТЛ, но также обладают высокой аффинностью связывания с антигеном HLA. С этой целью пептиды могут быть модифицированы посредством замены, вставки, делеции и/или добавления аминокислотных остатков для получения модифицированного пептида с улучшенной аффинностью связывания. Поскольку закономерность последовательностей пептидов, которые отображаются посредством связывания с антигенами HLA, уже известна (J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), то в дополнение к пептидам, которые отображаются естественным образом, в иммуногенные пептиды по изобретению можно вводить модификации на основании такой закономерности. Например, пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания HLA-A2 (A*0201), у которых вторая аминокислота с N-конца замещена лейцином или метионином, и пептиды, у которых аминокислота с C-конца замещена валином или лейцином. Таким образом, пептиды с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 3, 4 или 5, где вторая аминокислота с N-конца замещена лейцином или метионином и/или где C-конец замещен валином или лейцином, находятся в объеме данного изобретения. Замены можно вводить не только в терминальные аминокислоты, но также по позициям потенциального TCR-распознавания пептидов. Несколько исследований продемонстрировали, что замены аминокислот в пептиде могут быть эквивалентны исходным или лучше, например CAP1, p53 (264-272), Her-2/neu _(369-377) или gp100 _(209-217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1; 168(3):1338-47., S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 and S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314).

Настоящее изобретение также предусматривает добавление аминокислот к последовательностям, раскрытым в настоящем документе. Например, одна, две или несколько аминокислот могут также быть добавлены к N- и/или C-концу пептидов по изобретению. Такие модифицированные пептиды с высокой аффинностью связывания антигена HLA и сохраненной способностью индуцировать ЦТЛ также включены в настоящее изобретение.

Однако, когда последовательность пептида идентична части аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка с другой функцией, можно индуцировать побочные эффекты, такие как аутоиммунные нарушения и/или аллергические симптомы по отношению к специфическим веществам. Таким образом, предпочтительно сначала провести поиски гомологии с использованием доступных баз данных, для того чтобы избежать ситуаций, в которых последовательность пептида совпадает с аминокислотной последовательностью другого белка. Когда из поиска гомологии станет ясно, что не существует пептида с различием даже по одной или двум аминокислотам по сравнению с пептидом по изобретению, пептид по изобретению может быть модифицирован для повышения аффинности связывания с антигенами HLA и/или для усиления его способности индуцировать ЦТЛ без какой-либо опасности таких побочных эффектов.

Хотя ожидается, что пептиды с высокой аффинностью связывания с антигенами HLA, как описано выше, будут высокоэффективными, кандидатные пептиды, отобранные по наличию высокой аффинности связывания в качестве индикатора, далее проверяют на наличие способности индуцировать ЦТЛ. В настоящем документе фраза "способность индуцировать ЦТЛ" указывает на способность пептида индуцировать цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ), когда он презентирован на антигенпрезентирующих клетках. Далее, "способность индуцировать ЦТЛ" включает в себя способность пептида индуцировать активацию ЦТЛ, пролиферацию ЦТЛ, способствовать ЦТЛ-опосредованному лизису клеток-мишеней и повышать выработку IFN-гамма цитотоксическими лимфоцитами.

Подтверждение способности индуцировать ЦТЛ осуществляют путем индукции антигенпрезентирующих клеток, несущих антигены MHC человека (например, B-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток (DC)), или, более конкретно, DC, полученных из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека; после стимуляции пептидами их смешивают с CD8-позитивными клетками, и затем измеряют IFN-гамма, который произведен и высвобожден цитотоксическими лимфоцитами против клеток-мишеней. В качестве реакционной системы можно использовать трансгенных животных, которые созданы для экспрессии антигена человека HLA (например, тех, которые описаны у BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response) can be used.

Например, клетки-мишени можно пометить радиоактивной меткой ⁵¹ Cr и т.п., и цитотоксическую активность можно рассчитать по радиоактивности, высвобожденной из клеток-мишеней. Альтернативно, способность индуцировать ЦТЛ можно оценить путем измерения IFN-гамма, который произведен и высвобожден цитотоксическими лимфоцитами в присутствии антигенпрезентирующих клеток (APC), несущих иммобилизованные пептиды, и путем визуализации зоны ингибирования в среде для клеток с использованием моноклональных антител к IFN-гамма.

В результате исследования способности пептидов индуцировать ЦТЛ как описано выше, было обнаружено, что те пептиды, которые имели высокую аффинность связывания по отношению к антигену HLA, не обязательно имели высокую способность индуцировать ЦТЛ. Однако было установлено, что из выявленных и оцененных пептидов, особенно высокую способность индуцировать ЦТЛ, а также высокую аффинность связывания по отношению к антигену HLA демонстрируют нонапептиды или декапептиды, выбранные из пептидов с аминокислотными последовательностями, указанными в SEQ ID NOs: 3, 4 и 5. Таким образом, данные пептиды являются примером предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения.

В дополнение к вышеописанным модификациям пептиды по настоящему изобретению могут также быть связаны с другими веществами, при условии, что полученный связанный пептид сохраняет необходимую способность исходного пептида индуцировать ЦТЛ. Примеры подходящих веществ включают в качестве неограничивающих примеров: пептиды, липиды, сахар и цепи сахаров, ацетильные группы, природные и синтетические полимеры и т.д. Пептиды могут содержать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковой цепи или фосфорилирование, и т.д., при условии, что модификации не нарушают биологическую активность исходного пептида. Такие типы модификаций можно осуществлять для придания дополнительных функций (например, функции нацеливания и функции доставки) или для стабилизации полипептида.

Например, для увеличения стабильности полипептида in vivo, существует известное в данной области введение D-аминокислот, миметиков аминокислот неприродных аминокислот; этот подход можно также применять по отношению к полипептидам по изобретению. Стабильность полипептида можно анализировать различными способами. Например, для проверки стабильности можно использовать пептидазы и различные биологические среды, такие как плазма и сыворотка человека (см., например, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302).

Далее, пептиды по настоящему изобретению можно присоединять к другим пептидам посредством спейсеров или линкеров. Примеры других пептидов включают в качестве неограничивающих примеров, пептиды, полученные из других ОАА и способные индуцировать ЦТЛ. Альтернативно, два или более пептидов по настоящему изобретению могут быть связаны посредством спейсеров или линкеров. Пептиды, связанные посредством спейсеров или линкеров, могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. Спейсеры или линкеры конкретно не ограничены, но предпочтительно являются пептидами, более предпочтительно, пептидами с одним или несколькими сайтами расщепления, которые можно расщепить ферментами, такими как пептидазы, протеазы и протеасомы. Примеры линкеров или спейсеров включают в качестве неограничивающих примеров: AAY (P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK (R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) или от одного до нескольких остатков лизина (S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715). Пептиды по настоящему изобретению охватывают такие пептиды, связанные с другими пептидами посредством спейсеров или линкеров.

В настоящем документе пептиды по настоящему изобретению могут быть также описаны как "пептид(ы) RAB6KIFL", "полипептид(ы) RAB6KIFL " или "олигопептид RAB6KIFL".

III. Приготовление пептидов RAB6KIFL

Пептиды по настоящему изобретению можно приготовить с использованием хорошо известных техник. Например, пептиды можно приготовить синтетически с использованием технологии рекомбинантных ДНК или химического синтеза. Пептиды по настоящему изобретению могут быть синтезированы по отдельности или в виде более длинных полипептидов, состоящих из двух или более пептидов. Пептиды затем можно изолировать, т.е. очищать или выделять таким образом, чтобы они стали, по существу, свободными от других природных белков клетки-хозяина и их фрагментов или любых других химических веществ.

Пептид по настоящему изобретению можно получать посредством химического синтеза, основываясь на выбранной аминокислотной последовательности. Примеры подходящих способов пептидного синтеза, которые можно применять для синтеза, включают в качестве неограничивающих примеров:

(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;

(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;

(iii) Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1975;

(iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1985;

(v) Development of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese), Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991;

(vi) WO 99/67288; and

(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118.

Альтернативно, пептиды по изобретению можно получать, применяя любые известные способы генетической инженерии для получения пептидов (например, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Способы in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62). Например, сначала готовят подходящий вектор, который содержит полинуклеотид, кодирующий пептид по изобретению в экспрессирующейся форме (например, после регуляторной последовательности, которая соответствует промоторной последовательности) и трансформируют подходящую клетку-хозяина. Клетку-хозяина затем культивируют для получения интересующего пептида. Пептид также можно получать in vitro, применяя систему трансляции in vitro.

IV. Полинуклеотиды

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, который кодирует любой из указанных выше пептидов по настоящему изобретению. Таковые включают в себя полинуклеотиды, полученные из природного гена RAB6KIFL/KIF20A (ID GenBank NM_005733 (SEQ ID NO: 1)), а также те, которые содержат их консервативно модифицированную нуклеотидную последовательность. В настоящем документе фраза "консервативно модифицированная нуклеотидная последовательность" относится к последовательности, которая кодирует идентичные или, по существу, идентичные аминокислотные последовательности. В связи с вырожденностью генетического кода, большое число функционально идентичных нуклеиновых кислот кодирует любой заданный белок. Например, кодоны GCA, GCC, GCG, и GCU - все кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждой позиции, где кодоном предусмотрен аланин, кодон можно изменить на любой соответствующий описанный кодон без изменения закодированного полипептида. Такие вариации нуклеиновых кислот являются "молчащими мутациями", которые представляют собой один из видов консервативно модифицированных вариаций. Каждая последовательность нуклеиновой кислоты в настоящем документе, которая кодирует пептид, описывает также каждую возможную молчащую мутацию нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области будет понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который является, как правило, единственным кодоном для метионина, и TGG, который является, как правило, единственным кодоном для триптофана) может быть модифицирован для получения функционально идентичной молекулы. Таким образом, каждая молчащая мутация нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, косвенно описана в каждой раскрытой последовательности.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может быть составлен из ДНК, РНК и их производных. ДНК обычно состоит из оснований, таких как A, T, C и G; в РНК - T заменена на U.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может кодировать множество пептидов по настоящему изобретению, со вставками или без вставок аминокислотных последовательностей между ними. Например, вставленная аминокислотная последовательность может содержать сайт щепления (например, сайт распознавания фермента) полинуклеотида или транслируемых пептидов. Кроме того, полинуклеотид может включать в себя любые последовательности дополнительно к кодирующей последовательности, которая кодирует пептид по настоящему изобретению. Например, полинуклеотид может быть рекомбинантным полинуклеотидом, который включает в себя регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии пептида, или может быть экспрессирующим вектором (плазмидой) с маркерными генами и т.п. В основном, такие рекомбинантные полинуклеотиды могут быть приготовлены путем воздействия на полинуклеотиды подходящими рекомбинантными способами, например, с использованием полимераз и эндонуклеаз.

