мультиспецифическая связывающая антиген молекула, которая обладает альтернативной функцией к функции фактора свертывания крови viii

Формула изобретения

1. Биспецифическое антитело, которое узнает фактор свертывания крови IX и/или активированный фактор свертывания крови IX и узнает фактор свертывания крови X, в котором Н цепь первого антитела включает сайт связывания антигена, который содержит вариабельный участок Н цепи, состоящий из следующей аминокислотной последовательности (a10), Н цепь второго антитела включает сайт связывания антигена, содержащий вариабельный участок Н цепи, состоящий из следующей аминокислотной последовательности (b7), и каждая первая и вторая L цепи антитела включают сайт связывания антигена, содержащий вариабельный участок L цепи, состоящий из следующей аминокислотной последовательности (с5):

(a10) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 44 (вариабельный участок Н цепи Q460),

(b7) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 52 (вариабельный участок Н цепи J327);

(с5) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка L цепи SEQ ID NO: 60 (вариабельный участок L цепи L334),

причем L цепи первого и второго антитела формируют пары с Н цепью первого антитела и Н цепью второго антитела соответственно, а биспецифическое антитело активизирует свертывание крови.

2. Биспецифическое антитело по п.1, в котором Н цепь первого антитела включает константный участок Н цепи антитела, состоящий из следующих аминокислотных последовательностей (d6) или (d9), Н цепь второго антитела включает константный участок Н цепи антитела, состоящий из следующих аминокислотных последовательностей (d6) или (d9), и включает аминокислотную последовательность, отличную от таковой упомянутой выше Н цепи первого антитела, и каждая первая и вторая L цепи антитела включают константную область L цепи, состоящую из следующей аминокислотной последовательности (е):

(d6) константный участок Н цепи SEQ ID NO: 70 (z121);

(d9) константный участок Н цепи SEQ ID NO: 73 (z119) и

(е) константного участка L цепи антитела SEQ ID NO: 74 (k).

3. Биспецифическое антитело по п.2, в котором Н цепь первого антитела включает следующую Н цепь антитела (а12), Н цепь второго антитела включает следующую Н цепь антитела (b9) и каждая первая и вторая L цепи антитела включают следующую L цепь антитела (с5):

(а12) Н цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18 (Q460-z121);

(b9) Н цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25 (J327-z119); и

(с5) L цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30 (L334-k).

4. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-3, где первая и вторая L цепи являются L цепями с общей последовательностью.

5. Биспецифическое антитело (о):

(о) биспецифическое антитело (Q460-z121/J327-z119/L334-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25, и третий полипептид и четвертый полипептид являются L цепями с общей последовательностью SEQ ID NO: 30;

где первый полипептид и второй полипептид связаны с третьим полипептидом и четвертым полипептидом соответственно и биспецифическое антитело активизирует свертывание крови.

6. Нуклеиновая кислота, кодирующая биспецифическое антитело по любому из пп.1-5.

7. Вектор для экспрессии биспецифического антитела по любому из пп.1-5, где в вектор встроена нуклеиновая кислота по п.6.

8. Клетка для получения биспецифического антитела по любому из пп.1-5, где клетка включает нуклеиновую кислоту по п.6 или вектор по п.7.

9. Способ получения биспецифического антитела, где способ включает культивирование клетки по п.8 и выделение антитела.

10. Фармацевтическая композиция для предупреждения и/или лечения кровотечения, болезней, связанных с кровотечением, или болезней, вызванных кровотечением, включающая биспецифическое антитело по любому одному из пп.1-5 и фармацевтически приемлемый носитель.

11. Композиция по п.10, где болезнь развивается и/или прогрессирует благодаря снижению или дефициту активности фактора коагуляции крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII.

12. Композиция по п.11, где болезнь, которая развивается и/или прогрессирует благодаря снижению или дефициту активности фактора коагуляции крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII, представляет собой гемофилию А.

13. Композиция по п.11, где болезнь, которая развивается и/или прогрессирует благодаря снижению или дефициту активности фактора коагуляции крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII, представляет собой заболевание, демонстрирующее появление ингибитора против фактора свертывания крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII.

14. Композиция по п.11, где болезнь, которая развивается и/или прогрессирует благодаря снижению или дефициту активности фактора коагуляции крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII, представляет собой приобретенную гемофилию.

15. Композиция по п.11, где болезнь, которая развивается и/или прогрессирует благодаря снижению или дефициту активности фактора коагуляции крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII, представляет собой болезнь фон Виллебранда.

16. Набор для применения в способе предупреждения и/или лечения кровотечения, болезней, связанных с кровотечением, или болезней, вызванных кровотечением, который включает по крайней мере биспецифическое антитело по любому из пп.1-5.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к мультиспецифическим связывающим антиген молекулам, которые функционируют вместо фактора свертывания крови VII, кофактора, способствующего ферментативным реакциям, и фармацевтическим композициям, включающим такую молекулу в качестве активного ингредиента.

Предшествующий уровень техники

Гемофилия A представляет собой нарушение кровотечения, вызванное врожденным снижением или отсутствием функции фактора коагуляции крови VIII (F.VIII). Пациентам с гемофилией A обычно при кровотечении назначается композиция F.VIII (по мере необходимости). В последние годы F.VIII композиции также вводятся с профилактической целью для предотвращения случаев кровотечения (превентивное введение; непатентные документы 1 и 2). Период полураспада композиции F.VIII в крови составляет приблизительно от 12 до 16 часов. Таким образом, для беспрерывного предотвращения композиции F.VIII вводятся пациентам три раза в неделю (непатентные документы 3 и 4). По мере надобности композиции F.VIII также дополнительно вводятся тогда, когда это является необходимым, с регулярными интервалами для предотвращения повторного кровотечения. Кроме того, введение композиции F.VIII осуществляют внутривенно. Таким образом, существует острая необходимость в фармацевтических агентах с меньшей нагрузкой, чем композиции F.VIII.

Иногда у пациентов с гемофилией возникают анти-F.VIII антитела (ингибиторы). Такие ингибиторы отменяют эффекты композиций F.VIII. При кровотечении у пациентов, которые образуют ингибиторы (ингибирующие пациенты), вводятся обходные композиции. Механизмы их действия не являются зависимыми от функции F.VIII, то есть основываются на функции активации фактора коагуляции крови Х (F.X) с помощью активированного фактора свертывания крови IX (F.IXa). Таким образом, в некоторых случаях обходные композиции не могут в достаточной мере останавливать кровотечение. В соответствии с этим существует острая необходимость в фармацевтических агентах, которые не подвергаются влиянию со стороны ингибиторов и которые могут функционально заменять F.VIII.

Недавно в качестве средств для решения этой проблемы были раскрыты антитела, которые функционально заменяют F.VIII, и их применение (непатентные документы 1, 2 и 3). Антитела могут быть эффективными для приобретенной гемофилии, при которой присутствуют анти-F.VIII аутоантитела, и при болезни фон Виллебранда, которая вызывается патологией или недостаточностью функции фактора фон Виллебранда (vWF), но активность функционального замещения F.VIII не является достаточной. Таким образом, в качестве фармацевтических агентов, которые демонстрируют высокий гемостатический эффект, являются желательными антитела с более высокой активностью функционального замещения F.VIII, чем упомянутые выше антитела.

Документы уровня техники

[Патентный документ]

[Патентный документ 1] WO 2005/035754

[Патентный документ 2] WO 2005/035756

[Патентный документ 3] WO 2006/109592

[Непатентный документ]

[Непатентный документ 1] Blood 58, 1-13 (1981)

[Непатентный документ 2] Nature 312, 330-337 (1984)

[Непатентный документ 3] Nature 312, 337-342 (1984)

[Непатентный документ4] Biochim. Biophys. Acta 871, 268-278 (1986)

Краткое изложение сущности изобретения

[Проблемы, которые решаются с помощью изобретения]

Задача настоящего изобретения заключается в обеспечении мультиспецифических связывающих антиген молекул, которые функционально заменяют F.VIII, кофактор, который способствует ферментативным реакциям.

[Средства решения проблем]

В качестве результата специального исследования изобретатели в соответствии с данной заявкой преуспели в раскрытии биспецифического антитела, имеющего улучшенную активность, которая способствует образованию F.Xa, по сравнению с известными антителами среди различных биспецифических антител, которые специфически связываются как с F.IX/F.IXa, так и с F.X и заменяют функцию кофактора F.VIII, то есть основываются на функции способствования активации F.X с помощью F.IXa (функции способствования образованию F.Xa).

Кроме того, авторы настоящего изобретения преуспели в раскрытии положений аминокислотных последовательностей биспецифического антитела, обладающих активностью функциональных замен F.VIII, которые являются важными для улучшения активности в отношении способствования образованию F.Xa этих антител, и, таким образом, они являются успешно полученными биспецифическими антителами, в которых активность функциональной замены F.VIII является дополнительно повышенной путем замены этих аминокислот. Они также преуспели в получении биспецифических антител, которые не только обладают высокой активностью функциональной замены F.VIII, а также имеют низкую ингибиторную активность по отношению F.Хазе. Удовлетворение соответствия этим двум условиям является весьма сложным.

В частности, настоящее изобретение относится к мультиспецифическим связывающим антиген молекулам, которые функционально заменяют F.VIII, кофактор, который способствует ферментативным реакциям, и фармацевтическим композициям, включающим такую молекулу в качестве активного ингредиента, и, в частности, относится к следующим:

[1] мультиспецифической связывающей антиген молекуле, которая функционально заменяет фактор свертывания крови VIII, включающей первый сайт связывания антигена, который узнает фактор свертывания крови IX и/или активированный фактор свертывания крови IX, и второй сайт связывания антигена, который узнает фактор свертывания крови X, где функциональная замена фактора свертывания крови VIII является следствием активности в отношении способствования образованию активированного фактора свертывания крови X (F.Xa), более высокой, чем активность биспецифического антитела (hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ), которое включает H цепь, содержащую SEQ ID NO: 165 и 166, и общую L цепь, которая включает SEQ ID NO: 167;

[2] мультиспецифической связывающей антиген молекуле [1], которая включает первый полипептид, содержащий первый сайт связывания антигена, который узнает фактор свертывания крови IX и/или активированный фактор свертывания крови IX, и третий полипептид, включающий третий сайт связывания антигена, который узнает фактор свертывания крови IX и/или активированный фактор свертывания крови IX, а также второй полипептид, включающий второй сайт связывания антигена, который узнает фактор свертывания крови X, и четвертый полипептид, включающий четвертый сайт связывания антигена, который узнает фактор свертывания крови X;

[3] мультиспецифической связывающей антиген молекуле [2], в которой первый полипептид и третий полипептид, каждый включает сайт связывания антигена H цепи или L цепи антитела против фактора свертывания крови IX или активированного фактора свертывания крови IX соответственно; и второй полипептид, и четвертый полипептид, каждые, включают сайт связывания антигена H цепи или L цепи антитела против фактора свертывания крови X соответственно;

[4] мультиспецифической связывающей антиген молекуле [3], в которой сайт связывания антигена первого полипептида включает сайт связывания антигена, который включает CDR H цепи, состоящие из любой одной из аминокислотных последовательностей, выбранных из следующих (a1)-(a11), или сайт связывания антигена, функционально эквивалентный им, и сайт связывания антигена второго полипептида включает сайт связывания антигена, который включает CDR H цепи, состоящие из любой одной из аминокислотных последовательностей, выбранных из следующих (b1)-(b11), или сайт связывания антигена, функционально эквивалентный им:

(a1) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 75, 76 и 77 (CDR Н цепи Q1) соответственно;

(a2) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 78, 79 и 80 (CDR Н цепи Q31) соответственно;

(a3) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 81, 82 и 83 (CDR Н цепи Q64) соответственно;

(a4) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 84, 85 и 86 (CDR Н цепи Q85) соответственно;

(a5) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 87, 88 и 89 (CDR Н цепи Q153) соответственно;

(a6) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 90, 91 и 92 (CDR Н цепи Q354) соответственно;

(a7) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 93, 94 и 95 (CDR Н цепи Q360) соответственно;

(a8) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 96, 97 и 98 (CDR H цепи Q405) соответственно;

(a9) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 99, 100 и 101 (CDR H цепи Q458) соответственно;

(a10) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 102, 103 и 104 (CDR H цепи Q460) соответственно;

(a11) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 105, 106 и 107 (CDR Н цепи Q499) соответственно;

(b1) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 108, 109 и 110 (CDR Н цепи J232) соответственно;

(b2) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 111, 112, и 113 (CDR H цепи J259) соответственно;

(b3) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 114, 115 и 116 (CDR Н цепи J268) соответственно;

(b4) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 117, 118 и 119 (CDR Н цепи J300) соответственно;

(b5) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 120, 121 и 122 (CDR Н цепи J321) соответственно;

(b6) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 123, 124 и 125 (CDR Н цепи J326) соответственно;

(b7) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 126, 127,и 128 (CDR Н цепи J327) соответственно;

(b8) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 129, 130 и 131 (CDR Н цепи J339) соответственно;

(b9) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 132, 133 и 134 (CDR Н цепи J344) соответственно;

(b10) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 135, 136 и 137 (CDR Н цепи J346) соответственно; и

(b11) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 174, 175 и 176 (CDR Н цепи J142) соответственно;

[5] мультиспецифической связывающей антиген молекуле [3], в которой сайт связывания антигена первого полипептида включает сайт связывания антигена, включающий вариабельный участок Н цепи, состоящий из любой одной из аминокислотных последовательностей, выбранных из следующих (a1)-(a11), или сайт связывания антигена, функционально эквивалентный им, а сайт связывания антигена второго полипептида включает сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок Н цепи, состоящий из любой одной из аминокислотных последовательностей, выбранных из следующих (b1)-(b11), или сайт связывания антигена, функционально эквивалентный им:

(a1) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 35 (вариабельный участок Н цепи Q1);

(a2) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 36 (вариабельный участок Н цепи Q31);

(a3) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 37 (вариабельный участок Н цепи Q1);

(a4) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 38 (вариабельный участок Н цепи Q85);

(a5) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 39 (вариабельный участок Н цепи Q153);

(a6) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 40 (вариабельный участок Н цепи Q354);

