фармацевтическая композиция для лечения и предупреждения рака

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики рака, содержащая в качестве эффективного компонента антитело или его фрагмент, где указанное антитело обладает иммунореактивностью по отношению к белку CD179b, где указанный белок CD179b имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 или аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 80% идентична указанной аминокислотной последовательности или ее фрагменту, содержащему не менее чем 7 последовательных аминокислот.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанным раковым заболеванием является рак молочной железы, лейкоз или лимфома.

3. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, где указанным антителом является моноклональное антитело или поликлональное антитело.

4. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, где указанным антителом является антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или биспецифическое антитело.

5. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, где указанным антителом является любое из антител ниже:

(1) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:103, 104 и 102, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:106, 107 и 108, где указанное антитело обладает иммунореактивностью в отношении белка CD179b на поверхности раковых клеток;

(2) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:105, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:109, где указанное антитело обладает иммунореактивностью в отношении белка CD179b на поверхности раковых клеток;

(3) где антитело по (1) и (2), которое является гуманизированным антителом, химерным антителом, одноцепочечным антителом или биспецифическим антителом.

6. Способ лечения и/или профилактики рака с использованием антитела или его фрагмента, где указанное антитело обладает иммунореактивностью по отношению к белку CD179b, где белок CD179b имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 или аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 80% идентична указанной аминокислотной последовательности или ее фрагменту, содержащему не менее чем 7 смежных аминокислот.

Описание изобретения к патенту

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому фармацевтическому применению анти-CD179b антитела или его фрагмента в качестве средства для лечения и/или профилактики рака.

Предшествующий уровень техники

Из всех смертельных заболеваний самой главной причиной, приводящей к летальному исходу, является рак, и в настоящее время способы лечения рака включают, главным образом, хирургическую операцию в сочетании с лучевой терапией и химиотерапией. Хотя за последние годы были разработаны новые хирургические методы лечения рака и появились новые противораковые средства, однако в настоящее время какого-либо заметного улучшения результатов лечения рака, за исключением некоторых его видов, пока не наблюдается. В последнее время благодаря развитию молекулярной биологии и иммунологии рака были идентифицированы раковые антигены, распознаваемые антителами, и цитотоксические Т-клетки, которые специфически реагируют с раковыми клетками, а также были идентифицированы гены, кодирующие раковые антигены, а поэтому появилась надежда разработать такие терапевтические методы, которые обеспечивали бы специфическое нацеливание лекарственных средств на раковые антигены (не-патентный документ 1).

При разработке терапевтических методов лечения рака, для снижения побочных эффектов было бы желательно, чтобы пептид, полипептид или белок, распознаваемые как антигены, почти не присутствовали в нормальных клетках, а, в частности, желательно, чтобы они присутствовали только в раковых клетках. В 1991 году, в Бельгии в Институте Людвига, Boon и др. выделили антиген меланомы MAGE1 человека, распознаваемый CD8-позитивными Т-клетками, методом клонирования по уровню продуктов экспрессии кДНК, осуществляемого с использованием аутологичной раковой клеточной линии и Т-клеток, реагирующих с раковыми клетками (не-патентный документ 2). Позже в литературе был описан метод SEREX (серологической идентификации антигенов путем клонирования посредством рекомбинантной экспрессии), в котором опухолевые антигены, распознаваемые антителами, продуцируемыми в живом организме пациента с раком в ответ на опухолевые антигены самого пациента, были идентифицированы методом клонирования посредством экспрессии генов (не-патентный документ 3; патентный документ 1), и с применением этого метода было выделено несколько раковых антигенов, которые почти не экспрессируются в нормальных клетках, но специфически экспрессируются в раковых клетках (не-патентные документы 4-9). Кроме того, с использованием части этих антигенов в качестве мишеней были проведены клинические тесты по клеточной терапии с применением иммуноцитов, специфически реагирующих с этими раковыми антигенами, а также тесты по специфической противораковой иммунотерапии, такой как терапия с использованием вакцин, содержащих раковые антигены.

С другой стороны, в последние годы во всем мире появилось большое количество различных антител, используемых в качестве лекарственных средств для лечения рака, где указанные лекарственные средства нацелены на антигенные белки, присутствующие на раковых клетках. Поскольку с использованием таких лекарственных антител в качестве средств для противораковой терапии может быть достигнут определенный фармакологический эффект, то эти антитела заслуживают особого внимания, однако большинство антигенных белков, являющихся мишенями, также экспрессируются и в нормальных клетках, а поэтому в результате введения такого антитела повреждаются не только раковые клетки, но также и нормальные клетки, экспрессирующие такие антигены, что приводит к возникновению побочных эффектов, создающих серьезные проблемы. Таким образом, предполагается, что идентификация раковых антигенов, специфически экспрессирующихся на поверхности раковых клеток, и применение антител, нацеленных на эти антигены, в качестве лекарственных средств, позволит осуществлять лечение указанными лекарственными антителами с минимальными побочными эффектами.

Известно, что CD179b представляет собой часть суррогатной легкой цепи иммуноглобулина и экспрессируется на поверхностях мембран клеток, которые являются предшественниками В-клеток (пре-В-клеток и про-В-клеток). После дифференцировки В-клеток CD179b исчезает и не экспрессируется в зрелых В-клетках. Однако известно, что CD179b экспрессируется в клетках лейкоза (пре-В-клеточного лейкоза), продуцируемых при малигнизации пре-В-клеток (не-патентные документы 10 и 11). Кроме того, известно, что CD179b также экспрессируется в клетках лимфомы (пре-В-клеточной лимфомы), продуцируемых при малигнизации пре-В-клеток, и может быть использован в качестве диагностического маркера пре-В-клеточной лимфомы (не-патентный документ 12). Однако в литературе отсутствуют какие-либо сообщения о специфической экспрессии этого антигена в клетках лейкоза, не являющихся клетками пре-В-клеточного лейкоза, в клетках лимфомы, не являющихся клетками пре-В-клеточной лимфомы, в клетках рака молочной железы и т.п. Кроме того, отсутствуют какие-либо предположения о возможности применения анти-CD179b антител для лечения и/или профилактики рака.

Документы-прототипы

Патентные документы

Патентный документ 1: US 5698396 B

Не-патентные документы

Не-патентный документ 1: Tsuyoshi Akiyoshi, «Cancer and Chemotherapy», 1997, Vol. 24, pp.551-519

Не-патентный документ 2: Bruggen P. et al., Science, 254:1643-1647 (1991)

Не-патентный документ 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11810-11813 (1995)

Не-патентный документ 4: Int.J.Cancer, 72:965-971 (1997)

Не-патентный документ 5: Cancer Res., 58:1034-1041 (1998)

Не-патентный документ 6: Int.J. Cancer, 29:652-658 (1998)

Не-патентный документ 7: Int. J. Oncol., 14:703-708 (1999)

Не-патентный документ 8: Cancer Res., 56:4766-4772 (1996)

Не-патентный документ 9: Hum. Mol. Genet. 6:33-39 (1997)

Не-патентный документ 10: Adv. Immunol., 63:1-41 (1996)

Не-патентный документ 11: Blood, 92:4317-4324 (1998)

Не-патентный документ 12: Modern Pathology, 17:423-429 (2004).

Описание сущности изобретения

Проблемы, которые могут быть решены с помощью настоящего изобретения

Настоящее изобретение позволяет идентифицировать белки раковых антигенов, специфически экспрессирующиеся на поверхностях раковых клеток, и относится к применению антител, нацеленных на эти белки, в качестве средств для лечения и/или профилактики рака.

Средства для решения указанных проблем

Авторами настоящего изобретения были проведены интенсивные исследования методом SEREX с использованием сыворотки, взятой у собак-пациентов, от которых была создана библиотека кДНК тканей собачьего рака молочной железы, и в результате этих исследований была получена кДНК, кодирующая белок, который связывается с антителами, присутствующими в сыворотке организма животного с раковой опухолью, и на основе гена человека, гомологичного полученному гену, был продуцирован CD179b человека, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3. Кроме того, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что CD179b почти не экспрессируется в нормальных тканях, но специфически экспрессируется в клетках рака молочной железы, лейкоза и лимфомы. Кроме того, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что антитела против такого CD179b способны уничтожать раковые клетки, экспрессирующие CD179b, и этот факт был положен в основу настоящего изобретения.

Таким образом, настоящее изобретение имеет нижеследующие отличительные признаки.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, используемой для лечения и/или профилактики рака и содержащей в качестве эффективного компонента антитело или его фрагмент, где указанное антитело обладает иммунореактивностью по отношению к белку CD179b, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, или аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 60% идентична указанной аминокислотной последовательности или ее фрагменту, содержащему не менее чем 7 смежных аминокислот.

В этом варианте вышеупомянутым раковым заболеванием является раковая опухоль, экспрессирующая ген CD179b.

В другом варианте вышеупомянутым раковым заболеванием является рак молочной железы, лейкоз или лимфома.

В другом варианте указанным антителом является моноклональное антитело или поликлональное антитело.

В другом варианте указанным антителом является антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или биспецифическое антитело.

В другом варианте указанным антителом является антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:103, 104 и 102, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:106, 107 и 108, где указанное антитело обладает иммунореактивностью по отношению к белку CD179b.

В другом варианте указанным антителом является антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:105, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:109, где указанное антитело обладает иммунореактивностью по отношению к белку CD179b.

Настоящее изобретение также относится к таким антителам, как:

(i) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:103, 104 и 102, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:106, 107 и 108, где указанное антитело обладает иммунореактивностью по отношению к белку CD179b,

(ii) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:105, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:109, где указанное антитело обладает иммунореактивностью по отношению к белку CD179b,

(iii) антитела вышеуказанных пунктов (i) и (ii), обладающие цитотоксической активностью,

(iv) антитела вышеуказанных пунктов (i) и (ii), каждое из которых представляет собой гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или биспецифическое антитело.

Настоящее изобретение также относится к нижеследующим полипептидам или ДНК, таким как:

(v) ДНК, кодирующая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:105, или полипептид, кодируемый указанной ДНК,

(vi) ДНК, кодирующая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:109, или полипептид, кодируемый указанной ДНК,

(vii) ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:110,

(viii) ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:111,

(ix) полипептид гипервариабельной области (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 103, 104 и 102, или ДНК, кодирующая указанный полипептид,

(х) полипептид гипервариабельной области (CDR) легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 106, 107 и 108, или ДНК, кодирующая указанный полипептид.

Эффект настоящего изобретения

Анти-CD179b антитело, которое используется в настоящем изобретении, разрушает раковые клетки. Поэтому анти-CD179b антитело может быть использовано для лечения и/или профилактики рака.

Краткое описание графического материала

На фигуре 1 представлена диаграмма, иллюстрирующая профили экспрессии гена, кодирующего белок CD179b в нормальных тканях и в опухолевых клеточных линиях. На панели, обозначенной арабской цифрой 1, представлен профиль экспрессии гена, кодирующего белок CD179b, а на панели, обозначенной арабской цифрой 2, представлен характер экспрессии гена GAPDH.

На фигуре 2 представлена диаграмма, иллюстрирующая противоопухолевое действие антитела против CD179b (моноклонального анти-CD179b антитела #8) у «голых» мышей, которым была трансплантирована раковая клеточная линия Namalwa человека, экспрессирующая CD179b. Арабской цифрой 3 представлен размер опухоли у мышей, которым было введено моноклональное анти-CD179b антитело #8, а арабской цифрой 4 представлен размер опухоли у мышей, которым был введен PBS(-).

Наилучший способ осуществления настоящего изобретения

Аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:3 в Списке последовательностей, приведенном в настоящем изобретении, является аминокислотная последовательность CD179b, выделенная методом SEREX с использованием сыворотки, которая была взята у собак-пациентов и на основе которой была создана библиотека кДНК тканей собачьего рака молочной железы, где указанная кДНК была использована в качестве гомолога гена человека (гомологичного фактора) полипептида, специфически связывающегося с антителами, присутствующими в сыворотке, взятой у собак с раковой опухолью (см. пример 1). Антителом против CD179b, используемым в настоящем изобретении, может быть антитело любого типа, при условии, что оно обладает противоопухолевой активностью, и примерами таких антител являются моноклональные антитела, поликлональные антитела, синтетические антитела, мультиспецифические антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные антитела (scFv) и фрагменты антител, такие как Fab и F(ab')₂. Эти антитела и их фрагменты могут быть получены методами, известными специалистам. В настоящем изобретении антитело предпочтительно специфически связывается с белком CD179b, а в тех случаях, когда индивидуумом является человек, то указанным антителом предпочтительно является антитело человека или гуманизированное антитело, используемое в целях предотвращения или ингибирования реакции отторжения.

