способ получения протективной белоксодержащей фракции бактерий

Формула изобретения

Способ получения протективной белоксодержащей фракции бактерий, включающий культивирование бактерий на жидкой питательной среде, отделение культуральной среды от бактерий и последующую очистку и концентрирование методом ультрафильтрации до получения белоксодержащей фракции бактерий, отличающийся тем, что осуществляют культивирование на жидкой питательной среде вирулентного штамма бактерий Staphylococcus aureus № 6, отделение культуральной среды от бактерий проводят путем фильтрования через фильтр PLASMAFILTER PLASMAFLUX PSu 2S, с последующим добавлением к полученному фильтрату сульфата аммония до 80 % насыщения, центрифугированием его при 10000g в течение 30 минут и растворением в фосфатном буфере с pH 7,4, перед очисткой и концентрированием проводят микрофильтрацию белоксодержащей фракции через мембрану 0,22 мкм и обессоливание на колонке PD-10, а очистку и концентрирование осуществляют путем проведения ион-обменной хроматографии на колонке Q-сефарозы и элюции 0,15 М NaCl и ультрафильтрации на двух фильтрах 100 и 30 кДа до получения белоксодержащей фракции с молекулярной массой 30-90 кДа и содержанием белка 0,5-1,0 мг/мл.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к вакцинным препаратам, и касается способа получения протективных антигенов на основе секретируемых белоксодержащих соединений Staphylococcus aureus, которые могут быть использованы для получения профилактических и лечебных иммунопрепаратов.

Проблема стафилококковых инфекций на протяжении многих лет является одной из актуальнейших проблем медицинской науки и здравоохранения всего мира, поскольку Staphylococcus aureus - доминирующий возбудитель гнойно-септических внутрибольничных инфекций. Проблема антибиотикотерапии осложнена распространенностью метициллинрезистентных штаммов, а также тем, что многие антибиотики, обладая иммунодепрессивными свойствами, снижают защитные силы организма. Трудности терапии определяют необходимость профилактики и комплексной терапии стафилококковой инфекции, включающей использование бактериостатических и иммунобиологических препаратов, активирующих иммунную систему. Разработка стафилококковых вакцин велась в различных направлениях, однако по разным причинам в настоящее время отсутствуют коммерческие противостафилококковые иммунопрепараты с доказанной эффективностью.

В последние годы большое внимание уделяют исследованиям по изучению патогенеза стафилококковой инфекции, в которых выявлена значимость многочисленных факторов патогенности, таких, в частности, как секретируемые белки [Otto M. Novel targeted immunotherapy approaches for staphylococcal infection. Expert Opin Biol Ther. 2010 July; 10(7): 1049-59. doi:10.1517/14712598.2010.495115].

Однако в настоящее время нет препаратов с доказанной эффективностью, поскольку при изучении вакцин, разработанных на основе железорегулируемого белка IsdB [Intercell in trouble as Merck stops MRSA vaccine trial. World News, 09.06.2011.; Kuklin N.A., dark D.J, Secore S., Cook J., Cope L.D, McNeely T. et al. A novel Staphylococcus aureus vaccine: iron surface determinant В induces rapid antibody responses in rhesus macaques and specific increased survival in a murine S. aureus sepsis model. Infect. Immun. 2006; 74(4): 2215-2223], хлопьеобразующего фактора ClfA [DeJonge M., Burchfield D., Bloom В., Duenas M., Walker W., Polak M. et al. Clinical trial of safety and efficacy of INH-A21 for the prevention of nosocomial staphylococcal bloodstream infection in premature infants. J. Pediatr. 2007 151(3): 260-265; Josefsson E., Hartford 0., O Brien L., Patti J.M., Foster T. Protection against experimental Staphylococcus aureus arthritis by vaccination with clumping factor A, a novel virulence determinant. J. Infect. Dis. 2001; 184(12): 1572-1580] или лейкоцидина Пантона-Валентайна (PVL), получены противоречивые результаты [Brown E.L., Dumitrescu О., Thomas D., Badiou С., Koers E.M., Choudhury P. et al. The Panton-Valentine leukocidin vaccine protects mice against lung and skin infections caused by Staphylococcus aureus USA 300. Clin. Microbiol. Infect. 2008; 15(2); 156-164; Bubeck Wardenburg J., Palazzolo-Ballance A.M., Otto M., Schneewind O., DeLeo F.R. Panton-Valentine leukocidin is not a virulence determinant in murine models of community-associated methicillinresistant Staphylococcus aureus disease. J. Infect. Dis. 2008; 198(8): 1166-1170].