(a7) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 41 (вариабельный участок Н цепи Q360);

(a8) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 42 (вариабельный участок Н цепи Q405);

(a9) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 43 (вариабельный участок Н цепи Q458);

(a10) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 44 (вариабельный участок Н цепи Q460);

(a11) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 45 (вариабельный участок Н цепи Q499);

(b1) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 46 (вариабельный участок Н цепи J232);

(b2) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 47 (вариабельный участок Н цепи J259);

(b3) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 48 (вариабельный участок Н цепи J268);

(b4) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 49 (вариабельный участок Н цепи J300);

(b5) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 50 (вариабельный участок Н цепи J321);

(b6) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 51 (вариабельный участок Н цепи J326);

(b7) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 52 (вариабельный участок H цепи J327);

(b8) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 53 (вариабельный участок Н цепи J339);

(b9) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 54 (вариабельный участок Н цепи J344);

(b10) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 55 (вариабельный участок Н цепи J346); и

(b11) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 172 (вариабельный участок Н цепи J142);

[6] мультиспецифической связывающей антиген молекуле [3], в которой сайты связывания антигена, включенные в третий полипептид и в четвертый полипептид, включают сайт связывания антигена, которая включает CDR L цепи, состоящие из любой одной из аминокислотных последовательностей, выбранных из следующих (c1)-(c10), или сайт связывания антигена, функционально эквивалентный им:

(c1) сайт связывания антигена, который включает CDR L цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 138, 139 и 140 (CDR L цепи L2) соответственно;

(c2) сайт связывания антигена, который включает CDR L цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 141, 142 и 143 (CDR L цепи L45) соответственно;

(c3) сайт связывания антигена, который включает CDR L цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 144, 145 и 146 (CDR L цепи L248) соответственно;

(c4) сайт связывания антигена, который включает CDR L цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 147, 148 и 149 (CDR L цепи L324) соответственно;

(c5) сайт связывания антигена, который включает CDR L цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 150, 151 и 152 (CDR L цепи L334) соответственно;

(c6) сайт связывания антигена, который включает CDR L цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 153, 154 и 155 (CDR L цепи L377) соответственно;

(c7) сайт связывания антигена, который включает CDR L цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 156, 157 и 158 (CDR L цепи L404) соответственно;

(c8) сайт связывания антигена, который включает CDR L цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 159, 160 и 161 (CDR L цепи L406) соответственно;

(c9) сайт связывания антигена, который включает CDR L цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 137, 138 и 139 (CDR L цепи L408) соответственно; и

(c10) сайт связывания антигена, который включает CDR L цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 177, 178 и 179 (CDR L цепи LI 80) соответственно;

[7] мультиспецифической связывающей антиген молекуле [3], в которой сайты связывания антигена, включенные в третий полипептид и в четвертый полипептид, включают сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи, состоящий из любой одной из аминокислотных последовательностей, выбранных из следующих (c1)-(c10), или сайт связывания антигена, функционально эквивалентный им:

(c1) сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 56 (вариабельный участок L цепи L2);

(c2) сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 57 (вариабельный участок L цепи L45);

(c3) сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 58 (вариабельный участок L цепи L248);

(c4) сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 59 (вариабельный участок L цепи L324);

(c5) сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 60 (вариабельный участок L цепи L334);

(c6) сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 61 (вариабельный участок L цепи L377);

(c7) сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 62 (вариабельный участок L цепи L404);

(c8) сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 63 (вариабельный участок L цепи L406);

(c9) сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 64 (вариабельный участок L цепи L408); и

(c10) сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 173 (вариабельный участок L цепи L180);

[8] мультиспецифической связывающей антиген молекуле [3], в которой первый и второй полипептиды дополнительно включают константный участок Н цепи антитела, а третий и четвертый полипептиды включают константный участок L цепи антитела;

[9] мультиспецифической связывающей антиген молекуле [3], в которой первый и второй полипептиды включают константный участок H цепи антитела, а третий и четвертый полипептиды включают константный участок L цепи антитела, и где третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь;

[10] мультиспецифической связывающей антиген молекуле [8] или [9], где первый полипептид включает константный участок Н цепи антитела, состоящий из любой одной из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, которая состоит из следующих (d1)-(d6), или из группы, состоящей из следующих (d7)-(d9), а второй полипептид включает константный участок Н цепи антитела, который состоит из любой одной из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, отличной от такой упомянутого выше первого полипептида:

(d1) константный участок Н цепи SEQ ID NO: 65 (G4k);

(d2) константный участок Н цепи SEQ ID NO: 66 (z7);

(d3) константный участок Н цепи SEQ ID NO: 67 (z55);

(d4) константный участок Н цепи SEQ ID NO: 68 (z106);

(d5) константный участок Н цепи SEQ ID NO: 69 (z118);

(d6) константный участок Н цепи SEQ ID NO: 70 (z121);

(d7) константный участок Н цепи SEQ ID NO: 71 (G4h);

(d8) константный участок Н цепи SEQ ID NO: 72 (z107); и

(d9) константный участок Н цепи SEQ ID NO: 73 (z119);

[11] мультиспецифической связывающей антиген молекуле [8] или [9], где третий и четвертый полипептиды включают константный участок L цепи антитела, состоящий из следующей аминокислотной последовательности:

(e) константный участок L цепи антитела SEQ ID NO: 74 (k);

[12] мультиспецифической связывающей антиген молекуле [8] или [9], где первый полипептид включает любую одну Н цепь антитела, выбранную из следующих (a1)-(a14), второй полипептид включает любую одну Н цепь антитела, выбранную из следующих (b1)-(b12), а третий полипептид и четвертый полипептиды включают любую одну L цепь антитела, выбранную из следующих (c1)-(c10):

(a1) Н цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 (Q1-G4k);

(a2) Н цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 (Q31-z7);

(a3) Н цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 (Q64-z55);

(a4) Н цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 (Q64-z7);

(a5) Н цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 (Q85-G4k);

(a6) Н цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12 (Q153-G4k);

(a7) Н цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13 (Q354-z106);

(a8) Н цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14 (Q360-G4k);

(a9) Н цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15 (Q360-z118);

(a10) Н цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16 (Q405-G4k);

(a11) Н цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17 (Q458-z106);

(a12) Н цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18 (Q460-z121);

(a13) Н цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19 (Q499-z118);

(a14) Н цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20 (Q499-z121);

(b1) Н цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 (J268-G4h);

(b2) Н цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 (J321-G4h);

(b3) Н цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 (J326-z107);

(b4) Н цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 (J344-z107);

(b5) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21 (J232-G4h);

(b6) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22 (J259-z107);

(b7) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23 (J300-z107);

(b8) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24 (J327-z107);

(b9) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25 (J327-z119);

(b10) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26 (J339-z119);

(b11) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27 (J346-z107);

(b12) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 170 (J142-G4h);

(c1) L цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8 (L2-k);

(c2) L цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 (L45-k);

(c3) L цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 28 (L248-k);

(c4) L цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29 (L324-k);

(c5) L цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30 (L334-k);

(c6) L цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31 (L377-k);

(c7) L цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32 (L404-k);

(c8) L цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33 (L406-k);

(c9) L цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34 (L408-k); и

(c10) L цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 171 (L180-k);

[13] мультиспецифической связывающей антиген молекуле [1], в которой первый полипептид включает сайт связывания антигена, который связывается с эпитопом, который перекрывается с эпитопом, который связывается с антителом, состоящим из Н цепи антитела, которая представляет собой любую одну из (a1)-(a14), и L цепи антитела, которая представляет собой любую из (c1)-(c10) [12], а второй полипептид включает сайт связывания антигена, который связывается с эпитопом, который перекрывается с эпитопом, который связывается с антителом, которое состоит из Н цепи антитела, которая представляет собой любую одну из (b1)-(b12), и L цепи антитела, которая представляет собой любую из (c1)-(c10) [12];

[14] мультиспецифической связывающей антиген молекуле [8] или [9], в которой первый полипептид включает любую одну Н цепь антитела, выбранную из следующих (e1)-(e3), второй полипептид включает любую одну Н цепь антитела, выбранную из следующих (f1)-(f3), а третий полипептид и четвертый полипептид включают любую одну L цепь антитела, выбранную из следующих (g1)-(g4):

(e1) Н цепь антитела, которое связывается с эпитопом, перекрывающимся с эпитопом, который связывается с антителом, состоящим из Н цепи антитела, которая представляет собой любую одну из (a1)-(a14), и L цепи антитела, которая представляет собой любую одну из (c1)-(c10) [12];

(e2) Н цепь антитела, в которой, по крайней мере, один аминокислотный остаток, выбранный из аминокислотных остатков в положениях 34, 35, 49, 61, 62, 96, 98, 100, 100b и 102 в соответствии с нумерацией Кабат в любой одной Н цепи антитела, выбранной из (e1), является замещенным другой аминокислотой;

(e3) Н цепь антитела, в которой в соответствии с нумерацией Кабат, аминокислота в положении 34 представляет собой изолейцин, аминокислота в положении 35 представляет собой аспарагин, глутамин или серин, аминокислота в положении 49 представляет собой серин, аминокислота в положении 61 представляет собой аргинин, аминокислота в положении 62 представляет собой глутаминовую кислоту, аминокислота в положении 96 представляет собой серин или треонин, аминокислота в положении 98 представляет собой лизин или аргинин, аминокислота в положении 100 представляет собой фенилаланин или тирозин, аминокислота в положении 100 представляет собой глицин, или аминокислота в положении 102 представляет собой тирозин в любой Н цепи антитела, выбранной из (e1);

(f1) H цепь антитела, которое связывается с эпитопом, перекрывающимся с эпитопом, который связывается с антителом, состоящим из H цепи антитела, которая представляет собой любую из (b1)-(b12) [12], и L цепи антитела, которая представляет собой любую из (c1)-(c10) [12];

(f2) Н цепь антитела, в которой, по крайней мере, один аминокислотный остаток, выбранный из аминокислотных остатков в положениях 35, 53, 73, 76, 96, 98, 100, и 100a в соответствии с нумерацией Кабат в любой Н цепи антитела (f1), является замещенным другой аминокислотой;

(f3) Н цепь антитела, в которой в соответствии с нумерацией Кабат аминокислота в положении 35 представляет собой аспарагиновую кислоту, аминокислота в положении 53 представляет собой аргинин, аминокислота в положении 73 представляет собой лизин, аминокислота в положении 76 представляет собой глицин, аминокислота в положении 96 представляет собой лизин или аргинин, аминокислота в положении 98 представляет собой тирозин, аминокислота в положении 100 является тирозином или аминокислота в положении 100a является гистидином в любой одной Н цепи антитела, выбранной из (f1);

(g1) L цепь антитела, которое связывается с эпитопом, перекрывающимся с эпитопом, который связывается с антителом, состоящим из Н цепи антитела, которая представляет собой любую из (a1)-(a14), и L цепи антитела, которая представляет собой любую одну из (c1)-(c10) [12];

(g2) L цепь антитела, которое связывается с эпитопом, перекрывающимся с эпитопом, который связывается с антителом, состоящим из Н цепи антитела, которая представляет собой любую из (b1)-(b12), и L цепи антитела, которая представляет собой любую одну из (c1)-(c10) [12];

(g3) L цепь антитела, в которой, по крайней мере, один аминокислотный остаток, выбранный из аминокислотных остатков в положениях 27, 30, 31, 32, 50, 52, 53, 54, 55, 92, 93, 94 и 95 в соответствии с нумерацией Кабат в L цепи антитела либо (g1), либо (g2), является замещенным другой аминокислотой; и (g4) H цепь антитела, в которой в соответствии с нумерацией Кабат аминокислота в положении 27 представляет собой лизин или аргинин, аминокислота в положении 30 представляет собой глутаминовую кислоту, аминокислота в положении 31 представляет собой аргинин, аминокислота в положении 32 представляет собой глутамин, аминокислота в положении 50 представляет собой аргинин или глутамин, аминокислота в положении 52 представляет собой серин, аминокислота в положении 53 представляет собой аргинин, аминокислота в положении 54 является лизином, аминокислота в положении 55 является глутаминовой кислотой, аминокислота в положении 92 представляет собой серин, аминокислота в положении 93 является серином, аминокислота в положении 94 является пролином или аминокислота в положении 95 представляет собой пролин в L цепи антитела любой из либо (g1), либо (g2);

[15] мультиспецифической связывающей антиген молекуле любой одной из [1]-[14], где специфическая связывающая антиген молекула представляет собой мультиспецифическое антитело;

[16] биспецифическое антитело в соответствии с одним из следующих (a)-(u):

(a) биспецифическое антитело (Q1-G4k/J268-G4h/L45-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 9;

(b) биспецифическое антитело (Q1-G4k/J321-G4h/L45-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 9;

(c) биспецифическое антитело (Q31-z7/J326-z107/L2-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 8;

(d) биспецифическое антитело (Q64-z55/J344-z107/L45-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 9;

(e) биспецифическое антитело (Q64-z7/J326-z107/L334-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 30;

(f) биспецифическое антитело (Q64-z7/J344-z107/L406-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 33;

(g) биспецифическое антитело (Q85-G4k/J268-G4h/L406-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 33;

(h) биспецифическое антитело (Q85-G4k/J321-G4h/L334-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 30;

(i) биспецифическое антитело (Q153-G4k/J232-G4h/L406-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 33;

(j) биспецифическое антитело (Q354-z106/J259-z107/L324-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 29;

(k) биспецифическое антитело (Q360-G4k/J232-G4h/L406-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 33;

(l) биспецифическое антитело (Q360-z118/J300-z107/L334-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 30;

(m) биспецифическое антитело (Q405-G4k/J232-G4h/L248-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 28;

(n) биспецифическое антитело (Q458-z106/J346-z107/L408-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 34;

(o) биспецифическое антитело (Q460-z121/J327-z119/L334-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 30;

(p) биспецифическое антитело (Q499-z118/J327-z107/L334-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 30;

(q) биспецифическое антитело (Q499-z118/J327-z107/L377-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 31;

(r) биспецифическое антитело (Q499-z118/J346-z107/L248-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 28;

