способ прогнозирования уровня гликированного гемоглобина у больных сахарным диабетом 2 типа

Формула изобретения

Способ прогнозирования уровня гликированного гемоглобина y индивидуумов русской национальности, больных сахарным диабетом 2 типа, включающий забор периферической венозной крови, отличающийся тем, что после выделения из периферической венозной крови ДНК, проводят анализ полиморфизма гена рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа (+36A/G TNFR1) и прогнозируют повышенный уровень гликированного гемоглобина у больных сахарным диабетом 2-го типа в случае выявления полиморфного варианта +36АА TNFR1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для оценки степени компенсации сахарного диабета 2 типа.

Сахарный диабет - это эндокринное заболевание, характеризующееся хроническим повышением уровня сахара в крови вследствие абсолютного или относительного дефицита инсулина - гормона поджелудочной железы. Заболевание приводит к нарушению всех видов обмена веществ, поражению сосудов, нервной системы, а также других органов и систем. Согласно литературным данным роль генетических факторов в развитии СД2 составляет 60-80% [Аметов А.С. Гипергликемия и глюкозотоксичность - ключевые факторы прогрессирования сахарного диабета 2-го типа [Текст] / А.С. Аметов, Л.Н. Богданова // Русский медицинский журнал. - 2010. - Т.18, № 23. - С.1416-1418; Bluher, M Role of muscle and fat tissue in the pathogenesis of type 2 diabetes [Text] / M. Bluher, M. Stumvoll // Dtsch. Med. Wochenschr. - 2006. - Vol.131, suppl.8. - P.S231-S235].

Важное значение в определении степени компенсации сахарного диабета 2 типа имеет уровень гликированного гемоглобина, который отражает средний уровень гликемии за последние три месяца [Дедов И.И. Алгоритмы специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом [Текст] / И.И. Дедов, M.В. Шестакова // Сахарный диабет. - 2011. - 72 с. - (Прил. к журн. № 3, вып.5)]. Высокий уровень гликированного гемоглобина говорит о декомпенсированном сахарном диабете и возможно более раннем развитии осложнений на фоне повышенной гликемии. Низкий уровень гликированного гемоглобина отражает благоприятное течение сахарного диабета и положительный эффект от проводимого лечения сахароснижающими препаратами.

По данным литературы установлено, что фактор некроза опухолей и его рецепторы ассоциированы с клинико-лабораторным статусом больных сахарным диабетом 2-го типа [Кондратова Н.В. Клинико-лабораторные проявления метаболического синдрома у пациентов с различными аллелями гена фактора некроза опухолей альфа [Текст]: дис. канд. мед. наук: 14.00.06 / Н.В. Кондратова. - M., 2004. - 121 с.: ил.].

Рецептор фактора некроза опухолей 1-го типа (TNFR1), который известен также как CD120a, является белком с молекулярной массой 55-60 kDa (p55) и опосредует все виды действия факторов некроза опухолей - апоптоз, пролиферацию и дифференцировку клеток, а также обладает противовирусной активностью. Ген TNFR1 у человека расположен на хромосоме 12р13. Данный рецептор несет ответственность за острый воспалительный ответ и экспрессируется в большинстве типов клеток. Клеточный ответ приводит к протеолитическому расщеплению мембранного рецептора и образованию его растворимой формы. Растворимый TNFR1 стабилизирует циркулирующий TNF и увеличивает период полураспада данного цитокина. Факторы некроза опухолей, соединяясь со своим рецептором, образуют домен, обусловливающий конформационные изменения TNFR1 и инициацию определенного клеточного сигнала [Insulin sensitivity and adipocytokines in patients with diabetes and prediabetes [Text] / A. Mayorov, K. Urbanova, G. Galstyan [et al.] // Journal of Diabetes, 2009. - Vol.1, suppl. s.1. - P. A17].

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования уровня гликированного гемоглобина у больных сахарным диабетом 2-го типа на основе данных о полиморфизме гена рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа.

Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2013 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования уровня гликированного гемоглобина у больных сахарным диабетом 2-го типа на основе молекулярно-генетических данных в зависимости от полиморфных маркеров генов рецептора 1-го типа фактора некроза опухоли.

Известен способ по патенту № 2038597 (публ. 27.06.1995) «Способ определения гликированного гемоглобина в крови», включающий забор крови, отделение эритроцитов, их гемолиз, нанесение гемолизата на колонку с сорбентом с привитыми группами м-аминофенилборной кислоты, элюирование гликированного гемоглобина с последующим измерением оптической плотности и расчетом, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют кремнезем, содержащий привитые группы м-аминофенилборной кислоты.

Недостатком этого метода является определение только гликированного гемоглобина, без оценки уровня компенсации сахарного диабета 2 типа.

За прототип выбран патент № 2022270 (публ. 30.10.1994 г.) «Способ определения компенсации сахарного диабета у детей». Данное изобретение относится к медицине, в частности к эндокринологии, может быть использовано для установления компенсации сахарного диабета у детей, а также для оценки правильности выбора дозы инсулина. Сущность изобретения: для определения компенсации сахарного диабета у детей определяют содержание гликированных гемоглобинов и активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в крови. И при содержании гликированных гемоглобинов до 3,5% и активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в пределах 1,8-2,7 мкмоль мин/г Hb определяют компенсацию сахарного диабета.

