агент для придания кокуми

Формула изобретения

1. Пищевая композиция, содержащая от 0,000001 до 0,005 вес.% -Glu-Nva-Gly; от 0,005 до 80 вес.% ингредиентов, полученных из свинины или говядины, и другие пищевые ингредиенты.

2. Способ получения пищевого продукта, включающий стадии:

добавления агента для придания кокуми, содержащего -Glu-Nva-Gly в количестве от 0,000001 до 0,005 вес.% и 0,005 до 80 вес.% пищевых ингредиентов, происходящих из свинины или говядины, к другим пищевым ингредиентам, при смешивании их вместе; и

если требуется, кулинарной обработки полученной смеси пищевых ингредиентов.

3. Способ по п. 2, в котором указанный продукт находится в форме напитка.

4. Способ по п. 2, в котором указанный продукт представляет собой полуфабрикат для получения пищевого продукта.

5. Способ по п.2, в котором указанный продукт представляет собой полуфабрикат для получения пищевого продукта в форме напитка.

6. Способ по любому из пп.2-5, в котором стадия добавления агента для придания кокуми, состоящего из -Glu-Nva-Gly, к пищевым ингредиентам, происходящим из свинины или говядины, при смешивании их вместе, дополнительно включает стадию контроля концентрации -Glu-Nva-Gly в полуфабрикате, используемом для получения пищевого продукта, на уровне в диапазоне от 0,000001 до 99,9 вес.%.

7. Способ по п.6, дополнительно включающий стадию добавления полуфабриката для получения пищевого продукта к другим пищевым ингредиентам при контроле концентрации -Glu-Nva-Gly в полученном пищевом продукте на уровне от 0,000001 до 0,005 вес.%.

8. Способ по п.6, в котором стадия добавления агента для придания кокуми, состоящего из -Glu-Nva-Gly, к пищевым ингредиентам при смешивании их вместе, включает стадию контроля концентрации -Glu-Nva-Gly в полученном пищевом продукте на уровне от 0,000001 до 0,005 вес.%.

9. Пищевой продукт, полученный способом по любому из пп.2-8.

10. Пищевой продукт по п.9, в котором указанный продукт находится в форме напитка.

11. Пищевой продукт по п.9, в котором указанный продукт представляет собой полуфабрикат для получения пищевого продукта.

12. Пищевой продукт по п.9, в котором указанный продукт представляет собой полуфабрикат для получения пищевого продукта в форме напитка.

13. Способ усиления вкуса и/или запаха пищевого продукта, включая напиток, включающий стадию добавления пищевой композиции по п.1 в пищевой продукт.

14. Способ по п.13, в котором указанный продукт находится в форме напитка.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к агенту для придания кокуми и комплексному агенту для придания кокуми, содержащему пептид, проявляющий активность агониста CaSR. Кроме того, настоящее изобретение также относится к пищевой композиции, содержащей пептид, проявляющий активность агониста CaSR, в концентрации не менее заданного уровня.

Уровень техники

Требования потребителей к вкусу и привлекательности пищевых продуктов в последнее время повысились, например, из-за разнообразия пищевых привычек людей. В этой связи вкус и привлекательность пищи общепринятым образом выражают посредством пяти основных вкусов - сладкого, соленого, кислого, горького и умами («мясного» вкуса), но соответственно увеличивается потребность в создании нового агента, способного придавать пище прекрасный кокуми. Кокуми обозначает вкус, который нельзя выразить упомянутыми пятью основными вкусами, поскольку он предоставляет дополнительные ощущения к основным вкусам, такие как густота, полнота (наполненность), непрерывность и гармоничность (Прим. «Kokumi» приблизительно соответствует термину «mouthfeel» - «ощущение во рту»).

С другой стороны, кальций-чувствительный рецептор (CaSR) также называют кальциевым рецептором и сигналы от этого рецептора могут контролировать множество биологических функций в живых организмах, поэтому вещества, проявляющие активность агониста CaSR, можно использовать в качестве агентов для придания кокуми (см. патентные документы 1 и 2 и непатентный документ 4, как указано ниже).

Возможны различные профили развития вкуса в упомянутом «кокуми». В этой связи существует потребность в создании агента, способного придавать пище кокуми среднего вкуса и послевкусия, и имеющего высокий титр. Кроме того, поскольку агент для придания кокуми используют обычно в пищевых продуктах, то, соответственно, он должен обладать отличной стабильностью.

Соответственно, потребовался поиск среди множества вариантов соединений, проявляющих желательную активность агониста CaSR, чтобы таким образом обнаружить вещество, способное придавать кокуми другому материалу (т.е. пищевым продуктам или напиткам), обладающее более выдающимся эффектом придания кокуми, в частности кокуми начального вкуса, которое обладает отличной стабильностью и которое можно легко получать с низкой стоимостью, и чтобы таким образом предоставить агент для придания кокуми, состоящий из такого вещества, а также комплексный агент для придания кокуми, содержащий вещество и другие вещества, проявляющие активность агониста CaSR, в комбинации.

С другой стороны, что касается некоторых -глутамил-пептидов, каждый из которых несет остаток -глутамина на N-конце, известны пептиды, синтезированные в качестве субстратов, например, для исследований ферментативной активности (см. патентный документ 3 и непатентные документы 1-3, указанные позже), но еще не известно каких-либо случаев, когда -Glu-Nva-Gly действительно использовали в пищевых продуктах, или каких-либо случаев его выделения из природных материалов для добавления в пищу.

Кроме того, в вышеуказанном патентном документе 1 описано, например, что -Glu-X-Gly (где X представляет собой аминокислоту или ее производное) представляет собой соединение, обладающее активностью агониста CaSR, но в этом патентном документе не описано, например, в примерах, что -Glu-Nva-Gly синтезирован на практике, и его эффекты оценены, и более конкретно, в этом патентном документе нигде не описан конкретно этот трипептид. В этом отношении, полное содержание патентных документов 1 и 2 включено сюда путем ссылки, как если бы их содержание было непосредственно включено в настоящее описании.

Документы уровня техники

Патентные документы

Патентный документ 1: WO 2007/055393, реферат;

Патентный документ 2: WO 2008/139945, реферат;

Патентный документ 3: WO 2007/066430, реферат.

Непатентные документы

Непатентный документ 1: Molecular Pharmacology (1982), 21(3), 629-36;

Непатентный документ 2: Biokhimiya (Moscow) (1972), 37(4), 757-61;

Непатентный документ 3: The Journal of Biological Chemistry, (2010), 285 (2), 1016-22.

Сущность изобретения

Задача настоящего изобретения состоит в обнаружении большинства соединений, проявляющих желательную активность агониста CaSR, чтобы таким образом обнаружить вещество, способное придавать кокуми улучшенного вкуса, в частности кокуми среднего вкуса/послевкусия, и при этом обладающее отличной стабильностью и имеющее высокий титр, чтобы таким образом обеспечить агент для придания кокуми, состоящий из такого вещества, а также комплексный агент для придания кокуми, содержащий комбинацию такого вещества с другими веществами, проявляющими активность агониста CaSR. Еще одной задачей изобретения является обеспечение пищевой композиции, содержащей вышеуказанное вещество в концентрации не менее заданного уровня.

В результате поиска множества соединений авторы этого изобретения неожиданно обнаружили, что -Glu-Nva-Gly (L- -глутамил-L-норвалил-глицин) обладает высокой активностью агониста CaSR и эффектом придания прекрасного кокуми, а также что он, в частности, придает пище кокуми с рисунком развития вкуса, соответствующего кокуми среднего вкуса/послевкусия. Кроме того, авторы изобретения обнаружили, что обнаруженный -Glu-Nva-Gly имеет очень высокий титр, не менее чем в 10 раз превышающего титр, наблюдаемый для -Glu-Val-Gly в качестве одного из трипептидов, сходных с -Glu-Nva-Gly, обладает отличной стабильностью и обладает таким благоприятным характером развития вкуса, что демонстрирует высокую способность придания кокуми среднего вкуса/послевкусия. Кроме того, авторы изобретения далее обнаружили, что -Glu-Nva-Gly может служить самостоятельным агентом для придания кокуми. Кроме того, авторы изобретения подобным образом обнаружили, что предпочтительную пищевую композицию с улучшенным кокуми, можно получать включением -Glu-Nva-Gly в пищевые продукты. Кроме того, комплексный агент для придания кокуми можно получать комбинированием указанного вещества с другими веществами, каждое из которых проявляет активность агониста CaSR. Авторы таким образом пришли к настоящему изобретению.

Более конкретно, настоящее изобретение в настоящем документе относится к агенту для придания вкуса кокуми, состоящему из -Glu-Nva-Gly.

Кроме того, настоящее изобретение также относится к пищевой композиции, содержащей -Glu-Nva-Gly (в настоящем документе эта композиция обозначена также как «пищевая композиция по изобретению»). Настоящее изобретение также предоставляет комплексный агент для придания кокуми, содержащий в комбинации (а) -Glu-Nva-Gly и (b) одну или по меньшей мере две аминокислоты или пептида, выбранных из группы, состоящей из -Glu-X-Gly, где X представляет собой аминокислоту или производное аминокислоты, -Glu-Val-Y, где Y представляет собой аминокислоту или производное аминокислоты, -Glu-Abu, -Glu-Ala, -Glu-Gly, -Glu-Cys, -Glu-Met, -Glu-Thr, -Glu-Val, -Glu-Orn, Asp-Gly, Cys-Gly, Cys-Met, Glu-Cys, Gly-Cys, Leu-Asp, D-Cys, -Glu-Met (О), -Glu- -Glu-Val, -Glu-Val-NH₂, -Glu-Val-ола, -Glu-Ser, -Glu-Tau, -Glu-Cys (S-Me) (О), -Glu-Leu, y-Glu-Ile, -Glu-t-Leu и -Glu-Cys (S-Me).