Проводятся также исследования белоксодержащих соединений, секретируемых бактериальной клеткой в процессе ее жизнедеятельности.

Известен способ получения протективной белоксодержащей фракции бактерий, включающий культивирование бактерий на жидких питательных средах, отделение культуральной среды от бактерий. Культуральную среду, содержащую секретируемые белоксодержащие фракции, подвергают очистке и концентрируют методом ультрафильтрации с порогом отсечения белка 30 кДа и колоночной хроматографии с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-75 и последующей очистке на ДЕАЕ-сефарозе в градиенте Nad до получения фракций с молекулярной массой 30-50 кДа и содержанием белка 4-5 мг/мл. Для получения протективных антигенов на основе секретируемых белоксодержащих фракций используют нетоксигенные штаммы грамотрицательных или грамположительных микроорганизмов (RU 2311197 C1, A61K 39/00, 2007).

Недостатком этого способа является невозможность получения препаратов на основе протективного секретируемого стафилококкового белоксодержащего соединения для лечения и профилактики стафилококковых инфекций.

Техническим результатом, на решение которого направлено данное изобретение, является создание обладающего протективными свойствами белоксодержащего соединения на основе секретируемых белоксодержащих соединений Staphylococcus aureus, которые могут быть использованы для лечения и профилактики стафилококковых инфекций.

Для достижения указанного технического результата в способе получения протективной белоксодержащей фракции бактерий, включающем культивирование бактерий на жидкой питательной среде, отделение культуральной среды от бактерий и последующую очистку и концентрирование методом ультрафильтрации до получения белоксодержащей фракции бактерий, согласно изобретению осуществляют культивирование на жидкой питательной среде вирулентного штамма бактерий Staphylococcus aureus № 6, отделение культуральной среды от бактерий проводят путем фильтрования через фильтр PLASMAFILTER PLASMAFLUX PSu 2S с последующим добавлением к полученному фильтрату сульфата аммония, центрифугированием его при 10000 g в течение 30 минут и растворением в фосфатном буфере с pH 7,4, перед очисткой и концентрированием проводят микрофильтрацию белоксодержащей фракции через мембрану 0,22 мкм и обессоливание на колонке PD-10, а очистку и концентрирование осуществляют путем проведения ион-обменной хроматографии на колонке Q-сефарозы и элюции 0,15 М NaCl, ультрафильтрации на двух фильтрах 100 и 30 кДа до получения белоксодержащей фракции с молекулярной массой 30-90 кДа и содержанием белка 0,5-1,0 мг/мл.

Кроме того, в жидкую питательную среду добавляют 2,0 г/л экстракта дрожжевого растворимого при следующем соотношении компонентов питательной среды:

KH₂PO₄ - 4,50 г/л

K₂HPO₄ - 5,00 г/л

(NH₄)₂SO₄ - 1,00 г/л

MgSO₄×7H₂ O - 0,30 г/л

Цитрат натрия - 0,50 г/л

Глюкоза - 2,0 г/л

Экстракт дрожжевой растворимый - 2,0 г/л.

В предварительных экспериментах было выявлено, что в качестве продуцента протективных белоксодержащих соединений S. aureus целесообразно использование вирулентного слабоиммуногенпого штамма № 6 по сравнению с высокоиммуногенным слабовирулентным штаммом № 1991 (ЛД₅₀ последнего (0,5-2,0)×10 ⁹). Для изучения протективной активности выделенных белоксодержащих соединений иммунизацию мышей проводили подкожно двукратно двумя десятикратно убывающими дозами препаратов, выделенных из штаммов № № 1991 и 6; заражали двумя штаммами S.aureus: № № 1986 и 6. Перед заражением мышей была оттитрована доза ЛД₅₀, которая составляла для штаммов № № 1986 и 6 соответственно 1,14×10⁹ и 0,18×10 ⁹. Результаты, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о большей выживаемости мышей, иммунизированных препаратом из штамма № 6 в дозе 1,0 мкг белка на мышь, при заражении 2,2 ЛД ₅₀ двух штаммов, что говорит о более высоких протективных свойствах изучаемого препарата.