(s) биспецифическое антитело (Q499-z121/J327-z119/L404-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 32;

(t) биспецифическое антитело (Q499-z121/J339-z119/L377-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 31; и

(u) биспецифическое антитело (Q153-G4k/J142-G4h/L180-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 170, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 171;

[17] нуклеиновой кислоте, кодирующей мультиспецифическую связывающую антиген молекулу в соответствии с одним из [1]-[15] или биспецифическое антитело в соответствии с [16];

[18] вектор, содержащий нуклеиновую кислоту в соответствии с [17];

[19] клетка, включающая нуклеиновую кислоту в соответствии с [17] или вектор в соответствии с [18];

[20] способ получения мультиспецифической связывающей антиген молекулы в соответствии с любым из [1]-[15] или биспецифического антитела в соответствии с [16] путем культивирования клетки [19];

[21] фармацевтическая композиция, включающая мультиспецифическую связывающую антиген молекулу в соответствии с одним из [1]-[15] или биспецифическое антитело в соответствии с [16] и фармацевтически приемлемый носитель;

[22] композиция в соответствии с [21], которая представляет собой фармацевтическую композицию, используемую для предотвращения и/или лечения кровотечения, заболевания, сопровождающегося кровотечением, или заболевания, вызванного кровотечением;

[23] композиция в соответствии с [22], где кровотечение, заболевание, сопровождающееся кровотечением, или заболевание, вызванное кровотечением, представляет собой заболевание, которое развивается и/или прогрессирует благодаря снижению или отсутствию активности фактора коагуляции крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII;

[24] композиция в соответствии с [23], где заболевание, которое развивается и/или прогрессирует благодаря снижению или отсутствию активности фактора коагуляции крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII, представляет собой гемофилию A;

[25] композиция в соответствии с [23], где заболевание, которое развивается и/или прогрессирует благодаря снижению или отсутствию активности фактора коагуляции крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII, представляет собой заболевание, демонстрирующее возникновение ингибитора фактора свертывания крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII;

[26] композиция в соответствии с [23], где заболевание, которое развивается и/или прогрессирует благодаря снижению или отсутствию активности фактора коагуляции крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII, представляет собой приобретенную гемофилию;

[27] композиция в соответствии с [23], где заболевание, которое развивается и/или прогрессирует благодаря снижению или отсутствию активности фактора коагуляции крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII, представляет собой болезнь фон Виллебранда;

[28] способ предотвращения и/или лечения кровотечения, заболевания, сопровождающегося кровотечением, или заболевания, вызванного кровотечением, который включает этап введения мультиспецифической связывающей антиген молекулы в соответствии с одним из [1]-[15], или биспецифического антитела в соответствии с [16], или композиции в соответствии с любым одним из [21]-[27]; и

[29] набор для применения в способе предотвращения и/или лечения в соответствии с [28], который включает, по крайней мере, мультиспецифическую связывающую антиген молекулу в соответствии с одним из [1]-[15], или биспецифическое антитело в соответствии с [16], или композицию в соответствии с любым одним из [21]-[27].

Кроме того, настоящее изобретение относится к:

[30] применению мультиспецифической связывающей антиген молекулы в соответствии с любым из [1]-[15], биспецифического антитела в соответствии с [16] или композиции в соответствии с любым одним из [21]-[27] в производстве агента для предотвращения и/или лечения кровотечения, заболевания, сопровождающегося кровотечением, или заболевания, вызванного кровотечением; и

[31] мультиспецифической связывающей антиген молекуле в соответствии с любым одним из [1]-[15], биспецифическому антителу в соответствии с [16] или композиции в соответствии с любым одним из [21]-[27] для предотвращения и/или лечения кровотечения, заболевания, сопровождающегося кровотечением, или заболевания, вызванного кровотечением.

Настоящее изобретение также относится к биспецифическим антителам, которые функционально заменяют F.VIII, кофактор, который способствует ферментативным реакциям, и фармацевтическим композициям, включающим антитело в качестве активного ингредиента, и, в частности, относится к:

[32] биспецифическому антителу, которое функционально заменяет фактор свертывания крови VIII, включающему первый сайт связывания антигена, который узнает фактор свертывания крови IX и/или активированный фактор свертывания крови IX, и второй сайт связывания антигена, который узнает фактор свертывания крови X, в котором биспецифическое антитело представляет собой любое из следующих (a)-(u):

(a) биспецифическое антитело (Q1-G4k/J268-G4h/L45-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 9;

(b) биспецифическое антитело (Q1-G4k/J321-G4h/L45-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 9;

(c) биспецифическое антитело (Q31-z7/J326-z107/L2-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 8;

(d) биспецифическое антитело (Q64-z55/J344-z107/L45-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 9;

(e) биспецифическое антитело (Q64-z7/J326-z107/L334-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 30;

(f) биспецифическое антитело (Q64-z7/J344-z107/L406-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 33;

(g) биспецифическое антитело (Q85-G4k/J268-G4h/L406-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 33;

(h) биспецифическое антитело (Q85-G4k/J321-G4h/L334-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 30;

(i) биспецифическое антитело (Q153-G4k/J232-G4h/L406-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 33;

(j) биспецифическое антитело (Q354-z106/J259-z107/L324-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 29;

(k) биспецифическое антитело (Q360-G4k/J232-G4h/L406-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 33;

(l) биспецифическое антитело (Q360-z118/J300-z107/L334-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15, второй полипептид представляет собой H цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 30;

(m) биспецифическое антитело (Q405-G4k/J232-G4h/L248-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 28;

(n) биспецифическое антитело (Q458-z106/J346-z107/L408-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 34;

(o) биспецифическое антитело (Q460-z121/J327-z119/L334-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 30;

(p) биспецифическое антитело (Q499-z118/J327-z107/L334-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 30;

(q) биспецифическое антитело (Q499-z118/J327-z107/L377-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 31;

(r) биспецифическое антитело (Q499-z118/J346-z107/L248-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 28;

(s) биспецифическое антитело (Q499-z121/J327-z119/L404-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 32;

(t) биспецифическое антитело (Q499-z121/J339-z119/L377-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 31; и

(u) биспецифическое антитело (Q153-G4k/J142-G4h/L180-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 170, а третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 171;

[33] нуклеиновой кислоте, кодирующей биспецифическое антитело в соответствии с[32];

[34] вектору, содержащему нуклеиновую кислоту в соответствии с [33];

[35] клетке, включающей нуклеиновую кислоту в соответствии с [33] или вектор в соответствии с [34];

[36] способу получение биспецифического антитела в соответствии с [32] путем культивирования клетки в соответствии с [35];

[37] фармацевтической композиции, включающей биспецифическое антитело в соответствии с [32] и фармацевтически приемлемый носитель;

[38] композиции в соответствии с [37], которая представляет собой фармацевтическую композицию, используемую для предотвращения и/или лечения кровотечения, заболевания, сопровождающегося кровотечением, или заболевания, вызванного кровотечением;

[39] композиции в соответствии с [38], где кровотечение, заболевание, сопровождающееся кровотечением, или заболевание, вызванное кровотечением, представляет собой заболевание, которое развивается и/или прогрессирует благодаря снижению или отсутствию активности фактора коагуляции крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII;

[40] композиции в соответствии с [39], где заболевание, которое развивается и/или прогрессирует благодаря снижению или отсутствию активности фактора коагуляции крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII, представляет собой гемофилию A;

[41] композиции в соответствии с [39], где заболевание, которое развивается и/или прогрессирует благодаря снижению или отсутствию активности фактора коагуляции крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII, представляет собой заболевание, демонстрирующее возникновение ингибитора фактора свертывания крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII;

[42] композиции в соответствии с [39], где заболевание, которое развивается и/или прогрессирует благодаря снижению или отсутствию активности фактора коагуляции крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII, представляет собой приобретенную гемофилию;

[43] композиции в соответствии с [39], где заболевание, которое развивается и/или прогрессирует благодаря снижению или отсутствию активности фактора коагуляции крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII, представляет собой болезнь фон Виллебранда;

[44] способу предотвращения и/или лечения кровотечения, заболевания, сопровождающегося кровотечением, или заболевания, вызванного кровотечением, который включает этап введения биспецифического антитела в соответствии с [32] или композиции в соответствии с любым одним из [37]-[43]; и

[45] набору для применения в способе предотвращения и/или лечения в соответствии с [44], который включает биспецифическое антитело в соответствии с [32] или композицию в соответствии с любым одним из [37]-[43];

[46] применению биспецифического антитела в соответствии с [32] или композиции в соответствии с любым одним из [37]-[43] в производстве агента для предотвращения и/или лечения кровотечения, заболевания, сопровождающегося кровотечением, или заболевания, вызванного кровотечением; и

[47] биспецифическому антителу в соответствии с [32] или композиции в соответствии с любым одним из [37] - [43] для предотвращения и/или лечения кровотечения, заболевания, сопровождающегося кровотечением, или заболевания, вызванного кровотечением.

[Эффекты изобретения]

Настоящее изобретение обеспечивает антитела, узнающие как фермент, так и его субстрат, которые представляют собой мультиспецифические связывающие антиген молекулы, которые обладают высокой активностью функционального замещения F.VIII. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает антитела, узнающие как фермент, так и его субстрат, которые представляют собой мультиспецифические связывающие антиген молекулы, которые обладают высокой активностью функционального замещения F.VIII и низкой ингибиторной активностью по отношению к F.Хазе. Поскольку гуманизированные антитела в общем случае предполагаются как такие, которые имеют высокую стабильность в крови и низкую иммуногенность, мультиспецифические антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть многообещающими как фармацевтические агенты.

Краткое описание рисунков

Фиг.1 описывает ингибиторное действие по отношению к F.Хазе.

(a) F.VIIIa образует комплекс с F.IXa (F-Хазой) и активирует F.X.

(b) Биспецифическое антитело связывается с F.IXa и F.X и активирует F.X.

(c) Как F.VIIIa, так и биспецифическое антитело, активируют F.X без конкуренции.

(d) Связывание биспецифического антитела с F.IXa и/или F.X ингибирует образование комплекса, который образуется между F.Хазой и F.X.

(e) Связывание биспецифического антитела с F.IXa и/или F.X ингибирует активность F-Хазы.

Фиг.2 описывает скрининг. Было получено приблизительно 200 типов каждого из генов для антитела против человеческого F.IXa и человеческого F.X, они были встроены в экспрессионные векторы для животной клетки. Таким образом было временно экспрессировано 40000 или более биспецифических антител в виде комбинации анти-F.IXa антитела и анти-F.X антитела. Активность в отношении способствования образованию F.Xa и ингибиторная активность по отношению к F.Хазе подвергались оценке для скрининга на биспецифические антитела, которые обладают высокой активностью в отношении способствования образованию F.Xa и низким ингибиторным действием по отношению к F.Хазе. Кроме того, путем замены аминокислот, в случае необходимости, были получены прототипические антитела.

Фиг.3 показывает активность в отношении способствования образованию F.Xa для hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ, Q1-G4k/J268-G4h/L45-k, Q1-G4k/J321-G4h/L45-k, Q31-z7/J326-z107/L2-k и Q64-z55/J344-z107/L45-k. Концентрации растворов антитела составляли 300, 30 и 3 мкг/мл (концентрации после перемешивания человеческого фактора IXa, Novact (зарегистрированный товарный знак) М, человеческого фактора Х и раствора антитела составляли 100, 10 и 1 мкг/мл), развитие ферментативной реакции и окрашивания осуществляли в течение 10 минут и 50 минут соответственно. В результате эти антитела продемонстрировали более высокую активность в отношении способствования образованию F.Xa по сравнению с hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ, описанным в заявке WO 2006/109592.

Фиг.4 показывает активности в отношении способствования образованию F.Xa для hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ, антитела прототипа, и модифицированного антитела с аминокислотными заменами. Концентрации растворов антитела составляли 300, 30 и 3 мкг/мл (концентрации после смешивания человеческого фактора IXa, Novact (зарегистрированный товарный знак) M, человеческого фактора X и раствора антитела составляли 100, 10 и 1 мкг/мл), ферментную реакцию и развитие окрашивания осуществляли в течение 2 минут и 20 минут соответственно. В результате этого полученные модифицированные антитела продемонстрировали более высокие активности в отношении способствования образованию F.Xa по сравнению с антителами прототипа.

Фиг.5 показывает ингибиторное воздействие F.Хазы hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ, антител прототипа и модифицированных антител с аминокислотными заменами.

Фигура показывает влияние hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ, Q1-G4k/J268-G4h/L45-k, Q31-z7/J326-z107/L2-k, Q1-G4k/J321-G4h/L45-k, Q64-z55/J344-z107/L45-k, Q85-G4k/J268-G4h/L406-k, Q85-G4k/J321-G4h/L334-k, Q64-z7/J344-z107/L406-k, Q64-z7/J326-z107/L334-k, Q153-G4k/J142-G4h/L180-k, Q405-G4k/J232-G4h/L248-k, Q360-G4k/J232-G4h/L406-k, Q153-G4k/J232-G4h/L406-k, Q458-z106/J346-z107/L408-k, Q360-z118/J300-z107/L334-k, Q499-z118/J327-z107/L377-k, Q499-z121/J327-z119/L404-k, Q499-z121/J339-z119/L377-k, Q499-z118/J346-z107/L248-k, Q354-z106/J259-z107/L324-k, Q460-z121/J327-z119/L334-k и Q499-z118/J327-z107/L334-k на активацию F.X с помощью F.IXa в присутствии F.VIIIa. Такие ингибиторные воздействия F.Хазы антител отображаются как значения, полученные путем вычитания поглощения реакционного раствора, свободного от антитела, из поглощения реакционного раствора, содержащего антитело. Концентрации растворов антитела составляли 300 и 30 мкг/мл (концентрации после смешивания человеческого фактора IXa, F.VIIIa, человеческого фактора Х и раствора антитела составляли 100 и 10 мкг/мл), ферментную реакцию и развитие окрашивания осуществляли в течение 6 минут и 14 минут соответственно. Чем больше позитивное значение ингибиторного воздействия F.Хазы, показанного по горизонтальной оси, тем слабее ингибиторное воздействие F.Хазы. В результате этого hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ, описанный в WO 2006/109592, продемонстрировал более сильное ингибиторное воздействие F.Хазы. Все эти антитела в соответствии с настоящим изобретением продемонстрировали более слабое ингибиторное воздействие F.Хазы по сравнению с hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ или не выявили ингибиторного воздействия.