Настоящее изобретение предоставляет агент для придания кокуми с прекрасным действием и, в частности, придающий отличный и уникальный кокуми среднего вкуса/послевкусия, с характером развития вкуса, который имеет профиль, показанный, например, на Фиг. 1, а также обладающий отличной стабильностью и который можно легко получать с низкой стоимостью, так же как комплексный агент для придания кокуми, содержащий его. Кроме того, настоящее изобретение предоставляет отличную пищевую композицию, содержащую вещество, обладающее отличным эффектом придания кокуми в концентрации, не менее заданного уровня.

Применение агента для придания кокуми по изобретению может позволять придание пищевым продуктам с низким содержанием жира ощущения или впечатления плотности и гладкости, как у жира. Соответственно, полученный пищевой продукт, содержащий агент по изобретению, может сохранять впечатление плотности, подобное наблюдаемому у исходной пищи до снижения в ней содержания жира, даже когда содержание жира снижено, и, таким образом, агент по изобретению позволяет получать низкокалорийные пищевые продукты, полезные для здоровья. Примеры таких пищевых продуктов включают пищевые продукты, содержащие мясо, или родственные им продукты и молочные продукты. В частности, при употреблении пищевого продукта, содержащего агент для придания кокуми по изобретению, потребитель может получить ощущение плотности и гладкости, как у жира, причем не сразу при употреблении, а через короткое время после этого.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показан профиль развития вкуса, наблюдаемый для агента для придания кокуми среднего вкуса/послевкусия.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения

Вещество -Glu-Nva-Gly, используемое по изобретению, содержит L- -глутамил-L-норвалин-глицин, в котором две аминокислоты связаны друг с другом через пептидную связь, и/или его соли, в частности его пригодные к употреблению в пищу соли.

Вещество -Glu-Nva-Gly обладает отличным эффектом придания кокуми и, таким образом, его можно использовать в качестве агента для придания кокуми. -Glu-Nva-Gly можно использовать таким образом, что пищевая композиция, которой придают кокуми, содержит трипептид в количестве (все части и проценты здесь являются весовыми) в диапазоне от 0,1 млр.д. (миллиардных долей) до 99,9 вес.%, предпочтительно от 1 млр.д. до 10 вес.% и более предпочтительно от 0,01 м.д. (миллионных долей) до 1 вес.% от общего веса пищевой композиции. Иными словами, другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к пищевой композиции, содержащей -Glu-Nva-Gly, и предпочтительно пищевой композиции, содержащей -Glu-Nva-Gly в количестве, лежащем в диапазоне от 0,1 млр.д. до 99,9 вес.%. Более предпочтительно, настоящее изобретение относится к пищевой композиции, содержащей -Glu-Nva-Gly в количестве, лежащем в диапазоне от 0,1 млр.д. до 50 м.д.

Кроме того, агент для придания кокуми по изобретению или -Glu-Nva-Gly можно использовать также в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным ингредиентом для приправ, выбранным из группы, состоящей из аминокислот, таких как глутамат натрия (MSG), нуклеиновых кислот, таких как инозинмонофосфат (IMP), неорганических солей, таких как хлорид натрия, органических кислот, таких как лимонная кислота, и различных видов дрожжевых экстрактов, чтобы таким образом получить обеспечивающую преимущества приправу с улучшенным кокуми, по сравнению с кокуми, полученным при использовании таких дополнительных ингредиентов для приправ по отдельности.

Согласно изобретению термин «кокуми» обозначает вкус, который нельзя выразить посредством пяти основных вкусов или сладкого вкуса, соленого вкуса, кислого вкуса, горького вкуса и умами, и, более конкретно, обозначает вкус, при котором дополнительные вкусы основных вкусов, такие как густота, полнота (наполненность), продолжительность и гармоничность, усилены в дополнение к основным вкусам. Кроме того, термин «придание кокуми» в настоящем документе означает, что пять основных вкусов, выраженные сладким вкусом, соленым вкусом, кислым вкусом, горьким вкусом и умами, усилены, в то время как у субъекта одновременно создается впечатление вкусов, дополнительных к основными вкусами, таких как густота, полнота (наполненность), продолжительность и гармоничность, ассоциированные с первым упомянутым. Кроме того, это можно обозначать также как эффект усиления вкуса. Таким образом, -Glu-Nva-Gly, служащий в качестве агента для придания вкуса по изобретению, можно подобным образом обозначать как «усилитель вкуса». Агент для придания кокуми по изобретению, или -Glu-Nva-Gly, можно использовать также как усилитель сладкого вкуса, усилитель соленого вкуса, усилитель кислого вкуса, усилитель горького вкуса или усилитель умами.

Кроме того, вкус пищи может меняться с течением времени при потреблении и после него, и эти изменения вкуса обычно обозначают как начальный вкус, средний вкус и послевкусие, по порядку, начиная с момента потребления пищи. Хотя в действительности они представляют собой относительное понятие, но начальный вкус, средний вкус и послевкусие у субъекта, в целом, определяют как вкус, наблюдаемый в пределах времени, продолжающегося от 0 до 2 секунд, от 2 до 5 секунд и не менее 5 секунд потребления пищи соответственно. Вкус, наблюдаемый в течение времени, продолжающегося от 0 до 5 секунд, обозначают в настоящем документе как «начальный/средний вкус», и вкус, наблюдаемый в течение времени, продолжающегося от 2 до приблизительно 30 секунд, обозначают как «средний вкус/послевкусие» (см. данные, нанесенные на график на Фиг. 1). Что касается оценки вкуса, в случае, когда вкус разделяют на три подразделения, для дегустаторов (лиц, употребляющих пищу, подлежащую оценке) сложно концентрировать внимание на оценке, и привычно используемый тест содержит оценку вкуса с разделением на два подразделения.

Эффекты вещества, обладающего активностью CaSR, на кокуми и характер развития вкуса можно подтверждать, например, таким способом, как человеческая сенсорная проба для оценки вкуса. Пример такой человеческой сенсорной пробы для оценки вкуса проиллюстрирован в примерах этой патентной заявки, но сенсорная проба для оценки вкуса, пригодная по изобретению, не ограничена этой конкретной пробой.

Термин «CaSR», используемый в этом описании, обозначает кальций-чувствительный рецептор, который принадлежит к классу С 7-тяжевого трансмембранного рецептора, и который, таким образом, также обозначают как «кальциевый рецептор». Термин «агонист CaSR» используемый в этом описании, обозначает вещество, связывающееся с вышеупомянутым CaSR, чтобы таким образом активировать рецептор CaSR. Кроме того, термин «активировать CaSR», применяемый в настоящем документе, обозначает, что лиганд связывается с CaSR, чтобы таким образом активировать белок, связанный с гуаниновым нуклеотидом, и чтобы передавать сигналы, получаемые от него. Кроме того, способность вещества образовывать связь с CaSR, чтобы таким образом активировать его, обозначают как «активность агониста CaSR».

В настоящее время способ скрининга соединения, обладающего активностью агониста CaSR, конкретно представлен в настоящем документе, но стадии скрининга соединений нисколько не ограничены стадиями, указанными ниже.

1) Стадия добавления тестируемого вещества в систему для измерения активности CaSR, используемую для определения активности CaSR, и стадия определения активности CaSR;

2) Стадия сравнения активности CaSR, наблюдаемой при добавлении тестируемого вещества в систему для измерения активности, с активностью, наблюдаемой до добавления вещества; и

3) Стадия отбора вещества, обладающего активностью агониста CaSR при добавлении в систему для измерения активности CaSR.

Определение активности CaSR подобным образом можно проводить с использованием, например, системы измерения с использованием клеток, обладающих способностью экспрессировать CaSR. Вышеуказанные клетки могут представлять собой клетки с эндогенной экспрессией CaSR или генетически рекомбинантные клетки с экзогенно введенным геном для экспрессии CaSR. Вышеуказанная система для измерения активности CaSR не является ограниченной никакой конкретной системой, пока она позволяет детекцию связи (или реакции) между активирующим CaSR веществом и CaSR или пока она может испускать или выдавать поддающий детекции сигнал в ответ на образование связи (или реакцию) между активирующим CaSR веществом и CaSR внутри клеток при добавлении внеклеточного лиганда (активирующего вещества), специфического для CaSR, к вышеуказанным клеткам, обладающим способностью экспрессировать CaSR. Если активность CaSR детектируют в ходе реакции с тестируемым веществом, можно заключить, что тестируемое вещество обладает желательной активностью стимуляции CaSR.

Примером вышеуказанного CaSR, предпочтительно используемого в настоящем документе, является CaSR человека, кодируемый геном CaSR человека, зарегистрированным в GenBank под номером доступа NM_000388. В этом отношении, однако, CaSR не является ограниченным белком, кодируемым геном, обладающим вышеуказанной последовательностью зарегистрированного CaSR, и может представлять собой любой белок, который способен быть кодированным геном, обладающим не менее 60%, предпочтительно не менее 80%, и более предпочтительно не менее 90% гомологии последовательности с последовательностью вышеуказанного гена, при условии, что белок, кодируемый таким геном, обладает желательной функцией CaSR. В этой связи функцию CaSR можно проверять посредством получения клеток, экспрессирующих эти гены, и определения затем любого изменения силы тока и/или любого изменения концентрации иона кальция внутри клеток, наблюдаемого при добавлении кальция в систему, содержащую клетки.