Пример осуществления способа

Способ получения протективного секретируемого белоксодержащего соединения S. aureus № 6, предусматривающий следующие стадии:

а) культивирование S. Aureus № 6 в жидкой синтетической питательной среде;

б) отделение микробной массы стерилизующей фильтрацией;

в) концентрирование и очистка фильтрата методом ион-обменной хроматографии;

д) фракционирование по молекулярной массе с помощью ультрафильтрации на двух фильтрах с порогом отсечения белка ниже 30 кДа и выше 100 кДа.

Вирулентный штамм S. aureus № 6, полученный из ФГБУ «НЦ ЭСМП» Минздрава России, ЛД₅₀ которого при внутривенном и внутрибрюшинном заражении соответственно (0,8-2,8)×10⁸ и (0,04-1,9)×10 ⁸, выращивали в синтетической среде следующего состава, с добавлением экстракта дрожжевого растворимого:

KH₂PO₄ - 4,50 г/л

K ₂HPO₄ - 5,00 г/л

(NH₄ )₂SO₄ - 1,00 г/л

MgSO ₄×7H₂O - 0,30 г/л

Цитрат натрия - 0,50 г/л

Глюкоза - 2,0 г/л

Экстракт дрожжевой растворимый - 2,0 г/л.

Флакон с 200 мл питательной среды инокулировали 5-7 изолированными колониями агаровой культуры и после 12-14-часовой инкубации выросшую культуру переносили в бутыль с 2 л среды, сохраняя соотношение культуры к среде 1:10, и инкубировали при 37°C и 90 об/мин на Biosan Multi-Shaker. Рост бактерий контролировали по оптической плотности при 565 нм (на спектрофотометре Genesys 10 UV, Thermo Spectronic, Rochester, NY, USA) и заканчивали через 4,5 ч - в конце фазы экспоненциального роста. Уровень накопления биомассы по оптической плотности ( ОП=ОП_конечн-ОП_{начальн}) составляет 2,7±0,6, что соответствует (1,5±0,4)×10⁹ микробных клеток/мл, рассчитанных по КОЕ.

Полученную микробную суспензию фильтруют через фильтр PLASMAFILTER PLASMAFLUX PSu 2S, что позволяет избежать использования азида натрия, который применяют для инактивации бактерий, и полноту стерилизации фильтрата контролируют путем высева на питательный агар. К полученному фильтрату прибавляют сульфат аммония до 80% насыщения по методу [Koide N., Muramatsu T. Endo-N-acetylglucosaminnidase acting on carbohydrate moieties of glycoproteins. Mol. Microbiol., 1974, 249 (15)^897-4904]. Осадок отделяют центрифугированием при 10000 g в течение 30 минут, растворяют в 50 мл фосфатного буфера pH 7,4. Проводят микрофильтрацию через мембрану 0,22 мкм и обессоливание на колонке PD-10.

Фракционирование с помощью ион-обменной хроматографии проводят на колонке Q-сефарозы с последующей элюцией 0,15 М NaCl. Концентрирование и очистку методом ультрафильтрации выполняют на двух фильтрах 100 и 30 кДа и в итоге получают соединение с молекулярной массой свыше 30 кДа (рис.1) и содержанием белка 0,5-1,0 мг/мл.

Исследование протективной активности

Для оценки протективной активности полученных соединений в эксперименте активной защиты иммунизацию мышей линии BALB/c проводят 2-кратно подкожно с интервалом 14 дней. Иммунизированных мышей заражают разными дозами S. aurens № 6.