Используемый здесь термин «специфически связывается с белком CD179b» означает, что антитело специфически связывается с белком CD179b и, по существу, не связывается с другими белками.

В настоящем изобретении используемое антитело против CD179b может быть коммерчески доступным. Примерами известных антител против CD179b человека являются клоны, такие как GA170, H-60, HP6054, A-19, C-16, SLC1, SLC2, SLC3, SLC4 и HSL11, которые представляют собой коммерчески доступные клоны.

Противоопухолевая активность антитела, которое может быть использовано в настоящем изобретении, может быть проанализирована in vitr o путем проведения исследования на цитотоксичность этого антитела по отношению к опухолевым клеткам, экспрессирующим данный полипептид, с использованием иммуноцитов или комплемента, как описано ниже.

Кроме того, объектом настоящего изобретения, направленного на проведение лечения и/или профилактики рака, является млекопитающее, такое как человек, животное-компаньон, домашнее животное или животное, участвующее в спортивных состязаниях, а предпочтительным объектом является человек.

Используемые в настоящем описании термины «рак» и «опухоль» означают злокачественное новообразование и являются синонимами.

Получение антигенов, препаратов антител и фармацевтических композиций, рассматриваемых в настоящем изобретении, описано ниже.

Получение антигенов для получения препаратов антител

Виды организмов, белки или фрагменты которых используются в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела против CD179b, применяемого в настоящем изобретении, являются, но не ограничиваются ими, животные, такие как человек, собака, корова, мышь и крыса. Однако вид животного предпочтительно выбирают исходя из соображений совместимости с родительскими клетками, используемыми для слияния клеток, обычно, с белком, происходящим от млекопитающего, а особенно предпочтительно человека. Так, например, в случаях, когда CD179b представляет собой CD179b человека, белок CD179b человека или его пептидный фрагмент, могут быть использованы клетки, экспрессирующие CD179b человека или т.п.

Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности CD179b человека и его гомологов могут быть получены, например, в банке GenBank (NCBI, USA) и с использованием алгоритма, такого как BLAST или FASTA (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (87:2264-2268), 1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997). CD179b также обозначается как 5, IGLL1, Vpreb2, LOC608248 или т.п., однако в описании настоящего изобретения репрезентативным является обозначение «CD179b». Так, например, CD179b человека зарегистрирован под номерами NM_152855 и NM_020070, Vpreb2 мыши зарегистрирован под номером NM_016983, а LOC608248 собаки зарегистрирован под номером XM_845215.

В настоящем изобретении в случаях, если в качестве стандарта используется нуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность CD179b человека, то нуклеиновой кислотой или белком является мишень, последовательность которой на 50%-100%, предпочтительно на 60%-100%, более предпочтительно на 80%-100%, еще более предпочтительно на 90%-100%, а наиболее предпочтительно на 95%-100%, например на 97%-100%, 98%-100%, 99%-100% или 99,5%-100%, идентична последовательности SEQ ID NO:1 или 3. В описании настоящего изобретения термин «% идентичности последовательностей» означает процент (%) идентичных аминокислот (или оснований) от общего числа аминокислот (или оснований) при выравнивании двух последовательностей друг с другом так, чтобы между ними достигалось максимальное сходство с введением или без введения пробела(ов).

Длина фрагмента белка CD179b не должна быть меньше длины аминокислотной последовательности эпитопа (антигенной детерминанты), которая является самым коротким элементом, распознаваемым антителом, и его длина должна быть меньше общей длины белка. Длина эпитопа обычно составляет от 7 до 12 смежных аминокислот.

Вышеописанный белок CD179b человека и полипептиды, содержащие его пептидные фрагменты, могут быть синтезированы методом химического синтеза, таким как Fmoc-метод (метод с использованием флуоренилметилоксикарбонила) или tBoc-метод (метод с использованием трет-бутилоксикарбонила). Кроме того, они могут быть синтезированы стандартными методами, проводимыми с помощью коммерчески доступных пептидных синтезаторов различных типов. Кроме того, представляющий интерес полипептид может быть сконструирован известными методами генной инженерии, путем получения полинуклеотида, кодирующего вышеуказанный полипептид, и включения указанного полинуклеотида в вектор экспрессии, который затем встраивают в клетку-хозяина с последующим продуцированием полипептида в указанной клетке-хозяине.

Полинуклеотид, кодирующий вышеуказанный полипептид, может быть легко получен известным методом генной инженерии или стандартным методом с использованием коммерчески доступного синтезатора нуклеиновых кислот. Так, например, ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, может быть получена с помощью ПЦР, проводимой с использованием библиотеки хромосомных ДНК человека или библиотеки кДНК человека в качестве матрицы, и пары праймеров, сконструированных так, чтобы затем с помощью этих праймеров можно было амплифицировать нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1. ПЦР может быть проведена в соответствующих реакционных условиях, и примерами таких условий являются, но не ограничиваются ими, проведение 30 циклов реакции при 94°С в течение 30 секунд (денатурация), при 55°С в течение 30 секунд-1 минуты (отжиг) и при 72°С в течение 2 минут (удлинение), и последующее проведение реакции при 72°С в течение 7 минут. Затем нужная ДНК может быть выделена путем создания соответствующего(их) зонда(ов) или праймера(ов) исходя из данных о нуклеотидной и аминокислотной последовательностях SEQ ID NO:1 и 3, представленных соответственно в Списке последовательностей, прилагаемом к настоящему описанию, и с использованием зонда(ов) или праймера(ов) для скрининга библиотеки кДНК человека или т.п.

Библиотеку кДНК предпочтительно получают из клеток, органов или тканей, экспрессирующих белок SEQ ID NO:3. Примерами таких клеток и тканей являются костный мозг, клетки лейкоза, раковые клетки молочной железы и клетки лимфомы. Вышеописанные операции, такие как получение зонда(ов) или праймера(ов), конструирование библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК и клонирование представляющего интерес гена, известны специалистам и могут быть осуществлены методами, описанными, например, в руководстве Sambrook et al., Molecular Cloning:Second Edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989). Из полученной таким образом ДНК может быть создана ДНК, кодирующая белок CD179b человека или его пептидный фрагмент.

Описанными выше клетками-хозяевами могут быть любые клетки, при условии, что они будут экспрессировать вышеуказанный полипептид, и примерами прокариотических клеток являются, но не ограничиваются ими, клетки E.coli, а примерами эукариотических клеток являются, но не ограничиваются ими, культивированные клетки млекопитающих, такие как клетки почек обезьяны COS1, клетки яичника китайского хомячка СНО, клеточная линия почек плода человека НЕК293 и клеточная линия кожи мышиного эмбриона NIH3T3; дрожжевые клетки, такие как клетки дрожжей, размножающихся почкованием, и дрожжей, размножающимся делением; клетки тутового шелкопряда и клетки лягушачьих яиц Xenopus.

В случае использования прокариотических клеток в качестве клеток-хозяев вектор экспрессии, применяемый в прокариотических клетках, имеет ориджин репликации, промотор, сайт связывания с рибосомой, сайт множественного клонирования, терминатор, ген резистентности к лекарственному средству, неаллельный комплементарный ген и/или т.п. Примерами вектора экспрессии для E.coli являются система pUC, pBluescriptII, экспрессионная система рЕТ и экспрессионная система pGEX. Благодаря введению ДНК, кодирующей вышеуказанный полипептид, в такой вектор экспрессии и трансформации этим вектором прокариотических клеток-хозяев с последующим культивированием полученных трансформантов может быть осуществлена экспрессия полипептида, кодируемого указанной ДНК, в прокариотических клетках-хозяевах. В этом способе указанный полипептид может быть также экспрессирован в виде гибрида с другим белком (например, с белком, флуоресцирующим в зеленом диапазоне спектра (GFP) или с глутатион-S-трансферазой (GST)).

Если используются эукариотические клетки-хозяева, то в качестве вектора экспрессии применяется вектор экспрессии для эукариотических клеток, имеющий промотор, сайт сплайсинга, сайт присоединения pole(A) и/или т.п. Примерами таких векторов экспрессии являются pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, вектор EBV, pRS, pcDNA3, pMSG и pYES2. Полипептид, кодируемый ДНК, может быть экспрессирован в эукариотических клетках-хозяевах способом, аналогичным способу, описанному выше, путем включения ДНК, кодирующей вышеописанный полипептид, в указанный вектор экспрессии, и трансформации этим вектором эукариотических клеток-хозяев с последующим культивированием полученных трансформантов. Если в качестве вектора экспрессии используются pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 или т.п., то вышеописанный полипептид может экспрессироваться в виде слитого белка, к которому присоединена метка, такая как His-метка (например, (His)₆-(His) ₁₀), FLAG-метка, myc-метка, НА-метка или GFP.

Для введения вектора экспрессии в клетки-хозяева могут быть применены хорошо известные методы, такие как электропорация, метод с использованием фосфата кальция, метод с использованием липосом, метод с использованием DEAE-декстрана и микроинжекция.

Выделение и очистка представляющего интерес полипептида из клеток-хозяев могут быть осуществлены путем проведения комбинаций хорошо известных методов разделения. Примерами таких известных методов разделения являются, но не ограничиваются ими, обработка денатурирующим агентом, таким как мочевина, или поверхностно-активным веществом; ультразвуковая обработка; ферментативный гидролиз; высаливание или фракционированное осаждение растворителем; диализ; центрифугирование; ультрафильтрация; гель-фильтрация; электрофорез в ДСН-ПААГ; изоэлектрическое фокусирование; ионообменная хроматография; гидрофобная хроматография; аффинная хроматография; и обращенно-фазовая хроматография.

Структура антител

Антитело обычно представляет собой гетерополимерный гликопротеин, имеющий по меньшей мере две тяжелых цепи и две легких цепи. Антитело, за исключением IgM, представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин размером примерно 150 кДа, состоящий из двух идентичных легких цепей (L) и двух идентичных тяжелых цепей (Н). Обычно, каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью посредством одной ковалентной дисульфидной связи, однако у иммуноглобулинов различных изотипов число дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьируется. Каждая тяжелая цепь и легкая цепь также имеют внутрицепьевые дисульфидные связи. Каждая тяжелая цепь на одном своем конце имеет вариабельный домен (VH-область), а за ним расположено несколько константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (VL-область) и одну константную область с противоположного конца. Константная область каждой легкой цепи расположена на одной линии с первой константной областью тяжелой цепи, а каждый вариабельный домен легкой цепи расположен на одной линии с вариабельным доменом тяжелой цепи. Каждый вариабельный домен антитела имеет конкретные области, характеризующиеся особой вариабельностью и называемые комплементарность-определяющими (гипервариабельными) областями (CDR), и именно, эти области сообщают антителу специфичность связывания. Части в каждой вариабельной области, которые являются относительно консервативными, называются каркасными областями (FR). Каждый полный вариабельный домен тяжелой и легкой цепи имеет четыре FR, связанные тремя CDR. В каждой тяжелой цепи три CDR обозначаются CDRH1, CDRH2 и CDRH3 и расположены по порядку от N-конца, а в каждой легкой цепи они обозначаются CDRL1, CDRL2 и CDRL3 соответственно. Для специфичности связывания антитела с антигеном самое важное значение имеет CDRH3. Кроме того, CDR в каждой цепи удерживаются вместе посредством FR-областей таким образом, что CDR вместе с CDR другой цепи располагаются близко друг к другу, в результате чего эти CDR образуют антигенсвязывающий сайт. Хотя константная область не играет непосредственной роли в связывании антитела с антигеном, однако она обладает различными эффекторными функциями, такими как участие в антитело-зависимой клеточно-опосредуемой цитотоксичности (ADCC), и в фагоцитозе посредством связывания с рецептором Fc , и влияет на время полужизни/скорость клиренса под действием неонатального Fc-рецептора (FcRn), а также на комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) под действием компонента C1q каскада пути активации комплемента.

Получение антитела

Термин «анти-CD179b антитело согласно изобретению» означает антитело, обладающее иммунологической реактивностью с полноразмерным белком CD179b или его фрагментом. Используемый здесь термин «иммунологическая реактивность» означает свойство, благодаря которому антитело и антиген CD179b связываются друг с другом, и такое связывание запускает функцию разрушения (то есть гибели, ингибирования или регрессии) опухолей. В настоящем изобретении может быть использовано антитело любого типа, при условии, что оно будет связываться с белком CD179b и будет приводить к разрушению опухолей, таких как клетки лейкоза и лимфомы.