В отношении вышеуказанного CaSR его источник не является ограниченным каким-либо конкретным источником и он может представлять собой CaSR, полученный из совокупности видов животных, включая мышей, крыс и собак, в дополнение к вышеуказанному CaSR человека.

Как обсуждали выше, активность CaSR можно подтверждать посредством использования живых клеток, способных экспрессировать CaSR или его фрагмент, мембран клеток, способных экспрессировать CaSR или его фрагмент, или системы in vitro, содержащей CaSR или белок в виде его фрагмента.

Пример, в котором используют такие живые клетки, приведен ниже, но настоящее изобретение совершенно никаким образом не ограничено этим примером.

CaSR экспрессируют в культивируемых клетках, таких как ооциты ксенопуса, клетки яичника, полученные от хомяков, и фетальные клетки почки человека. Эту экспрессию CaSR можно осуществлять посредством введения, в плазмиде, обладающей экзогенным геном, гена CaSR, который подвергали обработке клонированием в форме плазмиды или кРНК, полученных с использованием гена в качестве матрицы. Пригодными для детекции такой реакции могут являться электрофизиологические способы или флуоресцентный индикатор для детекции какого-либо увеличения концентрации кальция внутри клеток.

Экспрессию CaSR исходно подтверждали по присутствию любого ответа, наблюдаемого при добавлении кальция или активатора, обладающего специфичностью к нему. Более конкретно, пригодными по изобретению в качестве желательных клеток являются клетки, в которых внутриклеточный электрический ток детектируют при добавлении кальция в концентрации приблизительно 5 мМ, или клетки, в которых испускание флуоресцентных лучей наблюдают при добавлении флуоресцентного индикатора. В этой связи концентрацию кальция, добавляемого к клеткам, различным образом изменяют для определения зависимости интенсивности внутриклеточной силы тока от концентрации кальция. Затем тестируемое вещество разводят до концентрации в диапазоне от приблизительно 1 мкМ до 1 мМ, полученную суспензию добавляют к ооцитам или культивируемым клеткам и затем активность CaSR в присутствии вышеуказанного тестируемого вещества измеряют, чтобы таким образом определить активность агониста CaSR для тестируемого вещества.

Более конкретно, в качестве такого теста для определения активности агониста CaSR по изобретению пригоден, например, тест, проиллюстрированный в тестовых примерах, описанных в этом описании, но тест для определения активности совсем не является ограниченным таким конкретным тестом.

Аминокислоты или пептиды, используемые в комплексе агента для придания кокуми по изобретению в комбинации с -Glu-Nva-Gly, включают в себя, например, одну или по меньшей мере две аминокислоты или пептида, выбранных из группы, состоящей из -Glu-X-Gly (где X представляет собой аминокислоту или производное аминокислоты, отличные от Nva), -Glu-Val-Y (где Y представляет собой аминокислоту или производное аминокислоты), -Glu-Nva, -Glu-Abu, -Glu-Ala, -Glu-Gly, -Glu-Cys, -Glu-Met, -Glu-Thr, -Glu-Val; -Glu-Orn, Asp-Gly, Cys-Gly, Cys-Met, Glu-Cys, Gly-Cys, Leu-Asp, D-Cys, -Glu-Met (О), -Glu- -Glu-Val, -Glu-Val-NH₂, -Glu-Val-ола, -Glu-Ser, -Glu-Tau, -Glu-Cys (S-Me) (О), -Glu-Leu, -Glu-Ile, -Glu-t-Leu и -Glu-Cys (S-Me). В этом отношении аминокислоты могут подобным образом включать в себя, например, нейтральные аминокислоты, такие как Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Cys, Met, Asn, Gln, Pro, Hyp и t-Leu; кислые аминокислоты, такие как Asp, Glu; основные аминокислоты, такие как Lys, Arg и His; ароматические аминокислоты, такие как Phe, Tyr и Trp; так же как гомосерин, цитруллин, орнитин, -аминомасляную кислоту, норвалин, норлейцин и таурин. Кроме того, аминокислоты, используемые по изобретению, могут представлять собой также искусственные аминокислоты (имеющие небелковую конструкцию), такие как трет-лейцин, циклолейцин, -аминоизомасляная кислота, L-пеницилламин, аллотреонин и аллоизолейцин. В этой связи в пептиде: -Glu-X-Gly X может представлять собой вышеуказанную аминокислоту или ее производное, но предпочтительно используемыми по изобретению являются аминокислоты или их производные, отличные от Cys. Из них предпочтительно используемые по изобретению в комбинации с -Glu-Nva-Gly включают в себя, например, -Glu-Val-Gly, -Glu-Abu-Gly, -Glu-tLeu-Gly, -Glu-Nva и -Glu-Abu.

В частности, агент для придания кокуми по изобретению состоит из -Glu-Nva-Gly и обладает способностью придания уникального и превосходного кокуми начального вкуса и профилем развития вкуса (запаха), показанным на фиг. 1. Соответственно, является предпочтительным, чтобы -Glu-Nva-Gly использовали в комбинации с пептидом, таким как -Glu-Val-Gly, обладающим профилем развития вкуса, отличным от первого упомянутого.

В описании этого патента следующие сокращенные формы аминокислот (остатков) обозначают следующие аминокислоты, соответственно:

(1) Gly: глицин;

(2) Ala: аланин;

(3) Val: валин;

(4) Leu: лейцин;

(5) Ile: изолейцин;

(6) Met: метионин;

(7) Phe: фенилаланин;

(8) Tyr: тирозин;

(9) Trp: триптофан;

(10) His: гистидин;

(11) Lys: лизин;

(12) Arg: аргинин;

(13) Ser: серин;

(14) Thr: треонин;

(15) Asp: аспарагиновая кислота;

(16) Glu: глутаминовая кислота;

(17) Asn: аспарагин;

(18) Gln: глутамин;

(19) Cys: цистеин;

(20) Pro: пролин;

(21) Orn: орнитин;

(22) Sar: саркозин;

(23) Cit: цитруллин;

(24) N-Val: (или Nva): норвалин (2-аминовалериановая кислота);

(25) N-Leu (или Nle): норлейцин;

(26) Abu: -аминомасляная кислота;

(27) Tau: таурин;

(28) Hyp: гидроксипролин;

(29) t-Leu: трет-лейцин;

(30) Cle: циклолейцин;

(3l) Aib: -амино-изомасляная кислота (2-метилаланин);

(32) Pen: L-пеницилламин;

(33) алло-Thr: аллотреонин;

(34) алло-Ile: аллоизолейцин.

Кроме того, термин «производное аминокислоты», применяемый в настоящем документе, обозначает множество производных вышеуказанных аминокислот, и их конкретные примеры включают особые аминокислоты и искусственные аминокислоты, аминоспирты или аминокислоты, аминокислотные боковые цепи которых, такие как карбоксильные группы, аминогруппы и/или тиоловая группа цистеина, являются замещенными множеством заместителей. Примеры таких заместителей включают алкильную группу, ацильную группу, гидроксильную группу, аминогруппу, алкиламиногруппу, нитрогруппу, сульфонильную группу или различные защитные группы. Таким образом, примеры таких производных аминокислот включают Arg (NO₂): N- -нитроальгинин, Cys (SNO): S-нитроцистеин, Cys (S-Me): S-метилцистеин, Cys (S-аллил): S-аллилцистеин, Val-NH₂ : валинамид, и Val-ол: валинол (2-амино-3-метил-1-бутанол). В то же время пептид: -Glu-Cys(SNO)-Gly, используемый по изобретению, представляет собой пептид, представленный следующей структурной формулой, и символ: «(О)», представленный в вышеуказанных формулах: -Glu-Met (O) и -Glu-Cys (S-Me) (O), означает, что каждый из этих пептидов обладает сульфоксидной структурой. Символ «( )» из -Glu означает, что другая аминокислота связана с глутаминовой кислотой через карбоксильную группу, расположенную в -положении последнего.

[Химическая формула 1]

-Glu-Nva-Gly и аминокислоты и пептиды, используемые в комбинации по изобретению, могут представлять собой коммерчески доступные аминокислоты и пептиды, если их можно закупать на рынке, или их можно получать любым известным способом, таким как (l) способы химического синтеза или (2) способ с использованием ферментативной реакции, но более удобным является использование способа химического синтеза. -Glu-Nva-Gly, используемый по изобретению, является очень коротким по длине, поскольку он содержит только три аминокислотных остатка, и, таким образом, является более удобным принять способ химического синтеза. По этой причине использование этого трипептида является достаточно преимущественным с промышленной точки зрения. Кроме того, при химическом синтезе -Glu-Nva-Gly, используемого по изобретению, и аминокислот и пептидов, используемых в комбинации с ним, их получение можно проводить посредством синтеза или полусинтеза этих олигопептидов с использованием устройства для синтеза пептидов. В качестве такого способа химического синтеза этих пептидов по изобретению может являться пригодным, например, способ твердофазного пептидного синтеза. Полученный таким образом пептид можно затем очищать обычными способами, такими как способ ионообменной хроматографии, способ обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии или способ аффинной хроматографии. Такой способ твердофазного пептидного синтеза и используемый затем способ очистки пептидов хорошо известны в данной области.

Альтернативно, при получении -Glu-Nva-Gly, используемого по изобретению, и аминокислот и пептидов, используемых в комбинации с ним, при использовании ферментативной реакции, их получение можно осуществлять с использованием способа, описанного в документации Международного патента, находящегося в открытом доступе, WO 2004/011653. Более конкретно, их можно получать посредством реакции аминокислоты или пептида, в которых концевая карбоксильная группа эстерифицирована или аминирована с другой аминокислотой, аминогруппа которой находится в свободном состоянии (например, аминокислотой, карбоксильная группа которой защищена) в присутствии пептидообразующего фермента и затем посредством очистки полученного дипептида или трипептида. Примерами таких пептидообразующих ферментов являются культуры микроорганизмов, обладающих способностью продуцировать пептид; клеточные тела микроорганизмов, выделенные из культуры; или продукт, полученный переработкой клеточных тел микроорганизмов; или пептидообразующий фермент, полученный из микроорганизмов. В то же время в настоящем документе подразумевают, что описание WO 2004/011653 включено в описание этой заявки.