Фиг.6A показывает аминокислотные последовательности прототипных антител и модифицированного антитела с аминокислотными заменами. Когда наименование последовательности не указано в колонке "Ссылка", то упоминается последовательность вариабельного участка колонки "Наименование". A "- (черточка)" показана тогда, когда аминокислотная последовательность отсутствует в положении в соответствии с нумерацией. A ". (точка)" показана тогда, когда аминокислотная последовательность является такой же по сравнению с вариабельным участком колонки "Название" и колонки "Ссылка", и аминокислотная последовательность вариабельного участка колонки "Название" показана тогда, когда аминокислоты являются различными. Аминокислоты, которые обнаружены как важные для активности в отношении способствования образованию F.Xa, обозначены с помощью взятия их в рамку.

Фиг.6B является продолжением Фиг.6A.

Фиг.6C является продолжением Фиг.6B.

Фиг.6D является продолжением Фиг.6C.

Способ осуществления изобретения

Мультиспецифические связывающие антиген молекулы, описанные в данной заявке, включают первый сайт связывания антигена и второй сайт связывания антигена, который может, в частности, связываться, по крайней мере, с двумя различными типами антигенов. В то время как первый сайт связывания антигена и второй сайт связывания антигена не являются особенно ограниченными до тех пор, пока они обладают активностью связывания с F.IX и/или F.IXa и F.X соответственно, примеры включают сайты, необходимые для связывания с антигенами, например антитела, каркасные молекулы (подобные антителу молекулы) или пептиды, или фрагменты, содержащие такие сайты. Каркасные молекулы представляют собой молекулы, которые демонстрируют свою функцию путем связывания с целевыми молекулами, и могут использоваться любые полипептиды до тех пор, пока они представляют собой конформационно стабильные полипептиды, которые могут связываться, по крайней мере, с одним целевым антигеном. Примеры таких полипептидов включают вариабельные участки антитела, фибронектин (WO 2002/032925), домен белка A (WO 1995/001937), А домен рецептора LDL (WO 2004/044011, WO 2005/040229), анкирин (WO 2002/020565) и другие, а также молекулы, описанные в документах Nygren и др. (Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469 (1997); и Journal of Immunol Methods, 290: 3-28 (2004), Binz и др. (Nature Biotech 23: 1257-1266 (2005) и Hosse и др. (Protein Science 15: 14-27(2006). Кроме того, как упоминается в Curr Opin Mol Ther. 2010 Aug; 12(4): 487-95 и Drugs. 2008; 68(7): 901-12, могут использоваться пептидные молекулы, которые могут связываться с целевыми антигенами.

В данной заявке мультиспецифические связывающие антиген молекулы не являются особенно ограниченными до тех пор, пока они представляют собой молекулы, которые могут связываться, по крайней мере, с двумя различными типами антигенов, но примеры включают полипептиды, содержащие упомянутые выше сайты связывания антигена, такие как антитела, каркасные молекулы, а также их фрагменты, аптамеры, включающие молекулы нуклеиновых кислот и пептиды, они могут представлять собой единичные молекулы или их мультимеры. Предпочтительные мультиспецифические связывающие антиген молекулы включают мультиспецифические антитела, которые могут связываться, в частности, по крайней мере, с двумя различными антигенами. Особенно предпочтительные примеры антител, которые обладают активностью функционального замещения F.VIII, в соответствии с настоящим изобретением включают биспецифические антитела (BsAb), которые могут связываться, в частности, с двумя различными антигенами (они могут называться также антителами с двойной специфичностью).

В данном изобретении термин "совместно разделяют L цепь" относится к L цепи, которая может связываться с двумя или более или различными Н цепями и демонстрировать способность связывания с каждым антигеном. В данной заявке термин "различная(ые) H цепь(и)" предпочтительно относится к Н цепям антитела против различных антигенов, но не является ограниченным таковыми, а также относится к Н цепям, аминокислотные последовательности которых отличаются друг от друга. Совместно разделяемая L цепь может быть получена, например, в соответствии со способом, описанным в WO 2006/109592.

Мультиспецифические связывающие антиген молекулы в соответствии с настоящим изобретением (предпочтительно биспецифические антитела) представляют собой антитела, обладающие специфичностью к двум или более различным антигенам, или молекулы, включающие фрагменты таких антител. Антитела в соответствии с настоящим изобретением не являются, в частности, ограниченными таковыми, но предпочтительно представляю собой моноклональные антитела. Моноклональные антитела, которые используются в настоящем изобретении, включают не только моноклональные антитела, полученные от животных, таких, как люди, мыши, крысы, хомяки, кролики, овцы, верблюды и обезьяны, но также включают искусственно полученные рекомбинантные антитела на основе модифицированного гена, такие как химерные антитела, гуманизированные антитела и биспецифические антитела.

Кроме того, L цепи антитела, которое будет становиться мультиспецифической связывающей антиген молекулой в соответствии с настоящим изобретением, могут быть различными, но предпочтительно имеют совместно разделяемые L цепи.

Мультиспецифические связывающие антиген молекулы в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляют собой рекомбинантные антитела, полученные при использовании методик генетической рекомбинации (смотри, например, Borrebaeck CAK и Larrick JW, THERAPEUTIC MONOKLONAL ANTIBODIES, опубликовано в Объединенном Королевстве MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Рекомбинантные антитела могут быть получены путем клонирования ДНК, которая кодируют антитела из гибридом или клеток, продуцирующих антитело, таких как сенсибилизированные лимфоциты, которые вырабатывают антитела, путем встраивания их в приемлемые векторы, и последующего введения их в хозяев (хозяйские клетки) для получения антител.

Кроме того, антитела в соответствии с настоящим изобретением могут включать не только цельные антитела, но также фрагменты антител, антитела с низким молекулярным весом (минитела) и модифицированные антитела.

Например, фрагменты антитела или минитела включают диатела (Dbs), линейные антитела и молекулы одноцепочечного антитела (в данной заявке далее также обозначается как scFvs). В данной заявке "Fv" фрагмент определяется как самый маленький фрагмент антитела, который включает полный сайт узнавания антигена и сайт связывания.

"Fv" фрагмент представляет собой димер (VH-VL димер), в котором вариабельный участок H цепи (VH) и вариабельный участок L цепи (VL) являются тесно связанными с помощью нековалентного связывания. Три участка, определяющие комплементарность (CDR) каждого из вариабельных участков, взаимодействуют друг с другом с образованием сайта связывания антигена на поверхности VH-VL димера. Шесть CDR обеспечивают сайт связывания антигена с антителом. Однако один вариабельный участок (или половина Fv, включающего только три CDR, специфических для антигена), взятый отдельно, может узнавать и связываться с антигеном, несмотря на то что его аффинность является ниже, чем таковая для цельного сайта связывания.

Fab фрагмент (который также называется F(ab)) дополнительно включает константный участок L цепи и константный участок Н цепи (CH1). Fab' фрагмент отличается от Fab фрагмента тем, что он дополнительно включает несколько остатков, имеющих происхождение от карбокситерминального конца Н цепи CH1 участка, включающего один или более остатков цистеина из шарнирного участка антитела. Fab'-SH относится к Fab', в котором один или более остатков цистеина константного участка включают свободную группу тиола. F(ab') фрагмент получают путем расщепления дисульфидных связей между остатками цистеина в шарнирном участке F(ab')₂ при использовании переваривания пепсином. Другие химически связанные фрагменты антитела также являются известными квалифицированному специалисту в данной области техники.

Диатела представляют собой бивалентные минитела, сконструированные путем слияния генов (Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); EP 404,097; WO 93/11161). Диатела представляют собой димеры, которые состоят из двух полипептидных цепей, где каждая полипептидная цепь включает вариабельный участок L цепи (VL) и вариабельный участок Н цепи (VH), связанные с помощью линкера, достаточно короткого для того, чтобы предотвратить ассоциацию этих двух доменов в той же цепи, например, линкера, состоящего предпочтительно из 2-12 аминокислот, более предпочтительно из 3-10 аминокислот, в частности приблизительно 5 аминокислот. Полипептидная цепь формирует димер, поскольку линкер между VL и VH, кодируемый на том же полипептиде, является весьма коротким для того, чтобы сформировать одноцепочечный фрагмент вариабельного участка. Таким образом, диатела включают два сайта связывания антигена.

Одноцепочечное антитело или scFv фрагмент антитела включает VH и VL участки антитела, и эти участки существуют в виде одной полипептидной цепи. В общем случае Fv полипептид дополнительно включает полипептидный линкер между VH и VL участками, и это позволяет scFv формировать структуру, необходимую для связывания антигена (для обзора относительно scFvs, смотри Pluckthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" том 113 (Rosenburg и Moore ed. (Springer Verlag, New York) стр.269-315, 1994). В контексте настоящего изобретения линкеры не являются особенно ограниченными до тех пор, пока они не ингибируют экспрессию вариабельных участков антитела, присоединенных к их концам.

Биспецифические антитела IgG типа могут секретироваться из гибридных гибридом (квардром), полученных путем слияния двух видов гибридом, которые продуцируют IgG антитела (Milstein C и др. Nature 1983, 305: 537-540). Они также могут секретироваться путем захвата генов L цепи и H цепи, составляющих два вида IgG, которые представляют интерес, в общей сложности восьми видов генов, и встраивания их в клетки для совместной экспрессии генов.

В этом случае путем введения приемлемых аминокислотных замен в CH3 участки Н цепей IgG, имеющие гетерогенную комбинацию Н цепей, могут быть преимущественно секретированы (Ridgway JB и др. Protein Engineering 1996, 9: 617-621; Merchant AM и др. Nature Biotechnology 1998, 16: 677-681; WO 2006/106905; Davis JH и др. Protein Eng Des Sel. 2010, 4: 195-202).

Что касается L цепей, то разнообразие вариабельных участков L цепи является ниже, чем таковое для вариабельных участков Н цепи, могут быть получены совместно разделяемые L цепи, которые могут придавать способность к связыванию обеим Н цепям. Антитела в соответствии с настоящим изобретением включают совместно разделяемые L цепи. Биспецифические IgG могут быть эффективно экспрессированы путем введения генов совместно разделяемой L цепи и обеих H цепей в клетки.

Биспецифические антитела могут быть получены путем химического образования перекрестных связей Fab'. Биспецифические F(ab')2 могут быть получены, например, с помощью приготовления Fab' из антитела с применением его для получения малеимидизированного Fab' с помощью орто-фенилендималеимида (o-PDM), а затем с помощью реакции его с Fab', полученным из другого антитела, для перекрестного связывания Fab', имеющих происхождение от различных антител (Keler T и др. Cancer Research 1997, 57: 4008-4014). Способ химического связывания Fab'-тионитробензойная кислота (TNB) производной и фрагмента антитела, такого, как Fab'-тиол (SH), также является известным (Brennan M и др. Science 1985, 229: 81-83).

Вместо химического перекрестного связывания может использоваться лейциновая застежка, имеющая происхождение от Fos и Jun. Используется предпочтительное образование гетеродимеров с помощью Fos и Jun, даже несмотря на то что они также образуют гомодимеры. Fab', к которому присоединяют Fos лейциновую застежку, и другой Fab', к которому присоединяют Jun лейциновую застежку, экспрессируют и получают. Мономерные Fab'-Fos и Fab'-Jun, восстановленные при мягких условиях, смешивают и подвергают реакции с образованием биспецифического F(ab')₂ (Kostelny SA и др. J. of Immunology, 1992, 148: 1547-53). Этот способ может использоваться не только для Fab', но также и для scFvs, Fvs и других.

Кроме того, биспецифические антитела, включая sc(Fv)₂ , такие как IgG-scFv (Protein Eng Des Sel. 2010 Apr; 23(4): 221-8) и BiTE (Drug Discov Today. 2005 Sep 15; 10(18): 1237-44.), DVD-Ig (Nat Biotechnol. 2007 Nov; 25(11): 1290-7. Epub 2007 Oct 14.; и MAbs. 2009 Jul; 1(4): 339-47. Epub 2009 Jul 10.), а также другие (IDrugs 2010, 13: 698-700), включая антитела "два в одном" (Science. 2009 Mar 20; 323(5921): 1610-4; и Immunotherapy. 2009 Sep; 1(5): 749-51.), Tri-Fab, тандемный scFv и диатела также являются известными (MAbs. 2009 November; 1(6): 539-547). Кроме того, даже тогда, когда используются молекулярные формы, такие как scFv-Fc и каркасный Fc, биспецифические антитела могут быть эффективно получены путем предпочтительной секреции гетерологичной комбинации Fcs (Ridgway JB et al., Protein Engineering 1996, 9: 617-621; Merchant AM и др. Nature Biotechnology 1998, 16: 677-681; WO 2006/106905; и Davis JH et al., Protein Eng Des Sel. 2010, 4: 195-202.).

Биспецифическое антитело может также быть получено при использовании диатела. Биспецифическое диатело представляет собой гетеродимер двух кроссоверов scFv фрагментов. В частности, его получают путем образования гетеродимера с использованием VH(A)-VL(B) и VH(B)-VL(A), полученного путем связывания VH и VL, которые имеют происхождение от двух видов антител, A и B, при использовании относительно короткого линкера, который состоит приблизительно из 5 остатков (Holliger Р и др. Proc Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90: 6444-6448).

Желаемая структура может быть достигнута путем связывания двух scFvs с гибким и относительно длинным линкером, включающим приблизительно 15 остатков (одноцепочечные антитела: Kipriyanov SM и др. J. of Molecular Biology. 1999, 293: 41-56), и создания приемлемых аминокислотных замен (выступы-во-впадины: Zhu Z и др. Protein Science. 1997, 6: 781-788; VH/VL инжиниринга границы между двумя системами: Igawa T и др. Protein Eng Des Sel. 2010, 8: 667-77).

Sc(Fv)₂, которые могут быть получены путем связывания двух типов scFvs с гибким и относительно длинным линкером, включающим приблизительно 15 остатков, могут также представлять собой биспецифическое антитело (Mallender WD и др. J. of Biological Chemistry, 1994, 269: 199-206).

