средство, обладающее антибактериальной активностью

Формула изобретения

Средство, обладающее антибактериальной активностью, представляющее собой дигидроксоцистинодиаминодиаргенат натрия со следующей структурной формулой (1):

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к антибактериальным препаратам широкого спектра действия.

В последнее десятилетие внимание многих исследователей все чаще обращается к антибактериальным веществам, обладающим универсальным механизмом воздействия на бактериальную клетку, например к серебру и его соединениям, но их исследование и активное использование оттеснено широким и не всегда оправданным применением антибиотиков.

Однако, в связи с широким распространением штаммов возбудителей, устойчивых к используемым антибиотикам, а также в связи с выявлением ряда серьезных осложнений (рост аллергических осложнений, токсическое действие антибиотиков на внутренние органы и подавлением иммунитета, возникновением грибкового поражения дыхательных путей и дисбактериоза после длительной антибактериальной терапии), вновь наблюдается повышенный интерес к препаратам серебра.

Согласно литературным данным, производные серебра обладают антимикробной активностью в отношении 650-700 видов микроорганизмов (Савадян Э.Ш., Мельникова В.М., Беликов Г.П. Современные тенденции использования серебросодержащих антисептиков // Антибиотики и химиотерапия. 1989. - т.34. - № 11. - С.874-878).

Известны препараты серебра в качестве антисептиков в виде водных растворов: серебряная вода, AgNO₃ или протаргол (Лекарственные средства. Свойства. Применение. Противопоказания. Справочник (под редакцией М.А. Клюева). Красноярск: гротеск, 1993, с.362).

Известен препарат, представляющий собой порошок цеолита, модифицированный серебром, с размерами частиц 17-20 Ангстрем, для лечения инфицированных ран (Патент RU 2245151 C2, опубл. 27.01.2005). Известный препарат обладает антимикробной активностью, угнетает рост и размножение микроорганизмов.

Известен препарат Арговит, включающий 7% нитрата серебра и стабилизирующее вещество - поливинилпирролидон - остальное, обладающий антибактериальными свойствами (патент RU 2147237 C1, опубл. 10.04.2000). Препарат используется для лечения колибактериоза телят.

Недостатком вышеперечисленных препаратов является необходимость использования достаточно высоких концентраций коллоидных растворов серебра для достижения эффекта, например от 0,1 до 0,4 масс.% для препарата «Арговит» (патент RU 2342120 C2, опубл. 27.12.2008) в пересчете на содержание серебра в разведенном препарате, а также изменение свойств препаратов в процессе хранения, особенно под воздействием таких факторов, как свет, колебания температуры, замораживание, при которых происходит агрегация кластерных частиц с образованием коллоидных, малоактивных частиц серебра.

Наиболее ближайшим к заявляемому средству - прототипом - является средство, обладающее противовирусной активностью, представляющее монолитиевую соль комплекса цистина с серебром, отвечающее составу C₆H₁₉N ₄O₆S₂LiAg₂ (патент RU 2277908 C1, опубл. 20.06.2006). Синтез заявленного средства осуществляют при комнатной температуре смешением следующих компонентов: цистин - гидроокись лития - нитрат серебра - аммиак в мольном соотношении 1:2:2:8. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре 6 часов, после чего упаривают в вакууме до 1/4 первоначального объема при температуре 40-50°C. К полученной суспензии прибавляют эквивалентное количество этилового спирта, охлаждают до 4÷6°C и выдерживают 12 часов. Образовавшийся целевой продукт в виде желтого мелкодисперсного осадка отфильтровывают, промывают этиловым спиртом и сушат в вакууме при комнатной температуре.

Основным недостатком известного средства является то, что оно не обладает антибактериальной активностью.

Задачей изобретения является получение нового стабильного, низкотоксичного средства, обладающего антибактериальной активностью в отношении широкого спектра патогенных микроорганизмов.

Поставленная задача достигается предлагаемым соединением, представляющим собой дигидроксоцистинодиаминодиаргенат натрия со следующей структурной формулой (1):

Общая схема синтеза дигидроксоцистинодиаминодиаргената натрия, представляющего собой комплекс двух ионов серебра с динатриевой солью природной аминокислоты L-цистина, отвечающий формуле C ₆H₁₂Ag₂N₂Na₂ O₆S₂, представлена ниже.