В дополнение к вышеуказанным способам ферментативного получения и способам химического синтеза пептиды, используемые по изобретению, часто включены в природные продукты, например растения, такие как овощи и фрукты, микроорганизмы, такие как дрожжи, и другие природные ресурсы. Когда они присутствуют в природных веществах, их можно выделять из этих веществ, и полученные выделенные продукты можно подобным образом использовать по изобретению.

Агент для придания кокуми или комплексный агент для придания кокуми по изобретению можно использовать в качестве приправы без какой-либо специальной последующей обработки или можно смешивать с носителями, пригодными для пищевых продуктов и напитков, или с ингредиентами для других приправ, чтобы таким образом получать различные приправы. Примеры таких других ингредиентов для приправ включают специи, сахариды, подсластители, пищевые волокна, витамины, аминокислоты, такие как глутамат натрия (MSG), нуклеиновые кислоты, такие как инозинмонофосфат (IMP), неорганические соли, такие как хлорид натрия и органические кислоты, такие как лимонная кислота, так же как различные виды дрожжевых экстрактов.

В частности, пищевые продукты с низким содержанием жира, предпочтительные в качестве пищевых композиций, каждая из которых содержит агент для придания кокуми или комплексный агент для придания кокуми по изобретению, представляют собой, по природе, пищевые продукты, содержащие жиры, и, в частности, пищевые продукты, содержание жира в которых понижено. В этом отношении термин «жир(ы)» является синонимом термина «масло и жир», где жиры включают жиры как в твердой, так и в жидкой формах, и они могут представлять собой животные жиры или растительные жиры.

Примеры таких пищевых продуктов с пониженным содержанием жира включают молочные продукты, такие как молоко, йогурт масло и сливки; животные жиры и жиросодержащие масла и/или растительные масла, и жиросодержащие пищевые продукты, такие как маргарин, молоко для кофе, соусы и заправка для соусов; эмульгированные пищевые продукты, такие как заправки для салатов и майонез; различные виды карри и рагу, содержащие переработанное или подвергнутое кулинарной обработке мясо или т.п.; и множество супов, содержащих мясные экстракты или мясные эссенции. Кроме того, такие пищевые продукты с пониженным содержанием жира подобным образом включают в себя, например, стейк, жареное на гриле мясо или т.п., каждое из которых состоит из мяса с пониженным содержанием жира, и печеные закусочные пищевые продукты, отличные от закусочных пищевых продуктов, подвергнутых обычной обработке обжариванием. Из них предпочтительные в качестве таких пищевых продуктов с пониженным содержанием жира включают в себя, например, пищевые продукты, каждый из которых обладает содержанием жира от 1/2 до 1/3 содержания в обычных пищевых продуктах.

Если агент для придания кокуми по изобретению включают в вышеуказанные пищевые продукты с пониженным содержанием жира, пищевые продукты становятся способными создавать у потребителя сильное впечатление плотности и гладкости, как у жира, не на начальной стадии, а на следующей за ней стадии, при употреблении этих пищевых продуктов с пониженным содержанием жира.

В этой связи обычные молочные продукты и йогурт обладают содержанием жира, лежащим в диапазоне от 3 до 4%, но известны также, в качестве таких молока и йогурта, молоко и йогурт, свободные от какого-либо жира (содержание жира приблизительно 0,1%). Агент для придания кокуми или комплексный агент для придания кокуми по изобретению сходным образом является эффективным для пищевых продуктов с пониженным содержанием жира.

Кроме того, агент для придания кокуми или комплексный агент для придания кокуми по изобретению особенно предпочтительно добавлять к пищевому продукту, содержащему ингредиент, полученный из свинины. Более конкретно, настоящее изобретение в настоящем документе относится к пищевой композиции, содержащей -Glu-Nva-Gly и ингредиент, полученный из свинины. Пищевые продукты, содержащие ингредиент, полученный из свинины, не являются ограниченным каким-либо конкретным пищевым продуктом, но можно перечислить, например, экстракты свинины, колбасу и супы для готовой к употреблению лапши. В этом отношении содержание ингредиента, полученного из свинины, предназначенного для включения в эти пищевые продукты, не является ограниченным каким-либо конкретным диапазоном, но примеры таких пищевых продуктов, содержащих ингредиент, полученный из свинины, включают пищевые продукты, обладающие его содержанием порядка от 0,005 до 80 вес.%.

Кроме того, является также предпочтительным включать агент для придания кокуми или комплексный агент для придания кокуми по изобретению в пищевой продукт, содержащий ингредиент, полученный из говядины. Более конкретно, настоящее изобретение в настоящем документе относится к пищевой композиции, содержащей -Glu-Nva-Gly и ингредиент, полученный из говядины. Пищевые продукты, содержащие ингредиент, полученный из говядины, не являются ограниченным каким-либо конкретным пищевым продуктом, но можно перечислить, например, экстракты говядины, говяжью солонину, супы, приготовленные с использованием говядины, и соусы с использованием говядины. В этом отношении содержание ингредиента, полученного из говядины, предназначенного для включения в эти пищевые продукты, не является ограниченным каким-либо конкретным диапазоном, но примеры таких пищевых продуктов, содержащих ингредиент, полученный из говядины, включают пищевые продукты, обладающие его содержанием порядка от 0,005 до 80 вес.%.

-Glu-Nva-Gly, используемый по изобретению, и аминокислоты или пептиды, используемые в комбинации с ним, могут подобным образом включать аминокислоты или пептиды в форме их солей. Если -Glu-Nva-Gly, используемый по изобретению, и аминокислоты или пептиды, используемые в комбинации с ним, присутствуют в форме их солей, соли не являются ограниченными конкретными солями, пока они представляют собой фармакологически пригодные и растворимые соли, и их конкретные примеры включают соли аммония, соли щелочных металлов, таких как натрий и калий, соли щелочноземельных металлов, таких как кальций и магний, соли алюминия, соли цинка, соли органических аминов, таких как триэтиламин, этаноламин, морфолин, пирролидин, пиперидин, пиперазин и дициклогексиламин, и соли основных аминокислот, таких как альгинин и лизин, и кислых групп, таких как карбоксильные группы. Кроме того, примеры вышеуказанных соединений подобным образом включают соли неорганических кислот, таких как соляная кислота, серная кислота, фосфорная кислота, азотная кислота и бромистоводородная кислота; соли органических карбоновых кислот, таких как уксусная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, виннокаменная кислота, янтарная кислота, дубильная кислота, масляная кислота, hibenzoic acid, памовая кислота, энантовая кислота, декановая кислота, теоклиновая кислота, салициловая кислота, молочная кислота, щавелевая кислота, миндальная кислота и яблочная кислота; и соли органических сульфоновых кислот, таких как метансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота и п-толуолсульфоновая кислота, с основными группами соединений.

Агент для придания кокуми, пищевую композицию или комплексный агент для придания кокуми по изобретению можно использовать в любой форме, такой как сухие порошки, пасты и растворы, без какого-либо ограничения их физических свойств.

Агент для придания кокуми, пищевую композицию или комплексный агент для придания кокуми по изобретению можно использовать для включения, например, во множество пищевых продуктов и напитков, таких как пищевые продукты, напитки и приправы.

Если агент для придания кокуми, пищевую композицию или комплексный агент для придания кокуми по изобретению используют для включения, например, во множество пищевых продуктов и напитков, таких как пищевые продукты, напитки и приправы, окончательное количество -Glu-Nva-Gly и окончательное количество аминокислоты или пептида, используемого в комбинации с ним, не является ограниченным каким-либо конкретным количеством, пока оно может обеспечивать достижение желательных эффектов по изобретению, однако каждое из количества -Glu-Nva-Gly и/или количества аминокислоты или пептида попадает в диапазон от приблизительно 0,1 млр.д. до 99,9 вес.%, и предпочтительно, от приблизительно 1 млр.д. до 10 вес.% и более предпочтительно, от приблизительно 0,01 м.д. до 1 вес.% от веса каждого соответствующего пищевого продукта, напитка, приправы или т.п.

Множество пищевых продуктов, таких как пищевые продукты, напитки или приправы, каждый из которых содержит включенное агент для придания кокуми, пищевую композицию или комплекс агента для придания кокуми по изобретению, может дополнительно содержать, например, любой твердый или жидкий носитель и/или пригодные ингредиенты приправы, пригодные для пищевых продуктов и напитков.

В качестве вышеуказанных носителей можно перечислить, например, глюкозу, лактозу, сахарозу, крахмал, маннит, декстрин, глицериды жирных кислот, полиэтиленгликоль, гидроксиэтилкрахмал, этиленгликоль, сложные эфиры жирных кислот и полиоксиэтиленсорбитана, желатин, альбумин, аминокислоты, воду и физиологический солевой раствор.

Вышеуказанные ингредиенты для приправы не являются ограниченными каким-либо одним конкретным ингредиентом и могут представлять собой любые ингредиенты, в настоящее время используемые в данной области, однако их конкретными примерами являются примеры, уже описанные выше.

Содержание вышеуказанных носителей, других ингредиентов приправы или т.п. не является ограниченным конкретным содержанием.