Недостаток прототипа заключается в том, что он имеет ограниченное применение, только для детей, и не учитывает влияние генетических маркеров на уровень гликированного гемоглобина больных сахарным диабетом 2 типа.

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов прогнозирования уровня гликированного гемоглобина для определения компенсации сахарного диабета 2 типа.

Технический результат использования изобретения - возможность определения компенсации сахарного диабета 2 типа путем прогнозирования уровня гликированного гемоглобина у индивидуумов русской национальности, больных сахарным диабетом 2 типа по данным генетического полиморфизма рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа (+36A/G TNFR1).

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования уровня гликированного гемоглобина у больных сахарным диабетом 2-го типа, включающий:

- забор периферической венозной крови;

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфизма гена +36A/G TNFR1;

- прогнозирование повышенного уровня гликированного гемоглобина у больных сахарным диабетом 2-го типа в случае выявления полиморфного варианта +36АА TNFR1.

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза уровня гликированного гемоглобина у больных сахарным диабетом 2-го типа по наличию генотипа +36АА TNFR1 гена рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа (+36A/G TNFR1).

Способ осуществляют следующим образом.

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных сахарным диабетом 2-го типа в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl₂ , 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°C, 4000 об./мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (pH=8,0) и 75 мМ NaCI, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°C в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°C.

Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1).

Анализ полиморфизма гена TNFR1 в области 1 экзона проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (pH=8,8), 2,5 мМ MgCl₂, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 95°C) выполняли 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров - 1 мин при 50°C; денатурация - 15 сек при 95°C.

Таблица 1
Ген	Полиморфизм и его локализация в гене	Структура праймеров	Литература
NFR1	+36A/G (1 экзон)	F:5'-AGCCCACTCTTCCCTTTGTC-3'	(Soo Jin Chae et al., 2008)
		R:5'-CCACCGTGCCTGACCTG-3'
		5'-FAM:CTGCTGCCACTGGT-RTQ1-3'
		5'-ROX:CTGCTGCCGCTGGT-BHQ2-3'

Изобретение характеризуется на фигурах 1 и 2.

На фигуре 1 представлена дискриминация аллелей по локусу +36A/G TNFR1 (где - гомозиготы 36АА TNFR1, - гомозиготы 36GG TNFR1, - гетерозиготы 36AG TNFR1, - отрицательный контроль), которая осуществляется методом Tag Man зондов по данным величин RFU, где RFU - это уровень относительной флуоресценции (УОФ) каждого зонда. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю A, зонд с красителем - FAM-аллелю G.

Две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием RFU для одного флуорофора (на оси x) относительно RFU для другого флуорофора (на оси у) на диаграмме дискриминации аллелей.

- Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (GA).

- Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю G (RFU аллеля G отложены по оси y).

- Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю A (RFU аллеля А отложены по оси x).

- Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно (в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль).

На фигуре 2 представлены ассоциации генетического полиморфизма +36A/G TNFR1 с уровнем гликированного гемоглобина у больных СД2.

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Ассоциации аллелей и генотипов изученных ДНК-маркеров с течением заболевания у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2×2 с расчетом критерия ² с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI) [Реброва О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA [Текст] / О.Ю. Реброва. - М.: Медиасфера, 2006. - 305 с.; Боровиков В. Statistica: искусство анализа данных на компьютере / В. Боровиков. - 2-е изд. - СПб.: Питер, 2003. - 688 с.: ил. - (Для профессионалов)].

Возможность использования предложенного способа для оценки уровня гликированного гемоглобина у больных сахарным диабетом 2-го типа подтверждает анализ результатов наблюдений 236 больных сахарным диабетом. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования, являлись индивидуумами русской национальности, уроженцами Центрального Черноземья России и не имели родства между собой.

Установлено, что медиана уровня гликированного гемоглобина в исследуемой группе больных составила 8,65% (интерквартильный размах 7,20-9,90%). Выявлено, что больные СД2 с генотипом +36АА TNFR1 отличаются повышенным уровнем гликированного гемоглобина (медиана - 8,95%, нижний квартиль - 7,80%, верхний квартиль - 10,60%) по сравнению с больными, имеющими генетические варианты +36AG и +36GG TNFR1 (медиана - 8,50%, интерквартильный размах 7,10-9,6%, p=0,03) (фиг.2).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что маркером повышенного уровня гликированного гемоглобина у индивидуумов русской национальности, больных сахарным диабетом 2 типа, является полиморфный вариант +36AA TNFR1, что может быть использовано в эндокринологических стационарах при обследовании пациентов с сахарным диабетом 2 типа для формирования группы риска с неблагоприятным клиническим течением СД2 (с прогнозируемым повышенным уровнем гликированного гемоглобина), что позволит оптимизировать тактику ведения данных пациентов (раннее назначение инсулинотерапии, реализация мероприятий по профилактике осложнений сахарного диабета 2 типа, проведение курсов сосудистой и метаболической терапии, более частое посещение эндокринолога и смежных специалистов).