Примеры модифицированного антитела включают антитела, связанные с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (PEG). Антитела в соответствии с настоящим изобретением включают такие модифицированные антитела. В контексте настоящего изобретения вещество, с которым связываются модифицированные антитела, не является ограниченным. Такие модифицированные антитела могут быть изготовлены путем химической модификации полученного антитела. Такие способы являются хорошо известными в области техники.

Антитела в соответствии с настоящим изобретением включают человеческие антитела, мышиные антитела, крысиные антитела или другие, и их происхождение не является ограниченным таковыми. Они могут представлять собой генетически модифицированные антитела, такие как химерные или гуманизированные антитела.

Способ получения человеческих антител являются хорошо известными в области техники. Например, трансгенные животные, которые несут полный набор генов антител человека, могут подвергаться иммунизации с помощью желаемых антигенов для получения желаемых человеческих антител (смотри международную патентную заявку WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 и WO 96/33735).

Генетически модифицированные антитела также могут быть получены при использовании известных способов. В частности, например, химерные антитела могут включать вариабельные участки Н цепи и L цепи антитела иммунизированного животного и константный участок Н цепи и L цепи человеческого антитела. Химерные антитела могут быть получены путем связывания ДНК, кодирующих вариабельные участки антитела, которые имеют происхождение от иммунизированного животного, с ДНК, кодирующей константные участки человеческого антитела, встраивания ее в экспрессионный вектор, а затем введения в хозяйские клетки для получения антител.

Гуманизированные антитела, которые представляют собой модифицированные антитела, часто называются "реконструированными" человеческими антителами. Гуманизированное антитело конструируют путем переноса CDR антитела, имеющих происхождение от иммунизированного животного, на участки, определяющие комплементарность, человеческого антитела. Традиционные методики генетической рекомбинации для таких целей являются известными (смотри публикацию европейской патентной заявки № ЕР 239400; международную публикацию WO 96/02576; Sato K и др., Cancer Research 1993, 53: 851-856; международную публикацию WO 99/51743).

Мультиспецифические связывающие антиген молекулы в соответствии с настоящим изобретением представляют собой те, которые узнают F.IX и/или F.IXa и F.X и функционально замещают функцию кофактора F.VIII, и характеризуются тем, что молекулы имеют более высокую активность в отношении способствования образованию F.Xa по сравнению с hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ (описывается в WO 2006/109592), которое является известным в качестве биспецифического антитела, которое функционально замещает F.VIII. Кроме того, антитела в соответствии с настоящим изобретением обычно имеют структуру, которая включает вариабельный участок анти-F.IXa антитела и вариабельный участок анти-F.X антитела.

В частности, настоящее изобретение обеспечивает мультиспецифическую связывающую антиген молекулу, которая функционально заменяет F.VIII и включает первый сайт связывания антигена, который узнает F.IX и/или F.IXa, и второй сайт связывания антигена, который узнает F.X, где функция, которая заменяет функцию F.VIII, возникает в результате более высокой активности в отношении способствования образованию F.Xa по сравнению с активностью биспецифического антитела (hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ), которое включает Н цепи, состоящие из SEQ ID NO: 165 и 166, и совместно разделяемую L цепь, которая состоит из SEQ ID NO: 167.

Мультиспецифическая связывающая антиген молекула в соответствии с настоящим изобретением включает первый полипептид и третий полипептид, включающий сайт связывания антигена, который узнает F.IX и/или F.IXa, а также второй полипептид и четвертый полипептид, включающий сайт связывания антигена, который узнает F.X. Первый полипептид и третий полипептид, а также второй полипептид и четвертый полипептид каждый включают сайт связывания антигена Н цепи антитела и сайт связывания антигена L цепи антитела.

Например, в мультиспецифической связывающей антиген молекуле в соответствии с настоящим изобретением первый полипептид и третий полипептид включают сайт связывания антигена Н цепи и L цепи антитела против F.IX или F.IXa соответственно; а второй полипептид и четвертый полипептид включают сайт связывания антигена Н цепи и L цепи антитела против F.X соответственно.

В то же время сайты связывания антигена L цепи антитела, содержащиеся в первом полипептиде и третьем полипептиде, а также втором полипептид и четвертом полипептиде, могут представлять собой совместно используемые L цепи.

Полипептид, включающий сайт связывания антигена L цепи антитела, в настоящем изобретении предпочтительно представляет собой полипептид, который включает всю или часть последовательности L цепи антитела, которая связывается с F.IX, F.IXa и/или F.X.

Предпочтительные воплощения сайта связывания антигена первого полипептида антитела в соответствии с настоящим изобретением, в частности, включают сайты связывания антигена, включающие аминокислотные последовательности:

Q1 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 Н цепи (SEQ ID NOs: 75, 76 и 77 соответственно);

Q31 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 Н цепи (SEQ ID NOs: 78, 79 и 80 соответственно);

Q64 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 Н цепи (SEQ ID NOs: 81, 82 и 83 соответственно);

Q85 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 Н цепи (SEQ ID NOs: 84, 85 и 86 соответственно);

Q153 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 Н цепи (SEQ ID NOs: 87, 88 и 89 соответственно);

Q354 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 Н цепи (SEQ ID NOs: 90, 91 и 92 соответственно);

Q360 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 Н цепи (SEQ ID NOs: 93, 94 и 95 соответственно);

Q405 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 Н цепи (SEQ ID NOs: 96, 97 и 98 соответственно);

Q458 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 Н цепи (SEQ ID NOs: 99, 100 и 101 соответственно);

Q460 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 Н цепи (SEQ ID NOs: 102, 103 и 104 соответственно); и

Q499 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 Н цепи (SEQ ID NOs: 105, 106 и 107 соответственно),

упомянутые в описанных ниже примерах, или сайты связывания антигена, которые являются функционально эквивалентными им.

Предпочтительные воплощения сайта связывания антигена второго полипептида, в частности, включают, например, сайты связывания антигена, включающие аминокислотные последовательности:

J232 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 Н цепи (SEQ ID NOs: 108, 109 и 110 соответственно);

J259 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 Н цепи (SEQ ID NOs: 111, 112 и 113 соответственно);

J268 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 Н цепи (SEQ ID NOs: 114, 115, и 116 соответственно);

J300 последовательность каждого из CDR 1, 2 и 3 Н цепи (SEQ ID NOs: 117, 118 и 119 соответственно);

J321 последовательность каждого из CDR 1, 2 и 3 Н цепи (SEQ ID NOs: 120, 121 и 122 соответственно);

J326 последовательность каждого из CDR 1, 2 и 3 И цепи (SEQ ID NOs: 123, 124 и 125 соответственно);

J327 последовательность каждого из CDR 1, 2 и 3 Н цепи (SEQ ID NOs: 126, 127 и 128 соответственно);

J339 последовательность каждого из CDR 1, 2 и 3 Н цепи (SEQ ID NOs: 129, 130 и 131 соответственно);

J344 последовательность каждого из CDR 1, 2 и 3 И цепи (SEQ ID NOs: 132, 133 и 134 соответственно);

J346 последовательность каждого из CDR 1, 2 и 3 Н цепи (SEQ ID NOs: 135, 136, и 137 соответственно); и

J142 последовательность каждого из CDR 1, 2 и 3 Н цепи (SEQ ID NOs: 174, 175 и 176 соответственно),

упомянутые в описанных ниже примерах, или сайты связывания антигена, которые являются функционально эквивалентными им.

В частности, настоящее изобретение обеспечивает мультиспецифические молекулы, связывающие антиген, в которых сайт связывания антигена первого полипептида включает сайт связывания антигена, который включает CDR Н цепи, состоящие из любой одной из аминокислотных последовательностей, выбранных из следующих (a1)-(a11), или сайт связывания антигена, функционально эквивалентный им, а сайт связывания антигена второго полипептида включает сайт связывания антигена, который включает CDR Н цепи, состоящие из любой одной из аминокислотных последовательностей, выбранных из следующих (b1)-(b11), или сайт связывания антигена, функционально эквивалентный им:

(a1) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 75, 76 и 77 (CDR Н цепи Q1) соответственно;

(a2) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 78, 79 и 80 (CDR Н цепи Q31) соответственно;

(a3) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 81, 82 и 83 (CDR Н цепи Q64) соответственно;

(a4) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 84, 85 и 86 (CDR Н цепи Q85) соответственно;

(a5) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 87, 88 и 89 (CDR Н цепи Q153) соответственно;

(a6) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 90, 91 и 92 (CDR Н цепи Q354) соответственно;

(a7) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 93, 94, и 95 (CDR Н цепи Q360) соответственно;

(a8) сайт связывания антигена, который включает of CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 96, 97 и 98 (CDR Н цепи Q405) соответственно;

(a9) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 99, 100 и 101 (CDR Н цепи Q458) соответственно;

(a10) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 102, 103 и 104 (CDR Н цепи Q460) соответственно;

(a11) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 105, 106 и 107 (CDR Н цепи Q499) соответственно;

(b1) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 108, 109 и 110 (CDR Н цепи J232) соответственно;

(b2) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 111, 112 и 113 (CDR Н цепи J259) соответственно;

(b3) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 114, 115 и 116 (CDR Н цепи J268) соответственно;

(b4) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 117, 118 и 119 (CDR Н цепи J300) соответственно;

(b5) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 120, 121 и 122 (CDR Н цепи J321) соответственно;

(b6) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 123, 124, и 125 (CDR Н цепи J326) соответственно;

(b7) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 126, 127 и 128 (CDR Н цепи J327) соответственно;

(b8) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 129, 130 и 131 (CDR Н цепи J339) соответственно;

(b9) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 132, 133 и 134 (CDR Н цепи J344) соответственно;

(b10) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 135, 136, и 137 (CDR Н цепей J346) соответственно; и

(b11) сайт связывания антигена, который включает CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 174, 175 и 176 (CDR Н цепи J142) соответственно.

Предпочтительные воплощения сайта связывания антигена третьего и четвертого полипептидов, в частности, включают, например, сайты связывания антигена, включающие аминокислотные последовательности:

L2 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 L цепи (SEQ ID NOs: 138, 139 и 140 соответственно);

L45 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 L цепи (SEQ ID NOs: 141, 142 и 143 соответственно);

L248 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 L цепи (SEQ ID NOs: 144, 145 и 146 соответственно);

L324 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 L цепи (SEQ ID NOs: 147, 148 и 149 соответственно);

L334 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 L цепи (SEQ ID NOs: 150, 151 и 152 соответственно);

L377 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 L цепи (SEQ ID NOs: 153, 154 и 155 соответственно);

L404 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 L цепи (SEQ ID NOs: 156, 157 и 158 соответственно);

L406 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 L цепи (SEQ ID NOs: 159, 160 и 161 соответственно);

L408 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 L цепи (SEQ ID NOs: 162, 163 и 164 соответственно); и

L180 последовательность каждого из CDR1, 2 и 3 L цепи (SEQ ID NOs: 177, 178, и 179 соответственно),

упомянутые в описанных ниже примерах, или сайты связывания антигена, которые являются функционально эквивалентными им.

В частности, настоящее изобретение обеспечивает мультиспецифические молекулы, связывающие антиген, в которых сайты связывания антигена, содержащиеся в третьем полипептиде и четвертом полипептиде, включают сайт связывания антигена, который включает CDR L цепи, состоящие из любой одной из аминокислотных последовательностей, выбранных из следующих (c1)-(c10), или сайт связывания антигена, функционально эквивалентный им:

(c1) сайт связывания антигена, который включает CDR L цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 138, 139 и 140 (CDR L цепи L2) соответственно;

(c2) сайт связывания антигена, который включает CDR L цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 141, 142 и 143 (CDR L цепи L45) соответственно;

(c3) сайт связывания антигена, который включает CDR L цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 144, 145 и 146 (CDR L цепи L248) соответственно;

(c4) сайт связывания антигена, который включает CDR L цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 147, 148 и 149 (CDR L цепи L324) соответственно;

(c5) сайт связывания антигена, который включает CDR L цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 150, 151 и 152 (CDR L цепи L334) соответственно;

(c6) сайт связывания антигена, который включает CDR L цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 153, 154 и 155 (CDR L цепи L377) соответственно;

(c7) сайт связывания антигена, который включает CDR L цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 156, 157 и 158 (CDR L цепи L404) соответственно;

(c8) сайт связывания антигена, который включает CDR L цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 159, 160 и 161 (CDR L цепи L406) соответственно;

(c9) сайт связывания антигена, который включает CDR L цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 137, 138 и 139 (CDR L цепи L408) соответственно; и

(c10) сайт связывания антигена, который включает CDR L цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs: 177, 178 и 179 (CDR L цепи LI 80) соответственно.

Аминокислотные последовательности вариабельных участков Н цепи Q1, Q31, Q64, Q85, Q153, Q354, Q360, Q405, Q458, Q460 и Q499 в соответствии с настоящим изобретением являются представленными следующими SEQ ID NO соответственно.

Q1: SEQ ID NO: 35

Q31: SEQ ID NO: 36

Q64: SEQ ID NO: 37

Q85: SEQ ID NO: 38

Q153: SEQ ID NO: 39

Q354: SEQ ID NO: 40

Q360: SEQ ID NO: 41

Q405: SEQ ID NO: 42

Q458: SEQ ID NO: 43

Q460: SEQ ID NO: 44

Q499: SEQ ID NO: 45

Аминокислотные последовательности вариабельных участков H цепи J232, J259, J268, J300, J321, J326, J327, J339, J344, J346 и J142 в соответствии с настоящим изобретением являются представленными следующими SEQ ID NOs соответственно.