Среди вышеуказанных ингредиентов приправ дрожжевой экстракт не является конкретно ограниченным какими-либо из клеточных тел микроорганизмов, из которых происходит экстракт, условиями культивирования микроорганизмов и способами его экстракции, и, соответственно, любой дрожжевой экстракт можно использовать в продуктах по изобретению Кроме того, эти дрожжевые экстракты могут представлять собой экстракты, которые подвергали, например, тепловой обработке, обработке ферментом, обработке концентрированием и/или обработке для превращения экстракта в порошок.

Настоящее изобретение относится также к способу получения множества пищевых продуктов и напитков, включающему стадию добавления ко множеству полуфабрикатов, используемых для получения различных видов пищевых продуктов и напитков, -Glu-Nva-Gly таким образом, что полученные пищевые продукты и напитки содержат -Glu-Nva-Gly в количестве в диапазоне от 1 млр.д. до 99,9 вес.%. В этом отношении различные виды пищевых продуктов и напитков предпочтительно представляют собой пищевые продукты с пониженным содержанием жира.

Настоящее изобретение также относится к способу получения множества пищевых продуктов или напитков, включающему стадию включения пищевой композиции по изобретению в полуфабрикаты, используемые для получения различных видов пищевых продуктов или напитков. В этой связи различные виды пищевых продуктов и напитков предпочтительно представляют собой пищевые продукты с пониженным содержанием жира.

Что касается способа по изобретению для получения полуфабриката, используемого для получения других пищевых продуктов или напитков, с использованием агента для придания кокуми, является предпочтительным, чтобы способ включал стадии добавления усилителя вкуса, состоящего из -Glu-Nva-Gly, к пищевым ингредиентам (таким как придающие умами ингредиенты, гидролизаты белков или мясные экстракты) во время их смешивания и, в зависимости от необходимости, дополнительной кулинарной обработки полученной смеси пищевых ингредиентов, чтобы таким образом получать пищевые продукты, или напитки, или полуфабрикаты для их получения.

В этом отношении стадия добавления усилителя вкуса, состоящего из -Glu-Nva-Gly, к пищевым ингредиентам предпочтительно включает стадию контроля концентрации -Glu-Nva-Gly в полуфабрикате, используемом для получения пищевого продукта или напитка, на уровне в диапазоне от 0,01 до 999900 м.д. и предпочтительно, от 0,1 до 200000 м.д.

Кроме того, является также предпочтительным, чтобы способ дополнительно включал стадию добавления полуфабриката для получения пищевых продуктов или напитков к другим пищевым ингредиентам (таким как сельскохозяйственные продукты, морепродукты, мясо, молочные продукты или продукты их переработки) при контроле концентрации -Glu-Nva-Gly в полученных пищевых продуктах или напитках на уровне от 0,01 до 50 м.д. и предпочтительно, от 0,05 до 20 м.д.

Кроме того, стадия добавления усилителя вкуса, состоящего из -Glu-Nva-Gly, к ингредиенту пищевого продукта во время их смешивания, предпочтительно включает стадию контроля концентрации -Glu-Nva-Gly в полученных пищевых продуктах или напитках на уровне от 0,01 до 50 м.д. и предпочтительно, от 0,05 до 20 м.д.

В вышеуказанном способе получения является предпочтительным, чтобы пищевые продукты или напитки представляли собой пищевые продукты или напитки, содержащие ингредиенты, полученные из говядины. В этом случае каждый пищевой продукт или напиток предпочтительно содержит от 0,01 до 50 м.д. -Glu-Nva-Gly; от 0,005 до 80% ингредиентов, полученных из говядины, и другие ингредиенты каждого соответствующего пищевого продукта.

Кроме того, пищевые продукты, предназначенные для настоящего изобретения, предпочтительно включают в себя, в дополнение к вышеуказанным пищевым продуктам, пищевые продукты (сладкого типа), принадлежащие к категории десертов и кондитерских изделий, в основном предназначенные для сладкого вкуса, такие как мороженое, мед, мармелад и клубничный джем; и пищевые продукты (острого типа), например, переработанные пищевые продукты и/или продукты каждодневного питания, в основном предназначенные для соленого вкуса, такие как куриные супы.

Настоящее изобретение описано в настоящем документе более подробно со ссылкой на следующие примеры, однако настоящее изобретение совсем не является ограниченным этими конкретными примерами.

Пример

(Пример синтеза 1): Синтез -Glu-Nva-Gly ( -L-глутамил-L-норвалин-глицина):

В метиленхлориде (CH2Cl2, 100 мл) растворяли Boc-Nva (т-бутоксикарбонил-L-норвалин, 4,44 г, 20,4 мМ) и Gly-OBzl HCl (гидрохлорида бензилового эфира глицина, 4,12 г, 20,4 мМ). Затем к реакционному раствору добавляли триэтиламин (Et ₃N, 3,13 г, 1,1 экв., 22,4 мМ), HOBt H₂O (1-гидроксибензотриазолгидрат, 3,44 г, 1,1 экв., 22,4 мМ) и WSC HC1 (гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида, 4,30 г, 1,1 экв., 22,4 мМ), при поддержании реакционного раствора при 0°C. Температуру реакционного раствора постепенно повышали и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи (16 часов). Затем реакционный раствор концентрировали под пониженным давлением, к полученному осадку добавляли этилацетат (150 мл), органическую фазу промывали водой (50 мл), дважды 5% водным раствором лимонной кислоты (50 мл), насыщенным раствором поваренной соли (50 мл), дважды 5% водным раствором гидрокарбоната натрия (50 мл) и насыщенным раствором поваренной соли (50 мл), и затем органическую фазу сушили над безводным сульфатом магния. Сульфат магния удаляли фильтрацией, и фильтрат концентрировали под пониженным давлением. Когда к остатку добавляли н-гексан, образовывались кристаллы, и их выделяли фильтрацией и высушивали под пониженным давлением для получения таким образом Boc-Nva-Cly-OBzl (6,88 г, 18,9 мМ) в виде кристаллов.

К Boc-Nva-Gly-OBzl (6,88 г, 18,9 мМ) добавляли раствор 4 Н HCl/диоксана (94,5 мл), и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Диоксан удаляли во время концентрирования смеси под пониженным давлением, и к полученному осадку добавляли н-гексан (30 мл), и затем полученную смесь концентрировали под пониженным давлением. В этом отношении, последние две стадии повторяли 3 раза, чтобы таким образом получить H-Nva-Gly-OBzl HCl с количественным выходом.

Продукт после предыдущей стадии: H-Nva-Gly-OBzl HCl растворяли в метиленхлориде (130 мл), и реакционный раствор поддерживали при 0°C. К реакционному раствору добавляли Z-Glu-OBzl (бензиловый сложный эфир N- -карбобензокси-L-глутаминовой кислоты, 7,03 г, 18,9 мМ), триэтиламин (2,90 мл, 1,1 экв., 20,8 мМ), HOBt H₂O (3,20 г, 1,1 экв., 20,8 мМ) и WSC HC1 (3,98 г, 1,1 экв., 20,8 мМ). Температуру реакционного раствора постепенно повышали и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи (16 часов). Затем реакционную смесь концентрировали под пониженным давлением, к полученному осадку добавляли этилацетат (1000 мл) и затем органическую фазу промывали водой (100 мл), дважды 5% водным раствором лимонной кислоты (100 мл), насыщенным раствором поваренной соли (100 мл), дважды 5% водным раствором гидрокарбоната натрия (100 мл) и насыщенным раствором поваренной соли (100 мл) и затем органическую фазу сушили над безводным сульфатом магния. После нагревания раствора до 50°C сульфат магния удаляли фильтрацией, и фильтрат концентрировали под пониженным давлением. После начала кристаллизации к полученному концентрату добавляли н-гексан, так что кристаллы в достаточной мере отделялись. Кристаллы собирали фильтрацией и затем высушивали под пониженным давлением для получения таким образом Z-Glu(Nva-Gly-OBzl)-OBzl (10,16 г, 16,4 мМ) в форме кристаллов.

К смешанному раствору этанола (250 мл) и воды (30 мл) добавляли Z-Glu(Nva-Gly-OBzl)-OBzl (10,16 г, 16,4 мМ) и 5% палладий на углероде (5% палладий/углерод, 1,20 г), и реакцию каталитического восстановления проводили при 50°C в течение ночи (14 часов) в атмосфере газообразного водорода. В реакционную систему добавляли воду (100 мл) малыми порциями во время реакции. Палладий/углерод удаляли из реакционной системы фильтрацией, и полученный фильтрат концентрировали под пониженным давлением. Осадок перекристаллизовывали из небольшого количества воды и этанола, чтобы таким образом получить -Glu-Nva-Gly (4,59 г, 15,1 мМ) в виде белых кристаллов. Характерные значения для него приведены ниже:

ESI-MS:(M+H)⁺=304,1

¹H-ЯМР (400 МГц, D₂O): (ppm): 0,82 (3H, т, J=7,4Гц), 1,23-1,37 (2H, м), 1,55-1,75 (2H, м), 2,01-2,09 (2H, м), 2,38-2,48 (2H, м), 3,72 (1H, т, J=6,4Гц), 3,87 (1H, дд, J=17,8 и 20,9Гц), 4,21 (1H, дд, J=4,4 и 8,9Гц).

Тестовый пример 1): Получение CaSR-экспрессирующей плазмиды

CaSR-экспрессирующую плазмиду получали согласно следующим способам:

Синтезировали синтетическую олиго-ДНК, используемую для способов ПЦР (т.е. прямой праймер (Последовательность No. 3: ACTAATACGACTCACTATAGGGACCATGGCATTTTATAGCTGCTGCTGG) и обратный праймер (Последовательность No. 4: TTATGAATTCACTACGTTTTCTGTAACAG) на основе последовательности ДНК, зарегистрированной в NCBI (CaSR (кальциевый рецептор): NM_000388, Последовательности No. 1 и 2).