Примерами такого антитела являются моноклональные антитела, поликлональные антитела, синтетические антитела, мультиспецифические антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител, например Fab и F(ab')₂. Кроме того, указанное антитело принадлежит к условному классу иммуноглобулиновых молекул, таких как IgG, IgE, IgM, IgA, IgD или IgY, или к условному подклассу иммуноглобулиновых молекул, таких как IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 или IgA2.

Указанное антитело может быть также модифицировано путем гликозилирования, ацетилирования, формилирования, амидирования, фосфорилирования, ПЭГилирования (ПЭГ) и/или т.п.

Примеры получения различных антител описаны ниже.

В том случае, если необходимо получить моноклональное антитело, то клеточную линию лейкоза, например Namalwa, экспрессирующую CD179b, вводят мышам для их иммунизации, а затем у этих мышей извлекают селезенку. После этого клетки разделяют и подвергают слиянию с мышиными миеломными клетками, а затем, из полученных слитых клеток (гибридом) отбирают клон, продуцирующий антитело, обладающее действием, направленным на ингибирование роста раковых клеток. Антитело может быть получено путем выделения гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело, обладающее действием, направленным на ингибирование роста раковых клеток, с последующим культивированием указанной гибридомы и очисткой антитела из супернатанта культуры хорошо известным методом аффинной очистки.

Гибридома, продуцирующая моноклональное антитело, может быть также получена, например, способом, описанным ниже.

Сначала в соответствии с известным методом животное иммунизируют сенсибилизирующим антигеном. В основном указанный метод осуществляют путем внутрибрюшинной или подкожной инъекции сенсибилизирующего антигена млекопитающему. Более конкретно, сенсибилизирующий антиген разводят PBS (забуференным фосфатом физиологическим раствором) или физиологическим раствором до соответствующего объема, а затем полученную суспензию смешивают, если это необходимо, с соответствующим количеством обычного адъюванта, такого как полный адъювант Фрейнда. После этого осуществляют эмульгирование и полученную эмульсию несколько раз вводят млекопитающему через каждые 4-21 день. Кроме того, при иммунизации сенсибилизирующим антигеном может быть также использован подходящий носитель.

После проведения такой иммунизации млекопитающего и подтверждения увеличения уровня нужного антитела в сыворотке у млекопитающего осуществляют забор иммуноцитов и эти иммуноциты подвергают слиянию. Предпочтительными примерами иммуноцитов являются, в частности, клетки селезенки.

В качестве других родительских клеток, подвергаемых слиянию с иммуноцитами, используются миеломные клетки млекопитающих. Примерами предпочтительно используемых миеломных клеток являются различные известные клеточные линии, такие как P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653)(J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978)81, 1-7), NS-1 (Kohler G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976)6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H. et al., Cell(1976)8, 405-415), SP2/0 (Shulman M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (deSt. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980)35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) и R210 (Galfre G. et al., Nature (1979) 277, 131-133).

Слияние иммуноцитов и миеломных клеток может быть осуществлено известным методом, например методом, описанным Kohler & Milstein (Kohler G. and Milstein C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Более конкретно, слияние клеток осуществляют, например, в присутствии агента, стимулирующего слияние клеток, в обычной питательной среде. Примерами агентов, стимулирующих слияние клеток, являются полиэтиленгликоль (ПЭГ) и вирус Сендай (HVJ), а для повышения эффективности такого слияния, если это необходимо, может быть также добавлено вспомогательное вещество, такое как диметилсульфоксид.

Соотношение между используемыми иммуноцитами и миеломными клетками может быть установлено произвольно. Так, например, иммуноциты предпочтительно использовать в 1-10 раз большем количестве, чем миеломные клетки. Примерами сред, которые могут быть использованы для слияния клеток, являются среда RPMI1640, которая может оказаться предпочтительной для роста миеломной клеточной линии; среда МЕМ и другие среды, обычно используемые для культивирования клеток такого типа. Кроме того, вместе с этим может быть проведена замена сыворотки, такой как фетальная телячья сыворотка (FCS).

В процессе слияния клеток предварительно определенное количество иммуноцитов и миеломных клеток тщательно смешивают в среде, и добавляют предварительно нагретый, примерно до 37°С, раствор ПЭГ (например, со средней молекулярной массой примерно от 1000 до 6000) обычно до концентрации 30-60% (масс./об.), а затем полученную смесь перемешивают для получения представляющей интерес гибридомы. Затем, после проведения повторной операции последовательного добавления соответствующей среды и удаления супернатанта путем центрифугирования, агенты для слияния клеток и т.п., которые не являются предпочтительными для роста гибридом, удаляют.

Полученные таким образом гибридомы отбирают путем культивирования в нормальной селективной среде, такой как среда НАТ (среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культуру в вышеуказанной среде НАТ сохраняют в течение периода времени (обычно в течение периода времени от нескольких дней до нескольких недель), достаточного для гибели клеток, не являющихся представляющими интерес гибридомами (неслитых клеток). Затем проводят скрининг и клонирование одной гибридомы, продуцирующей представляющее интерес антитело, обычным методом лимитирующего разведения.

Помимо метода, в котором вышеуказанную гибридому получают путем иммунизации указанным антителом животного, не являющегося человеком, может быть также применен метод, в котором лимфоциты человека, такие как лимфоциты человека, инфицированные вирусом ЭБ, сенсибилизируют in vitr o белком, белок-экспрессирующими клетками или их лизатом, а затем сенсибилизированные лимфоциты подвергают слиянию с миеломными клетками человека, обладающими способностью непрерывно делиться, например U266 (регистрационный номер TIB196), с получением гибридомы, продуцирующей антитело человека, обладающее нужной активностью (например, активностью ингибирования роста клеток).

Полученная таким образом гибридома, продуцирующая моноклональное антитело, может быть субкультивирована в обычной среде и может храниться в жидком азоте в течение длительного периода времени.

То есть, гибридома может быть получена способом, в котором нужный антиген или клетки, экспрессирующие нужный антиген, используют в качестве сенсибилизирующего антигена для осуществления иммунизации стандартным методом иммунизации, с получением иммуноцитов, которые затем подвергают слиянию с известными родительскими клетками стандартным методом деления клеток, с последующим проведением скрининга клеток, продуцирующих моноклональное антитело (гибридом), в соответствии со стандартным методом скрининга.

Другим примером антитела, которое может быть использовано в настоящем изобретении, является поликлональное антитело. Поликлональное антитело может быть получено, например, методом, описанным ниже.

Природный белок CD179b или рекомбинантный белок CD179b, экспрессируемый как слитый белок с GST в микроорганизме, таком как E.coli, или их пептидный фрагмент используют для иммунизации мелких животных, таких как мыши, а также мыши или кролики, продуцирующие антитело человека, и у этих мелких животных берут сыворотку. Поликлональное антитело получают посредством очистки сыворотки, например путем преципитации сульфатом аммония, на колонках с белком А и G-белком с помощью ионообменной хроматографии с использованием DEAE или на аффинной колонке, связанной с белком CD179b или с синтетическим пептидом.

В настоящем описании известными примерами мышей, продуцирующих антитело человека, являются мыши КМ (Kirin Pharma/Medarex) и XenoMouse (Amgen). Если такая мышь является иммунизованной белком CD179b или его фрагментом, то полноразмерное поликлональное антитело человека может быть выделено из крови. Кроме того, моноклональное антитело человека может быть получено путем выделения клеток селезенки у иммунизованных мышей и последующего их слияния с миеломными клетками.

Антиген может быть получен методом с использованием клеток животных (переведенная выложенная заявка РСТ на патент Японии № 2007-530068), методом с использованием бакуловируса (например, W098/46777) или т.п. В случае низкой иммуногенности антигена иммунизация может быть осуществлена после процедуры связывания антигена с макромолекулой, обладающей иммуногенностью, такой как альбумин.

Кроме того, может быть также использовано антитело, кодируемое рекомбинантным геном, где указанное антитело было получено путем клонирования гена антитела, выделенного из гибридомы, и его включения в соответствующий вектор, который затем вводят хозяину для последующего продуцирования у данного хозяина антитела в соответствии с методами рекомбинантных ДНК (см., например, Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).

Более конкретно, кДНК вариабельной области (V-области) антитела синтезируют из мРНК гибридомы с использованием обратной транскриптазы. После получения ДНК, кодирующей V-область представляющего интерес антитела, эту ДНК присоединяют к ДНК, кодирующей константную область (С-область) представляющего интерес антитела, и полученный продукт встраивают в вектор экспрессии. Альтернативно, ДНК, кодирующая V-область антитела, может быть включена в вектор экспрессии, имеющий ДНК С-области антитела. Встраивание осуществляют так, чтобы экспрессия проходила под контролем регуляторных областей, таких как энхансер и/или промотор. Затем клетки-хозяева могут быть трансформированы этим вектором экспрессии в целях осуществления экспрессии антитела.

Анти-CD179b антителом согласно изобретению предпочтительно является моноклональное антитело. Однако таким антителом может быть также поликлональное антитело, генетически модифицированное антитело (такое как химерное антитело или гуманизированное антитело) или т.п.

Примерами моноклональных антител являются моноклональные антитела человека и моноклональные антитела животных, не являющихся человеком (например, моноклональные антитела мыши, моноклональные антитела крысы и моноклональные антитела курицы). Моноклональное антитело может быть получено путем культивирования гибридомы, продуцированной путем слияния клеток селезенки, выделенных у млекопитающего, не являющегося человеком (например, у мыши, продуцирующей антитело мыши или человека) и иммунизованного белком CD179b, с миеломными клетками. Как описано ниже в примерах, было получено мышиное моноклональное антитело #8, которое обладало подтвержденным противоопухолевым действием. Антитело #8 содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:105, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:109. В данном случае, область VH имеет аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:103 (CDR1), SEQ ID NO:104 (CDR2) и SEQ ID NO:102 (CDR3), а область VL имеет аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:106 (CDR1), SEQ ID NO:107 (CDR2) и SEQ ID NO:108 (CDR3).

Химерным антителом является антитело, полученное путем объединения последовательностей, происходящих от различных животных. В качестве примера может служить антитело, имеющее вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи мышиного антитела и константные области тяжелой цепи и легкой цепи антитела человека. Получение химерного антитела может быть осуществлено известным методом. Так, например, оно может быть получено путем присоединения ДНК, кодирующей V-область антитела, к ДНК кодирующей С-область антитела человека, а затем введения полученного продукта в вектор экспрессии и переноса этого вектора хозяину с последующим продуцированием у этого хозяина химерного антитела.

Примерами поликлональных антител являются антитела, полученные путем иммунизации животного, продуцирующего антитело человека (например, мыши), белком CD179b.

Гуманизированным антителом является модифицированное антитело, также называемое реконструированным антителом человека. Гуманизированное антитело может быть сконструировано путем переноса CDR антитела, выделенного у иммунизованного животного, в гипервариабельные области антитела человека. Для этих целей применяется общеизвестный метод рекомбинантных ДНК.

Более конкретно, последовательность ДНК, сконструированную так, чтобы CDR мышиного антитела были присоединены к каркасным областям (FR) антитела человека, синтезируют ПЦР-методом из нескольких олигонуклеотидов, полученных так, чтобы указанные олигонуклеотиды имели на своих концах перекрывающиеся области. Полученную ДНК присоединяют к ДНК, кодирующей константную область антитела человека, и продуцированный продукт встраивают в вектор экспрессии, после чего этот вектор вводят хозяину с получением гуманизированного антитела (см. публикацию Европейской патентной заявки № ЕР 239400 и публикацию Международной патентной заявки № WO96/02576). FR антитела человека, связанные посредством CDR, отбирают так, чтобы гипервариабельные области образовывали подходящий антигенсвязывающий сайт. Если это необходимо, то аминокислоты в каркасных областях вариабельных областей антитела могут быть заменены так, чтобы гипервариабельные области реконструированного антитела человека образовывали подходящий антигенсвязывающий сайт (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856). Кроме того, каркасные области могут быть заменены каркасными областями, происходящими от различных антител человека (см. публикацию Международной патентной заявки № WO99/51743).

После получения химерного антитела или гуманизированного антитела аминокислоты в вариабельных областях (например, FR) и/или в константных областях могут быть заменены другими аминокислотами.