В таблице 2 приведены результаты изучения выделенного белоксодержащего соединения в опытах активной защиты мышей линии BALB/c при внутривенном заражении штаммом S. aureus № 6. Показано, что выделенное белоксодержащее соединение при иммунизирующих дозах 4,0 и 12,0 мкг (группа 1, 3) обладает протективной активностью: значимые различия с контролем (группа 2, 4), соответственно p<0,05 и p<0,01.

Исследование антигенной активности

Для получения кроличьих сывороток разработана курсовая схема иммунизации белоксодержащим препаратом при суммарной иммунизирующей дозе - 480 мкг белка, в то время как по данным исследователей при получении сывороток к секретируемым белкам S. aureus (коагулазе, железорегулируемым белкам, хлопьеобразующему фактору и фибронектин-связывающему белку) она составляет 1500 мкг [Arrecubieta С., Matsunaga I., Asai Т., Naka Y., Deng M.C., Lowy F.D Vaccination with clumping factor A and fibronectin binding protein A to prevent Staphylococcus aureus infection of an aortic patch in mice. J Infect Dis., 2008, 198: 571-575; Cheng A.G., McAdow M., Kirn H.K., Bae Т., Missiakas D., Schneewind O. Contribution of Coagulases towards Staphylococcus aureus Disease and Protective Immunity. PLoS Pathog 6(8): e1001036. doi: 10.1371/journal. ppat.1001036; Kirn H.K., DeDent A, Cheng A.G, McAdow M, Bagnoli F, Missiakas D.M, Schneewind O. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 2010, 28: 6382-92].

Для получения мышиных сывороток животных иммунизировали двукратно в дозах 4,0-12,0 мкг белка.

Изучение антигенных свойств белоксодержащих соединений проводили в твердофазном ИФА, определяя динамику накопления специфических IgG антител в полученных сыворотках кроликов (средние данные по сывороткам, полученным от 3 кроликов) и в сыворотках крови иммунизированных мышей, полученной через 14 суток после второй иммунизации. Сыворотки изучены в подобранных условиях ИФА: сорбция антигенного препарата в дозе 10 мкг белка/мл; использован антивидовой конъюгат - антитела диагностические против IgG кролика или мыши, меченные пероксидазой, в разведении 1:200; исходное разведение сыворотки в 100 раз. Учет проводили на планшетном фотометре (bio Rad) при 450 нм по оптической плотности иммунных сывороток с вычетом фона ( ОП_им-ф). В таблицах 3 и 4 приведены полученные результаты, свидетельствующие о высокой антигенпой активности полученных иммунных кроличьих и мышиных сывороток.

Полученные кроличьи и мышиные сыворотки изучены в опытах пассивной защиты мышей, для чего их вводят мышам линии BALB/c внутрибрюшинно по 0,5 мл сывороток иммунных и интактных животных, разведенных в 5 раз. Через 2 часа после введения сывороток мышей заражают внутрибрюшинно разведением штамма S. aureus № 6 в 0,4% агаре в дозе 2,5×10⁷ на мышь. Учет выживаемости мышей приведен в таблице 5 и свидетельствует о протективных свойствах мышиных и кроличьих сывороток, полученных при иммунизации белоксодержащим препаратом, поскольку выявлены различия с контрольной группой (p=0,022<0,05). При этом различий с контролем в пассивной защите сыворотками интактных мышей и кроликов (соответственно, группы 2 и 3, 5 и 6) не выявлено, т.к. p>0,05 (p=0,576 и 0,302).

Преимущество изобретения заключается в создании белоксодержащего соединения, обладающего антигенными и протективными свойствами, рассматриваемого как кандидат при разраработке противостафилококковой вакцины, предназначенной для профилактики и терапии инфекций, вызываемых S. aurens, выделенного из стерильного фильтрата культуральной жидкости вирулентного штамма S. aureus № 6, выращенного в синтетической питательной среде, очищенного и концентрированного до содержания 0,5-1,0 мг белка в мл.