Способы ПЦР осуществляли в условиях, указанных ниже, с использованием кДНК (доступной из компании Clontech), полученной из почки человека в качестве материала, с использованием вышеуказанных праймеров и ДНК-полимеразы Pfu Ultra (доступной из компании Stratagene): Реакционную систему обрабатывали при 94°C в течение 3 минут и затем при 94°C в течение 30 секунд, при 55°C в течение 30 секунд и при 72°C в течение 2 минут, где эти стадии повторяли 35 раз, и в системе проводили конечную реакцию при 72°C в течение 7 минут. Затем реакционную систему подвергали обработке электрофорезом в агарозе в качестве поддержки, агарозу окрашивали средством для окрашивания ДНК и затем ее облучали лучами ультрафиолетового цвета для детекции, действительно ли кДНК является амплифицированной способами ПЦР или нет. В то же самое время картину электрофореза сравнивали с маркером ДНК, электрофоретический размер которого известен, чтобы таким образом подтвердить длину цепей продуктов ПЦР.

Плазмидный вектор pBR322 расщепляли рестрикционным ферментом EcoRV (доступным из Tikara Co., Ltd) и фрагмент гена, амплифицированный способами ПЦР, лигировали в плазмидный вектор по участку расщепления, с использованием набора для лигирования (доступного из компании Promega). Клетки Escherichia coli штамма DH5 трансформировали реакционным раствором, с последующим отбором трансформантов, содержащих плазмиду, в которой был клонирован амплифицированный продукт ПЦР, и затем амплифицированный продукт ПЦР подтверждали анализом последовательности ДНК-оснований.

Эту рекомбинантную плазмиду использовали для получения плазмиды, экспрессирующей CaSR человека, hCaSR/pcDNA3.1.

(Тестовый пример 2): Оценка активности агониста CaSR

Клетки 293E (EBNA1-экспрессирующие клетки HEK293, ATCC No. CRL-10852) культивировали в DMEN/Ham's-F12 (содержащей 3,15/мл глюкозы модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, доступной из Nakalai Tesque), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой, в присутствии 200 мкг/мл G418 (Генетицина). Культивированные клетки инокулировали во флакон F25 при плотности 3×10 ⁶ клеток/10 мл, флакону позволяли стоять в течение 24 часов в CO₂-инкубаторе (5% CO₂, 37°C, и затем трансформировали или трансфицировали плазмидой, экспрессирующей CaSR человека hCaSR/pcDNA3.1, с помощью реагента для трансфекции Fugene6 (доступного из компании Roche). Трансфицированную плазмиду поддерживали в CO₂-инкубаторе в течение 6-7 часов, затем клетки восстанавливали с использованием содержащей 10% эмбриональную телячью сыворотку DMEM/Ham's-F12, и клетки инокулировали в каждую лунку покрытого поли-D-лизином 96-луночного планшета (BDBiocoat) при плотности 70000 клеток/лунку.

96-луночному планшету позволяли стоять в течение 24 часов в CO ₂-инкубаторе, затем культуральную среду удаляли из каждой лунки 96-луночного планшета, в который инокулировали клетки, с последующим добавлением в каждую лунку, флуоресцентного индикатора Ca²⁺ из набора Calcium 4 Assay (доступного из компании Molecular Devices), растворенного в буфере для анализа (содержащем 146 мМ NaCl, 5 мМ KC1, 1 мМ MgSO₄, 1 мг/мл глюкозы, 20 мМ HKPES (pH 7,2) и от 0,75 до 1,25 мМ CaCl₂), в количестве 200 мкл/лунку, и затем позволяли 96-луночному планшету стоять при 37°C в течение одного часа, и затем при комнатной температуре в течение 10 минут, так что индикатор включался в клетки.

В каждую лунку 96-луночного планшета добавляли каждое тестируемое соединение, растворенное в буфере для анализа, содержащем 0,1% BSA, в количестве 50 мкл/лунку, и затем любые изменения интенсивности мониторировали в течение 3 минут с использованием установки FLEX (доступной из компании Molecular Devices).

(Способ определения EC ₅₀):

Различие (RFU (Макс-Мин)) между максимальной и минимальной интенсивностями флуоресценции, наблюдаемыми для каждой лунки до и после добавления каждого конкретного тестируемого соединения, определяли посредством автоматического вычисления с использованием установки FLEX. Рассчитывали степень активности, в то время как значение RFU (Макс-Мин), наблюдаемое при добавлении соединения в максимальной концентрации, определяли как 100%, и значение RFU (Макс-Мин), наблюдаемое при использовании буфера для анализа, содержащего 0,1% BSA, свободного от какого-либо тестируемого соединения, определяли как 0%, с последующим подверганием полученных данных процедурам подбора кривых с использованием программного обеспечения для обработки электронных таблиц Xfit или Graph-Pad-Prism, чтобы таким образом определять EC₅₀ , которая представляла собой концентрацию соединения при степени активности 50%. Полученные таким образом результаты обобщены в следующей таблице 1. Кроме того, повторяли такие же способы определения EC₅₀, использованные выше, за исключением использования других трипептидов, как в сравнительных примерах. Полученные таким образом результаты обобщены в следующих таблицах 2 и 3. В этом отношении данные, перечисленные в таблице 3, описаны в непатентном документе 3.

Таблица 1
Соединение	EC50 , мкМ
-Glu-Nva-Gly	0,055
-Glu-Val-Gly	0,075

Таблица 2
Соединение	EC50 , мкМ
-Glu-Ala-Gly	0,016
-Glu-tLeu-Gly	0,09
-Glu-Thr-Gly	2,8

Таблица 3
Соединение	EC50 , мкМ
-Glu-Val-Gly	0,039
-Glu-Abu-Gly	0,025
-Glu-Cys-Gly	0,7

Неожиданно, вышеуказанные результаты показывают, что -Glu-Nva-Gly обладает высокой активностью агониста CaSR, почти идентичной активности, наблюдаемой для других пептидов, каждый из которых обладает структурой типа -Glu-X-Gly.

Пример 1: Оценка активности придания кокуми

В этом примере проверяли -Glu-Nva-Gly по силе его активности придания кокуми согласно тесту количественной сенсорной оценки.

Этот тест количественной сенсорной оценки проводили следующими способами.

Силу активности придания кокуми, наблюдаемой для каждого тестируемого соединения, определяли как значение, наблюдаемое при смешивании от 0,000001 до 0,1 г/дл соответствующего тестируемого соединения с дистиллированной водой, содержащей глутамат натрия (0,05 г/дл), монофосфат инозиновой кислоты (0,05 г/дл) и хлорид натрия (0,5 г/дл). В этой связи, когда для образца показывали кислый характер после растворения тестируемого соединения по сравнению с контролем без тестируемого соединения, значение pH образца доводили, с использованием NaOH, до уровня значения pH (наблюдаемого для контроля) ±0,2 перед практическим использованием образца в оценке. Критерии оценки принимали следующие: контроль: 0 балов: сильный: 3 балла; очень сильный: 5 баллов. Кроме того, чтобы сделать критерии более ясными, начальный/средний вкус и послевкусие -Glu-Cys-Gly принимали за 3,0 балла, соответственно. Выставление баллов или классификацию проводили с использованием стандартного линейного способа, и, более конкретно, их проводили посредством указания каждого соответствующего балла на прямой линии, на которой были обозначены точки, соответствующие -5~0~5. Дегустаторов для участия в этом тесте определяли как лиц, которые занимались разработкой приправ для пищевых продуктов в течение не менее одного года суммарного периода времени и которые могли судить, что различия в титре между -Glu-Cys-Gly и -Glu-Val-Gly, добавленными в раствор, обладающий вкусом умами/ соленым вкусом, составляет приблизительно 10 раз (при регулярном подтверждении способности этих лиц). Оценку проводили при n (число участвовавших дегустаторов)=4. В этой связи термин «начальный/средний вкус» обозначает развитие вкуса, детектированное на протяжении времени, продолжающегося от 0 до 5 секунд после того, как дегустатор удерживал образец во рту, в то время как термин «послевкусие» обозначает развитие вкуса, детектированное после этого. Для тестируемого соединения показали активность придания кокуми широко по всему вышеуказанному диапазону его добавленных концентраций. Однако результаты, наблюдаемые для его типичных концентраций, обобщены в следующей таблице 4.

В результате выявили, что для всех трипептидов, отличных от -Glu-Nva-Gly, исследованных выше, показали активность CaSR, порядка самое большее в 10 раз выше активности, наблюдаемой для глутатиона ( -Glu-Cys-Gly), но для -Glu-Nva-Gly неожиданно показали более высокую активность CaSR, порядка более чем в 100 раз выше активности, наблюдаемой для глутатиона.

Таблица 4
Соединение	Конц. (г/дл)	Интенсивность кокуми		Комментарии к оценке
		Начальный/средний вкус	Послевкусие
Контроль	--	0	0	--
-Glu-Cys-Gly	0,01	3,0	3,0	Усилены плотность, густота и продолжительность.
-Glu-Val-Gly	0,001	2,5	3,0	В основном усилены зрелость, плотность и наполнение.
	0,005	3,5	4,0	В основном усилены зрелость, плотность и наполнение.
-Glu-Nva-Gly	0,00005	2,7	2,9	В основном усилены плотность и наполнение на стадии среднего вкуса/послевкусия.
	0,0001	3,0	3,3	В основном усилены плотность и наполнение на стадии среднего вкуса/послевкусия.
	0,001	4,0	4,0	Вкус являлся полностью сгущенным. Вкус являлся слишком сильным.
-Glu-Abu-Gly	0,002	3,0	2,0	Средний вкус был усилен по сравнению с -Glu-Val-Gly.
-Glu-Ala-Gly	0,001	3,3	2,3	Плотность на стадии начального вкуса являлась сильной, но послевкусие становилось неявным.
-Glu-Abu-GlyA	0,001	2,7	3,0	Слабый вяжущий вкус наблюдали на стадии послевкусия.
-Glu-tLeu-Gly	0,001	2,5	3,0	Показана такая тенденция, что послевкусие являлось довольно сильным. Слабый вяжущий вкус оставался во рту.