C₆H₁₂N₂O₄S₂ +2NaOH+Ag₂O C₆H₁₂Ag₂N₂Na ₂O₆S₂+H₂O

Используемая для синтеза аминокислота цистин (цистеин) относится к серосодержащим аминокислотам и играет важную роль в процессах формирования тканей кожи, а также для дезинтоксикационных процессов. Цистин и цистеин тесно связаны между собой, каждая молекула цистина состоит из двух молекул цистеина, соединенных друг с другом. Цистеин очень нестабилен и легко переходит в L-цистин, и одна аминокислота легко переходит в другую при необходимости.

Синтез заявленного средства осуществляют при комнатной температуре смешением следующих компонентов: цистин - гидроокись натрия - окись серебра в мольном соотношении 1:2,2:2, реакционную смесь перемешивают до полного растворения окиси серебра, фильтруют и продукт осаждают спиртом. В результате получают комплекс серебра с цистином, обладающий антибактериальной активностью в отношении широкого спектра патогенных микроорганизмов.

В результате проведения экспериментов в лабораторных условиях были изучены токсичность, антибактериальная активность и стабильность при хранении заявляемого средства.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение комплекса серебра с цистином.

Цистин (12 г, 0.05 моль) и гидроокись натрия (4,4 г, 0.11 моль) растворяют в 200 мл H₂O. К полученному раствору, при перемешивании, добавляют 23.1 г (0.1 моль) окиси серебра. Мольное соотношение исходных компонентов 1:2,2:2, соответственно. Реакционную смесь перемешивают до полного растворения осадка (около 6 ч). Реакционную смесь фильтруют и выливают при интенсивном перемешивании в 1 л метилового спирта. Выпавший осадок отфильтровывают и последовательно промывают 200 мл метилового спирта и 200 мл ацетона. Осадок высушивают в вакууме. Выход целевого соединения дигидроксоцистинодиаминодиаргената натрия (АС-01) в виде мелкодисперсного порошка желтого цвета составил 22.1 г (83.1%). Элементный анализ: Найдено: C, 13,24; H, 2,41; Ag, 40,26; N, 5,17; Na, 8,21; S, 11,68. C₆ H₁₂Ag₂N₂Na₂O ₆S₂ Вычислено: С, 13,49; Н, 2,26; Ag, 40,40; N, 5,25; Na, 8,61; S, 12,01.

Пример 2. Определение влияния условий и сроков хранения АС-01 на стабильность его химического состава.

АС-01 хранили в защищенном от света месте при комнатной температуре 20±2°C и в условиях бытового холодильника при - 4±2°C в течение 2 лет (срок наблюдения). Проводили сопоставление ИК-спектров образцов с периодичностью один раз месяц. В результате проведенных исследований не было отмечено отклонений в его составе.

При нагревании до 45°C соединение темнеет в течение 6 часов. Отклонение в ИК-спектрах наблюдается через 18 ч нагревания до 45°C. Таким образом, полученное соединение стабильно (срок наблюдения 2 года), допускает хранение при комнатной температуре в защищенном от света месте.

Пример 3.

Оценка антибактериальной активности соединения АС-01 на патогенные тест-штаммы: Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa.

Растворы АС-01 вносили в питательную среду одновременно с посевной концентрацией тест-штамма, инкубировали стационарно в пробирках (по 1 мл) при 37°C в течение 24 часов.

Результаты учитывали методом биологического титрования, определяя количество микроорганизмов (титр) до и после инкубации (в колонии образующие единицы на 1 мл, КОЕ/мл). В качестве контроля использовали среду с тест-штаммом без внесения препарата.

Бактерицидную активность (БА) оценивали условно:

+ наличие бактерицидной активности (резкое уменьшение количества микроорганизмов);

+/- наличие бактериостатической активности (отсутствие увеличения или незначительное увеличение количества микроорганизмов);

- отсутствие активности (увеличение количества микроорганизмов, сравнимое с контролем).

В таблице 1 представлены показатели активности различных концентраций соединения АС-01 на патогенные штаммы бактерий и штамм дрожжей Candida albicans. Значение <10² показывает, что на чашках Петри не выросло ни одной колонии патогенных микроорганизмов.

Из таблицы 1 видно, что соединение АС-01 обладает выраженным антибактериальным действием по отношению к патогенным штаммам микроорганизмов. При концентрации препарата 100 мкг/мл происходит полная инактивация всех исследуемых микроорганизмов. При снижении концентрации до 10 мкг/мл препарат полностью инактивирует штаммы бактерий Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и уменьшает титр Candida albicans в тысячу раз по отношению к контролю.

Пример 4. Определение токсичности соединения АС-01.