Число замененных аминокислот составляет, например, менее 15, менее 10, не более 8, не более 7, не более 6, не более 5, не более 4, не более 3 или не более 2, предпочтительно 1-5, а более предпочтительно 1 или 2, и такое антитело с заменами должно быть функционально эквивалентным антителу без замен. Такими заменами предпочтительно являются консервативные аминокислотные замены, где указанные замененные аминокислоты обладают аналогичными свойствами, то есть, имеют аналогичные заряд, боковые цепи, полярность, ароматичность и/или т.п. Аминокислоты, обладающие аналогичными свойствами, могут быть подразделены, например, на основные аминокислоты (аргинин, лизин и гистидин), кислотные аминокислоты (аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота), незаряженные полярные аминокислоты (глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, цистеин и тирозин), неполярные аминокислоты (лейцин, изолейцин, аланин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин), аминокислоты с разветвленной цепью (треонин, валин и изолейцин) и ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин, триптофан и гистидин).

Примерами модифицированных антител являются антитела, связанные с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ). В модифицированном антителе согласно изобретению вещества, с которыми связывается антитело, не имеют ограничений. Такое модифицированное антитело может быть получено путем химической модификации продуцированного антитела. Такие методы хорошо известны специалистам.

Используемый здесь термин «функционально эквивалентный» означает, например, что рассматриваемые антитела обладают аналогичной биологической или биохимической активностью, а более конкретно, обладают аналогичной функцией, стимулирующей разрушение опухоли, и, по существу, не вызывают реакции отторжения при их введении человеку. Примерами такой активности могут быть активность, направленная на ингибирование роста клеток, и активность связывания.

Хорошо известным методом получения полипептида, функционально эквивалентного некоторым полипептидам, является метод введения мутации(й) в полипептид. Так, например, для введения, если это необходимо, мутации(й) в антитело согласно изобретению в целях получения антитела, функционально эквивалентного данному антителу, может быть проведен сайт-направленный мутагенез, известный специалистам (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W. and Fritz HJ (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA. 82, 488-492; Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) или т.п.

Антитело, которое распознает эпитоп белка CD179b, распознаваемого вышеуказанным анти-CD179b антителом, может быть получено методом, известным специалистам. Примерами методов, с помощью которых может быть получено указанное антитело, являются: метод, где белок CD179b, распознаваемый анти-CD179b антителом, определяют стандартным методом (например, путем картирования эпитопов), и такое антитело получают с использованием в качестве имунногена полипептида, имеющего определенную аминокислотную последовательность, включенную в данный эпитоп; и метод, где эпитоп антитела определяют стандартным методом с последующим отбором антитела, имеющего такой же эпитоп, как и эпитоп анти-CD179b антитела. Используемый здесь термин «эпитоп» означает полипептидный фрагмент, обладающий антигенностью или иммуногенностью у млекопитающего, предпочтительно человека, и имеющий длину минимум примерно 7-12 аминокислот.

Константа аффинности Ка (K_on/K_off ) антитела согласно изобретению предпочтительно составляет по меньшей мере 10⁷ М^-1, по меньшей мере 10 ⁸ М^-1, по меньшей мере 5×10⁸ М^-1, по меньшей мере 10⁹ М^-1 , по меньшей мере 5×10⁹ М^-1, по меньшей мере 10¹⁰ М^-1, по меньшей мере 5×10 ¹⁰ М^-1, по меньшей мере 10¹¹ М ^-1, по меньшей мере 5×10¹¹ М^-1 , по меньшей мере 10¹² М^-1 и по меньшей мере 10¹³ М^-1.

Антитело согласно изобретению может быть конъюгировано с противоопухолевым средством. Связывание антитела с противоопухолевым средством может быть осуществлено посредством спейсера, имеющего группу (например, сукцинимидильную группу, формильную группу, 2-пиридилтиогруппу, малеимидильную группу, алкоксикарбонильную группу или гидроксигруппу), реагирующую с аминогруппой, карбоксильной группой, гидроксигруппой, тиоловой группой и/или т.п.

Примерами противоопухолевых средств являются нижеследующие противоопухолевые средства, описанные в литературе и т.п., а именно паклитаксел, доксорубицин, даунорубицин, циклофосфамид, метотрексат, 5-фторурацил, тиотепа, бусульфан, импросульфан, пипосульфан, бензодопа, карбоквон, метуредопа, уредопа, альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, триметилолмеламин, буллатацин, буллатацинон, камптотецин, бриостатин, каллистатин, криптофицин 1, криптофицин 8, доластатин, дуокармицин, элеутеробин, панкратистатин, саркодиктиин, спонгистатин, хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, оксигидрохлорид мехлоретамина, мелфалан, новембицин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый аналог горчичного газа, кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин, калихеамицин, динемицин, клодронат, эсперамицин, аклациномицин, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицин, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицин, дактиномицин, деторбицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, адриамицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицин С, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, хеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин, деноптерин, птероптерин, триметрексат, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин и флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон, аминоглутетимид, митотан, трилостан, фролиновая кислота, ацеглатон, гликозид альдофосфамида, аминолевулиновая кислота, энилурацил, амсакрин, бестрабуцил, бизантрен, эдатраксат, дефофамин, демекольцин, диазиквон, элфорнитин, ацетат эллиптиния, эпотилон, этоглюцид, лентинан, лонидамин, майтанзин, ансамитоцин, митогуазон, митоксантрон, мопиданмол, нитраэрин, пентостатин, фенамет, пирорубицин, лозоксантрон, подофиллиновая кислота, 2-этилгидразид, прокарбазин, разоксан, ризоксин, шизофиллан, спирогерманий, тенуазоновая кислота, триазиквон, роридин А, ангуидин, уретан, виндезин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, гацитозин, доксетаксел, хлорамбуцил, гемцитабин, 6-тиогуанин, меркаптопурин, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин, винбластин, этопозид, ифосфамид, митоксантрон, винкристин, винорелбин, новантрон, тенипозид, эдатрексат, дауномицин, аминоптерин, кселода, ибандронат, иринотекан, ингибиторы топоизомеразы, дифторметилорнитин (ДМФО), ретиноевая кислота и капецитабин, и их фармацевтически приемлемые соли и производные.

Альтернативно, антитело согласно изобретению может быть связано с известным радиоизотопом, описанным в литературе, или т.п., таким как ²¹¹At, ¹³¹I, ¹²⁵I, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁵³Sm, ²¹² Bi, ³²P или Lu. Предпочтительным является радиоизотоп, эффективный для терапии и/или диагностики опухоли.

Антителом согласно изобретению является антитело, обладающее иммунологической реактивностью с CD179b, или антитело, которое специфически распознает CD179b. Таким антителом должно быть антитело, имеющее структуру, которая не вызывает или почти не вызывает реакцию отторжения у животного, которому вводят данное антитело. Если рассматриваемым животным является человек, то примерами таких антител являются антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела (например, химерные антитела «человек-мышь»), одноцепочечные антитела и биспецифические антитела. Каждым из указанных антител является рекомбинантное антитело, где каждая вариабельная область тяжелой цепи и легкой цепи происходит от антитела человека; каждая вариабельная область тяжелой цепи и легкой цепи состоит из гипервариабельных областей (CDR1, CDR2 и CDR3) антитела, происходящего от животного, не являющегося человеком, и каркасных областей, происходящих от антитела человека; либо каждая вариабельная область тяжелой цепи и легкой цепи происходит от животного, не являющегося человеком, где указанное рекомбинантное антитело имеет константные области антитела человека в тяжелой цепи и легкой цепи. Предпочтительными являются первые два антитела.

Эти рекомбинантные антитела могут быть получены следующим образом. ДНК, кодирующую моноклональное антитело (например, моноклональное антитело человека, моноклональное антитело мыши, моноклональное антитело крысы или куриное моноклональное антитело) против человеческого CD179b, клонируют из антитело-продуцирующих клеток, таких как гибридомы, с использованием этой ДНК в качестве матрицы, и получают ДНК, кодирующие вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи антитела, например, методом ОТ-ПЦР, с последующим определением последовательности вариабельной области или последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 в каждой легкой и тяжелой цепи в соответствии с Европейской системой нумерации по Кабату (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^Th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). Кроме того, ДНК, кодирующие соответствующие вариабельные области, или ДНК, кодирующие соответствующие CDR, получают методом рекомбинантных ДНК (Sambrook et al., Molecular Cloning, Second Edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989)) или на синтезаторе ДНК. В данном случае, вышеописанная гибридома, продуцирующая моноклональное антитело человека, может быть получена путем иммунизации животного, продуцирующего антитело человека (например, мыши), человеческим CD179b, и последующего слияния клеток селезенки, выделенных у иммунизованного животного, с миеломными клетками. Кроме того, если это необходимо, ДНК, кодирующие вариабельную область и константную область легкой цепи или тяжелой цепи антитела человека, получают методом рекомбинантных ДНК или на синтезаторе ДНК.

В случае гуманизированного антитела ДНК, кодирующая гуманизированное антитело, может быть получена способом, в котором последовательности CDR для ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи или тяжелой цепи, происходящей от антитела человека, заменяют соответствующими последовательностями CDR антитела, происходящего от животного, не являющегося человеком (например, мыши, крысы или курицы), и полученную таким образом ДНК присоединяют к ДНК, кодирующей константную область легкой цепи или тяжелой цепи антитела человека, соответственно.

В случае химерного антитела ДНК, кодирующая химерное антитело, может быть получена способом, в котором ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи или тяжелой цепи антитела, происходящего от животного, не являющегося человеком (например, мыши, крысы или курицы), присоединяют к ДНК, кодирующей константную область легкой цепи или тяжелой цепи антитела человека соответственно.

В случае одноцепочечного антитела, которое представляет собой антитело, имеющее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, линейно связанные друг с другом посредством линкера, ДНК, кодирующая одноцепочечное антитело, может быть получена способом, в котором ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, ДНК, кодирующая линкер, и ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи, связаны друг с другом. В данном случае каждая вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи происходит от антитела человека или от антитела человека, в котором только CDR-области заменены CDR-областями антитела, происходящего от животного, не являющегося человеком (например, от мыши, крысы или курицы). Кроме того, указанный линкер имеет длину в 12-19 аминокислот, и примером такого линкера является (G₄S)₃ , имеющий 15 аминокислот (Kim, GB et al., Protein Engineering Design and Selection 2007, 20(9):425-432).

В случае биспецифического антитела (диатела), которое представляет собой антитело, способное специфически связываться с двумя различными эпитопами, ДНК, кодирующая биспецифическое антитело, может быть получена, например, способом, в котором ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи А; ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи В; ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи В; и ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи А, присоединяют друг к другу в указанном порядке (но при этом ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи В, и ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи В, присоединяют друг к другу посредством ДНК, кодирующей линкер, описанный выше). В данном случае, каждая вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи происходят от антитела человека или от антитела человека, в котором только CDR-области были заменены CDR-областями антитела, происходящего от животного, не являющегося человеком (например, от мыши, крысы или курицы).

Рекомбинантное антитело может быть получено путем включения полученной(ых) таким образом рекомбинантной(ых) ДНК в один или несколько соответствующих векторов и введения полученного(ых) вектора(ов) в клетки-хозяева (например, клетки млекопитающих, дрожжевые клетки и клетки насекомых) с последующей (ко)экспрессией рекомбинантной(ых) ДНК (P.J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES, 1997 WILEY; P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; J.W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).

Антитело согласно изобретению, полученное вышеописанным методом, представляет собой антитело, включающее, например, вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:103, 104 и 102, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:106, 107 и 108. В данном случае аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO:103, 104 и 102, являются аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи мышиного антитела соответственно, а аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO:106, 107 и 108, являются аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи мышиного антитела соответственно. Поэтому гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или биспецифическое антитело согласно изобретению представляют собой, например, антитела, описанные ниже:

(i) Антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:103, 104 и 102, и аминокислотные последовательности каркасных областей, происходящих от антитела человека; и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:106, 107 и 108, и аминокислотные последовательности каркасных областей, происходящих от антитела человека.

(ii) Антитело, содержащее: вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:103, 104 и 102, и аминокислотные последовательности каркасных областей, происходящих от антитела человека; константную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, полученную от антитела человека; вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:106, 107 и 108, и аминокислотные последовательности каркасных областей, происходящих от антитела человека; и константную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, полученную от антитела человека.

(iii) Антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность в SEQ ID NO:105; и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:109.

(iv) Антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:105; константную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, полученную от антитела человека; вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:109; и константную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, полученную от антитела человека.