Активность придания кокуми -Glu-Nva-Gly приблизительно в 100 раз выше активности, наблюдаемой для -Glu-Cys-Gly, и по меньшей мере приблизительно в 10 раз выше активности, наблюдаемой для -Glu-Val-Gly, из подобных. Кроме того, -Glu-Nva-Gly никогда не обладал каким-либо привкусом (таким как вяжущий вкус при послевкусии), в отличие от -Glu-Ala-Gly, -Glu-Abu-Gly и -Glu-tLeu-Gly, и это, соответственно, показывает, что -Glu-Nva-Gly является отличным по сравнению с другими исследованными трипептидами.

Пример 2: Оценка активности придания кокуми

В этом примере проверяли -Glu-Nva-Gly по силе его активности придания кокуми согласно тесту количественной сенсорной оценки, принимая во внимание отдельный предмет оценки, чтобы прояснить, что этот трипептид является трипептидом среднего вкуса/послевкусия.

Этот тест количественной сенсорной оценки проводили следующими способами.

В этом тесте для легкой детекции среднего вкуса/послевкусия использование монофосфата инозиновой кислоты в жидкости, используемой для оценки, исключали, чтобы таким образом уменьшать умами на стадии среднего вкуса/послевкусия в жидкости. Более конкретно, силу активности придания кокуми, наблюдаемой для каждого тестируемого соединения, определяли как значение, наблюдаемое при смешивании от 0,000001 до 0,1 г/дл соответствующего тестируемого соединения в качестве образца с дистиллированной водой, содержащей глутамат натрия (0,1 г/дл) и хлорид натрия (0,4 г/дл). В этой связи, когда для образца показывали кислый характер после растворения тестируемого соединения по сравнению с контролем без тестируемого соединения, значение pH образца доводили, с использованием NaOH, до уровня значения pH (наблюдаемого для контроля) ±0,2 перед практическим использованием образца в оценке. Критерии оценки принимали следующие: контроль: 0 балов: сильный: 3 балла; очень сильный: 5 баллов. Кроме того, чтобы сделать критерии более ясными, начальный/средний вкус и послевкусие -Glu-Cys-Gly принимали за 3,0 балла, соответственно. Выставление баллов или классификацию проводили с использованием способа линейной шкалы, и, более конкретно, их проводили посредством указания каждого соответствующего балла на прямой линии, на которой были обозначены точки, соответствующие -5~0~5. Дегустаторов для участия в этом тесте определяли как лиц, которые занимались разработкой приправ для пищевых продуктов в течение не менее одного года суммарного периода времени и которые могли судить, что различия в титре между -Glu-Cys-Gly и -Glu-Val-Gly, добавленными в раствор, обладающий вкусом умами/ соленым вкусом, составляет приблизительно 10 раз (при регулярном подтверждении способности этих лиц). Оценку проводили при n (число участвовавших дегустаторов) =4. В этой связи термин «начальный вкус» обозначает развитие вкуса, детектированное на протяжении времени, продолжающегося от 0 до 2 секунд после того, как дегустатор удерживал образец во рту, в то время как термин «средний вкус/послевкусие» обозначает развитие вкуса, детектированное после этого. Для тестируемого соединения показали активность придания кокуми широко по всему вышеуказанному диапазону его добавленных концентраций. Однако результаты, наблюдаемые для его типичных концентраций, обобщены в следующей таблице 5.

Эти результаты сходным образом показывают, что для -G1u-Val-Gly показали активность придания кокуми приблизительно в 10 раз выше активности, наблюдаемой для глутатиона ( -Glu-Cys-Gly), в то время как для -Glu-Nva-Gly показали более высокую активность CaSR, порядка более чем в 100 раз выше активности, наблюдаемой для глутатиона.

Таблица 5
Соединение	Конц. (г/дл)	Интенсивность кокуми		Комментарии к оценке
		Начальный вкус	Средний вкус/послевкусие
Контроль	--	0	0	--
-Glu-Cys-Gly	0,01	3	3	Усилены плотность, густота и продолжительность.
-Glu-Val-Gly	0,001	2	3	В основном усилены гладкость, плотность и наполнение.
-Glu-Nva-Gly	0,00005	2	3	Плотность и наполнение усилены в основном на стадии среднего вкуса/послевкусия.
	0,0001	3	4	Плотность и наполнение усилены в основном на стадии среднего вкуса/послевкусия.

В результате обнаружили, что -Glu-Nva-Gly являлся достаточно выдающимся. Это происходит благодаря тому, что он обладает отличной активностью придания кокуми, обладает характеристиками среднего вкуса/послевкусия по отношению к его профилю развития вкуса и является свободным от какого-либо привкуса (такого как вяжущий вкус). Крое того, -Glu-Nva-Gly проявляет активность придания кокуми приблизительно в 100 раз выше активности, наблюдаемой для -Glu-Cys-Gly, и по меньшей мере приблизительно в 10 раз выше активности, наблюдаемой, например, для -Glu-Val-Gly. По этой причине -Glu-Nva-Gly можно использовать в необычайно низкой концентрации. Соответственно, настоящее изобретение может, таким образом, предоставлять агент для придания кокуми, которое можно легко получать при низкой стоимости, и таким образом, настоящее изобретение может являться достаточно эффективным с промышленной точки зрения.

Пример 3: Оценка активности придания кокуми в пищевых продуктах

Проверяли, проявляет или нет -Glu-Nva-Gly эффект придания кокуми более сильный, чем эффект, наблюдаемый для -Glu-Nva-Gly, имеющего высокий титр, согласно тесту количественной сенсорной оценки, при действительном включении первого упомянутого в пищевой продукт.

Тест количественной сенсорной оценки проводили следующими способами.

В качестве пищевых продуктов, считающихся имеющими сильные средний вкус/послевкусие, коммерчески доступные мороженое, мед, мармелад и клубничный джем использовали в этом примере в качестве типичных пищевых продуктов (сладкого типа), принадлежащих к категории десертов и кондитерских изделий, в основном предназначенных для сладкого вкуса. В качестве образцов типичных пищевых продуктов (острого типа), принадлежащих к категории переработанных пищевых продуктов, продуктов каждодневного питания и закусочных пищевых продуктов, в основном предназначенных для соленого вкуса, использовали коммерчески доступный куриный суп; массу, содержащую картофельное пюре и 0,1 вес.% коммерчески доступного перца в порошке; коммерчески доступную имбирную пасту; и массу, содержащую картофельное пюре и 2 вес.% масла. Количество -Glu-Val-Gly, в качестве объекта сравнения, подлежащего добавке, принимали на уровне 0,002 вес.%, при котором его эффект являлся обнаружимым. Трипептид -Glu-Nva-Gly проверяли по улучшению (интенсивности активности придания кокуми) общего развития вкуса при его смешивании с каждым тестируемым пищевым продуктом в количестве от 0,0000001% до 0,01 вес.%. В этом случае контролем служил каждый пищевой продукт, свободный от добавления какого-либо трипептида. Критерии оценки принимали следующие, чтобы не получать каких-либо небольших различий, таких как дробные части каждого балла: контроль: ±; достаточно сильный: +; сильный: ++ ; очень сильный: +++. Кроме того, оценку + определяли как 1 балл; оценку ++ определяли как 2 балла и оценку +++ определяли как 3 балла, и если среднее числовое значение составляло, например, 2,2, десятичную дробь приближенно приравнивали к 2=++ посредством округления числа до ближайшего целого. Дегустаторов для участия в этом тесте определяли как лиц, которые занимались разработкой приправ для пищевых продуктов в течение не менее одного года суммарного периода времени и которые могли судить, что различия в титре между -Glu-Cys-Gly и -Glu-Val-Gly, добавленными в раствор, обладающий вкусом умами/ соленым вкусом, составляет приблизительно 10 раз (при регулярном подтверждении способности этих лиц). Оценку проводили при n (число участвовавших дегустаторов) =4. Для тестируемого соединения -Glu-Nva-Gly показали активность придания кокуми широко по всему вышеуказанному диапазону его добавленных концентраций. Однако только результаты, которые определенно можно использовать с целью сравнения, обобщены в следующих таблицах 7 и 8.