Для получения полинуклеотидов по настоящему изобретению можно использовать технологии как рекомбинантного, так и химического синтеза. Например, полинуклеотид может быть получен посредством вставки в подходящий вектор, который экспрессируется в компетентных клетках после трансфекции. Альтернативно, полинуклеотид можно амплифицировать с использованием методов ПЦР или экспрессии в подходящих носителях (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Альтернативно, полинуклеотид может быть синтезирован с использованием методов твердой фазы, как описано в Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5.

Векторы, содержащие полинуклеотид по настоящему изобретению, и клетки-хозяева, которые содержат такие векторы, также включены в настоящее изобретение.

V. Экзосомы

Настоящее изобретение дополнительно относится к внутриклеточным пузырькам, которые называются экзосомами и презентируют на своей поверхности комплексы, образованные пептидами и антигенами HLA. Экзосомы могут быть получены, например, с использованием способов, подробно описанных в Japanese Patent Application Kohyo Publications Nos. Hei 11-510507 и WO 99/03499, и могут быть приготовлены с использованием APC, полученных от пациентов, которых лечат и/или которым проводят профилактику. Экзосомы по данному изобретению можно прививать как вакцины, некоторым образом сходно с пептидами по данному изобретению.

Тип антигенов HLA, входящих в комплексы, должен соответствовать типу антигенов у пациента, которому требуется и/или профилактика. Для получения эффективных результатов желательно применение типа HLA-A2, который высоко экспрессирован среди японцев и европеоидов; находят применение и субтипы, такие как HLA-A2 (A*0201) и HLA-A2 (A*0206). Обычно в клинике типа антигена HLA у пациента, которому требуется лечение, определяют заранее, что позволяет проводить соответствующую селекцию пептидов, имеющих высокие уровни связывания с данным антигеном или обладающих свойством индуцировать ЦТЛ посредством презентации антигена. Кроме того, для того чтобы получить пептиды, показывающие высокую аффинность связывания и способность индуцировать ЦТЛ, можно производить замещение или добавление 1, 2, или нескольких аминокислот, основываясь на аминокислотной последовательности природного неполного пептида RAB6KIFL.

Когда для экзосомы по настоящему изобретению используется антиген HLA-A2 (A*0201), применяют пептиды с последовательностью выбранного пептида SEQ ID NO: 3, 4 и 5.

VI. Антигенпрезентирующие клетки (APC)

Настоящее изобретение также относится к изолированным APC, которые презентируют на своей поверхности комплексы, сформированные между антигенами HLA и пептидами по данному изобретению. APC, которые получены путем контакта с пептидами по данному изобретению или посредством введения нуклеотидов, кодирующих пептиды по данному изобретению в экспрессирующейся форме, можно выделять у пациентов, у которых проводят профилактику или которых лечат, и можно вводить в виде вакцин сами по себе или в сочетании с другими лекарственными средствами, включая пептиды по данному изобретению, экзосомы или цитотоксические T-клетки.

APC не ограничены определенным типом клеток и включают дендритные клетки(DC), клетки Лангерганса, макрофаги, B-клетки и активированные T-клетки, которые известны тем, что презентируют белковые антигены на своей клеточной поверхности, таким образом, что лимфоциты могут их распознать. Поскольку DC являются представителем APC с наиболее сильным индуцирующим действием в отношении ЦТЛ среди APC, они являются предпочтительными APC по настоящему изобретению.

Например, APC можно получать путем индуцирования DC из моноцитов периферической крови и последующего контакта (стимуляции) их с пептидами по данному изобретению in vitro, ex vivo или in vivo. Когда пептиды по данному изобретению вводят пациенту, APC, которые презентируют пептиды по данному изобретению, индуцируются в организме пациента. Фраза "индукция APC" включает в себя контакт (стимулирование) клетки с пептидами по данному изобретению, или нуклеотидами, кодирующими пептиды по данному изобретению, для презентирования комплексов, образованных антигенами HLA-A0206 и пептидами по данному изобретению на поверхности клетки. Альтернативно, после добавления пептидов по данному изобретению к APC, для того чтобы APC могли презентировать пептиды, APC можно вводить пациенту в виде вакцины. Например, введение ex vivo может включать этапы:

a: сбор APC от первого субъекта,

b: контакт APC с этапа a с пептидом и

c: введение APC, нагруженных пептидом, второму субъекту.

Первый субъект и второй субъект могут быть одним и тем же индивидуумом или разными. Альтернативно, по настоящему изобретению предлагается применение пептидов по изобретению для производства фармацевтической композиции, индуцирующей антигенпрезентирующие клетки. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу или процессу для производства фармацевтической композиции, индуцирующей антигенпрезентирующие клетки, где способ включает этап смешивания или соединения пептида по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем. Альтернативно, настоящее изобретение относится к способу или процессу для производства фармацевтической композиции для лечения раков, включая рак мочевого пузыря, рак молочной железы, холангиоцеллюлярную карциному, рак пищевода, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, карциному почек и мелкоклеточный рак легких (SCLC), где способ включает этап смешивания или соединения пептида по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем. Далее, настоящее изобретение также относится к пептидам по настоящему изобретению для индукции антигенпрезентирующих клеток. APC, полученные на этапе b, можно вводить пациенту в виде вакцины. Альтернативно, настоящее изобретение относится к пептидам для лечения раков, включая мочевого пузыря, рак молочной железы, холангиоцеллюлярную карциному, рак пищевода, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, карциному почек и мелкоклеточный рак легких (SCLC).

По одному из аспектов настоящего изобретения, APC по изобретению имеют высокий уровень способности индуцировать ЦТЛ. Термин "высокий уровень способности индуцировать ЦТЛ", означает высокий уровень по отношению к уровню тех APC, которые не контактировали с пептидом или контактировали с пептидами, которые не могут индуцировать ЦТЛ. Такие APC с высоким уровнем способности индуцировать ЦТЛ, можно приготовить способом, который включает этап переноса генов, содержащих полинуклеотиды, которые кодируют пептиды по данному изобретению, в APC in vitro. Введенные гены могут быть в форме ДНК или РНК. Примеры способов введения, которые можно использовать, включают, без ограничений, различные способы, которые обычно применяют в данной области, такие как липофекция, электропорация, и фосфатно-кальциевый способ. Более конкретно, это может быть выполнено, как описано в Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; Published Japanese Translation of International Publication No. 2000-509281. В результате переноса гена в APC, ген подвергается транскрипции, трансляции и т.п. в клетке, и затем полученный белок процессируется при помощи MHC класса I или класса II и проходит дальше путь презентации для презентирования пептидов.

В предпочтительном варианте осуществления APC по настоящему изобретению презентируют на своей поверхности комплекс, состоящий из антигена HLA и олигопептида, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, 4 и 5. Предпочтительно, APC по настоящему изобретению несут на своей поверхности антиген HLA-A2, более конкретно, HLA-A2 (A*0201). Альтернативно, олигопептид, который образует комплекс с антигеном HLA, может быть олигопептидом, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, 4, и 5, где одна две или несколько аминокислот замещены, вставлены, удалены и/или добавлены, например, вторая аминокислота с N-конца может быть замещена лейцином или метионином, и/или аминокислота на C-конце может быть замещена валином или лейцином.

VII. Цитотоксические T-клетки (ЦТЛ)

Цитотоксическая T-клетка, индуцированная против любого из пептидов по настоящему изобретению, усиливает иммунный ответ, направленный на опухоль-ассоциированный эндотелий in vivo, и таким образом может быть использована в качестве вакцин, некоторым образом сходно с пептидами как таковыми. Таким образом, настоящее изобретение также относится к изолированным цитотоксическим T-клеткам, которые специфически индуцированы или активированы любым пептидом по изобретению.

Такие цитотоксические T-клетки можно получать путем (1) введения пациенту пептидов по настоящему изобретению и последующего забора цитотоксических T-клеток у пациента или (2) при контакте (стимуляции) антигенпрезентирующих клеток пациента, и CD8-положительных клеток, или мононуклеарных лейкоцитов периферической крови in vitro с пептидами по настоящему изобретению с последующим выделением цитотоксических T-клеток.

Цитотоксические T-клетки, которые были индуцированы стимуляцией при помощи APC, презентирующих пептиды по данному изобретению, можно получать от пациентов, проходящих лечение и/или профилактику, и можно вводить сами по себе или в сочетании с другими лекарственными средствами, включая пептиды по данному изобретению или экзосомы, для регулирования эффектов. Полученные цитотоксические T-клетки действуют специфически против клеток-мишеней, презентирующих пептиды по данному изобретению, или, например, те пептиды, которые использовали для индуцирования. Другими словами, эти цитотоксические T-клетки могут распознавать (т.е. связывать) при помощи Т-клеточного рецептора комплекс, сформировавшийся между антигеном HLA и пептидом по настоящему изобретению на поверхности клетки-мишени, и затем атаковать клетку-мишень для индуцирования гибели клетки-мишени. Клетки-мишени могут быть клетками, которые эндогенно экспрессируют RAB6KIFL, или клетками, которые трансфицированы геном RAB6KIFL; и клетки, которые презентируют пептид по данному изобретению на своей поверхности вследствие стимуляции пептидом, могут также служить мишенями для атаки активированными ЦТЛ.

В предпочтительном варианте осуществления клетки-мишени несут на своей поверхности антиген HLA-A2, более конкретно, HLA-A2 (A*020).