J232: SEQ ID NO: 46

J259: SEQ ID NO: 47

J268: SEQ ID NO: 48

J300: SEQ ID NO: 49

J321: SEQ ID NO: 50

J326: SEQ ID NO: 51

J327: SEQ ID NO: 52

J339: SEQ ID NO: 53

J344: SEQ ID NO: 54

J346: SEQ ID NO: 55

J142: SEQ ID NO: 172

В частности, настоящее изобретение обеспечивает мультиспецифические молекулы, связывающие антиген, в которых сайт связывания антигена первого полипептида включает сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок Н цепи, состоящий из любой одной из аминокислотных последовательностей, выбранных из следующих (a1)-(a11), или сайт связывания антигена, функционально эквивалентный им, а сайт связывания антигена второго полипептида включает сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок H цепи, состоящий из любой одной из аминокислотных последовательностей, выбранных из следующих (b1)-(b11), или сайт связывания антигена, функционально эквивалентный им:

(a1) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка H цепи SEQ ID NO: 35 (вариабельный участок H цепи Q1);

(a2) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 36 (вариабельный участок Н цепи Q31);

(a3) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 37 (вариабельный участок Н цепи Q1);

(a4) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 38 (вариабельный участок Н цепи Q85);

(a5) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 39 (вариабельный участок Н цепи Q153);

(a6) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 40 (вариабельный участок H цепи Q354);

(a7) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 41 (вариабельный участок Н цепи Q360);

(a8) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 42 (вариабельный участок Н цепи Q405);

(a9) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 43 (вариабельный участок Н цепи Q458);

(a10) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 44 (вариабельный участок Н цепи Q460);

(a11) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 45 (вариабельный участок Н цепи Q499);

(b1) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 46 (вариабельный участок Н цепи J232);

(b2) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 47 (вариабельный участок Н цепи J259);

(b3) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 48 (вариабельный участок Н цепи J268);

(b4) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 49 (вариабельный участок Н цепи J300);

(b5) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 50 (вариабельный участок B цепи J321);

(b6) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 51 (вариабельный участок Н цепи J326);

(b7) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 52 (вариабельный участок Н цепи J327);

(b8) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 53 (вариабельный участок Н цепи J339);

(b9) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 54 (вариабельный участок Н цепи J344);

(b10) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 55 (вариабельный участок Н цепи J346); и

(b11) сайт связывания антигена, который включает аминокислотную последовательность вариабельного участка Н цепи SEQ ID NO: 172 (вариабельный участок Н цепи J142).

Кроме того, аминокислотные последовательности вариабельных участков L цепи L2, L45, L248, L324, L334, L377, L404, L406, L408 и L180 в соответствии с настоящим изобретением являются представленными следующими SEQ ID NO соответственно.

L2: SEQ ID NO: 56

L45: SEQ ID NO: 57

L248: SEQ ID NO: 58

L324: SEQ ID NO: 59

L334: SEQ ID NO: 60

L377: SEQ ID NO: 61

L404: SEQ ID NO: 62

L406: SEQ ID NO: 63

L408: SEQ ID NO: 64

L180: SEQ ID NO: 173

В частности, настоящее изобретение обеспечивает мультиспецифические молекулы, связывающие антиген, в которых сайты связывания антигена, содержащиеся в третьем полипептиде и четвертом полипептиде, включают сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи, состоящий из любой одной из аминокислотных последовательностей, выбранных из следующих (c1)-(c10), или сайт связывания антигена, функционально эквивалентный им:

(c1) сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 56 (вариабельный участок L цепи L2);

(c2) сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 57 (вариабельный участок L цепи L45);

(c3) сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 58 (вариабельный участок L цепи L248);

(c4) сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 59 (вариабельный участок L цепи L324);

(c5) сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 60 (вариабельный участок L цепи L334);

(c6) сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 61 (вариабельный участок L цепи L377);

(c7) сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 62 (вариабельный участок L цепи L404);

(c8) сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 63 (вариабельный участок L цепи L406);

(c9) сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 64 (вариабельный участок L цепи L408); и

(c10) сайт связывания антигена, который включает вариабельный участок L цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 173 (вариабельный участок L цепи L180).

Аминокислотные последовательности CDR 1-3 и FR 1-4 в каждой из этих последовательностей являются такими, как описывается на Фиг.3A-D.

При получении полноразмерного антитела при использовании вариабельных участков, раскрытых в данном изобретении, без особых ограничений могут использоваться константные участки, хорошо известные квалифицированному специалисту в данной области техники. Например, могут использоваться константные участки, описанные в "Sequences of proteins of immunological interest", (1991), U.S. Department of Health и Human Services. Public Health Service National Institutes of Health, или "An efficient route to human bispecific IgG", (1998). Nature Biotechnology vol. 16, 677-681. Предпочтительные примеры константных участков антитела в соответствии с настоящим изобретением включают константные участки IgG антитела. При использовании константного участка IgG антитела его тип не является ограниченным, при этом может использоваться константный участок IgG подкласса, такого как IgGI, IgG2, IgG3 или IgG4. Кроме того, могут быть введены аминокислотные мутации в константный участок этих подклассов IgG. Аминокислотные мутации, которые вводятся, могут представлять собой, например, те, которые повышают или понижают связывание с Fc- рецепторами (Proc Nati Acad Sci USA. 2006 Mar 14; 103(11): 4005-10; и MAbs. 2009 Nov; 1(6): 572-9), повышают или понижают связывание с FcRn (J Biol Chem. 2001 Mar 2; 276(9): 6591-604; Int Immunol. 2006 Dec; 18(12): 1759-69; и J Biol Chem. 2006 Aug 18; 281(33): 23514-24), но не являются ограниченными таковыми. Два типа Н цепей должны быть гетерологично ассоциированы для получения биспецифического антитела. Методика "выступы-во-впадины" (J Immunol Methods. 2001 Feb 1; 248(1-2): 7-15; и J Biol Chem. 2010 Jul 2; 285(27): 20850-9), методика электростатического отталкивания (WO 2006/106905), методика SEEDbody (Protein Eng Des Sel. 2010 Apr; 23(4): 195-202) и другие могут использоваться для гетерологической ассоциации двух типов Н цепей с помощью СНЗ домена. Кроме того, антитела в соответствии с настоящим изобретением могут представлять собой такие с модифицированной или дефектной сахарной цепью. Примеры антител, обладающих модифицированными сахарными цепями, включают антитела, сконструированные при использовании модифицированного гликозилирования (например, WO 99/54342), антитела с дефукозилированными сахарными цепями (WO 00/61739, WO 02/31140, WO 2006/067847, WO 2006/067913, и т.д.) и антитела, имеющие сахарную цепь с разрезанным пополам GlcNAc (например, WO 02/79255). Примеры известных способов для получения IgG антител с дефектной сахарной цепью включают способ введения мутации на аспарагин в положении 297 при использовании нумерации EU (J Clin Pharmacol. 2010 May; 50(5): 494-506), а также способ получения IgG при использовании Escherichia coli (J Immunol Methods. 2002 May 1; 263(1-2): 133-47; и J Biol Chem. 2010 Jul 2; 285(27): 20850-9). Кроме того, делеция, сопровождающаяся гетерогенностью С-терминального лизина IgG, и неправильное спаривание, сопровождающееся гетерогенностью дисульфидных связей в шарнирном участке IgG2, могут быть снижены путем введения аминокислотных делеций/замен (WO 2009/041613).

Настоящее изобретение обеспечивает, например, мультиспецифические молекулы, связывающие антиген, в которых первый и второй полипептиды включают константный участок Н цепи антитела, и третий и четвертый полипептиды включают константный участок L цепи антитела.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает мультиспецифические молекулы, связывающие антиген, где первый полипептид включает константный участок Н цепи антитела, который состоит из любой одной из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, которая состоит из следующих (d1)-(d6), или из группы, которая состоит из следующих (d7)-(d9), и второй полипептид включает константный участок Н цепи антитела, который состоит из любой одной из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, отличной от таковой упомянутого выше первого полипептида:

(d1) константный участок Н цепи SEQ ID NO: 65 (G4k);

(d2) константный участок Н цепи SEQ ID NO: 66 (z7);

(d3) константный участок Н цепи SEQ ID NO: 67 (z55);

(d4) константный участок Н цепи SEQ ID NO: 68 (z106);

(d5) константный участок Н цепи SEQ ID NO: 69 (z118);

(d6) константный участок Н цепи SEQ ID NO: 70 (z121);

(d7) константный участок Н цепи SEQ ID NO: 71 (G4h);

(d8) константный участок Н цепи SEQ ID NO: 72 (z107); и

(d9) константный участок Н цепи SEQ ID NO: 73 (z119).

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает мультиспецифическую молекулу, связывающую антиген, где третий и четвертый полипептиды включают константный участок L цепи антитела, который состоит из следующей аминокислотной последовательности:

(e) константный участок L цепи антитела SEQ ID NO: 74 (k).

В настоящем изобретении фраза "функционально заменяет F.VIII" означает, что F.IX, и/или F.IXa, и F.X узнаются и повышается активация F.X (промотируется выработка F.Xa).

В настоящем изобретении "активность в отношении способствования образованию F.Xa" может быть подтверждена путем оценки мультиспецифических связывающих антиген молекул в соответствии с настоящим изобретением при использовании, например, системы измерения, которая включает F.XIa (F.IX активирующий фермент), F.IX, F.X, F синтетический субстрат S-2222 (синтетический субстрат F.Xa) и фосфолипиды. Эта система измерения показывает корреляцию между тяжестью заболевания и клиническими симптомами в случаях гемофилии A (Rosen S, Andersson M, Blomba"ck M и др. Clinical applications of a chromogenic substrate method for determination ofFVIII activity. Thromb Haemost 1985, 54: 811-23). To есть в данной системе измерения исследуемые вещества, которые показывают более высокую активность в отношении способствования образованию F.Xa, предполагаются как такие, которые демонстрируют лучшие гемостатические эффекты, направленные против эпизодов кровотечения при гемофилии A. В соответствии с этими результатами, если мультиспецифическая связывающая антиген молекула, которая обладает активностью функционального замещения F.VIII, представляет собой молекулу, имеющую более высокую активность, чем hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ, она может обеспечить отличную активность промотирования свертывания крови, а также могут быть получены отличные эффекты для фармацевтического компонента, предназначенного для предотвращения и/или лечения кровотечения, заболевания, сопровождающегося кровотечением, или заболевания, вызванного кровотечением. Для получения отличных эффектов в качестве упомянутого выше фармацевтического компонента, например, активность в отношении способствования образованию F.Xa, которая измеряется при условиях, описанных в [Примере 2], предпочтительно является не меньшей, чем таковая для hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ, и, в частности, активность более предпочтительно является такой же или не меньшей, чем для Q153-G4k/J142-G4h/L180-k. В данной заявке "промотирующая активность в отношении образования F.Xa" представляет собой значение, полученное путем вычитания изменения поглощения через 20 минут в растворителе из изменения поглощения через 20 минут в растворе антитела.

Предпочтительное воплощение в соответствии с настоящим изобретением представляет собой мультиспецифические антитело, которое функционально замещает F.VIII, узнающее F.IX и/или F.IXa и F.X.

Упомянутые выше мультиспецифические антитела в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляют собой антитела, которые включают CDR Н цепей анти-F.IX/F.IXa антитела или CDR, функционально эквивалентные им, и CDR Н цепей анти-F.X антитела или CDR, функционально эквивалентные им.

Кроме того, антитела в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляют собой антитела, которые включают сайт связывания антигена, имеющий:

CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 75, 76 и 77 (CDR Н цепи Q1) соответственно;

CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 78, 79 и 80 (CDR Н цепей Q31) соответственно;

CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 81, 82 и 83 (CDR Н цепей Q64) соответственно;

CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 84, 85 и 86 (CDR Н цепей Q85) соответственно;

CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 87, 88 и 89 (CDR Н цепи Q153) соответственно;

CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 90, 91 и 92 (CDR Н цепей Q354) соответственно;

CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 93, 94 и 95 (CDR Н цепей Q360) соответственно;

CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 96, 97 и 98 (CDR Н цепей Q405) соответственно;

CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 99 100 и 101 (CDR Н цепей Q458) соответственно;

CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 102 103 и 104 (CDR Н цепей Q460) соответственно; или

CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 105 106 и 107 (CDR Н цепей Q499) соответственно,

в анти-F.IX/IXa антителе, или сайт связывания антигена, функционально эквивалентный им, и сайт связывания антигена, включающий:

CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 108, 109 и 110 (CDR Н цепей J232) соответственно;

CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 111, 112 и 113 (CDR H цепей J259) соответственно;

CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 114, 115 и 116 (CDR H цепей J268) соответственно;

CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 117, 118 и 119 (CDR H цепей J300) соответственно;

CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 120, 121 и 122 (CDR H цепей J321) соответственно;

CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 123, 124 и 125 (CDR H цепей J326) соответственно;

CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 126, 127 и 128 (CDR H цепей J327) соответственно;

CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 129, 130 и 131 (CDR H цепей J339) соответственно;

CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 132, 133 и 134 (CDR H цепей J334) соответственно;

CDR 1, 2 и 3 H цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 135, 136 и 137 (CDR H цепей J346) соответственно; или

CDR 1, 2 и 3 Н цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NOs 174, 175 и 176 (CDR H цепей J142) соответственно,

в анти-F.IX/IXa антителе, или сайт связывания антигена, функционально эквивалентный им.

В настоящем изобретении "сайты связывания антигена являются функционально эквивалентными" означает, что активности функционального замещения F.VIII, которыми обладают мультиспецифические связывающие антиген молекулы, имеющие сайты связывания антигена, являются эквивалентными.

В данном изобретении термин "эквивалент" с необходимостью не должен означать одинаковую степень активности, и активность может быть повышена, или активность может быть снижена до тех пор, пока существует активность более высокая, чем таковая hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ в соответствии с системой измерения, описанной выше, или предпочтительно активность в отношении способствования образованию F.Xa, которая измеряется при условиях, описанных в [Примере 2], является эквивалентной или не меньше таковой для Q153-G4k/J142-G4h/L180-k.