Последовательности константных областей и вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела человека могут быть взяты, например, из базы данных NCBI (USA: GenBank, UniGene и т.п.). Примерами таких последовательностей могут быть последовательности константной области тяжелой цепи человеческого IgG1, имеющие регистрационный номер J00228; последовательности константной области тяжелой цепи человеческого IgG2, имеющие регистрационный номер J00230; последовательности константной области тяжелой цепи человеческого IgG3, имеющие регистрационный номер Х03604; последовательности константной области тяжелой цепи человеческого IgG4, имеющие регистрационный номер К01316; последовательности константной области тяжелой цепи к человека, имеющие регистрационные номера V00557, X64135, X64133 и т.п., и последовательности константной области легкой цепи человека, имеющие регистрационные номера Х64132, Х64134 и т.п.

Вышеуказанное антитело предпочтительно обладает цитотоксической активностью, а поэтому оно может обладать противоопухолевым действием.

Кроме того, конкретные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи и CDR вышеуказанных антител приводятся лишь в целях иллюстрации, и специалистам в данной области очевидно, что они не ограничиваются этими конкретными последовательностями. Так, например, получают гибридому, которая может продуцировать другое антитело человека или антитело, происходящее от животного, не являющегося человеком (например, мышиное антитело), и направленное против человеческого CD179b, а затем моноклональное антитело, продуцируемое такой гибридомой, выделяют и проводят анализ для того, чтобы подтвердить, обладает ли представляющее интерес антитело такими свойствами, как иммунологическая аффинность и цитотоксичность по отношению к человеческому CD179b. С помощью такой процедуры идентифицируют гибридому, продуцирующую представляющее интерес моноклональное антитело, а затем из вышеописанной гибридомы выделяют ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи представляющего интерес антитела, после чего определяют последовательности этих ДНК и указанные ДНК используют для получения другого антитела.

Кроме того, вышеуказанное антитело согласно изобретению может иметь 1 или несколько (предпочтительно 1 или 2) аминокислотных замен, делеций и/или добавлений, в частности, в последовательности(ях) каркасной области и/или последовательности(ях) константной области каждого из описанных выше антител (i)-(iv) при условии, что указанное антитело будет обладать способностью к специфическому распознаванию CD179b. Используемый здесь термин «несколько» означает 2-5, а предпочтительно 2 или 3.

Настоящее изобретение также относится к ДНК, кодирующей вышеуказанное антитело согласно изобретению, к ДНК, кодирующей тяжелую цепь или легкую цепь вышеуказанного антитела, или к ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи вышеуказанного антитела. Примерами таких ДНК являются: ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой цепи, имеющие нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:103, 104 и 102; ДНК, кодирующие вариабельные области легкой цепи, имеющие нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:106, 107 и 108; и т.п.

Поскольку гипервариабельные области (CDR), кодируемые ДНК, имеющими эти последовательности, представляют собой области, определяющие специфичность антитела, то последовательности, кодирующие другие области в данном антителе (то есть константные области и каркасные области), могут происходить от другого антитела. Хотя, в данном случае, таким другим антителом является антитело, происходящее от организмов, не принадлежащих человеку, однако предпочтительно, чтобы такое антитело происходило от человека, так как это позволило бы уменьшить риск возникновения побочных эффектов. Таким образом, предпочтительно, чтобы в вышеописанной ДНК, области, кодирующие соответствующие каркасные области и константные области тяжелой цепи и легкой цепи, имели нуклеотидные последовательности, кодирующие соответствующие аминокислотные последовательности, происходящие от антитела человека.

Другими примерами ДНК, кодирующей антитело согласно изобретению, являются ДНК, которые кодируют вариабельную область тяжелой цепи, имеющую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:105, и ДНК, в которых область, кодирующая вариабельную область легкой цепи, имеет нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:109. В данном случае, примерами нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислотную последовательность SEQ ID NO:105, является нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:110. Кроме того, примерами нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислотную последовательность SEQ ID NO:109, является нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:111. Из этих ДНК предпочтительными являются ДНК, содержащие область, кодирующую константную область тяжелой цепи и легкой цепи, и имеющие нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность, полученную от антитела человека.

ДНК согласно изобретению может быть получена, например, вышеописанным методом или методом, описанным ниже. Сначала из гибридомы, от которой происходит антитело согласно изобретению, получают полноразмерную РНК с использованием коммерчески доступного набора для экстракции РНК, а затем синтезируют кДНК посредством обратной транскриптазы с использованием рандомизированных праймеров или т.п. Затем ПЦР-методом амплифицируют кДНК, кодирующую указанное антитело, с использованием в качестве праймеров олигонуклеотидов, имеющих последовательности, которые являются консервативными в гене вариабельной области тяжелой и легкой цепи известного мышиного антитела. Последовательность, кодирующая каждую константную область, может быть получена путем амплификации известной последовательности ПЦР-методом. Нуклеотидные последовательности ДНК могут быть определены стандартным методом, например, путем включения последовательностей в плазмиду или фаги, используемые для определения последовательностей.

Считается, что противоопухолевое действие анти-CD179b антитела согласно изобретению, направленное против CD179b-экспрессирующих раковых клеток, осуществляется по нижеследующим механизмам:

посредством антитело-зависимой клеточно-опосредуемой цитотоксичности (ADCC), вызываемой эффекторными клетками и направленной против CD179b-экспрессирующих клеток, и

посредством комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), направленной против CD179b-экспрессирующих клеток.

Таким образом, оценка активности анти-CD179b антитела, используемого в настоящем изобретении, может быть осуществлена, в частности, как описано ниже в примерах, путем измерения вышеуказанной ADCC-активности или CDC-активности, направленной против раковых клеток, экспрессирующих CD179b in vitro.

Поскольку анти-CD179b антитело, используемое в настоящем изобретении, связывается с белком CD179b на раковых клетках и обладает противоопухолевым действием, обусловленным вышеуказанной активностью, то предполагается, что такое антитело будет эффективным для лечения и/или профилактики рака. То есть, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, предназначенной для лечения и/или профилактики рака и содержащей анти-CD179b антитело в качестве эффективного компонента. В тех случаях, когда для введения в организм человека используется анти-CD179b антитело (терапия антителами), то для снижения иммуногенности предпочтительно, чтобы такое антитело было получено в виде антитела человека или гуманизированного антитела.

Чем выше аффинность связывания анти-CD179b антитела с белком CD179b на поверхности раковых клеток, тем выше противоопухолевая активность анти-CD179b антитела. То есть, если может быть получено анти-CD179b антитело, обладающее более высокой аффинностью связывания с белком CD179b, то больше вероятность того, что оно будет давать более высокий противоопухолевый эффект, а поэтому такое антитело может быть использовано в качестве фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака. Что касается более высокой аффинности связывания, то в данном случае предпочтительно, чтобы константа аффинности Ка (K_on/K_off) составляла по меньшей мере 10⁷ М^-1, по меньшей мере 10 ⁸ М^-1, по меньшей мере 5×10⁸ М^-1, по меньшей мере 10⁹ М^-1 , по меньшей мере 5×10⁹ М^-1, по меньшей мере 10¹⁰ М^-1, по меньшей мере 5×10 ¹⁰ М^-1, по меньшей мере 10¹¹ М ^-1, по меньшей мере 5×10¹¹ М^-1 , по меньшей мере 10¹² М^-1 и по меньшей мере 10¹³ М^-1, как указывалось выше.

Фармацевтическая композиция

Мишенью фармацевтической композиции согласно изобретению, предназначенной для лечения и/или профилактики рака, может быть любая мишень, при условии, что такой мишенью является раковая опухоль (клетка), экспрессирующая ген CD179b, а предпочтительно раковая опухоль (клетка), выбранная из группы, состоящей из клеток лейкоза, лимфомы и рака молочной железы, включая также рак молочной железы, комбинированный рак молочной железы, смешанную злокачественную опухоль молочной железы, внутрипросветную сосочковую аденокарциному, мастоцитому, хронический лимфоцитарный лейкоз, лимфому желудочно-кишечного тракта, лимфому пищеварительных органов и/или мелкоклеточную/среднеклеточную лимфому.

Кроме того, антитело или его фрагмент, используемые в настоящем изобретении, могут быть применены для терапии и/или профилактики вышеуказанных раковых заболеваний.

Если в настоящем изобретении антитело используется в качестве фармацевтической композиции, то такая композиция может быть приготовлена известными методами. Так, например, эта композиция может быть введена парентерально в форме раствора для инъекций и содержит раствор или суспензию, полученные с использованием другой фармацевтически приемлемой жидкости. Так, например, такая композиция может быть использована в комбинации с фармацевтически приемлемым(и) носителем(ями) и/или со средой/средами, такими как стерильная вода, физиологический раствор, растительное масло, эмульгатор, суспендирующий агент, поверхностно-активное вещество, стабилизатор, ароматизатор, наполнитель, носитель, антисептик и/или связующее вещество, которые затем смешивают с получением унифицированной дозы, необходимой для составления препарата, который, по существу, отвечает нужным требованиям. Количество эффективного компонента в данном препарате определяют так, чтобы данный препарат имел объем в назначенных пределах.

Стерильная композиция для инъекций может быть получена с использованием носителя, такого как дистиллированная вода для инъекций в соответствии со стандартным методом получения композиций.

Примерами водных растворов являются изотонические растворы, содержащие физиологический раствор, глюкозу и/или добавку(и), такую(ие) как D-сорбит, D-манноза, D-маннит и/или хлорид натрия, которые могут быть использованы в комбинации с соответствующим(и) солюбилизатором(ами), таким(и) как спирт, в частности этанол; многоатомный спирт, такой как пропиленгликоль; полиэтиленгликоль; неионное поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат 80 (ТМ); и/или НСО-60.

Примерами маслянистых жидкостей являются кунжутные масла и соевые масла, которые могут быть использованы в комбинации с бензилбензоатом или бензиловым спиртом в качестве солюбилизитора. Кроме того, может быть также включен забуферивающий агент, такой как фосфатный буфер или натрийацетатный буфер; мягчитель, такой как гидрохлорид прокаина; и/или стабилизатор, такой как бензиловый спирт, фенол или антиоксидант. Полученный раствор для инъекций обычно заливают в соответствующие ампулы.

Введение композиций осуществляют перорально или парентерально, а предпочтительно парентерально, и конкретными примерами такого введения являются инъекция раствора, интраназальное введение, внутрилегочное введение и чрескожное введение. Примерами инъекций растворов являются внутривенная инъекция, внутримышечная инъекция, внутрибрюшинное введение и подкожная инъекция, и такая инъекция может быть введена системно или местно.

Кроме того, способ введения может быть соответствующим образом выбран в зависимости от возраста, симптомов заболевания, пола пациента и т.п. Доза фармацевтической композиции, содержащей антитело или его фрагмент, может составлять в пределах, например, от 0,0001 мг до 1000 мг на 1 кг массы тела за один раз. Альтернативно, выбранная доза может составлять в пределах от 0,001 мг до 100000 мг на массу тела пациента, но эта доза не ограничивается указанными величинами. Доза и способ введения могут варьироваться в зависимости от массы тела, возраста и симптомов заболевания пациента и т.п. и могут быть соответствующим образом выбраны самим специалистом.

Полипептид и ДНК

Настоящее изобретение также относится к нижеследующим полипептидам и к ДНК, кодирующим описанное выше антитело, а именно:

(i) к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:105, и к ДНК, кодирующей указанный полипептид,

(ii) к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:109, и к ДНК, кодирующей указанный полипептид,

(iii) к ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:110,

(iv) к ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:111,

(v) к полипептиду CDR тяжелой цепи, выбранному из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:103, 104 и 102, и к ДНК, кодирующей указанный полипептид,

(vi) к полипептиду CDR легкой цепи, выбранному из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:106, 107 и 108, и к ДНК, кодирующей указанный полипептид.

Указанные полипептиды и ДНК могут быть получены методами генетической рекомбинации, описанными выше.

Примеры

Настоящее изобретение конкретно описано на нижеследующих примерах, однако эти примеры не ограничивают объема настоящего изобретения.

Пример 1: Идентификация нового ракового антигена методом SEREX

(1) Получение библиотеки кДНК

Из ткани раковой опухоли собачьей молочной железы, удаленной хирургическим путем, экстрагировали полноразмерную РНК методом с использованием кислотного гуанидиния-фенола-хлороформа, и poly(A)⁺-РНК очищали с использованием набора для очистки мРНК Oligotex-dT30 (изготавливаемого компанией Takara Shuzo Co., Ltd.) в соответствии с протоколом, описанным в прилагаемых инструкциях.