VIII. T-клеточный рецептор (TCR)

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептиды, способные формировать субъединицу T-клеточного рецептора (TCR), и к способам его применения. TCR альфа и бета обладают способностью формировать TCR, который придает специфичность T-клеткам против опухолевых клеток, экспрессирующих RAB6KIFL. С использованием известных способов в данной области можно изолировать последовательность нуклеиновых кислот альфа- и бета-цепей TCR, экспрессирующихся в ЦТЛ, который индуцирован одним или несколькими пептидами по данному изобретению, и использовать для создания подходящих векторов, которые способны обеспечить высокоэффективный перенос генов в первичные лимфоциты человека (WO 2007/032255 и Morgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)).

Например, такие векторы являются ретровирусными векторами. Предпочтительно, настоящее изобретение относится к готовой композиции, позволяющей быстро модифицировать собственные T-клетки пациента (или клетки другого млекопитающего) для быстрого и легкого получения модифицированных T-клеток с превосходными цитолитическими свойствами по отношению к злокачественной клетке.

Также, настоящее изобретение относится к ЦТЛ, которые получены путем трансдукции нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды субъединиц TCR, которые связываются с пептидом RAB6KIFL, например SEQ ID NOs: 3, 4 и 5 в контексте HLA-A2 (A*0201). Трансдуцированные ЦТЛ обладают свойством хоуминга в отношении злокачественных клеток in vivo, и могут быть наращены хорошо известными способами культивирования in vitro (например, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). T-клетки по настоящему изобретению можно использовать для создания иммуногенной композиции, которую можно применять для лечения или предупреждения рака у пациента, который нуждается в терапии или защите (WO2006/031221).

IX. Фармацевтические средства или композиции

Термины "предупреждение" и "профилактика" используют в данном документе взаимозаменяемо по отношению к любой деятельности, которая уменьшает бремя смертности и заболеваемость. Предупреждение и профилактика могут происходить "на первичном, вторичном и третичном уровнях". В то время как первичное предупреждение и профилактика предотвращают развитие заболевания, вторичный и третичный уровни предупреждения и профилактики охватывают деятельность, нацеленную на предупреждение и профилактику прогрессирования заболевания и появления симптомов, а также на снижение негативного воздействия уже развившегося заболевания за счет восстановления функций и уменьшения осложнений, связанных с заболеванием. Альтернативно, предупреждение и профилактика могут включать широкий спектр профилактической терапии, нацеленной на облегчение тяжести конкретного расстройства, например, снижение пролиферации и мтастазирования опухолей.

Лечение и/или профилактика рака и/или предупреждение его послеоперационного рецидива включает в себя любой из следующих шагов, таких как хирургическое удаление злокачественных клеток, ингибирование роста злокачественных клеток, инволюцию или регрессию опухоли, индукцию ремиссии и подавление развития рака, регрессию опухоли и уменьшение или ингибирование метастазирования. Эффективное лечение и/или профилактика рака снижает смертность и улучшает прогноз пациентов с раком, снижает уровни опухолевых маркеров в крови и облегчает выявляемые симптомы, сопровождающие рак. Например, уменьшение или улучшение симптомов, составляющих эффективное лечение и/или профилактику, включают 10%, 20%, 30% или более уменьшение или стабилизацию заболевания.

Поскольку экспрессия RAB6KIFL повышена при некоторых видах рака по сравнению с нормальными тканями, пептиды по данному изобретению или полинуклеотиды, кодирующие такие пептиды, можно использовать для лечения и/или для профилактики рака и/или предупреждения его послеоперационного рецидива. Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтическому средству или композиции для лечения и/или предупреждения рака, и/или предупреждения его послеоперационного рецидива, которое включает в качестве активного ингредиента один или несколько пептидов по данному изобретению, или полинуклеотиды, кодирующие эти пептиды. Альтернативно, пептиды по изобретению могут экспрессироваться на поверхности любой из вышеупомянутых экзосом или клеток, таких как APC, для применения в качестве фармацевтических средств или композиций. Кроме того, указанные выше цитотоксические T-клетки, которые нацелены на любой из пептидов по настоящему изобретению, также можно использовать в качестве активного ингредиента фармацевтических средств или композиций по изобретению. В контексте настоящего изобретения, фраза "нацеленные на пептид" относится к распознаванию (т.е., связыванию) комплекса, сформированного антигеном HLA-A0206 и пептидом на поверхности клетки-мишени, с Т-клеточным рецептором, и последующей атаке клетки-мишени для индуцирования гибели клетки-мишени.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к применению активного ингредиента, выбранного из:

a) пептида по настоящему изобретению,

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей такой пептид, как описано в настоящем документе, в экспрессирующейся форме,

(c) APC по настоящему изобретению, и

(d) цитотоксической T-клетки по настоящему изобретению

для производства фармацевтической композиции или вещества для лечения рака.

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к активному ингредиенту, выбранному из:

(a) пептида по настоящему изобретению,

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей такой пептид, как описано в настоящем документе, в экспрессирующейся форме,

(c) APC по настоящему изобретению, и

(d) цитотоксической T-клетки по настоящему изобретению

для применения в лечении рака.

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к способу или процессу для производства фармацевтической композиции или вещества для лечения рака, где способ или процесс включают этап соединения фармацевтически или физиологически приемлемого носителя с активным ингредиентом, выбранным из:

(a) пептида по настоящему изобретению,

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей такой пептид, как описано в настоящем документе, в экспрессирующейся форме,

(c) APC по настоящему изобретению, и

(d) цитотоксических T-клеток по настоящему изобретению

в качестве активных ингредиентов.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к способу или процессу для производства фармацевтической композиции или вещества для лечения рака, где способ или процесс включают этап смешивания активного ингредиента с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем, где активный ингредиент выбран из:

(a) пептида по настоящему изобретению,

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей такой пептид, как описано в настоящем документе, в экспрессирующейся форме,

(c) APC по настоящему изобретению, и

(d) цитотоксических T-клеток по настоящему изобретению.

Альтернативно, фармацевтическую композицию или вещество по настоящему изобретению можно использовать как для профилактики рака, так и для предупреждения его послеоперационного рецидива.

Данные фармацевтические средства или композиции находят применение в виде вакцины. В контексте настоящего изобретения, фраза "вакцина" (также обозначаемая как "иммуногенная композиция") относится к веществу, которое обладает функцией индукции противоопухолевого иммунитета после прививки животным.

Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению можно использовать для лечения и/или предупреждения раков и/или предупреждения их послеоперационных рецидивов у субъектов или пациентов, включая человека и любое другое млекопитающее, включая в качестве неограничивающих примеров, мышь, крысу, морскую свинку, кролика, кошку, собаку, овцу, козу, свинью, крупный рогатый скот, лошадь, мартышку, бабуина и шимпанзе, в особенности, коммерчески важное животное или одомашненное животное.

Согласно настоящему изобретению, обнаружено, что олигопептиды с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:3, 4 и 5, являются ограниченными по HLA-A2 (А*0201) эпитопными пептидами, которые могут индуцировать мощный и специфический иммунный ответ. Таким образом, фармацевтические средства или композиции по изобретению, которые содержат любой из олигопептидов с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:3, 4 и 5, особенно подходят для введения пациентам, у которых антиген HLA представляет собой HLA-A2 (A*0201). То же самое касается фармацевтических средств или композиций, которые содержат полинуклеотиды, кодирующие любые из указанных олигопептидов.

Опухоли, которые можно лечить с помощью фармацевтических средств или композиций по настоящему изобретению, не ограничены и включают все типы раков, где задействован RAB6KIFL, включая, например, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, холангиоцеллюлярную карциному, рак пищевода, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, карциному почек и мелкоклеточный рак легких (SCLC). В частности, фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению предпочтительно применяют при раке поджелудочной железы.

Указанные фармацевтические средства или композиции могут содержать, в дополнение к указанным выше активным ингредиентам, дополнительные пептиды, которые обладают свойством индуцировать ЦТЛ против злокачественных клеток, другие полинуклеотиды, кодирующие дополнительные пептиды, другие клетки, презентирующие дополнительные пептиды или т.п. В настоящем документе, дополнительные пептиды, которые обладают свойством индуцировать ЦТЛ против злокачественных клеток, представлены в качестве примера, но не ограничены, опухолеспецифическими антигенами (например, установленными ОАА).

Если необходимо, фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут, но не обязательно, содержать в качестве активного ингредиента дополнительные терапевтические вещества, при условии, что вещество не ингибирует противоопухолевое действие активного ингредиента, например, любого из указанных пептидов. Например, составы могут содержать противовоспалительные средства или композиции, обезболивающие, химиотерапевтические средства и т.п. В дополнение к включению других терапевтических веществ в лекарственное средство как таковых, лекарственные средства по настоящему изобретению можно также вводить последовательно или одновременно с одним или несколькими дополнительными фармакологическими препаратами или композициями. Количества лекарства и фармакологического препарата или композиции зависят, например, от того, какой тип фармакологического препарата(-ов) или композиции(-ий) применяют, от заболевания, которое лечат, и от схемы применения и путей введения.

Следует понимать, что в дополнение к ингредиентам, частично указанным в настоящем документе, фармацевтические средства или композиции по данному изобретению могут содержать другие вещества или композиции, общепринятые в данной области, имеющие отношение к типу обсуждаемого состава.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанные фармацевтические средства или композиции можно включать в промышленные изделия и наборы, которые содержат материалы для лечения патологических состояний заболевания, которое лечат, например, рака. Промышленное изделие может содержать контейнер с любым из данных фармацевтических средств или композиций с этикеткой. Подходящие контейнеры включают бутылки, флаконы и пробирки. Контейнеры могут быть произведены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Этикетка на контейнере должна указывать вещество или композиции, которые применяются для лечения или предупреждения одного или нескольких состояний заболевания. Этикетка может также содержать указания по введению и т.д.

В дополнение к вышеописанному контейнеру набор, содержащий фармацевтическое средство или композиции по настоящему изобретению, может необязательно дополнительно включать в себя второй контейнер с фармацевтически приемлемым растворителем. Он может дополнительно включать другие материалы, желательные с коммерческой и потребительской точки зрения, включая другие буферы, растворители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыш в упаковки с инструкциями по применению.