Исследование проведено на 190 белых беспородных мышах ICR, самцах и самках, с массой тела 18-20 г. До начала и в ходе эксперимента животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном освещении, на сбалансированном пищевом рационе.

Значения параметров токсичности субстанции АС-01 определяли по методу Кербера и экспресс-методом по Прозоровскому. Навеску препарата заливали водой для инъекций, выдерживали препарат 5-10 мин при комнатной температуре и растворяли при перемешивании. Перед введением препарат подвергали стерильной фильтрации через фильтры с размером пор 0,2 мкм. Было проведено две серии экспериментов. В первом эксперименте по определению параметров летальных доз при внутрибрюшинном введении препарат АС-01 вводили самцам мышей однократно внутрибрюшинно в дозах 6; 30; 60; 90; 120 мг/кг в объеме 0,2 мл на 20 г массы тела; во втором эксперименте - в дозах 30, 50, 70, 90, 110, 130 мг/кг в объеме 0,2 мл на 20 г массы тела. В первом эксперименте по определению параметров летальных доз при внутрижелудочном способе введения препарат вводили в дозах 6; 30; 60; 90; 120 мг/кг в объеме 0,2 мл на 20 г массы тела; во втором - в дозах 1, 2, 3, 4, 5 г/кг в объеме 0,5 мл. При определении параметров токсичности по методу Кербера каждая группа состояла из 6 мышей, по методу Прозоровского - из 3 мышей. Период наблюдения за животными составлял 7 суток.

В ходе эксперимента были установлены следующие параметры летальных доз: ЛД₁₆=60 мг/кг, ЛД₅₀=80 (74÷86) мг/кг, ЛД₈₄=100 мг/кг. Доза 110 мг/кг вызывала 100% гибель животных, доза 50 мг/кг являлась максимально переносимой. На основании этих данных, по классификации Мельниковой (1977), препарат может быть отнесен к классу среднетоксичных соединений.

Однократное внутрижелудочное введение субстанции АС-01 мышам в диапазоне доз от 6 до 120 мг/кг не вызывало гибели животных. При введении препарата в диапазоне доз от 1 до 5 г/кг было установлено, что доза 5 г/кг вызывала 100% гибель животных, доза 4 г/кг являлась максимально переносимой, что позволяет отнести препарат к классу малотоксичных соединений (по классификации Мельниковой, 1977).

Внутрижелудочное введение субстанции АС-01 в дозах 6; 30; 60; 90; 120 мг/кг не приводило к изменению внешнего вида, подвижности мышей, потребления пищи и воды, к появлению клинических симптомов отравления. Препарат в дозах 1, 2, 3, 4 и 5 г/кг вызывал снижение мышечного тонуса и подвижности животных, повышение частоты дыхания, снижение потребления пищи. Гибель животных (при дозе 5 г/кг) происходила через 1-2 суток после введения препарата. К 7 суткам после введения клиническое состояние выживших мышей не отличалось от нормы. В ходе патоморфологического исследования у животных опытной группы обнаружены воспалительные изменения слизистой желудка.

Таким образом, заявляемое средство обладает следующими преимуществами перед прототипом:

- обладает выраженным антибактериальным действием по отношению к патогенным штаммам микроорганизмов;

- обладает низкой токсичностью;

- имеет стабильный химический состав на протяжении двух лет хранения (срок наблюдения) при режиме его хранения -4±2°C и +20±4°C.

Использование заявляемого средства в качестве основы антибактериальных препаратов позволит получить новые эффективные лекарственные средства с иным механизмом действия по сравнению с ныне применяемыми лекарственными препаратами, не содержащими ионов металлов в своей структуре.

Таблица 1
C мкг/м л	Salmonella typhimurium		Staphylococcus aureus		Candida albicans		Proteus vulgaris		Pseudomonas aeruginosa
	исх. титр -9,0×10 5		исх. титр - 1,3×10 6		исх. титр - 1,5×10 5		исх. титр - 3,2×10 6		исх. титр - 10 6
	титр	БА	титр	БА	титр	БА	титр	БА	титр	БА
100	<102	+	<102	+	2,3×103	+	<102	+	<102	+
10	6,0×10 2	+	<10 2	+	6,1×10 4	+/-	<10 2	+	<10 2	+
1	3,2×108	-	<102	+	7,4×106	-	2,1×108	-	3,0×102	+
0.1		-	<10 2	+	4,3×10 7	-	>10 8	-	8,7×10 8	-
00,1			<102	+	~108	-	>108	-	~109	-
Контроль	8,6×108		1,2×109		3,6×107		7,7×108		1,3×109