С использованием полученной таким образом мРНК (5 мкг) была синтезирована библиотека фаговой кДНК раковой опухоли собачьей молочной железы. Для получения библиотеки кДНК фага использовали набор для синтеза кДНК, набор для синтеза ZAP-кДНК и набор для клонирования ZAP-кДНК GigapackIII Gold Cloning (изготавливаемый фирмой STRATAGENE) в соответствии с протоколами, описанными в прилагаемых инструкциях. Размер полученной библиотеки фаговой кДНК составлял 2,99×10⁵ б.о.е./мл.

(2) Скрининг библиотеки кДНК с использованием сыворотки

Иммуноскрининг осуществляли с использованием библиотеки фаговой кДНК раковой опухоли собачьей молочной железы, полученной, как описано выше. Более конкретно, E.coli-хозяина (XL-1-Blue MRF) инфицировали полученной библиотекой так, чтобы в планшете размером 90×15 мм, содержащем агарозу NZY, находилось 2340 клонов, а затем осуществляли культивирование при 42°С в течение 3-4 часов для образования бляшек. Планшет покрывали нитроцеллюлозной мембраной (Hybond C Extra; изготовленной фирмой GE Healthcare Bio-Science), пропитанной IPTG (изопропил- -D-тиогалактозидом), и оставляли на 4 часа при 37°С для индуцирования и экспрессии белков, а затем белки переносили на мембрану. После этого, мембрану вынимали и погружали в буфер TBS (10 мм Tris-HCl, 150 мМ NaCl, рН 7,5), в который было добавлено 0,5% обезжиренное сухое молоко, а затем встряхивали в течение ночи при 4°С для ингибирования неспецифических реакций. Этот фильтр оставляли на 2-3 часа при комнатной температуре для прохождения реакции с 500-кратно разведенной сывороткой собаки-пациента.

В качестве вышеуказанной сыворотки собаки-пациента использовали всего 3 пробы сыворотки, которые брали у каждой собаки с вышеуказанной раковой опухолью молочной железы и у других собак-пациентов с раковой опухолью молочной железы. Эти пробы сыворотки хранили при -80°С и предварительно обрабатывали непосредственно перед использованием. Предварительную обработку сыворотки осуществляли нижеследующим способом. То есть, E.coli -хозяина (XL-1-Blue MRF) инфицировали фагом ZAP Express, в который не встраивали экзогенный ген, и культивировали на планшете с NZY в течение ночи при 37°С. Затем в планшет добавляли 0,2 М буфер NaHCO₃ (рН 8,3), содержащий 0,5 М NaCl, и этот планшет оставляли на 15 часов при 4°С с последующим выделением супернатанта в виде экстракта E.coli/фага. Затем выделенный экстракт E.coli/фаг пропускали через NHS-колонку (изготовленную фирмой GE Healthcare Bio-Science) для иммобилизации белков, происходящих от E.coli /фага. Сыворотку, взятую у собаки-пациента, пропускали через эту колонку с иммобилизованным белком и оставляли для реакции с белками, после чего из сыворотки удаляли антитела, которые адсорбировались на E.coli и фаге. Сывороточную фракцию, пропущенную через колонку в неадсорбированном виде, 500-кратно разводили TBS, в который было добавлено 0,5% обезжиренное сухое молоко, и полученное разведение использовали в качестве материала для иммуноскрининга.

Мембрану, на которой осуществляли блоттинг обработанной таким образом сыворотки и вышеописанных слитых белков, 4 раза промывали буфером TBS-Т (0,05% твин-20/TBS) и козье антитело против собачьих IgG (ПХ-конъюгированное козье антитело против собачьих IgG-h+I, полученное в лаборатории BETHYL Laboratories, Inc.), которое было 500-кратно разведено буфером TBS, содержащим 0,5% обезжиренное сухое молоко, и которое использовалось в качестве «второго» антитела, оставляли на 1 час при комнатной температуре для прохождения реакции. Детектирование осуществляли посредством ферментативной цветовой реакции с использованием реакционного раствора NBT/BCIP (полученного фирмой Roche) и колонии, в которых сайты положений были идентичны сайтам положений в цветовой реакции, собирали из планшета с агарозой NZY размером 90×15 мм, а затем растворяли в 500 мкл буфера SM (100 мМ NaCl, 10 мМ MgClSO₄, 50 мМ Tris-HCl, 0,01% желатина, рН 7,5). Второй и третий скрининг осуществляли путем повторения той же самой процедуры, описанной выше, до тех пор, пока колонии, которые были позитивными в цветовой реакции, не превращались в моноколонии, и после скрининга 92820 фаговых клонов, реагирующих с IgG в сыворотке, выделяли 45 позитивных клонов.

Поиск гомологии выделенных генов антигена

Для анализа последовательностей 45 позитивных клонов, выделенных вышеуказанным методом, осуществляли процедуру превращения фагового вектора в плазмидный вектор. Более конкретно, 200 мкл раствора, полученного так, чтобы оптическая плотность OD₆₀₀E.coli-хозяина (XL-1-Blue MRF) не превышала 1,0, а также 250 мкл очищенного фагового раствора и 1 мкл фага-помощника ExAssist (полученного фирмой STRATAGENE) смешивали вместе и полученную смесь оставляли на 15 минут при 37°С для прохождения реакции, а затем добавляли 3 мл LB-бульона и полученный продукт культивировали при 37°С в течение 2,5-3 часов. Затем сразу проводили 20-минутное инкубирование в водяной бане при 70°С и центрифугирование при 1000× g в течение 15 минут, после чего супернатант собирали в виде фагмидного раствора. После этого 200 мкл раствора, полученного так, чтобы оптическая плотность фагмиды в E.coli-хозяине (SOLR) не превышала OD₆₀₀=1,0, и 10 мкл очищенного фагмидного раствора смешивали вместе и полученную смесь оставляли на 15 минут при 37°С для прохождения реакции, а затем 50 мкл-аликвоты полученной смеси высевали на агаровую среду LB, в которую был добавлен ампициллин (в конечной концентрации 50 мкг/мл), и культивировали в течение ночи при 37°С. Моноколонии трасформированной SOLR собирали и культивировали в среде LB, в которую был добавлен ампициллин (в конечной концентрации 50 мкг/мл) при 37°С, а затем плазмидные ДНК, имеющие представляющие интерес вставки, очищали с использованием набора для получения плазмид QIAGEN plasmid Miniprep (изготавливаемого фирмой QIAGEN).

Каждую очищенную плазмиду подвергали анализу путем секвенирования полноразмерной последовательности-вставки методом «прогулки по праймеру» с использованием праймера Т3, представленного в SEQ ID NO:94, и праймера Т7, представленного в SEQ ID NO:95. В результате анализа этой последовательности были получены генные последовательности, представленные под четными номерами SEQ ID NO:4-92. С использованием нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей (нечетные номера SEQ ID NO:5-93) этих генов осуществляли поиск гомологии с известными генами с использованием программы поиска гомологии BLAST (), и в результате было обнаружено, что все полученные 45 генов представляют собой гены, кодирующие CD179b. Гомология нуклеотидных последовательностей этих 45 генов составляла 94-99%, а гомология аминокислотных последовательностей этих генов составляла 96-99%. В области трансляции в белок гомология этих генов и гена, кодирующего гомологичный фактор человека, составляла 62-82% для нуклеотидных последовательностей и 69-80% для аминокислотных последовательностей. Нуклеотидная последовательность гомологичного фактора человека представлена в SEQ ID NO:1, а аминокислотные последовательности гомологичного фактора человека представлены в SEQ ID NO:2 и 3.

(4) Анализ экспрессии гена в каждой ткани

Экспрессию генов, полученных вышеописанным методом, в нормальных тканях собак и человека и в различных клеточных линиях исследовали методом ОТ-ПЦР (с помощью ПЦР с обратной транскриптазой). Реакцию обратной транскрипции осуществляли следующим образом. То есть, из 50-100 мг каждой ткани или из 5-10×10⁶ клеток каждой клеточной линии экстрагировали полноразмерную РНК с использованием реагента TRIZOL (полученного фирмой INVITROGEN) в соответствии с протоколом, описанным в прилагаемых инструкциях. С использованием этой полноразмерной РНК была синтезирована кДНК с помощью системы синтеза первой цепи Superscript для ОТ-ПЦР (полученной фирмой INVITROGEN) в соответствии с протоколом, описанным в прилагаемых инструкциях. В качестве ДНК нормальных тканей человека (головного мозга, гиппокампа, яичек, толстой кишки и плаценты) использовали кДНК Gene Pool (полученную фирмой INVITROGEN), кДНК QUICK-Clone (полученную фирмой CLONETECH) и библиотеку кДНК с крупной вставкой (полученную фирмой CLONETECH). ПЦР-реакцию осуществляли, как описано ниже, с использованием праймеров, специфичных к полученным собачьим генам (представленным в SEQ ID NO:96 и 97) и к гомологичному гену человека (представленному в SEQ ID NO:98 и 99). То есть, реагенты и добавленный буфер смешивали так, чтобы концентрации/количество 0,25 мкл образца, полученного с помощью реакции обратной транскрипции, 2 мкМ каждого из вышеописанных праймеров, 0,2 мМ каждого из dNTP и 0,65 единиц полимеразы ExTaq (полученной фирмой Takara Shuzo Co., Ltd.) были доведены до общего объема 25 мкл, а затем осуществляли реакцию путем проведения 30 циклов: 94°С, 30 секунд, 60°С, 30 секунд и 72°С, 30 секунд, с использованием термоячейки (изготовленной фирмой Bio-Rad Laboratories, Inc.). Вышеописанные праймеры, специфичные к генам, имеющим нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:96 и 97, использовали для амплификации в положениях 32-341 нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:4, и амплификации области, которая является общей для всех собачьих генов CD179b, представленных нечетными номерами в SEQ ID NO:4-92. Кроме того, праймеры, специфичные к генам, имеющим нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:98 и 99, использовали для амплификации нуклеотидных последовательностей в положениях 216-738, представленных в SEQ ID NO:1. В то же самое время, для сравнения, в качестве контроля использовали праймеры, специфичные к GAPDH (представленные в SEQ ID NO:100 и 101). В результате этого, как показано на фигуре 1, полученные собачьи гены не экспрессировались в нормальных тканях собак, но обнаруживали высокий уровень экспрессии в тканях собачьего рака молочной железы. Что касается экспрессии гомологичного гена человека, то костный мозг был единственной нормальной тканью человека, в которой была подтверждена экспрессия этого гена, но что касается раковых клеток человека, то его экспрессия детектировалась в клеточных линиях лейкоза и в клеточных линиях рака молочной железы, то есть была подтверждена специфическая экспрессия CD179b в клеточных линиях лейкоза и в клеточных линиях рака молочной железы.

Как показано на фиг.1, на панели, обозначенной арабской цифрой 1, цифры в ординатах означают паттерн экспрессии гена, идентифицированного, как описано выше, а на панели, обозначенной арабской цифрой 2, представлен паттерн экспрессии гена GAPDH, используемого в качестве контроля для сравнения.

(5) Анализ экспрессии антигенного белка в раковых клетках

Затем исследовали каждую раковую клеточную линию, в которой была подтверждена экспрессия гена CD179b, для того, чтобы определить, экспрессируется ли на поверхности этих клеток белок CD179b. В микроцентрифужную 1,5 мл-пробирку помещали 10 ⁶ клеток каждой раковой клеточной линии человека, в которых наблюдалась экспрессия указанного гена, и эту пробирку центрифугировали. Затем в пробирку добавляли 5 мкл мышиного антитела против человеческого CD179b (название клона: GA170, полученного фирмой Santa Cruz Biotechnology), и полученную смесь суспендировали в 95 мкл PBS, в который была добавлена 0,1% фетальная телячья сыворотка, после чего полученную суспензию оставляли на 1 час на льду. После промывки клеток PBS эти клетки суспендировали в смеси 5 мкл ФИТЦ-меченного кроличьего моноклонального антитела против мышиных IgG2a (полученного фирмой BD Pharmingen) и 95 мкл PBS, в который была добавлена 0,1% фетальная бычья сыворотка, а затем полученную суспензию оставляли на 1 час на льду. После промывки клеток PBS измеряли интенсивность флуоресценции с помощью устройства FACSCalibur, изготовленного компанией Becton Dickinson. С другой стороны, описанную выше процедуру проводили для получения контрольных клеток, в которой вместо мышиного антитела против человеческого CD179b использовали контрольный изотип мышиного антитела IgG2a (полученный фирмой MBL). В результате этого клетки, к которым было добавлено антитело против человеческого CD179b, обнаруживали интенсивность флуоресценции, которая не менее чем на 10% превышала интенсивность контроля, и, следовательно, было подтверждено, что белок CD179b экспрессировался на поверхности клеточной мембраны вышеуказанной клеточной линии раковой опухоли человека.