Фармацевтические композиции могут, при желании, быть представлены в упаковке или распылителе, которые могут содержать одну или несколько стандартных лекарственных форм с активным ингредиентом. Упаковка, например, может содержать металлическую или пластиковую пленку, как например, блистерная упаковка. Упаковка или распылитель могут сопровождаться инструкциями по введению.

(1) Фармацевтические средства или композиции, которые содержат в качестве активного ингредиента пептиды

Пептиды по данному изобретению можно вводить непосредственно в виде фармацевтического средства или композиции или, при необходимости, они могут быть соединены удобными способами для составления фармацевтических средств. В последнем случае, в дополнение к пептидам по данному изобретению, при необходимости, без конкретных ограничений, можно включать носители, эксципиенты, и т.п., которые, как правило, применяются для лекарственных средств. Примерами таких носителей являются стерилизованная вода, физиологический раствор, фосфатный буфер, культуральная жидкость и т.п. Кроме того, фармацевтические средства или композиции могут содержать по мере необходимости, стабилизаторы, суспензии, консерванты, поверхностно-активные вещества и т.п. Фармацевтические средства или композиции по данному изобретению можно использовать с противоопухолевыми целями.

Пептиды по данному изобретению можно готовить в виде комбинации, состоящей из двух или более пептидов по изобретению для индукции ЦТЛ in vivo. Пептидная комбинация может быть в форме коктейля или пептиды могут быть конъюгированы друг с другом с использованием стандартных техник. Например, пептиды могут быть связаны химически или экспрессироваться в виде единой слитой полипептидной последовательности. Пептиды в комбинации могут быть одинаковыми или разными. При введении пептидов по данному изобретению пептиды презентируются посредством антигенов HLA с высокой плотностью на APC, затем происходит индукция ЦТЛ, которые специфически реагируют на комплекс, образованный представленным пептидом и антигеном HLA. Альтернативно, APC, которые презентируют любой из пептидов по данному изобретению на своей поверхности, получают посредством выделения APC (например, DC) у субъектов, которые стимулированы пептидами по изобретению. При обратном введении APC субъектам ЦТЛ субъектов индуцируются, и в результате может быть увеличена агрессивность в отношении злокачественных клеток, таких как рак мочевого пузыря, рак молочной железы, холангиоцеллюлярная карцинома, рак пищевода, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), рак поджелудочной железы, рак простаты, карцинома почек и мелкоклеточный рак легкого (SCLC).

Фармацевтические средства или композиции для лечения и/или предупреждения рака, которые содержат в качестве активного ингредиента пептид по данному изобретению, могут также содержать адъювант, известный эффективным установлением клеточного иммунитета. Альтернативно, их можно вводить с другими активными ингредиентами, и их можно вводить в составе гранул. "Адъювант" относится к соединению, которое усиливает иммунный ответ против белка, когда вводится совместно (или последовательно) с иммунологически активным белком. Адъюванты, предусмотренные в настоящем документе, включают описанные в литературе (Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89). Примеры подходящих адъювантов включают в качестве неограничивающих примеров, фосфат алюминия, гидроксид алюминия, алюмокалиевые квасцы, холерный токсин, токсин сальмонеллы и т.п.

Кроме того, удобно использовать липосомные составы, гранулярные составы, в которых пептид связан с бусинами диаметром в несколько микрометров, и составы, в которых пептид связан с липидом.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут дополнительно включать компонент, праймирующий ЦТЛ. Липиды были идентифицированы как вещества или композиции, способные праймировать ЦТЛ in vivo против вирусных антигенов. Например, остатки пальмитиновой кислоты могут быть присоединены к эпсилон- и альфа-аминогруппам лизиновых остатков и затем связаны с пептидом по изобретению. Липидированный пептид можно затем вводить или непосредственно в мицелле или частице, инкорпорированной в липосому, или эмульгированным в адъюванте. В качестве другого примера липидного праймирования ответа ЦТЛ, можно использовать для праймирования ЦТЛ липопротеины E. coli, такие как трипальмитоил-S-глицерилцистеинлисерил-серин (P3CSS), когда он ковалентно присоединен к подходящему пептиду (см., например, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4).

Способ введения может быть оральным, внутрикожным, подкожным, внутривенным или т.п., а также системным введением или местным введением рядом с областью-мишенью. Введение может быть однократным или усилено за счет многократных введений. Дозировка пептидов по данному изобретению может быть скорректирована соответствующим образом согласно заболеванию, которое лечат, возрасту пациента, весу, способу введения и т.п., и представляет собой, как правило, 0,001 мг на 1000 мг, например, 0,001 мг на 1000 мг, например, 0,1 мг на 10 мг, и может вводиться однократно в период от нескольких дней до нескольких месяцев. Специалист в данной области может выбрать подходящую дозу соответствующим образом.

(2) Фармацевтические средства или композиции, которые содержат в качестве активного ингредиента полинуклеотиды

Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут также содержать нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды, описываемые в настоящем документе, в экспрессирующейся форме. В настоящем документе фраза "в экспрессирующейся форме" означает, что полинуклеотид при введении в клетку будет экспрессироваться in vivo как полипептид, который индуцирует противоопухолевый иммунитет. В примерном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты интересующего полинуклеотида включает в себя регуляторные элементы, необходимые для экспрессии полинуклеотида. Полинуклеотид(ы) может быть оснащен подобным образом для получения стабильной вставки в геноме клетки-мишени (см., например, Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 для описания кассетных векторов для гомологической рекомбинации). См., например, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; патенты США № № 5580859; 5589466; 5804566; 5739118; 5736524; 5679647; и WO 98/04720. Примеры технологий доставки, основанных на ДНК, включают "оголенную ДНК", облегченную доставку (бупивакаин, полимеры, пептид-опосредованная), катионные липидные комплексы и опосредованную частицами ("генная пушка") или доставку, опосредованную давлением (см., например, патент США № 5922687).

Пептиды по настоящему изобретению могут также быть экспрессированы с помощью вирусных или бактериальных векторов. Примеры экспрессирующих векторов включают ослабленные вирусные носители, такие как вирус осповакцины или вирус оспы птиц. Этот подход включает использование вируса осповакцины, например, в качестве вектора для экспрессии нуклеотидных последовательностей, кодирующих пептид. После введения в носитель, рекомбинантный вирус осповакцины экспрессирует иммуногенный пептид и, таким образом, вызывает иммунный ответ. Векторы на основе осповакцины и способы, которые используют в протоколах иммунизации, описаны, например, в патенте США № 4722848. Примеры других векторов включают BCG (Bacille Calmette Guerin). Векторы на основе BCG описаны в Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60. Очевиден широкий спектр других векторов, применимых для терапевтического введения или иммунизации, например, аденовирусные и ассоциированные с аденовирусами векторы, ретровирусные векторы, векторы на основе Salmonella typhi, векторы на основе обезвреженного токсина сибирской язвы и т.п. См., например, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85.

Доставка полинуклеотида пациенту может быть либо прямой, в этом случае пациент напрямую подвергается воздействию вектора, несущего полинуклеотид, либо непрямой, в этом случае клетки сначала трансформируют при помощи интересующего полинуклеотида in vitro, затем клетки трансплантируют пациенту. Эти два подхода известны как генная терапия in vivo и ex vivo, соответственно.

Для общих обзоров способов генной терапии, см. Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215). Общеизвестные способы в области технологии рекомбинантных ДНК, которые также можно использовать для настоящего изобретения описаны в eds. Ausubel et al., Current Protocols in Молекулярная биология, John Wiley & Sons, NY, 1993; и Krieger, Gene Transfer и Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990.

Способ введения может быть оральным, внутрикожным, подкожным, внутривенным или т.п., и системным введением или местным введением рядом с областью-мишенью. Введение может быть однократным или усилено за счет многократных введений. Дозировка полинуклеотида в подходящем носителе или клетках, трансформированных полинуклеотидом, который кодирует пептиды по данному изобретению, может быть скорректирована соответствующим образом согласно заболеванию, которое лечат, возрасту пациента, весу, способу введения и т.п., и представляет собой, обычно, 0,001 мг на 1000 мг, например, 0,001 мг на 1000 мг, например, 0,1 мг на 10 мг, и может вводиться однократно каждые несколько дней или однократно каждые насколько месяцев. Специалист в данной области может соответствующим образом выбрать подходящую дозу.

X. Способы применения пептидов, экзосом, APC и ЦТЛ

Пептиды по настоящему изобретению и полинуклеотиды, кодирующие такие пептиды, можно использовать для индукции APC и ЦТЛ. Экзосомы и APC по настоящему изобретению также можно использовать для индукции ЦТЛ. Пептиды, полинуклеотиды, экзосомы и APC можно использовать в сочетании с любыми другими соединениями при условии, что соединения не ингибируют их способность индуцировать ЦТЛ. Таким образом, любые из указанных выше фармацевтических средств или композиций по настоящему изобретению можно использовать для индукции ЦТЛ и, кроме того, те, что включают пептиды и полинуклеотиды, также можно использовать для индукции APC, как обсуждается далее.

(1) Способ индукции антигенпрезентирующих клеток (APC)

Настоящее изобретение относится к способам индукции APC с использованием пептидов по данному изобретению или полинуклеотидов, кодирующих эти пептиды. Индукцию APC можно проводить, как описано выше в разделе "VI. Антигенпрезентирующие клетки". Изобретение также предлагает способ индукции APC с высоким уровнем способности индуцировать ЦТЛ, индукция которых также упоминалась выше в разделе "VI. Антигенпрезентирующие клетки".

Предпочтительно, способы для индукции APC включают, по меньшей мере, один этап, выбранный из:

a: контакт APC с пептидами по настоящему изобретению, и

b: введение полипептидов по настоящему изобретению в экспрессирующейся форме в APC.

Такие способы индукции APC предпочтительно использовать in vitro или ex vivo. Когда способы используют in vitro или ex vivo, APC для индукции можно получить от пациента, которого будут лечить или от других субъектов, чей антиген HLA такой же, как у пациента. В предпочтительном варианте осуществления APC, индуцированные данными способами, несут на своей поверхности антиген HLA-A2, в частности HLA-A2 (A*0201).

(2) Способ индукции ЦТЛ

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам индукции ЦТЛ с использованием пептидов по данному изобретению, полинуклеотидов, кодирующих эти пептиды, или экзосом или APC, презентирующих эти пептиды.