Таблица 7
Образец	Конц. (вес.%)	Улучшение общего развития вкуса (запаха)
		Мороженое	Мед	Мармелад	Клубничный джем
-Glu- Val-Gly	0,002	+	+	+	+
-Glu- Val-Gly	0,00015	+	±	±	±
	0,00028	++	±	±	±
	0,0004	+++	+	+	+

Таблица 8
Образец	Конц. (вес.%)	Улучшение общего развития вкуса (запаха)
		Куриный суп	Имбирная паста	Перец в порошке	Масляная паста
-Glu- Val-Gly	0,002	+	+	+	+
-Glu- Val-Gly	0,00015	+	+	±	±
	0,00028	++	++	+	+
	0,0004	+++	+++	++	++

Результаты вышеуказанного теста показывают, что для -Val-Nva-Gly показали многообещающую активность придания кокуми, способную улучшать способность общего развития вкуса во всех существующих пищевых продуктах, для которых характерными являются средний вкус/послевкусие и которые распространяются от пищевых продуктов острого типа до пищевых продуктов сладкого типа. Кроме того, вышеуказанные результаты показывают также, что для -Val-Nva-Gly показали необычайно высокую активность придания кокуми, в существующих пищевых продуктах, от 5 до более 13 раз превышающую активность придания кокуми, наблюдаемую для -Glu-Val-Gly. Соответственно, использование -Val-Nva-Gly в необычайно низком количестве может улучшать качество пищевых продуктов, даже когда большее количество дополнительных ингредиентов нельзя включать в каждый конкретный пищевой продукт с целью обеспечения намеченной стабильности качества, когда существуют требования к дальнейшему увеличению его качества. Кроме того, агент для придания кокуми можно предоставлять при низкой стоимости.

Пример 4: Эффект -Glu-Nva-Gly на экстракты свинины:

Обнаружили, что активность придания кокуми -Glu-Nva-Gly можно улучшать на ранней стадии после употребления содержащего его пищевого продукта по сравнению с активностью придания кокуми, наблюдаемой для -Glu-Cys-Gly (глутатиона) и -Glu-Val-Gly. В этих условиях подтвердили, согласно тесту количественной сенсорной оценки, что -Glu-Nva-Gly являлся заметно эффективным для улучшения развития вкуса экстракта свинины, развитие вкуса которого не является полностью типом среднего вкуса, но вкус которого улучшался немного раньше по сравнению с эффектом, наблюдаемым для -Glu-Cys-Gly (глутатиона) и -Glu-Val-Gly.

Тест количественной сенсорной оценки проводили следующими способами.

Коммерчески доступный экстракт свинины (содержание твердого вещества: 55,1 вес.%, содержание соли: 9,3 вес.%) растворяли в горячей воде, так что концентрацию экстракта доводили до 5,0 вес.%, чтобы таким образом получить раствор экстракта свинины. Затем с этим раствором экстракта свинины смешивали -Glu-Nva-Gly, -Glu-Cys-Gly или -Glu-Val-Gly в качестве образца. Согласно критерию парного сравнения у дегустаторов требовали сравнительной оценки следующих трех образцов и решения, «какой из них являлся предпочтительным или благоприятным, поскольку мог усиливать запах и вкус экстракта свинины без изменения равновесия между ними»: (1) 0,02 вес.% -Glu-Cys-Gly, активность придания кокуми которого являлась идентичной 0,0003 вес.% -Glu-Nva-Gly; (2) 0,0003 вес.% -Glu-Val-Gly, количество которого являлось идентичным 0,0003 вес.% -Glu-Nva-Gly; (3) 0,002 вес.% -Glu-Val-Gly, активность придания кокуми которого являлась идентичной активности, наблюдаемой для 0,0003 вес.% -Glu-Nva-Gly. Оценку проводили при N (количество участвовавших дегустаторов)=9. В следующей таблице 9 показано количество дегустаторов, решивших, что 0,0003 вес.% -Glu-Nva-Gly являлось «предпочтительным или благоприятным, поскольку оно могло усиливать запах и вкус экстракта свинины без изменения равновесия между ними».

Из полученных таким образом результатов можно заключить следующее: для -Glu-Nva-Gly показали заметный эффект того, что он может определенно «усиливать запах и вкус экстракта свинины без изменения равновесия между ними» даже в случаях, когда титры кокуми идентичны между собой, как в случаях (1) и (3).

Таблица 9 N=9
Образец	Конц. (вес.%)	Образец	Конц. (вес.%)	No. дегустаторов*
(1) -Glu-Nva-Gly	0,0003	-Glu-Cys-Gly	0,02	8/9**
(2) -Glu-Nva-Gly	0,0003	-Glu-Val-Gly	0,0003	8/9**
(3) -Glu-Nva-Gly	0,0003	-Glu-Val-Gly	0,002	8/9**
*: Количество дегустаторов, решивших, что -Glu-Nva-Gly являлся более предпочтительным, поскольку он мог усиливать запах и вкус экстракта свинины, без изменения равновесия между ними. **: Результат показывает, что -Glu-Nva-Gly является более предпочтительным, поскольку он может усиливать запах и вкус экстракта свинины без изменения равновесия между ними, на уровне значимости 5%.

Вышеуказанные результаты ясно указывают на то, что для -Glu-Nva-Gly показан следующий достаточно заметный эффект: он может «усиливать и делать более благоприятным запах и вкус экстракта свинины без изменения равновесия между ними», при сравнении с эффектом, наблюдаемым для -Glu-Cys-Gly и -Glu-Val-Gly, используемых в концентрациях, способных проявлять такую же активность придания кокуми. Ингредиенты, полученные из свинины, широко используют во всем мире, например в приправах, супах, переработанных мясных продуктах, готовых и переработанных продуктах, кондитерских изделиях и закусочных пищевых продуктах. Как обсуждали выше, -Glu-Nva-Gly может позволять улучшение запаха и вкуса пищевых продуктов при низкой стоимости, с использованием его в то же время только в следовом количестве, и, таким образом, его использование является достаточно преимущественным с промышленной точки зрения.

Пример 4: Эффект -Glu-Nva-Gly на экстракты говядины:

Обнаружили, что активность придания кокуми -Glu-Nva-Gly можно улучшать на ранней стадии после употребления содержащего его пищевого продукта по сравнению с активностью придания кокуми, наблюдаемой для -Glu-Cys-Gly (глутатиона) и -Glu-Val-Gly. В этих условиях подтвердили, согласно тесту количественной сенсорной оценки, что -Glu-Nva-Gly являлся заметно эффективным для улучшения развития вкуса экстракта говядины, развитие вкуса которого не является полностью типом среднего вкуса, но вкус которого улучшался немного раньше по сравнению с эффектом, наблюдаемым для -Glu-Cys-Gly (глутатиона) и -Glu-Val-Gly.

Тест количественной сенсорной оценки проводили следующими способами: Коммерчески доступный экстракт говядины (содержание твердого вещества: 61,2 вес.%, содержание соли: 12,2 вес.%) растворяли в горячей воде, так что концентрацию экстракта доводили до 3,0 вес.%, чтобы таким образом получить раствор экстракта говядины. Затем с этим раствором экстракта говядины смешивали -Glu-Nva-Gly, -Glu-Cys-Gly или -Glu-Val-Gly в качестве образца. Согласно способу критерия парного сравнения (парного теста) у дегустаторов требовали сравнительной оценки следующих трех образцов и решения, «какой из них являлся предпочтительным или благоприятным, поскольку мог усиливать запах и вкус экстракта говядины без изменения равновесия между ними»: (1) 0,02 вес.% -Glu-Cys-Gly, активность придания кокуми которого являлась идентичной 0,0003 вес.% -Glu-Nva-Gly; (2) 0,0003 вес.% -Glu-Val-Gly, количество которого являлось идентичным 0,0003 вес.% -Glu-Nva-Gly; (3) 0,002 вес.% -Glu-Val-Gly, активность придания кокуми которого являлась идентичной активности, наблюдаемой для 0,0003 вес.% -Glu-Nva-Gly. Оценку проводили при N (количество участвовавших дегустаторов) =9. В следующей таблице 10 показано количество дегустаторов, решивших, что 0,0003 вес.% -Glu-Nva-Gly являлось «предпочтительным или благоприятным, поскольку оно могло усиливать запах и вкус экстракта говядины без изменения равновесия между ними».

Из полученных таким образом результатов можно заключить следующее: для -Glu-Nva-Gly показали заметный эффект того, что он может определенно «усиливать запах и вкус экстракта говядины без изменения равновесия между ними», даже в случаях, когда титры кокуми идентичны между собой, как в случаях (1) и (3).

Таблица 10 N=9
Образец	Конц. (вес.%)	Образец	Конц. (вес.%)	No. дегустаторов*
(1) -Glu-Nva-Gly	0,0003	-Glu-Cys-Gly	0,02	9/9**
(2) -Glu-Nva-Gly	0,0003	-Glu-Val-Gly	0,0003	8/9***
(3) -Glu-Nva-Gly	0,0003	-Glu-Val-Gly	0,002	8/9***
*: Количество дегустаторов, решивших, что -Glu-Nva-Gly являлся более предпочтительным, поскольку он мог усиливать запах и вкус экстракта говядины без изменения равновесия между

ними. **: Результат показывает, что -Glu-Nva-Gly является более предпочтительным, поскольку он может усиливать запах и вкус экстракта говядины без изменения равновесия между ними, на уровне значимости 1%. ***: Результат показывает, что -Glu-Nva-Gly является более предпочтительным, поскольку он может усиливать запах и вкус экстракта говядины без изменения равновесия между ними, на уровне значимости 5%.

Вышеуказанные результаты ясно указывают на то, что для -Glu-Nva-Gly показан следующий достаточно заметный эффект: он может «усиливать и делать более благоприятным запах и вкус экстракта говядины без изменения равновесия между ними» при сравнении с эффектом, наблюдаемым для -Glu-Cys-Gly и -Glu-Val-Gly, используемых в концентрациях, способных проявлять такую же активность придания кокуми. Ингредиенты, полученные из говядины, широко используют во всем мире, например, в приправах, супах, переработанных мясных продуктах, готовых и переработанных продуктах, кондитерских изделиях и закусочных пищевых продуктах. Как обсуждали выше, -Glu-Nva-Gly может позволять улучшение запаха и вкуса пищевых продуктов при низкой стоимости, с использованием его в то же время только в следовом количестве, и, таким образом, его использование является достаточно преимущественным с промышленной точки зрения.