Пример 2: Противоопухолевое действие анти-CD179b антитела, направленное против раковых клеток

(1) ADCC-активность

Затем было проведено исследование для того, чтобы определить, может ли анти-CD179b антитело разрушать опухолевые клетки, экспрессирующие CD179b. Анализ проводили с использованием коммерчески доступного мышиного антитела против человеческого CD179b (название клона: GA170). В 50-миллилитровой центрифужной пробирке собирали 10⁶ клеток, принадлежащих к каждому из 3 типов клеток человеческого лейкоза, Namalwa, BDCM и RPMI1788 (все они были закуплены в коллекции АТСС), в которых экспрессия CD179b была подтверждена, как описано в примере 1(5), собирали и в пробирку добавляли 100 мкКи хрома-51, а затем инкубировали при 37°С в течение 2 часов. Затем клетки 3 раза промывали средой RPMI, в которую была добавлена 10% фетальная телячья сыворотка, после чего эти клетки в количестве 10³ на лунку помещали в 96-луночный планшет с V-образным дном. В каждую лунку добавляли 1 мкг GA170, а затем добавляли 2×10⁵ лимфоцитов, выделенных из мышиной селезенки, после чего проводили культивирование при 37°С в атмосфере 5% CO₂ в течение 4 часов. Затем измеряли количество хрома-51, присутствующего в супернатанте культуры, высвобождаемом из разрушенных опухолевых клеток, и вычисляли ADCC-активность для GA170 против раковых клеток каждого типа. В результате этого было установлено, что ADCC-активность для Namalwa, BDCM и RPMI1788 составляла 32,6%, 32,3% и 28,3% соответственно. С другой стороны, если в той же самой процедуре использовали контрольный изотип (название клона: 6Н3) GA170, то вышеуказанная активность не была детектирована. Таким образом, было установлено, что благодаря ADCC-активности, индуцированной с использованием анти-CD179b антитела, опухолевые клетки, экспрессирующие CD179b, могут быть разрушены.

Цитотоксическую активность индуцировали способом, в котором анти-CD179b антитело согласно изобретению, мышиные лимфоциты и 10³ клеток от каждой клеточной линии лейкоза смешивали вместе, а затем клетки культивировали в течение 4 часов и измеряли количество хрома-51, высвобождаемого в среду после культивирования, после чего вычисляли цитотоксическую активность, направленную против клеточной линии лейкоза, по следующему уравнению:

*Уравнение: Цитотоксическая активность (%)=количество хрома-51, высвобождаемого из клеток Namalwa, BDCM и RPMI1788 после добавления анти-CD179b антитела и мышиных лимфоцитов/количество хрома-51, высвобождаемого из клеток-мишеней после добавления 1 н. соляной кислоты×100.

(2) CDC-активность

Кровь, взятую у кролика, помещали в пробирку Эппендорфа и оставляли на 60 минут при комнатной температуре, а затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут для получения сыворотки, которую анализировали на CDC-активность. В 50-миллилитровой центрифужной пробирке собирали 10⁶ клеток, принадлежащих к каждому из 3 типов клеток лейкоза человека, Namalwa, BDCM и RPMI1788, и в эту пробирку добавляли 100 мкКи хрома-51, а затем инкубировали при 37°С в течение 2 часов и клетки 3 раза промывали средой RPMI, в которую была добавлена 10% фетальная телячья сыворотка. Затем клетки суспендировали в среде RPMI, содержащей кроличью сыворотку, полученную, как описано выше, в количестве 50%, и помещали в 96-луночный планшет с V-образным дном в количестве 10³ клеток/лунку. В каждую лунку добавляли 1 мкг GA170, а затем проводили культивирование при 37°С в атмосфере 5% CO₂ в течение 4 часов. Затем измеряли количество хрома-51, присутствующего в супернатанте культуры, высвобождаемом из разрушенных опухолевых клеток, и вычисляли CDC-активность для GA170, направленную против раковых клеток каждого типа. В результате этого было установлено, что CDC-активность для Namalwa, BDCM и RPMI1788 составляла 30,5%, 21,2% и 30,5% соответственно. С другой стороны, если в той же самой процедуре использовали контрольный изотип (название клона: 6Н3) GA170, то вышеуказанная активность не была детектирована. Таким образом, было установлено, что благодаря CDC-активности, индуцированной с использованием анти-CD179b антитела, опухолевые клетки, экспрессирующие CD179b, могут быть разрушены.

Цитотоксическую активность индуцировали, как описано выше в (1) способом, в котором вычисляли цитотоксическую активность, направленную против каждой клеточной линии лейкоза, по следующему уравнению:

*Уравнение: Цитотоксическая активность (%)=количество хрома-51, высвобождаемого из клеток Namalwa, BDCM и RPMI1788 после добавления анти-CD179b антитела и кроличьей сыворотки/количество хрома-51, высвобождаемого из клеток-мишеней после добавления 1 н. соляной кислоты ×100.

Пример 3: Получение моноклонального антитела

(1) Получение антигенного белка

Человеческий белок CD179b получали методом липофекции клеток животных. Человеческий ген CD179b (SEQ ID NO:22) вводили в вектор, кодирующий область человеческого IgG1Fc, то есть в вектор SRaIgG1Fc, посредством рестрикционных XhoI- и BamHI- сайтов. Вектор SRaIgG1Fc представляет собой вектор, полученный путем введения гена для человеческой IgG1-Fc-области в вектор pcDL-SRa296 (полученный фирмой DNAX). Затем 24 мкг плазмиды смешивали с 60 мкл липофектамина 2000 (полученного фирмой Invitrogen) и к полученной смеси добавляли среду OPTI-MEM (полученного фирмой Invitrogen) до достижения общего объема в 3 мл, после чего смесь оставляли на период времени не менее чем 20 минут при комнатной температуре. К клеткам СНО-К1, предварительно доведенным до плотности 2×10⁶ клеток/12 мл OPTI-MEM, добавляли 3 мл вышеупомянутого смешанного раствора плазмиды, а затем культивировали в течение 8 часов при 37ºС в атмосфере 5% CO₂. Среду заменяли 10 миллилитрами среды СНО-S-SFM (полученной от Invitrogen), а затем культивировали в течение 4-5 дней. Очистку антигенного белка, продуцированного в супернатанте полученной культуры, осуществляли с использованием белка А- сефарозы НР (полученной от GE Healthcare). Белок А-сефарозу НР в достаточной степени уравновешивали 20 мМ фосфатным буфером (рН 7,4)/0,15 М NaCl (уравновешивающий буфер/промывочный буфер) и вводили раствор, приготовленный путем смешивания супернатанта культуры с уравновешивающим буфером в отношении 1:1. Затем колонку в достаточной степени промывали промывочным буфером и проводили элюирование с использованием 0,2 М глицин-содержащего буфера (рН 2,5). Проэлюированный раствор нейтрализовали добавлением 1 М Tris (рН 9) и буфер заменяли путем ультрафильтрации с использованием 20 мМ фосфатного буфера (рН 7,4)/0,15 NaCl для получения белка CD179b человека.

(2) Получение гибридом

Для получения антигенного раствора для каждой отдельной мыши 100 мкг антигенного белка (белка CD179b человека), полученного, как описано выше в (1), смешивали с равным количеством адъюванта MPL+TDM (полученного фирмой Sigma). Этот антигенный раствор внутрибрюшинно вводили 6-недельным мышам Balb/с (Japan SLC, Inc.) и такое введение осуществляли более 3 раз с интервалами в 1 неделю, после чего иммунизацию завершали. Селезенку, взятую через 3 дня после последней иммунизации, помещали между двумя стерильными предметными стеклами и столиком микроскопа, а затем 3 раза повторяли процедуру, в которой эти клетки промывали PBS(-) (полученным фирмой Nissui Pharmaceuticals Co., Ltd.) и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 минут для удаления супернатанта, в результате чего получали клетки селезенки. Полученные клетки селезенки и клетки мышиной миеломы SP2/0 (закупленные в АТСС) смешивали вместе в отношении 10:1, а затем к полученной смеси добавляли раствор ПЭГ, подогретый до 37°С и полученный путем смешивания 200 мкл среды RPMI-1640, в которую была добавлена 10% фетальная телячья сыворотка и 800 мкл ПЭГ 1500 (полученного фирмой Boehringer), после чего смесь оставляли на 5 минут для слияния клеток. Супернатант удаляли путем 5-минутного центрифугирования при 1700 об/мин, а затем клетки суспендировали в 150 мл среды RPMI1640 (селективной среды НАТ), которая содержала 15% фетальную телячью сыворотку и в которую добавляли 2% эквивалент раствора НАТ, полученный фирмой Gibco. В каждую лунку пятнадцати 96-луночных планшетов (изготовленных фирмой Nunc) высевали 100 мкл клеточной суспензии. Затем клетки культивировали в течение 7 дней при 37°С в атмосфере 5% CO₂ и получали гибридомы, продуцированные путем слияния клеток селезенки и миеломных клеток.

(3) Отбор гибридом

Гибридомы отбирали по аффинности связывания антител против белка CD179b человека, продуцируемых полученными гибридомами. В каждую лунку 96-луночного планшета помещали 100 мкл 1 мкг/мл раствора белка CD179b человека, полученного, как описано выше в (1), и раствор оставляли на 18 часов при 4°С. Каждую лунку 3 раза промывали PBS-Т и в каждую лунку добавляли 400 мкл 0,5% раствора BSA (альбумина бычьей сыворотки) (полученного фирмой Sigma), а затем планшет оставляли на 3 часа при комнатной температуре. Раствор удаляли и лунки 3 раза промывали 400 мкл/лунку PBS-Т, а затем добавляли 100 мкл/лунку супернатанта культуры каждой гибридомы, полученной, как описано выше в (2), и планшет оставляли на 2 часа при комнатной температуре. После 3-кратной промывки лунок PBS-Т в каждую лунку добавляли 100 мкл ПХ-меченного антитела против мышиных IgG (Н+L) (полученного фирмой Invitrogen), 5000-кратно разведенного PBS, и планшет оставляли на 1 час при комнатной температуре. Лунки 3 раза промывали PBS-Т и в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора субстрата ТМВ (полученного фирмой Thermo), а затем планшет оставляли на 15-30 минут для прохождения цветовой реакции. После окрашивания в каждую лунку добавляли 100 мкл 1 н. серной кислоты для прекращения реакции и измеряли оптическую плотность на 450 нм-595 нм с помощью абсорбционного спектрометра. В результате этого были отобраны гибридомы, продуцирующие антитела с наивысшей оптической плотностью.

Отобранные гибридомы помещали в 96-луночный планшет так, чтобы каждая лунка содержала 0,5 клеток, и культивировали. Через одну неделю в лунках наблюдалось образование моноколоний гибридом. Затем клетки в этих лунках снова культивировали и получали 60 клонированных гибридомных клеточных линий.

Затем гибридомную клеточную линию отбирали по аффинности связывания антител с антигеном клеток лейкоза, где указанные антитела продуцировались 60 вышеуказанными гибридомными клеточными линиями. В каждую лунку 96-луночного планшета помещали 100 мкл 1 мкг/мл раствора поли-L-лизина (полученного фирмой Sigma)-PBS и планшет оставляли на 30 минут при комнатной температуре. После удаления раствора поли-L-лизина-PBS процедуру заполнения каждой лунки стерильной дистиллированной водой и ее слива повторяли 3 раза, после чего планшет сушили воздухом в ламинарном шкафу. Клеточную линию лейкоза человека, Namalwa, для которой была подтверждена экспрессия CD179b, суспендировали в PBS(-) так, чтобы клеточная плотность составляла 10⁶ клеток/лунку, и 100 мкл полученной суспензии добавляли в каждую лунку вышеуказанного планшета, а затем планшет оставляли на 15 минут при комнатной температуре. После центрифугирования при 1700 об/мин в течение 5 минут супернатант удаляли и в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора 0,05% глутаральдегида (полученного Sigma)-PBS, после чего планшет оставляли на 10 минут при комнатной температуре. Каждую лунку 3 раза промывали PBS-Т и в эти лунки добавляли 300 мкл 0,5% раствора BSA, а затем планшет оставляли на 18 часов при 4°С. После 3-кратной промывки лунок PBS-Т в каждую лунку добавляли 100 мкл супернатанта культуры каждой из 60 гибридомных клеточных линий, полученных, как описано выше, и планшет оставляли на 2 часа при комнатной температуре. Затем супернатант удаляли и лунки 3 раза промывали PBS-Т, после чего в каждую лунку добавляли 100 мкл ПХ-меченного антитела против мышиных IgG (Н+L) (полученного фирмой Invitrogen), 5000-кратно разведенного в PBS, и планшет оставляли на 1 час при комнатной температуре. Лунки 3 раза промывали PBS-Т и в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора субстрата ТМВ (полученного фирмой Thermo), а затем планшет оставляли на 30 минут для прохождения цветовой реакции. После окрашивания в каждую лунку добавляли 100 мкл 1 н. серной кислоты для прекращения реакции и измеряли оптическую плотность на 450 нм-595 нм с помощью абсорбционного спектрометра. В результате этого была отобрана гибридомная клеточная линия #8, продуцирующая антитело с наивысшей оптической плотностью.