Настоящее изобретение также относится к способам индукции ЦТЛ с использованием полинуклеотида, кодирующего полипептид, который способен формировать субъединицу Т-клеточного рецептора (TCR), распознающую (т.е. связывающую) комплекс из пептидов по настоящему изобретению и антигенов HLA на поверхности клетки. Предпочтительно, способы для индукции ЦТЛ включают, по меньшей мере, один этап, выбранный из:

a: контакт CD8-позитивной T-клетки с антигенпрезентирующей клеткой и/или экзосомой, которые презентируют на своей поверхности комплекс из антигена HLA и пептида по настоящему изобретению, и

b: введение в CD8-позитивную T-клетку полинуклеотида, кодирующего полипептид, который способен формировать субъединицу Т-клеточного рецептора (TCR), распознающую комплекс из пептида по настоящему изобретению и антигена HLA.

Когда пептиды по данному изобретению вводят пациенту, ЦТЛ индуцируются в организме пациента, и сила иммунного ответа, направленного против злокачественных клеток, возрастает. Альтернативно, пептиды и полинуклеотиды, кодирующие эти пептиды можно использовать для способа терапии ex vivo, при котором APC, полученные у пациента, и CD8-позитивные клетки или мононуклеарные лейкоциты периферической крови приводят в контакт (стимулируют) с пептидами по данному изобретению in vitro, и после индукции ЦТЛ, активированные ЦТЛ возвращают пациенту. Например, способ может включать этапы:

a: выделение APC у пациента,

b: контакт APC из этапа a с пептидом по настоящему изобретению,

c: смешивание APC из этапа b с CD8+ T-клетками, и совместное культивирование для индукции ЦТЛ и

d: выделение CD8+ T-клеток из совместной культуры из этапа c.

Альтернативно, настоящее изобретение предлагает применение пептидов по данному изобретению для производства фармацевтической композиции для индукции ЦТЛ. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу или процессу для производства фармацевтического средства или композиции для индукции ЦТЛ, где способ включает шаг смешивания или соединения пептида по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем. Далее, настоящее изобретение также относится к пептиду по настоящему изобретению для индукции ЦТЛ.

CD⁸⁺-T-клетки с цитотоксической активностью, полученные на этапе d можно вводить пациенту в виде вакцины. APC, которые смешивают с CD⁸⁺ T-клетками на вышеуказанном этапе, также можно получать путем переноса в APC генов, кодирующих данные пептиды, как подробно описано выше в разделе "VI. Антигенпрезентирующие клетки, но без ограничений любая APC или экзосома, которая эффективно презентирует данные пептиды Т-клеткам, может быть использована для данного способа.

Хотя можно использовать в практическом осуществлении или тестировании вариантов осуществления настоящего изобретения любые способы и материалы, сходные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, предпочтительные способы, приборы и материалы описаны здесь. Все публикации, патентные заявки, патенты и остальные источники, упомянутые в настоящем документе, в полном объеме включены в качестве ссылки. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущество. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстрирующими и неограничивающими.

Следующие примеры представлены для того, чтобы проиллюстрировать настоящее изобретение и помочь специалистам в его создании и применении. Примеры никоим образом не ограничивают объем изобретения.

ПРИМЕРЫ

Материалы и Способы

Анализ кДНК на микрочипах

Анализ профиля экспрессии генов с помощью кДНК микрочипа проводили, как описано ранее (Nakamura T. et al. Oncogene 2004; 23:2385-400). Образцы тканей рака поджелудочной железы и прилежащих не опухолевых нормальных тканей поджелудочной железы были получены из операционных препаратов, и все пациенты дали свое письменное информированное согласие на участие в исследовании. На фиг. 1C, относительный показатель экспрессии был рассчитан с помощью деления величины экспрессии мРНК RAB6KIFL в злокачественных клетках на величину экспрессии в нормальном аналоге. На Фиг. 1B относительный показатель экспрессии в нормальных тканях был рассчитан с помощью деления величины экспрессии мРНК RAB6KIFL в каждой нормальной ткани на величину экспрессии мРНК RAB6KIFL в контрольной РНК, которая представляла собой смесь равного количества образцов из 40 нормальных тканей, указанных на Фиг.1B.

Мыши

HLA-A2.1 (HHD) Tgm; H-2D^b-/- бета 2^m-/- двойные нокаутные мыши, которым была введена одноцепочечная генетическая конструкция человеческого 2m-HLA-A2.1 (альфа 1, альфа 2)-H-2Db (альфа 3 трансмембранный цитоплазматический; HHD) были созданы в Department SIDA-Retrovirus, Unite d'Immunite Cellulaire Antivirale, Institute Pasteur, France (Pascolo S. et al. J Exp Med 1997;185:2043-51, Firat H. et al. Eur J Immunol 1999; 29:3112-21) и любезно предоставлены Dr. F.A. Lemonnier. Мышей выращивали в Center for Animal Resources и Development университета Кумамото и содержали в соответствии с указаниями по уходу за животными университета Кумамото.

Клеточные линии и экспрессия HLA

Клеточная линия рака поджелудочной железы человека PANC1, клеточная линия рака толстого кишечника человека CaCo-2, и TAP-дефицитная и HLA-A2 (A*0201)- позитивная клеточная линия T2 были приобретены у Riken Cell Bank (Tsukuba, Japan). Клеточная линия рака поджелудочной железы человека PK8 была любезно предоставлена Cell Resource Center for Biomedical Research Institute of Development, Aging и Cancer, Tohoku University (Sendai, Japan). Линия злокачественных клеток печени человека SKHep1 была любезно предоставлена Dr. Kyogo Ito, Kurume University (Kurume, Japan). Экспрессию HLA-A2 исследовали с использованием проточной цитометрии с анти-HLA-A2 моноклональным антителом (mAb), BB7,2 (One Lambda, Inc., Canoga Park, CA) для того, чтобы отобрать HLA-A2-позитивных доноров крови и направить клеточные линии на анализ цитотоксичности. Эти клетки растили in vitro в среде RPMI 1640 или DMEM, дополненной 10% FCS, в атмосфере с 5% CO₂ при 37°C.

Пациенты, образцы крови и опухолевые ткани.

Клиническое исследование с использованием донорских PBMC было одобрено Экспертным советом по этике университета Кумамото, Кумамото, Япония. Образцы крови, раковые и прилежащие нераковые ткани были получены в ходе рутинных диагностических процедур после получения формального письменного информированного согласия от пациентов госпиталя университета Кумамото. Образцы крови были также взяты у здоровых доноров после получения письменного информированного согласия. Все образцы были анонимными, пронумерованы случайным образом и до момента использования и хранились при -80°C. Все пациенты и здоровые доноры были японцами.

ПЦР с обратной транскрипцией и Нозерн-блоттинг.

Для оценки экспрессии RAB6KIFL на уровне мРНК проводили анализ нормальных и опухолевых тканей, и клеточных линий при помощи ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Использовали следующие последовательности праймеров: RAB6KIFL, прямой 5'-CTACAAGCACCCAAGGACTCT-3' (SEQ ID NO:6) и обратный 5'-AGATGGAGAAGCGAATGTTT-3' (SEQ ID NO: 7) и бета-актин, прямой 5'-CATCCACGAAACTACCTTCAACT-3' (SEQ ID NO: 8) и обратный 5'-TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG-3' (SEQ ID NO: 9), и реакции RT-ПЦР, включающие начальную денатурацию при 94°C в течение 5 минут и 32-35 циклов амплификации при температуре отжига 58°C. Экспрессию мРНК RAB6KIFL сравнивали в тканях и клеточных линиях после нормализации по контрольной мРНК бета-актина.

Анализ вестерн-блоттинга и иммуногистохимическое исследование

Вестерн-блоттинг и иммуногистохимическое окрашивание белка RAB6KIFL проводили, как описано ранее (Nakatsura T. et al. Biochem Biophys Res Commun 2001; 281:936-44. Yoshitake Y. et al. Clin Cancer Res 2004; 10:6437-48). Для анализа нормальных тканей человека Вестерн-блоттингом использовали заранее приготовленный блот нормальных тканей взрослого человека (Biochain, Hayward, CA). Использованные в настоящей работе первичные антитела, поликлональное антитело против RAB6KIFL и моноклональное антитело против бета-актина были приобретены у Bethyl Laboratories, Inc. (Montgomery, TX, USA) и Sigma (Steinheim, Germany), соответственно. Иммуногистохимическое окрашивание CD4 или CD8 в образцах ткани мышей HLA-A2.1 (HHD) Tgm, иммунизированных пептидом RAB6KIFL-A2-10-284, проводили, как описано ранее (Matsuyoshi H. et al. 2004;172:776-86).

Лентивирусный перенос генов

Перенос генов при помощи лентивирусных векторов проводили, как описано ранее (Imai K. et al. Clin Cancer Res 2008; 14:6487-95, Tahara-Hanaoka S. et al. Exp Hematol 2002; 30:11-7). В кратком изложении, 17 мкг самоинактивирующихся векторов CSII-CMV-RfA и CSIIEF-RfA (Miyoshi H. et al. J Virol 1998; 72: 8150-7), несущих кДНК RAB6KIFL, и 10 мкг pCMV-VSV-G-RSV-Rev и pCAG-HIVgp трансфицировали с помощью реагента Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) в клетки 293T, растущие в 10-см чашках Петри. Через 60 часов после трансфекции отбирали среду и осаждали вирусные частицы ультрацентрифугированием (50,000×g, 2 часа). Осадок суспендировали в 50 мкл среды RPMI 1640 и добавляли 10 мкл вирусной суспензии к 5×10⁴ клеток SKHep1, на лунку в плоскодонном 96-луночном планшете. Экспрессия трансфицированного гена RAB6KIFL была подтверждена с помощью Вестерн-блоттинга.