Упомянутые выше антитела могут иметь одну или более аминокислотных замен, делеций, дополнений и/или инсерций в вариабельном участке (последовательности CDR и/или последовательности FR) аминокислотной последовательности до тех пор, пока они имеют активность более высокую, чем таковая hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ в соответствии с системой измерения, описанной выше на стр.35, строки 11-30, или предпочтительно активность в отношении способствования образованию F.Xa, которая измеряется при условиях, описанных в [Примере 2], является эквивалентной или не меньше таковой для Q153-G4k/J142-G4h/L180-k. Способ введения мутаций в белки является хорошо известным квалифицированному специалисту в данной области техники как способ введения одной или более аминокислотных замен, делеций, дополнений и/или инсерций в аминокислотную последовательность. Например, квалифицированный специалист в данной области техники может получить желаемый мутант, функционально эквивалентный мультиспецифическому полипептидному мультимеру, который обладает активностью функционального замещения F.VIII, путем введения приемлемых мутаций в аминокислотную последовательность при использовании сайт-направленного мутагенеза (Hashimoto-Gotoh, Т, Mizuno, Т, Ogasahara, Y, и Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152: 271-275; Zoller, MJ, и Smith, M. (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis ofDNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100: 468-500; Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, и Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W, и Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154: 350-367; и Kunkel, ТА (1985) Rapid и efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Nati Acad Sci USA. 82: 488-492) и т.п.

Как таковые, антитела в соответствии с настоящим изобретением также включают антитела, с одной или более аминокислотными мутациями в вариабельном участке и обладающие активностью более высокой, чем таковая для hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ в соответствии с системой измерения, описанной выше на стр.35, строки 11-30, или предпочтительно активность в отношении способствования образованию F.Xa, которая измеряется при условиях, описанных в [Примере 2], является эквивалентной или не меньше таковой для Q153-G4k/J142-G4h/L180-k.

Когда изменяют аминокислотный остаток, аминокислота предпочтительно подвергается мутации с изменением на другую(ие) аминокислоту(ы), которая сохраняет свойства аминокислотной боковой цепи. Примеры свойств аминокислотных боковых цепей представляют собой: гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y и V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S и T), аминокислоты, содержащие алифатические боковые цепи (G, A, V, L, I, и P), аминокислоты, имеющие боковые цепи, содержащие группу гидроксила (S, Т, и Y), аминокислоты, имеющие серосодержащие боковые цепи (C и M), аминокислоты, имеющие боковые цепи, содержащие карбоновые кислоты и амид (D, N, E, и Q), аминокислоты, содержащие основные боковые цепи (R, K, и H), и аминокислоты, содержащие ароматические боковые цепи (H, F, Y, и W) (аминокислоты являются представленными в однобуквенном коде в скобках). Аминокислотные замены в каждой группе называются консервативными заменами. Является также известным, что полипептид, содержащий модифицированную аминокислотную последовательность, в которой один или более аминокислотных остатков в данной аминокислотной последовательности являются делегированными, вставленными и/или замененными другими аминокислотами, могут сохранять исходную биологическую активность (Mark, D. F. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; (1984) 81: 5662-6; Zoller, M. J. и Smith, M., Nucleic Acids Res. (1982) 10: 6487-500; Wang, A. и др. Science (1984) 224: 1431-3; Dalbadie-McFarland, G. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79: 6409-13). Такие мутанты имеют аминокислотную идентичность, по крайней мере 70%, более предпочтительно, по крайней мере 75%, даже более предпочтительно, по крайней мере 80%, еще более предпочтительно, по крайней мере 85%, еще более предпочтительно, по крайней мере 90%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере 95%, с вариабельными участками (например, CDR последовательностями, FR последовательностями или цельными вариабельными участками) в соответствии с настоящим изобретением. В данной заявке идентичность последовательности определяется как процент остатков, идентичных таким в исходной аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи или вариабельного участка легкой цепи, определяемая после выравнивания последовательностей и приемлемого введения пробелов для максимизации идентичности последовательности, если это является необходимым. Идентичность аминокислотных последовательностей может быть определена с помощью способов, описанных ниже.

Альтернативно, аминокислотные последовательности вариабельных участков, которые имеют замену, делецию, вставку и/или инсерцию одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности вариабельных участков (последовательности CDR и/или последовательности FR) и имеют активность более высокую, чем таковая для hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ в соответствии с системой измерения, описанной выше на странице 35, строки 11-30, или предпочтительно активность в отношении способствования образованию F.Xa, которая измеряется при условиях, описанных в [Примере 2] является эквивалентной таковой или не меньшей, чем таковая для Q153-G4R/J142-G4h/L180-k, могут быть получены из нуклеиновых кислот, которые могут гибридизоваться при жестких условиях с нуклеиновой кислотой, которая состоит из нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность вариабельных участков. Условия строгой гибридизации для изоляции нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется при строгих условиях с нуклеиновой кислотой, которая включает нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельных участков, включают, например, условия 6 М мочевина, 0,4% SDS, 0,5 × SSC, и 37°C, или условия гибридизации с жесткостью, эквивалентной той, что описана выше. При более жестких условиях, например при условиях 6 М мочевина, 0,4% SDS, 0,1 × SSC, и 42°C, может ожидаться изоляция нуклеиновых кислот с намного большей гомологией. Последовательности изолированных нуклеиновых кислот могут быть определены с помощью известных способов, описанных ниже. Общая гомология нуклеотидной последовательности изолированной нуклеиновой кислоты составляет, по крайней мере, 50% или более высокую идентичность последовательности, предпочтительно 70% или выше, более предпочтительно 90% или выше (например, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или выше).

Нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются при жестких условиях с нуклеиновой кислотой, которая состоит из нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность вариабельных участков, могут также быть изолированы при использовании, вместо описанных выше способов, применяющих методики гибридизации, методов амплификации генов, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием праймеров, синтезированных на основе информации о нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность вариабельных участков.

Идентичность одной нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности с другой может быть определена при использовании алгоритма BLAST, Karlin и Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 5873-7). Программы, такие как BLASTN и BLASTX, были разработаны на основе этого алгоритма (Altschul и др., J. Mol. Biol. (1990) 215: 403-10). Для анализа нуклеотидных последовательностей в соответствии с BLASTN на основе BLAST устанавливают параметры, например, такие как балл =100 и длина слова =12. С другой стороны, параметры, используемые для анализа аминокислотных последовательностей с помощью BLASTX на основе BLAST, включают балл=50 и длина слова =3. Применяются параметры по умолчанию тогда, когда используются программы BLAST и Gapped BLAST. Конкретные методики для осуществления таких анализов являются известными в области техники (смотри вебсайт Национального центра по биотехнологической информации (BLAST); http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Настоящее изобретение также обеспечивает антитела, которые связываются с эпитопом, перекрывающимся с эпитопом, который связывается антителами, описанными выше.

Способность антитела узнавать эпитоп, перекрывающийся с эпитопом, который узнается другим антителом, может быть подтверждена с помощью конкуренции между двумя антителами против этого эпитопа. Конкуренция между антителами может быть оценена с помощью анализов конкурентного связывания при использовании средств, таких как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), способ переноса энергии флуоресценции (FRET) и методика флуоресцентного анализа в малом объеме (FMAT (зарегистрированный товарный знак)). Количество антитела, связанного с антигеном, непосредственно коррелирует со связывающей способностью кандтидатного конкурентного антитела (исследуемого антитела), которое конкурентно связывается с перекрывающимся эпитопом. Другими словами, в то время как количество или аффинность исследуемого антитела против перекрывающегося эпитопа повышается, количество антитела, связанного с антигеном, уменьшается, и количество исследуемого антитела, связанного с антигеном, повышается. В частности, приемлемым образом меченные антитела и антитела, которые подвергаются оценке, одновременно прибавляют к антигенам, и таким образом связанные антитела определяют при использовании метки с помощью предварительного мечения антитела. Такая метка не является особенно ограниченной, и способ мечения выбирают в соответствии с методикой используемого анализа. Способ мечения включает флуоресцентную метку, радиоактивную метку, ферментную метку и т.д.

Например, флуоресцентно меченные антитела и немеченные антитела или исследуемые антитела одновременно прибавляют к шарикам, иммобилизованным с помощью F.IX, F.IXa или F.X, и меченные антитела определяют с помощью методики флуоресцентного анализа в малом объеме.

В данной заявке "антитело, которое связывается с перекрывающимся эпитопом" относится к антителу, которое может снижать связывание меченного антитела, по крайней мере, на 50% при концентрации, которая обычно является в 10 раз выше, предпочтительно в 80 раз выше, более предпочтительно в 50 раз выше, даже более предпочтительно в 30 раз выше, и еще более предпочтительно в 10 раз выше, чем концентрация, при которой немеченное антитело снижает связывание меченного антитела на 50% (IC₅₀).

Мультиспецифические молекулы, связывающие антиген, которые имеют сайты связывания антигена антител, которые связываются с эпитопами, перекрывающимися с эпитопами, связанными с упомянутыми выше антителами, могут обеспечивать отличную активность функциональной замены F.VIII. Кроме того, в сайтах связывания антигена антител, которые связываются с эпитопами, перекрывающимися с эпитопами, связанными с упомянутыми выше антителами, одна или более аминокислот могут быть изменены для лучшей активности функционального замещения F.VIII. Мультиспецифические связывающие антиген молекулы, обладающие лучшей активностью функционального замещения F.VIII, могут быть получены путем изменения аминокислот сайтов связывания антигена и отбора мультиспецифических связывающих антиген молекул, обладающих активностью, более высокой, чем таковая для hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ, в соответствии с системой измерения, описанной выше, или предпочтительно, обладающих активностью в отношении способствования образованию F.Xa, которая измеряются при условиях, описанных в [Примере 2], и которая является эквивалентной или не ниже таковой для Q153-G4R/J142-G4h/L180-k. Для получения отличной активности функционального замещения F.VIII в соответствии с настоящим изобретением следующие изменения аминокислот являются наиболее предпочтительными.

(1) По крайней мере, один аминокислотный остаток, выбранный из аминокислотных остатков в положениях 34, 35, 49, 61, 62, 96, 98, 100, 100b и 102 в соответствии с нумерацией Кабат в H цепи антитела, которое узнает F.IX и/или F.IXa, является замещенным с помощью отличной аминокислоты.

(2) По крайней мере, один аминокислотный остаток, выбранный из аминокислотных остатков в положениях 35, 53, 73, 76, 96, 98, 100 и 100a в соответствии с нумерацией Кабат в H цепи антитела, которое узнает F.X., является замещенным с помощью отличной аминокислоты.

(3) По крайней мере, один аминокислотный остаток, выбранный из аминокислотных остатков в положениях 27, 30, 31, 32, 50, 52, 53, 54, 55, 92, 93, 94 и 95 в соответствии с нумерацией Кабат в L цепи антитела является замещенным с помощью отличной аминокислоты.

Кроме того, в настоящем изобретении предпочтительные аминокислоты антитела для получения лучшей активности функционального замещения F.VIII включают те, которые упомянуты в пунктах (4)-(6), приведенных ниже. В отношении этих аминокислот можно сказать, что H цепь антитела может исходно иметь такие аминокислоты, или аминокислоты H цепи антитела могут быть модифицированы для того, чтобы обладать такой последовательностью. (4) Н цепь антитела, которое узнает F.IX и/или F.IXa, где в соответствии с нумерацией Кабат аминокислота в положении 34 представляет собой изолейцин, аминокислота в положении 35 представляет собой аспарагин, глутамин или серин, аминокислота в положении 49 представляет собой серин, аминокислота в положении 61 представляет собой аргинин, аминокислота в положении 62 представляет собой глутаминовую кислоту, аминокислота в положении 96 представляет собой серин или треонин, аминокислота в положении 98 представляет собой лизин или аргинин, аминокислота в положении 100 представляет собой фенилаланин или тирозин, аминокислота в положении 100b представляет собой глицин, или аминокислота в положении 102 представляет собой тирозин.

(5) H цепь антитела, которое узнает F.X, где в соответствии с нумерацией Кабат аминокислота в положении 35 представляет собой аспарагиновую кислоту, аминокислота в положении 53 представляет собой аргинин, аминокислота в положении 73 представляет собой лизин, аминокислота в положении 76 представляет собой глицин, аминокислота в положении 96 представляет собой лизин или аргинин, аминокислота в положении 98 представляет собой тирозин, аминокислота в положении 100 представляет собой тирозин, или аминокислота в положении 100a представляет собой гистидин.

(6) L цепь антитела, где в соответствии с нумерацией Кабат аминокислота в положении 27 представляет собой лизин или аргинин, аминокислота в положении 30 представляет собой глутаминовую кислоту, аминокислота в положении 31 представляет собой аргинин, аминокислота в положении 32 представляет собой глутамин, аминокислота в положении 50 представляет собой аргинин или глутамин, аминокислота в положении 52 представляет собой серин, аминокислота в положении 53 представляет собой аргинин, аминокислота в положении 54 представляет собой лизин, аминокислота в положении 55 представляет собой глутаминовую кислоту, аминокислота в положении 92 представляет собой серин, аминокислота в положении 93 представляет собой серин, аминокислота в положении 94 представляет собой пролин, или аминокислота в положении 95 представляет собой пролин.

Среди упомянутых выше аминокислотных остатков антитела пунктов (1)-(6) благоприятные положения аминокислотных остатков для получения особенно хорошей F.VIII-подобной активности являются представленными в последующих пунктах (1)-(3).

(1) Аминокислотные остатки в положениях 34, 35, 61, 98, 100 и 100b, особенно аминокислотные остатки в положениях 61 и 100 в соответствии с нумерацией Кабат в H цепи антитела, которое узнает F.IX и/или F.IXa.

(2) Аминокислотные остатки в положениях 35, 53, 73, 96, 98, 100 и 100a в соответствии с нумерацией Кабат в H цепи антитела, которое узнает F.X.

(3) Аминокислотные остатки в положениях 27, 30, 31, 32, 50, 52, 53, 93, 94 и 95, особенно аминокислотные остатки в положениях 27, 30, 31, 50, 53, 94 и 95 в соответствии с нумерацией Кабат в L цепи антитела.