Изотип моноклонального анти-CD179b антитела #8, продуцированного штаммом #8 гибридомной клеточной линии, отобранной, как описано выше, определяли ELISA-методом. Супернатант культуры штамма #8 гибридомной клеточной линии оценивали с использованием набора для определения подтипов (COSMO BIO Co., Ltd.) в соответствии с протоколом, описанным в прилагаемых инструкциях, и этот анализ показал, что указанное моноклональное анти-CD179b антитело имеет подтип IgG3.

Пример 4: Противоопухолевое действие моноклонального анти-CD179b антитела #8

(1) Получение моноклонального анти-CD179b антитела #8

Штамм гибридомной клеточной линии #8 культивировали в среде Hibridoma SFM (поставляемой Invitrogen). Культуральную жидкость центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 минут и пропускали через систему фильтров с размером пор 0,22 мкм. Для очистки антитела использовали колонку Hitrap с белком А-сефарозой FF (полученной фирмой GE Healthcare). Эту колонку промывали PBS для уравновешивания. Затем в колонку вводили супернатант культуры, а затем эту колонку промывали PBS. Элюирование проводили с использованием 0,1 М глицина-HCl (рН 2,5), в результате чего получали очищенное антитело.

Противоопухолевое действие (на клетки) in vitro

ADCC-активность

Было проведено исследование для того, чтобы определить, может ли моноклональное анти-CD179b антитело #8 разрушать опухолевые клетки, экспрессирующие человеческий CD179b. Клетки лейкоза человека, Namalwa, для которых была подтверждена экспрессия человеческого CD179b, помещали в количестве 10⁶ в центрифужную 50 мл-пробирку, а затем в нее добавляли 10 мкКи хрома-51 и инкубировали при 37°С в течение 2 часов. Затем клетки 3 раза промывали средой RPMI, в которую была добавлена 10% фетальная телячья сыворотка, после чего эти клетки в количестве 10³ клеток/лунку помещали в 96-луночный планшет с V-образным дном. В каждую лунку добавляли 2 мкг моноклонального анти-CD179b антитела #8, а затем добавляли 2×10⁵ лимфоцитов, выделенных из мышиной селезенки, после чего проводили культивирование при 37°С в атмосфере 5% CO₂ в течение 4 часов. Затем измеряли количество хрома-51, присутствующего в супернатанте культуры, высвобождаемом из разрушенных опухолевых клеток, и оценивали ADCC-активность для моноклонального анти-CD179b антитела #8, направленную против клеток Namalwa. В результате этого было установлено, что ADCC-активность для Namalwa в каждой лунке составляет 60,6%. С другой стороны, если в той же самой процедуре использовали контрольный изотип (название клона: МЕ07), то вышеуказанная активность не детектировалась. Таким образом, было установлено, что благодаря ADCC-активности, индуцированной моноклональным анти-CD179b антителом #8, опухолевые клетки, экспрессирующие CD179b, могут быть разрушены.

CDC-активность

Кровь, взятую у кролика, помещали в пробирку Эппендорфа и оставляли на 60 минут при комнатной температуре, а затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут для получения сыворотки, которую анализировали на CDC-активность. В 50-миллилитровой центрифужной пробирке собирали 10⁶ клеток Namalwa, которые представляют собой клетки человеческого лейкоза, и в эту пробирку добавляли 100 мкКи хрома-51, а затем инкубировали при 37°С в течение 2 часов, после чего клетки 3 раза промывали средой RPMI, в которую была добавлена 10% фетальная телячья сыворотка. Затем клетки суспендировали в среде RPMI, содержащей сыворотку кролика, полученную. как описано выше, в количестве 50%, и эти клетки помещали в 96-луночный планшет с V-образным дном в количестве 10³ клеток/лунку. В каждую лунку добавляли 2 мкг моноклонального анти-CD179b антитела #8, а затем проводили культивирование при 37°С в атмосфере 5% CO₂ в течение 4 часов. После этого измеряли количество хрома-51, присутствующего в супернатанте культуры и высвобождаемого из разрушенных опухолевых клеток, и оценивали CDC-активность, индуцированную моноклональным анти-CD179b антителом #8 и направленную на клетки Namalwa. В результате этого было установлено, что CDC-активность для Namalwa составляла 30,5%. С другой стороны, если в той же самой процедуре использовали контрольный изотип (название клона: МЕ07), то вышеуказанная активность не детектировалась. Таким образом, было установлено, что благодаря CDC-активности, индуцированной моноклональным анти-CD179b антителом #8, опухолевые клетки, экспрессирующие CD179b, могут быть разрушены.

(3) Противоопухолевое действие на организм живых мышей

Был проведен анализ на противоопухолевую активность моноклонального анти-CD179b антитела #8 в организме живой мыши, имеющей опухоль. Используемое антитело получали путем очистки супернатанта культуры штамма #8 гибридомной клеточной линии на колонке в соответствии с процедурой, описанной выше.

Противоопухолевую активность моноклонального анти-CD179b антитела #8 оценивали на мышах с опухолью, которым была трансплантирована раковая клеточная линия, происходящая от клеток человека, экспрессирующих CD179b. Клетки Namalwa были подкожно трансплантированы в спинку каждой из 20 «голых» мышей (BALB/c Slc-nu/nu, поставляемых компанией Japan SLC, Inc.) в количестве 10⁶ клеток, после чего опухоль выращивали до размера примерно диаметром 7 мм. Каждой из 10 мышей с опухолью вводили 10⁷ лимфоцитов, выделенных из периферической крови мышей Balb/с (BALB/c Cr Slc, поставляемых компанией Japan SLC, Inc.), и 300 мкг моноклонального анти-CD179b антитела #8, выделенного из хвостовой вены. Затем то же самое количество мышиных лимфоцитов и антител, выделенных из хвостовой вены, вводили каждой мыши с опухолью всего 3 раза за 2 дня и каждый день измеряли объем опухоли для оценки противоопухолевого эффекта. С другой стороны, каждой из оставшихся 10 мышей с опухолью вместо вышеуказанного антитела вводили PBS(-) и этих мышей использовали как контрольную группу. В результате этого исследования было установлено, что в группе, которой вводили анти-CD179b антитело, объем опухоли на 8-й день снижался на 65% по отношению к объему опухоли в самом начале введения антитела, который принимали за 100%. На 11-й день, 17-й день и 20-й день объем опухоли снижался на 52%, 45% и 35% соответственно (см. фиг.2). С другой стороны, в контрольной группе, на 8-й день, 11-й день, 17-й день и 20-й день опухоль выросла примерно на 180%, 220%, 350% и 420% (см. фиг.2). Эти результаты показали, что полученное моноклональное анти-CD179b антитело #8 обладает сильным противоопухолевым действием in vivo на раковые клетки, экспрессирующие CD179b. Что касается размера опухоли, то ее объем вычисляли по следующему уравнению: большой диаметр×малый диаметр×малый диаметр×0,5.

Пример 5: Клонирование гена для вариабельной области моноклонального анти-CD179b антитела #8

Из гибридомной клеточной линии #8 экстрагировали мРНК и гены для вариабельной области (VH) тяжелой цепи и вариабельной области (VL) легкой цепи моноклонального анти-CD179b антитела #8 получали ОТ-ПЦР-методом с использованием праймеров, которые являются специфичными к мышиной лидерной последовательности и константной области антитела IgG3. Для определения последовательностей генов эти гены клонировали в вектор pCR2.1 (полученный фирмой Invitrogen).

(1) ОТ-ПЦР

Из 10⁶ клеток штамма гибридомной клеточной линии #8 получали мРНК с использованием набора для микроочистки мРНК (поставляемого фирмой GE Healthcare), и полученную мРНК подвергали обратной транскрипции для синтеза кДНК с использованием набора для синтеза 1-й цепи Superscript II (поставляемого фирмой Invitrogen). Эти процедуры осуществляли в соответствии с протоколами, описанными в инструкциях, прилагаемых к этому набору.

С использованием полученной кДНК гены, кодирующие данное антитело, амплифицировали ПЦР-методом. Для получения гена VH-области использовали праймер, специфичный к мышиной лидерной последовательности (SEQ ID NO:112), и праймер, специфичный к мышиной константной области IgG3 (SEQ ID NO:113). Кроме того, для получения гена VL-области использовали праймер, специфичный к мышиной лидерной последовательности (SEQ ID NO:114), и праймер, специфичный к мышиной константной области цепи (SEQ ID NO:115). Эти праймеры конструировали, как описано в публикации Jones ST and Bending MM Bio/technology 9, 88-89 (1991). Для ПЦР использовали буфер Ex Taq (полученный фирмой TAKARA BIO INC.). К 5 мкл 10×буфера EX Taq, 4 мкл смеси dNTP (2,5 мМ), 2 мкл каждого из праймеров (1,0 мкМ) и 0,25 мкл Ex Taq (5 единиц/мкл) добавляли образец кДНК, а затем добавляли стерильную воду для получения смеси общим объемом 50 мкл. Реакцию осуществляли в следующих условиях: 2-минутная обработка при 94°С, последующее проведение 30 комбинированных циклов, включающих денатурацию при 94°С, 1 минута, отжиг при 58°С, 30 секунд и реакцию удлинения при 72°С, 1 минута.

(2) Клонирование

С использованием каждого из ПЦР-продуктов, полученных, как описано выше, осуществляли электрофорез на агарозном геле и ДНК-полосы, соответствующие каждой VH-области и VL-области, вырезали. Каждый фрагмент ДНК подвергали процессингу с использованием набора для гель-очистки QIAquick (изготовленного фирмой QIAGEN) в соответствии с протоколом, описанным в прилагаемых инструкциях. Каждую очищенную ДНК клонировали в вектор pCR2.1 с использованием набора для клонирования ТА (поставляемого фирмой Invitrogen). Вектор, к которому была присоединена ДНК, использовали для трансформации компетентных клеток DH5a (полученных фирмой TOYOBO) в соответствии со стандартным методом. Десять клонов каждого из трансформантов культивировали в среде (100 мкг/мл ампициллина) при 37°С в течение ночи и каждую плазмидную ДНК очищали с использованием набора Qiaspin Miniprep (изготовленного фирмой QIAGEN).

(3) Определение последовательностей

Определение генных последовательностей области VH и области VL осуществляли путем анализа плазмидных ДНК, как описано в (2), с использованием прямого праймера М13 (SEQ ID NO:116) и обратного праймера М13 (SEQ ID NO:117) на флуоресцентном секвенаторе (секвенаторе ДНК 3130XL, изготавливаемом фирмой ABI), с использованием набора для секвенирования BigDye Terminator Ver.3.1 Cycle Sequencing в соответствии с протоколом, описанным в прилагаемых инструкциях. В результате этого были определены соответствующие генные последовательности (идентичные для 10 клонов каждого гена). Аминокислотная последовательность VH-области моноклонального анти-CD179b антитела #8 представлена в SEQ ID NO:105, а аминокислотная последовательность VL-области указанного антитела представлена в SEQ ID NO:109.

Промышленное применение

Антитело согласно изобретению может быть использовано для лечения и/или профилактики рака.

Список последовательностей, представленный в свободном формате

SEQ ID NO:94, 96-99: праймеры

SEQ ID NO:95: праймер Т7

SEQ ID NO:100 и 101: праймеры GAPDH

SEQ ID NO:116 и 117: праймеры