Индукция RAB6KIFL-реактивных ЦТЛ мыши и иммуноферментный спот-анализ на IFN-гамма

Пептиды, производные RAB6KIFL человека, (чистота >95%), несущие связывающие мотивы для HLA-A2 (A*0201)-кодируемых молекул, были выбраны с помощью программного обеспечения BIMAS (BioInformatics and Molecular Analysis Section, Center for information Technology, NIH, Bethesda, MD), и 36 пептидов были синтезированы (American Peptide Company, CA, USA). Ограниченный по HLA-A2 пептид ВИЧ (SLYNTYATL) (SEQ ID NO: 10) был использован в качестве неподходящего пептида. Иммунизацию мышей пептидами производили, как описано ранее (Nakatsura T. et al. Biochem Biophys Res Commun 2003; 306:16-25). Частоту клеток, вырабатывающих IFN-гамма/1×10 ⁵ клеток селезенки CD4- после стимуляции сингенными BM-DC (1×10⁴/лунку), которые были активированы каждым пептидом или не активированы пептидами, анализировали посредством иммуноферментного спот-анализа (ELISPOT), как описано ранее (Komori H. et al. Clin Cancer Res 2006; 12: 2689-97).

Индукция RAB6KIFL-реактивных ЦТЛ человека

Пептиды, производные RAB6KIFL человека, (чистота > 95%), несущие связывающие мотивы для HLA-A2 (A*0201)-кодируемых молекул, были выбраны с помощью программного обеспечения BIMAS (BioInformatics and Molecular Analysis Section, Center for information Technology, NIH, Bethesda, MD), и 36 пептидов были синтезированы (American Peptide Company, CA, USA) (Таблицы 1A и B). Моноцитарные дендритные клетки (DC) были использованы в качестве антигенпрезентирующих клеток (APC) для индукции ответа ЦТЛ против пептидов, презентированных в контексте HLA. DC были получены в культуре in vitro, как описано ранее (Yoshitake Y, et al. Clin Cancer Res 2004;10:6437-48, Harao M, et al. Int J Cancer 2008; in press., Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; in press.). В кратком изложении, PBMC, выделенные у нормального добровольца, позитивного по HLA-A2, с использованием раствора Ficoll-Plaque (GE Healthcare UK, Ltd., Buckinghamshire, UK) были рассортированы на популяцию CD8⁺ и популяцию CD14⁺ при помощи микрогранул (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). Для создания DC, популяция CD14⁺ была культивирована в присутствии 100 нг/мл гранулоцит-макрофаг колониестимулирующего фактора (GM-CSF; PeproTec Inc., NJ, USA) и 10 нг/мл интерлейкина (IL)-4 (PeproTec) в среде AIM-V (Invitrogen), содержащей 2% аутологичной плазмы, инактивированной нагреванием. После 5 дней культивирования добавляли в чашку OK-432 для созревания DC. На седьмой день после начала культивирования производящих цитокины DC, они были активированы 20 нг/мл HLA-A2-связывающими пептидами в присутствии 4 мкг/мл бета 2-микроглобулина (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) в течение 2 ч при 37°C в среде AIM-V. Эти активированные пептидами DC затем облучали (40 Gy) и смешивали в соотношении 1:50 с аутологичными CD8⁺ T-клетками, полученными при помощи позитивной селекции PBMC с использованием анти-CD8 микрогранул (Miltenyi Biotec). Эти культуры высаживали в 24-луночные планшеты, каждая лунка содержала 1×10 ⁵ активированных пептидом DC, 2×10⁶ CD8 ⁺ T-клеток и 5 нг/мл рекомбинантного IL-7 человека (Wako, Osaka, Japan) в 2 мл среды AIM-V с 2% аутологичной плазмы. Через 2 дня к этим культурам добавляли рекомбинантный IL-2 человека (PeproTec Inc.) до конечной концентрации 20 IU/мл. Две дополнительные стимуляции один раз в неделю при помощи нагруженных пептидом аутологичных DC с использованием аналогичной процедуры проводили на 7 и 14 дни. Через шесть дней после последней стимуляции исследовали антигенспецифический ответ индуцированных ЦТЛ с помощью анализа высвобождения ⁵¹Cr и ELISPOT на IFN-гамма.

Ответ ЦТЛ против линий злокачественных клеток

ЦТЛ культивировали совместно со злокачественными клетками, или с активированными пептидом T2-клетками, в качестве клетки-мишени (5×10³/лунку) в указанном соотношении эффектор/мишень и проводили стандартный анализ высвобождения ⁵¹Cr, как описано ранее (Yoshitake Y, et al. Clin Cancer Res 2004;10:6437-48. Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; in press. ). В кратком изложении, клетки-мишени метили 3,7 KBq Na₂ ⁵¹Cr₄ (Perkin Elmer Life Sciences) в течение 1 ч при 37°C в инкубаторе с CO₂. Меченые клетки-мишени промывали три раза и готовили активированные пептидом клетки-мишени путем инкубирования клеток с 20 мкг/мл пептида в течение 3 ч при 37°C. Клетки-мишени смешивали с эффекторными клетками в финальном объеме 200 мкл в плоскодонной планшете для микротитрования и инкубировали. После 6 часов инкубирования отбирали 50 мкл супернатанта из каждой лунки и измеряли радиоактивность с использованием гамма-счетчика. Специфическую цитотоксичность оценивали посредством расчета процента специфического высвобождения ⁵¹Cr.

Блокирование HLA класса I, или HLA-DR, выполняли, как описано ранее (Yoshitake Y. et al. Clin Cancer Res 2004; 10:6437-48., Imai K. et al. Clin Cancer Res 2008; in press.). В кратком изложении, перед совместным культивированием ЦТЛ с линией злокачественных клеток для анализа высвобождения ⁵¹Cr или ELISPOT, злокачественные клетки-мишени инкубировали в течение 1 часа с 10 мкг/мл mAb против класса I, W6/32, или 10 мкг/мл mAb против HLA-DR, H-DR-1, и затем исследовали воздействие mAb на цитотоксическую активность или выработку IFN-гамма ЦТЛ.

Статистический анализ

Для оценки статистической значимости различий между данными, полученными посредством ELISPOT, и различий в размере опухоли между группами использовали двусторонний t-тест Стъюдента. Достоверным считали значение P<0,05. Статистический анализ проводили с использованием коммерческого статистического пакета программ (SPSS for Windows, version 11,0, Chicago, IL, USA).

Результаты

Выявление активации гена RAB6KIFL при раке поджелудочной железы и различных злокачественных опухолях на основании кДНК микрочипа.

Предварительно были исследованы профили экспрессии генов в 6 образцах тканей рака поджелудочной железы и прилежащих нормальных аналогах с использованием полногеномного микрочипа для кДНК, содержащего 27,648 генов. После анализа были выбраны 6 генов, поскольку относительный показатель экспрессии для этих генов был более чем в пять раз выше в тканях рака поджелудочной железы по сравнению с их нормальными аналогами (фиг. 1A) (Imai K. et al. Clin Cancer Res 2008; 14: 6487-95). Экспрессию этих генов анализировали с использованием анализа кДНК на микрочипе в 29 типах нормальных тканей, включая 4 эмбриональные ткани (фиг. 1B). Таким образом, сфокусировались на RAB6KIFL/KIF20A, как на новом ОАА для рака поджелудочной железы. Экспрессия гена RAB6KIFL в тканях рака поджелудочной железы была заметно повышена у всех 6 исследованных пациентов (средний показатель относительной экспрессии: 32,000, диапазон: 15-72,000). Кроме того, ген RAB6KIFL был слабо экспрессирован только в яичках и тимусе (фиг. 1B). На основании данных предварительного анализа кДНК на микрочипе уровень экспрессии гена RAB6KIFL был также повышен в раках легкого и раке мочевого пузыря (фиг. 1C) (Nakamura T. et al. Oncogene 2004;23:2385-400, Kitahara O. et al. Cancer Res 2001; 61: 3544-9, Hasegawa S. et al. Cancer Res 2002; 62: 7012-7, Kikuchi T. et al. Oncogene 2003; 22: 2192-205, Obama K. et al. Hepatology 2005; 41: 1339-48).

Экспрессия мРНК и белка RAB6KIFL в нормальных органах, линиях злокачественных клеток и тканях рака поджелудочной железы.

Экспрессию гена RAB6KIFL в нормальных тканях на уровне мРНК анализировали с использованием ОТ-ПЦР. Полуколичественный ОТ-ПЦР анализ RAB6KIFL в нормальных тканях выявил, что он экспрессируется только в яичках (фиг. 2A). Экспрессия гена RAB6KIFL была выявлена при помощи ОТ-ПЦР практически во всех панкреатических и других HLA-A2-позитивных линиях злокачественных клеток (фиг. 2B).

Потом экспрессию гена RAB6KIFL проанализировали при помощи ОТ-ПЦР в тканях рака и их прилежащих нормальных аналогах, которые были удалены хирургически. Экспрессия гена RAB6KIFL была выявлена в 5 из 8 образцов тканей рака поджелудочной железы, но незначительная экспрессия была выявлена в их нормальных аналогах (фиг. 2C). Кроме того, его экспрессия была выявлена в метастатических очагах в коже и брюшине. Также исследовали экспрессию белка RAB6KIFL в раковых и нескольких нормальных тканях посредством Вестерн-блоттинга (фиг. 3A, B). Мы не смогли выявить белок RAB6KIFL в восьми нормальных тканях и получили очень слабую полосу для яичек с мобильностью, сходной с той, которую наблюдали в лизате клеток PANC1 (фиг. 3A). С другой стороны, белок RAB6KIFL был обнаружен в тканях рака поджелудочной железы у двух исследованных пациентов, но не в прилежащих нормальных тканях (фиг. 3B).

Затем, для подтверждения опухоль-ассоциированной сверхэкспрессии белка RAB6KIFL было исследовано большое количество образцов ткани рака поджелудочной железы в парафине при помощи иммуногистохимического анализа. Сильное окрашивание RAB6KIFL наблюдали, в основном, в цитоплазме злокачественных клеток при раке поджелудочной железы, в то время как очень слабое окрашивание наблюдали в ацинарных клетках и нормальном эпителии протоков в прилежащих панкреатических тканях (фиг. 4A). Кроме того, сходное сильное окрашивание наблюдали в метастатических очагах брюшины (фиг. 4A). Никакого окрашивания не было обнаружено в образцах ткани с опухолеподобным панкреатитом (фиг. 4A). RAB6KIFL не был окрашен в нормальном головном мозге, легком, печени, почке, желудке, тонком кишечнике, толстом кишечнике, селезенке, скелетной мышце, коже, тимусе и яичках(фиг. 4B).