Таблица 1
Сравнение протективных свойств белоксодержащих препаратов, выделенных из вирулентного штамма S.aureus № 6 и слабовирулентного штамма № 1991
№ п/п групп	Иммунизирующий препарат		Заражающий штамм		Отношение количества выживших мышей к зараженным
	из штамма №	доза, мкг белка	№	доза, ×109	абс	%
1	1991	0,1	1986	2,5	0/10	0
2			6	0,4	0/10	0
3		1,0	1986	2,5	4/10	50
4			6	0,4	1/10	10
5	6	0,1	1986	2,5	2/10	20
6			6	0,4	1/10	10
7		1,0	1986	2,5	7/10	70
8			6	0,4	8/10	80
9	Невакцинированные (контроль)		1986	2,5	0/10	0
10			6	0,4	0/10	0

Различия протективных свойств иммунизирующих препаратов между группами определяли с использованием критерия согласия Пирсона - %2 (программа BioStat D):

для 7 и 9 групп ²=7,912, p=0,005 (<0,05);

для 8 и 10 групп ²=10,208, p=0,001 (<0,05);

для 4 и 8 групп ²=7,273, p=0,007 (<0,05);

для 3 и 7 групп ²=0,808, p=0,369 (>0,05);

для 3 и 9 групп ²=2,812, p=0,094 (>0,05);

для 4 и 10 групп ²=0, p=1,0 (>0,05).

Таблица 2
Результаты изучения выделенного препарата в опытах активной защиты мышей при внутривенном заражении
№ опыта	№ п/п группы	Иммунизирующий препарат, доза мкг белка/мышь	Заражение мышей		Различия с контролем
			Доза, ×10 9	Количество павших/зараженным	2*	p
1	1	Белоксодержащее соединение, 4,0 мкг	0,4	0/10	4,29	<0,05
			2,0	2/10
			10,0	10/10
	2	Контроль (0,9% р-р натрия хлорида)	0,4	4/10
			2,0	6/10
			10,0	10/10
2	3	Белоксодержащее соединение,12 мкг	0,4	1/10	6,857	<0,01
			2,0	2/10
			10,0	4/10
	4	Контроль (0,9% р-р натрия хлорида)	0,4	4/10
			2,0	5/10
			10,0	9/10
* Различия с контролем определяли с использованием критерия согласия Пирсона - 2 (программа BioStat D).

Таблица 3
Динамика накопления специфических IgG антител в сыворотках кроликов, иммунизированных белоксодержащими препаратами по разработанной схеме
Анализируемые сыворотки		Результаты по ОПим-ф сывороток
№ п/п	Кровопускание	При разведении сывороток в 100 раз (M±m)	По титру*
1	До иммунизации	0,28±0,05	1:200
2	После 1 курса	0,37±0,01	1:400
3	После 2 курса	1,25±0,01	1:1600-1:3200
4	После 3 курса	1,88±0,6	1:3200-1:6400
5	После тотального кровопускания (лиофилизирован.)	1,99±0,36	1:6400
* ОПим-ф>0,2

Таблица 4
Уровень специфических IgG антител в сыворотках мышей, двукратно иммунизированных белоксодержащими препаратами
Иммунизирующий препарат	Количество изученных сывороток	ОПим-ф сывороток (M±m)
Белоксодержащее соединение	6	0,65±0,13
Неиммунизированные интактные мыши	6	0,13±0,07

Таблица 5
Пассивная защита мышей, зараженных S. aureus № 6 в/бр в дозе 2,5×107 через 2 часа после введения сывороток
Сыворотки иммунизированных животных	№ п/п группы	Иммунизирующий препарат	Количество мышей павших/ зараженных	Различия с контролем
				2*	p
мышиные	1	Сыворотка к белоксодержащему соединению (1:4)	3/10	5,208	0,022
	2	Сыворотка интактных мышей (1:4)	7/10	0,312	0,576
	3	Контроль (0,9% р-р натрия хлорида)	9/10
кроличьи	4	Сыворотка к белоксодержащему соединению (1:4)	3/10	5,210	0,022
	5	Сыворотка интактных кроликов (1:4)	6/10	1,067	0,302
	6	Контроль (0,9% р-р натрия хлорида)	9/10