Предсказание HLA-A2 (A*0201)-связывающих пептидов, полученных из RAB6KIFL.

Таблицы 1A и 1B показывают HLA-A2 (A*0201)-связывающие пептиды белка RAB6KIFL в порядке убывания оценки предсказания высокой аффинности связывания. В итоге, были выбраны 36 пептидов с потенциальной HLA-A2-связывающей активностью.

Таблица 1A HLA-A2(A*0201)-связывающие 9-мерные пептиды, полученные из RAB6KIFL.
Обозначение	Стартовая позиция	Подпоследовательность	Оценка	SEQ ID
	204	LLSNEVIWL	459
RAB6KIFL-A2-9-12	12	LLSDDDVVV	199	SEQ ID NO:3
	715	KMLEPPPSA	191
	750	KLGESLQSA	164
	300	SIWISFFEI	131
	38	NLLSDCSVV	106
	688	QLQEVKAKL	88
	695	KLQQCKAEL	75
RAB6KIFL-A2-9-809	809	CIAEQYHTV	59	SEQ ID NO:4
	11	GLLSDDDVV	52
	436	TLGRCIAAL	49
	179	ILPRSLALI	41
	183	SLALIFNSL	41
	625	KLNILKESL	37
	781	ILIKQDQTL	36
	231	GLQEEELST	31
	494	TLHVAKFSA	29
	556	SMYGKEELL	24
	788	TLAELQNNM	20
	209	VIWLDSKQI	20
Стартовая позиция указывает номер аминокислоты с N-конца RAB6KIFL. Оценка связывания получена из Материалов и Способов.

Таблица 1B HLA-A2(A*0201)-связывающие 10-мерные пептиды, полученные из RAB6KIFL.
Обозначение	Стартовая позиция	Подпоследовательность	Оценка	SEQ ID
	654	LLQEARQQSV	485
	788	TLAELQNNMV	285
	742	RLLRTELLQKL	182
	39	LLSDCSVVST	119
	11	GLLSDDDVVV	106
	400	KISELSLCDL	97
	573	LLLKERQEKL	66
	97	VLQAPKDSFA	46
RAB6KIFL-A2-10-284	284	AQPDTAPLPV	29	SEQ ID NO:5
	132	GQASFFNLTV	27
	625	KLNILKESTL	26
	382	SIFSIRILHL	25
	203	PLLSNEVIWL	22
	455	NLVPFRDSKL	21
	506	QLVHAPPMQL	21
	98	LQAPKDSFAL	21
	66	KVYLRVRPLL	21
Стартовая позиция указывает номер аминокислоты с N-конца RAB6KIFL. Оценка связывания получена из Материалов и Способов.

Выявление полученных из RAB6KIFL и ограниченных по HLA-A2 эпитопов для ЦТЛ мыши с использованием трансгенных мышей HLA-A2,1 (HHD)

Для выявления полученных из RAB6KIFL и ограниченных по HLA-A2 эпитопов для ЦТЛ были выбраны 36 различных кандидатных пептидов. Каждый состоял из 9 или 10 аминокислот с высокой предсказанной оценкой связывания с HLA-A2 (A*0201), наиболее распространенным в мире продуктом аллеля HLA. Оценка была основана на предсказывающем алгоритме для HLA-связывающих пептидов NIH BIMAS (Таблицы 1A, B). Для того чтобы определить, какой пептид может индуцировать реактивные к пептиду ЦТЛ, клетки селезенки CD4^- выделяли у мышей HLA-A2.1 (HHD) Tgm, которые были иммунизированы дважды интраперитонеально BM-DC, активированными 12 смесями из трех видов пептидов, выбранных из 36 пептидов. Выделенные клетки были снова стимулированы in vitro при помощи BM-DC, активированных каждым пептидом. Результаты ELISPOT анализа показали, что клетки селезенки CD4^- , стимулированные пептидом RAB6KIFL-A2-9-12, RAB6KIFL-A2-9-809 и RAB6KIFL-A2-10-284, вырабатывают значительное количество IFN-гамма в пептид-специфической манере (фиг. 5A). Эти клетки селезенки CD4^- (2×10⁴) показали 149,0±22,2 точечных импульсов/лунку в ответ на BM-DC, активированные пептидом RAB6KIFL-A2-9-12, и 32,6±9,9 точечных импульсов/лунку в присутствии не нагруженных пептидом BM-DC (P<0,01). Аналогично, клетки селезенки CD4^-, которые были стимулированы BM-DC, активированными пептидом RAB6KIFL-A2-9-809, показали 117,2±23,4 точечных импульсов/лунку и 51,4±7,8 точечных импульсов/лунку в присутствии не нагруженных пептидом BM-DC (P<0,01). Кроме того, клетки селезенки CD4^-,которые были стимулированы BM-DC, активированными пептидом RAB6KIFL-A2-10-284, также показали 141,2±5,5 точечных импульсов/лунку и 19,2±5,2 точечных импульсов/лунку в присутствии не нагруженных пептидом BM-DC (P<0,01). Для остальных пептидов не наблюдалось никакого достоверного пептид-специфического ответа. Эти результаты подтверждают, что пептиды RAB6KIFL-A2-9-12, RAB6KIFL-A2-9-809 и RAB6KIFL-A2-10-284 могут быть ограниченными по HLA-A2 эпитопными пептидами для ЦТЛ у мышей HLA-A2.1 (HHD) Tgm, и эти пептиды, как ожидается, будут эпитопами для ЦТЛ человека.

Иммунизация эпитопным пептидом RAB6KIFL-A2-9-809 не индуцирует аутоиммунный феномен у HLA-A2.1 (HHD) Tgm

Для исследования очень важно, индуцирует ли иммунизация пептидом RAB6KIFL аутоиммунную реакцию или нет. Мы, таким образом, провели иммуногистохимический анализ нескольких жизненно важных органов с использованием mAb против CD4 и CD8 у мышей HLA-A2 (HHD) Tgm после двухкратной вакцинации пептидом RAB6KIFL-A2-9-809, аминокислотная последовательность которого полностью консервативна в человеческом и мышином RAB6KIFL. В результате, не выявили никаких патологических нарушений, таких как инфильтрация лимфоцитами или разрушение тканей, вызванное аутоиммунитетом (фиг. 5B). Также у этих мышей не выявили нарушения, которые часто наблюдают у мышей с аутоиммунными заболеваниями, такие как нарушения шерсти и кожи, диарея и потеря веса. Эти результаты указывают, что T-лимфоциты, стимулированные пептидом RAB6KIFL-A2-9-809, не атаковали нормальные ткани, по меньшей мере, у HLA-A2 Tgm.

Индукция RAB6KIFL-реактивных ЦТЛ из PBMC от HLA-A2 (A*0201)-позитивных здоровых доноров

Была предпринята попытка создания RAB6KIFL-специфических ЦТЛ из PBMC здоровых HLA-A2 (A*0201)-позитивных доноров путем стимуляции пептидами RAB6KIFL-A2-9-12 (SEQ ID NO: 3), RAB6KIFL-A2-9-809 (SEQ ID NO: 4) и RAB6KIFL-A2-10-284 (SEQ ID NO: 5). PBMC были изолированы у здоровых HLA-A2 (A*0201)-позитивных доноров, и CD8⁺ T-клетки, отсортированные из PBMC, инкубировали с аутологичными моноцитарными DC, активированными каждым пептидом. После трехкратной стимуляции исследовали цитотоксическую активность против T2-клеток, активированных пептидом, с использованием анализа высвобождения ⁵¹Cr (фиг. 6A) и анализа ELISPOT на IFN-гамма (данные не показаны). ЦТЛ, индуцированные из PBMC от двух здоровых доноров, продемонстрировали цитотоксическую активность по отношению к T2-клеткам, активированным пептидом RAB6KIFL-A2-9-12 (SEQ ID NO: 3), RAB6KIFL-A2-9-809 (SEQ ID NO: 4) или RAB6KIFL-A2-10-284 (SEQ ID NO: 5), но не по отношению к T2-клеткам, активированным неподходящим и ограниченным по HLA-A2 пептидом ВИЧ, или без пептидной нагрузки. Сходные ответы наблюдали у остальных доноров (данные не показаны). Эти результаты указывают, что данные ЦТЛ обладают пептид-специфической цитотоксичностью.

Далее исследовали, способны ли эти ЦТЛ убивать линии злокачественных клеток человека, экспрессирующие RAB6KIFL и HLA-A2 (A*0201). Как показано на фиг. 6B, RAB6KIFL-реактивные ЦТЛ, стимулированные пептидом RAB6KIFL-A2-9-12 (слева), RAB6KIFL-A2-9-809 (посередине), или RAB6KIFL-A2-10-284 (справа), демонстрируют цитотоксичность по отношению к PANC1 (RAB6KIFL⁺, HLA-A2⁺ ), CaCo-2 (RAB6KIFL⁺, HLA-A2⁺), но не по отношению к PK8 (RAB6KIFL⁺, HLA-A2^-) у здоровых доноров.

Кроме того, SKHep1/RAB6KIFL (RAB6KIFL^high, HLA-A2⁺), клетки SKHep1 (RAB6KIFL^low, HLA-A2⁺), трансфицированные геном RAB6KIFL (фиг. 2B), были использованы в качестве клеток-мишеней для подтверждения, что данные пептиды процессируются естественным образом из белка RAB6KIFL в злокачественных клетках. Как показано на фиг. 6C, ЦТЛ, индуцированные посредством стимуляции пептидом RAB6KIFL-A2-9-12 (слева), RAB6KIFL-A2-9-809 (посередине), и RAB6KIFL-A2-10-284 (справа) демонстрируют цитотоксичность против SKHep1/RAB6KIFL, но не против SKHep1/Mock. Эти результаты подтверждают, что данные пептиды могут быть процессированы естественным образом и экспрессированы на поверхности злокачественных клеток в контексте HLA-A2 молекулы.

Для подтверждения того, что индуцированные ЦТЛ распознают клетки-мишени в HLA-класс I-ограничивающей манере, проводили HLA класс I-блокирующий анализ с использованием mAb против HLA класса I (W6/32) для того, чтобы заблокировать распознавание злокачественных клеток с помощью ЦТЛ (фиг. 6D). В результате, антитело против HLA класса I могло значительно и статистически достоверно (фиг. 6D, P<0,01) ингибировать выработку IFN-гамма, стимулированную клетками PANC1, в анализе ELISPOT на ЦТЛ, которые были созданы путем стимуляции пептидом RAB6KIFL-A2-9-12 (слева), RAB6KIFL-A2-9-809 (посередине), или RAB6KIFL-A2-10-284 (справа). Эти результаты ясно указывают, что данные индуцированные ЦТЛ распознают клетки-мишени, экспрессирующие RAB6KIFL, в HLA-класс I-ограничивающей манере.

Обсуждение

Согласно примеру, было показано, что RAB6KIFL представляет собой ОАА и является перспективной мишенью для противоопухолевой иммунотерапии при раке поджелудочной железы. Для создания противоопухолевой иммунотерапии важно идентифицировать ОАА, которые активно экспрессируются в опухолевых, но не в нормальных клетках. Анализ кДНК на микрочипе показал, что мРНК RAB6KIFL была сверхэкспрессирована в клетках рака поджелудочной железы (Imai K, Hirata S, Irie A, Senju S, Ikuta Y, Yokomine K, Harao M, Inoue M, Tsunoda T, Nakatsuru S, Nakagawa H, Nakamura Y et al. Clin Cancer Res 2008; 14: 6487-95) и едва экспрессирована в их нормальных аналогах и большинстве нормальных тканей взрослого человека, за исключением яичек и тимуса (фиг. 1B). Кроме того, ген RAB6KIFL был также сверхэкспрессирован при раках легкого и раке мочевого пузыря, а также при раке поджелудочной железы (фиг. 1C). Анализ ОТ-ПЦР продемонстрировал, что мРНК RAB6KIFL часто экспрессируется в некоторых линиях злокачественных клеток и тканях рака поджелудочной железы, но не в нормальных тканях взрослого человека, включая костный мозг, за исключением яичек (фиг. 2). Сходно, Вестерн-блоттинг и иммуногистохимический анализ выявили, что белок RAB6KIFL обнаруживается в клетках рака поджелудочной железы, но не в их нормальных аналогах и нормальных тканях взрослого человека, включая тимус, за исключением яичек (Фиг. 3, 4). Эти наблюдения подтверждают характеристику RAB6KIFL, как ракового тестикулярного ОАА на уровне белка.

Для идентификации ОАА, пригодных в качестве мишеней для противоопухолевой иммунотерапии, другим ключевым моментом является выбор антигенов, которые незаменимы для пролиферации, инвазии, метастазирования и выживания злокачественных клеток. Недавно, Taniuchi et al. сообщили, что RAB6KIFL вовлечен в канцерогенез поджелудочной железы (Taniuchi K. еt al. Cancer Res 2005; 65:105-12), в дополнение к его ранее описанной роли в движении мембран (Echard A. еt al. Science 1998;279:580-5) и делении клеток (Fontijn RD et al. Mol Cell Biol 2001;21:2944-55, Hill E, Clarke M, Barr FA. EMBO J 2000; 19:5711-9). Они показали, что подавление эндогенного RAB6KIFL в клетках рака поджелудочной железы при помощи малой интерферирующей РНК приводит к резкому ослаблению роста злокачественной клетки, опосредованного взаимодействием с DLG5 (disc, large homologue 5), белком-переносчиком RAB6KIFL (Taniuchi K. et al. Cancer Res 2005; 65:105-12), предполагая, что, таким образом, RAB6KIFL, по-видимому, играет важную роль в канцерогенезе поджелудочной железы и мог бы, таким образом, быть потенциально пригодной мишенью для противоопухолевой иммунотерапии.

Потенциал RAB6KIFL, как мишени для иммунотерапии, был проверен в настоящем изобретении путем выявления ограниченных по HLA-A2 эпитопных пептидов и оценки их иммуногенности. Эксперимент с использованием вакцинации мышей HLA-A2 (HHD) Tgm 36 кандидатными пептидами с предсказанной с помощью алгоритма BIMAS аффиностью связывания с HLA-A2 (A*0201) выявил три ограниченных по HLA-A2 эпитопных пептида RAB6KIFL, которые могут стимулировать создание ограниченных по HLA-A2 мышиных ЦТЛ, не вызывая аутоиммунного феномена, такого как инфильтрация лимфоцитами или разрушение тканей (фиг. 5). Кроме того, RAB6KIFL-реактивные ЦТЛ можно создать из PBMC, стимулированных всеми тремя пептидам у трех независимых здоровых доноров (фиг. 6). Такие ЦТЛ могут убивать не только T2-клетки, активированные распознаваемым пептидом, но также и линии злокачественных клеток, экспрессирующие RAB6KIFL и HLA-A2. Антигенспецифичность ЦТЛ по отношению к этим пептидам была подтверждена полученными данными, что эти ЦТЛ демонстрируют цитотоксичность по отношению к клеткам SKHep1, трансфицированным человеческим геном RAB6KIFL, но не по отношению к Mock-трансфицированным SKHep1. Эти данные подтверждают, что эти пептиды RAB6KIFL (RAB6KIFL-A2-9-12, RAB6KIFL-A2-9-809, и RAB6KIFL-A2-10-284) процессируются естественным образом из белка RAB6KIFL в злокачественных клетках и презентируются на поверхности клетки вместе с молекулами HLA-A2 для того, чтобы их распознали ЦТЛ. Кроме того, возможно, что пептид RAB6KIFL-A2-9-809 может более эффективно процессироваться из белка RAB6KIFL по сравнению с пептидами RAB6KIFL-A2-9-12 и RAB6KIFL-A2-10-284 в злокачественных клетках, поскольку ЦТЛ, индуцированные пептидом RAB6KIFL-A2-9-809, демонстрируют более сильную цитотоксичность, направленную против злокачественных клеток, экспрессирующих RAB6KIFL и HLA-A2, по сравнению с цитотоксичностью ЦТЛ, которые индуцированы путем стимуляции пептидами RAB6KIFL-A2-9-12 или RAB6KIFL-A2-10-284.

HLA-A2.1 (HHD) Tgm, у которых отсутствует экспрессия эндогенной мышиной молекулы H-2b-класса I, были использованы для выявления ограниченных по HLA-A2 эпитопных пептидов RAB6KIFL для ЦТЛ. Как сообщалось, HLA-A2.1 (HHD) Tgm являются универсальной животной моделью для доклинической оценки иммунотерапии, основанной на пептидах (Imai K. et al. Clin Cancer Res 2008; 14:6487-95, Komori H. et al. Clin Cancer Res 2006; 12:2689-97, Harao M. et al. Int J Cancer 2008; 123: 2616-25, Pascolo S. et al. J Exp Med 1997; 185: 2043-51, Firat H. et al. Eur J Immunol 1999; 29: 3112-21).

Для того чтобы избежать неблагоприятных воздействий, вызванных вакцинацией ОАА, RAB6KIFL был выбран, как мишень, которая слабо экспрессируется в нормальных тканях взрослого человека. Однако было очень важно установить, может ли вакцинация RAB6KIFL индуцировать аутоиммунные заболевания в течение или после противоопухолевой иммунотерапии. В настоящем документе аминокислотные последовательности двух из трех эпитопных пептидов не являются консервативными у человека и мыши (RAB6KIFL-A2-9-12, человек: LLSDDDVVV (SEQ ID NO: 3), мышь: LLSDEDVVD (SEQ ID NO: 11); RAB6KIFL-A2-10-284, человек: AQPDTAPLPV (SEQ ID NO: 5), мышь: AQPDTVPVSV) (SEQ ID NO: 12). Таким образом, аутоиммунный феномен у HLA-A2 Tgm исследовали после двухкратной вакцинации пептидом RAB6KIFL-A2-9-809, аминокислотные последовательности которого полностью консервативны у человека и мыши. Одним из преимуществ использования HLA-A2 Tgm является возможность исследовать аутоиммунный феномен in vivo. Конечно, поскольку число нормальных тканей, исследованных здесь, является ограниченным, нельзя исключать возможную экспрессию RAB6KIFL в некоторых нормальных тканях, которые не были здесь исследованы. Таким образом, следует быть осторожным относительно индукции аутоиммунных заболеваний при использовании пептидов RAB6KIFL для иммунотерапии рака.

В заключение, настоящие результаты подтверждают, что RAB6KIFL представляет собой ОАА, содержащий эпитопные пептиды, которые способны вызывать реакцию ЦТЛ на злокачественные клетки, экспрессирующие как RAB6KIFL, так и HLA-A2. Поскольку RAB6KIFL высоко экспрессируется в широком спектре злокачественных опухолей человека, RAB6KIFL, таким образом, представляет собой перспективную мишень для основанной на пептидах иммунотерапии для лечения широкого спектра злокачественных опухолей, в особенности рака поджелудочной железы. Дальнейшее исследование возможности индуцировать RAB6KIFL-специфические ЦТЛ у пациентов с раком поджелудочной железы остается, таким образом, вопросом большой важности для клинического применения.

Промышленная применимость

Настоящее изобретение описывает новые ОАА, в частности, производные RAB6KIFL, которые индуцируют мощные и специфические противоопухолевые иммунные ответы и применимы для широкого спектра типов рака. Такие ОАА требуют дальнейшей разработки в качестве пептидных вакцин против заболеваний, ассоциированных с RAB6KIFL, например, раков, таких как рак мочевого пузыря, рак шейки матки, холангиоцеллюлярная карцинома, рак пищевода, рак желудка, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), остеосаркома, рак поджелудочной железы, карцинома почек и опухоль мягких тканей.

Хотя изобретение описано здесь подробно и со ссылкой на конкретные варианты его осуществления, следует понимать, что вышеизложенное описание является по своей природе иллюстративным и пояснительным и предназначено для иллюстрации изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления. Посредством рутинных экспериментов, специалист в данной области легко узнает, что различные изменения и модификации могут быть сделаны в нем в пределах сущности и объема изобретения, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.