В частности, настоящее изобретение обеспечивает мультиспецифические молекулы, связывающие антиген, в которых первый полипептид включает любую из Н цепей антитела, выбранную из следующих (a1)-(a14), и любую из L цепей антитела, выбранную из следующих (c1)-(c10), и второй полипептид включает любую из Н цепей антитела, выбранную из следующих (b1)-(b12), и любую из L цепей антитела, выбранную из следующих (c1)-(c10):

(a1) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 (Q1-G4k);

(a2) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 (Q31-z7);

(a3) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 (Q64-z55);

(a4) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 (Q64-z7);

(a5) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 (Q85-G4k);

(a6) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12 (Q153-G4k);

(a7) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13 (Q354-z106);

(a8) Н цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14 (Q360-G4k);

(a9) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15 (Q360-z118);

(a10) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16 (Q405-G4k);

(a11) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17 (Q458-z106);

(a12) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18 (Q460-z121);

(a13) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19 (Q499-z118);

(a14) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20 (Q499-z121);

(b1) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 (J268-G4h);

(b2) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 (J321-G4h);

(b3) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 (J326-z107);

(b4) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 (J344-z107);

(b5) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21 (J232-G4h);

(b6) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22 (J259-z107);

(b7) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23 (J300-z107);

(b8) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24 (J327-z107);

(b9) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25 (J327-z119);

(b10) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26 (J339-z119);

(b11) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27 (J346-z107);

(b12) H цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 170 (J142-G4h);

(c1) L цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8 (L2-k);

(c2) L цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 (L45-k);

(c3) L цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 28 (L248-k);

(c4) L цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29 (L324-k);

(c5) L цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30 (L334-k);

(c6) L цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31 (L377-k);

(c7) L цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32 (L404-k);

(c8) L цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33 (L406-k);

(c9) L цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34 (L408-k); и

(c10) L цепи антитела, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 171 (L180-k).

Настоящее изобретение также обеспечивает мультиспецифические молекулы, связывающие антиген, в которых первый полипептид включает сайт связывания антигена, связывающийся с эпитопом, который связывается с антителом, состоящим из Н цепи в соответствии с любым одним из пунктов (a1)-(a14) и L цепи антитела в соответствии с любым одним из пунктов (c1)-(c10), описанных выше, а второй полипептид включает сайт связывания антигена, связывающийся с эпитопом, который связывается с антителом, состоящим из H цепи антитела в соответствии с любым одним из пунктов (b1)-(b12) и L цепи антитела в соответствии с любым одним из пунктов (c1)-(c10), описанных выше.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает мультиспецифические молекулы, связывающие антиген, в которых первый полипептид включает любую одну H цепь антитела, выбранную из следующих (e1)-(e3), второй полипептид включает любую одну Н цепь антитела, выбранную из следующих (f1)-(f3), a третий полипептид и четвертый полипептид включают любую одну L цепь антитела, выбранную из следующих (g1)-(g4):

(e1) H цепь антитела, связывающаяся с эпитопом, который перекрывается с эпитопом, который связывается антителом, которое состоит из H цепи антитела в соответствии с любым одним из пунктов (a1)-(a14), и L цепь антитела в соответствии с любым одним из пунктов (c1)-(c10), описанных выше

(e2) H цепь антитела, в которой, по крайней мере, один аминокислотный остаток, выбранный из аминокислотных остатков в положениях 34, 35, 49, 61, 62, 96, 98, 100, 100b и 102 в соответствии с нумерацией Кабат в любой одной Н цепи антитела, выбранной из (e1), как описано выше, является замещенным другой аминокислотой;

(e3) H цепь антитела, в которой в соответствии с нумерацией Кабат аминокислота в положении 34 представляет собой изолейцин, аминокислота в положении 35 представляет собой аспарагин, глутамин или серин, аминокислота в положении 49 представляет собой серин, аминокислота в положении 61 представляет собой аргинин, аминокислота в положении 62 представляет собой глутаминовую кислоту, аминокислота в положении 96 представляет собой серин или треонин, аминокислота в положении 98 представляет собой лизин или аргинин, аминокислота в положении 100 представляет собой фенилаланин или тирозин, аминокислота в положении 100b представляет собой глицин, или аминокислота в положении 102 представляет собой тирозин в любой H цепи антитела, выбранной из (е1), как описано выше;

(f1) Н цепь антитела, связывающаяся с эпитопом, который перекрывается с эпитопом, который связывается антителом, которое состоит из H цепи антитела в соответствии с любым одним из пунктов (b1)-(b12), как описано выше, и L цепи антитела в соответствии с любым из пунктов (c1)-(c10), как описано выше;

(f2) H цепь антитела, в которой, по крайней мере, один аминокислотный остаток, выбранный из аминокислотных остатков в положениях 35, 53, 73, 76, 96, 98, 100 и 100a в соответствии с нумерацией Кабат в любой Н цепи антитела (f1), как описано выше, является замещенной другой аминокислотой;

(f3) H цепь антитела, в которой в соответствии с нумерацией Кабат, аминокислота в положении 35 представляет собой аспарагиновую кислоту, аминокислота в положении 53 представляет собой аргинин, аминокислота в положении 73 представляет собой лизин, аминокислота в положении 76 представляет собой глицин, аминокислота в положении 96 представляет собой лизин или аргинин, аминокислота в положении 98 представляет собой тирозин, аминокислота в положении 100 представляет собой тирозин, или аминокислота в положении 100a представляет собой гистидин в любой одной Н цепи антитела, выбранной из (f1), как описано выше;

(g1) L цепь антитела, которая связывается с эпитопом, перекрывающимся с эпитопом, который связывается антителом, которое состоит из Н цепи антитела в соответствии с любым из пунктов (a1)-(a14) и L цепи антитела в соответствии с любым из пунктов (c1)-(c10), как описано выше;

(g2) L цепь антитела, которая связывается с эпитопом, перекрывающимся с эпитопом, который связывается антителом, которое состоит из H цепи антитела в соответствии с любым из пунктов (b1)-(b12) и L цепи антитела в соответствии с любым из пунктов (c1)-(c10), как описано выше;

(g3) L цепь антитела, в которой, по крайней мере, один аминокислотный остаток, выбранный из аминокислотных остатков в положениях 27, 30, 31, 32, 50, 52, 53, 54, 55, 92, 93, 94 и 95 в соответствии с нумерацией Кабат в L цепи антитела либо (g1), либо (g2), как описано выше, является замещенным другой аминокислотой; и

(g4) L цепь антитела, в которой в соответствии с нумерацией Кабат аминокислота в положении 27 представляет собой лизин или аргинин, аминокислота в положении 30 представляет собой глутаминовую кислоту, аминокислота в положении 31 представляет собой аргинин, аминокислота в положении 32 представляет собой глутамин, аминокислота в положении 50 представляет собой аргинин или глутамин, аминокислота в положении 52 представляет собой серин, аминокислота в положении 53 представляет собой аргинин, аминокислота в положении 54 представляет собой лизин, аминокислота в положении 55 представляет собой глутаминовую кислоту, аминокислота в положении 92 представляет собой серин, аминокислота в положении 93 представляет собой серин, аминокислота в положении 94 представляет собой пролин, или аминокислота в положении 95 представляет собой пролин в L цепи антитела либо (g1), либо (g2), как описано выше.

Аминокислотные замены могут осуществляться в антителах (клонах) в соответствии с настоящим изобретением для того, чтобы избежать дезамидирования, реакции окисления метионина и т.д., или для того, чтобы структурно стабилизировать антитело.

Способы получения мультиспецифических связывающих антиген молекул в соответствии с настоящим изобретением не являются особенно ограниченными и могут представлять собой любой способ. Биспецифические антитела могут быть получены в соответствии со способами, описанными в WO 2006/109592, WO 2005/035756, WO 2006/106905 или WO 2007/114325, которые являются известными в качестве примеров способа получения биспецифических антител; после этого могут быть отобраны и получены желаемые антитела, обладающие активностью замещения функции кофактора.

Например, в соответствии с настоящим изобретением обеспечивается биспецифическое антитело, описанное в любом из следующих пунктов (a)-(u):

(a) биспецифическое антитело (Q1-G4k/J268-G4h/L45-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, второй полипептид представляет собой H цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 9;

(b) биспецифическое антитело (Q1-G4k/J321-G4h/L45-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, второй полипептид представляет собой H цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, и третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 9;

(c) биспецифическое антитело (Q31-z7/J326-z107/L2-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 8;

(d) биспецифическое антитело (Q64-z55/J344-z107/L45-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, и третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 9;

(e) биспецифическое антитело (Q64-z7/J326-z107/L334-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 30;

(f) биспецифическое антитело (Q64-z7/J344-z107/L406-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, и третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 33;

(g) биспецифическое антитело (Q85-G4k/J268-G4h/L406-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 33;

(h) биспецифическое антитело (Q85-G4k/J321-G4h/L334-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, второй полипептид представляет собой H цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, и третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 30;

(i) биспецифическое антитело (Q153-G4k/J232-G4h/L406-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, второй полипептид представляет собой H цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, и третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 33;

(j) биспецифическое антитело (Q354-z106/J259-z107/L324-k), в котором первый полипептид представляет собой H цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13, второй полипептид представляет собой H цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22, и третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 29;

(k) биспецифическое антитело (Q360-G4k/J232-G4h/L406-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14, второй полипептид представляет собой H цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, и третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 33;

(l) биспецифическое антитело (Q360-z118/J300-z107/L334-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23, и третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 30;

(m) биспецифическое антитело (Q405-G4k/J232-G4h/L248-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, второй полипептид представляет собой H цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, и третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 28;

(n) биспецифическое антитело (Q458-z106/J346-z107/L408-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, второй полипептид представляет собой H цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27, и третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 34;

(o) биспецифическое антитело (Q460-z121/J327-z119/L334-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25, и третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 30;

(p) биспецифическое антитело (Q499-z118/J327-z107/L334-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, и третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 30;

(q) биспецифическое антитело (Q499-z118/J327-z107/L377-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, и третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 31;

(r) биспецифическое антитело (Q499-z118/J346-z107/L248-k), в котором первый полипептид представляет собой H цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, второй полипептид представляет собой H цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27, и третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 28;

(s) биспецифическое антитело (Q499-z121/J327-z119/L404-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, второй полипептид представляет собой H цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25, и третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 32;

(t) биспецифическое антитело (Q499-z121/J339-z119/L377-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26, и третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 31; и

(u) биспецифическое антитело (Q153-G4k/J142-G4h/L180-k), в котором первый полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, второй полипептид представляет собой Н цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 170, и третий полипептид и четвертый полипептид имеют общую L цепь последовательности SEQ ID NO: 171.

Аминокислотные последовательности, молекулярные массы, изоэлектрические точки присутствие или отсутствие и форма сахарных цепей антитела в соответствии с настоящим изобретением могут варьироваться в зависимости от клеток или хозяев, которые вырабатывают антитела, или способов очистки, описанных ниже. Однако поскольку полученные антитела имеют функции, эквивалентные антителам в соответствии с настоящим изобретением, они являются включенными в настоящее изобретением. Например, когда антитело в соответствии с настоящим изобретением экспрессируется в прокариотических клетках, таких как Е. coli, остаток метионина будет прибавляться к N терминальному концу аминокислотной последовательности исходного антитела. Антитела в соответствии с настоящим изобретением также включают такие антитела.

Биспецифические антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены с помощью способов, известных квалифицированному специалисту в данной области техники.

На основе полученной последовательности анти-F.IX/F.IXa антитела или анти-F.X антитела может быть получено анти-F.IX/F.IXa антитело или анти-F.X антитело, например, с помощью методик генетической рекомбинации, известных квалифицированному специалисту в данной области техники. В частности, полинуклеотид, кодирующий антитело, может быть сконструирован на основе последовательности анти-F.IX/F.IXa антитела или анти-F.X антитела, встроенной в экспрессионный вектор, и последующей экспрессии в приемлемых хозяйских клетках (смотри, например. Со, М. S. и др., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, М. и Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, А. и Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. и др. Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. и Walker, В. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137).

Такие векторы включают М13 векторы, pUC векторы, pBR322, pBluescript и pCR-Script. Альтернативно, тогда, когда целью является субклонировать и вырезать кДНК, эти векторы включают, например, pGEM-T, pDIRECT и рТ7, в дополнение к векторам, описанным выше. Экспрессионные векторы являются особенно полезными при использовании векторов для получения антитела в соответствии с настоящим изобретением. Например, при ориентации на экспрессию в E.coli, такой как JM109, DH5 , НВ101 и XL I-Blue, экспрессионные векторы не только имеют характеристики, которые позволяют осуществлять амплификацию вектора в E.coli, но могут также нести промотор, который позволяет осуществлять эффективную экспрессию в E.coli, например, lacZ промотор (Ward и др., Nature (1989) 341: 544-546; FASEB J. (1992) 6: 2422-2427), аrаВ промотор (Better и др., Science (1988) 240: 1041-1043), T7 промотор или другие. Такие векторы включают pGEX-5X-l (Pharmacia), "QIAexpress system" (Qiagen), pEGFP, или рЕТ (в этом случае хозяин предпочтительно представляет собой BL21, который экспрессирует РНК полимеразу T7) дополнительно к векторам, описанным выше.

Экспрессионные плазмидные векторы могут содержать сигнальные последовательности для секреции антитела. В качестве сигнальной последовательности для секреции антитела может использоваться pelB сигнальная последовательность (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169: 4379) тогда, когда белок секретируется в периплазму Е.coli. Вектор может быть введен в хозяйские клетки при использовании, например, способов на основе хлорида кальция или электропорации.

В дополнение к векторам для Е.coli, векторы для получения антитела в соответствии с настоящим изобретением включают экспрессионные векторы млекопитающих (например, pcDNA3 (Invitrogen), pEF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17): p5322), pEF, и pCDM8), экспрессионные векторы, которые имеют происхождение от клеток насекомых (например, "бакуловирусная экспрессионная система Bac-to-BAC" (Gibco-BRL) и рВасРАК8), экспрессионные векторы на основе растений (например, рМН1 и рМН2), экспрессионные векторы, которые имеют происхождение от вирусов животных (например, pHSV, pMV и pAdexLcw), ретровирусные экспрессионные векторы (например, pZIPneo), дрожжевые экспрессионные векторы (например, "Pichia экспрессионный набор" (Invitrogen), pNV11 и SP-Q01) и экспрессионные векторы на основе Bacillus subtilis (например, pPL608 и рКТН50).

Имея целью экспрессию в клетках животных, таких как CHO, COS и NIH3T3 клетки, экспрессионные плазмидные векторы должны иметь промотор, существенный для экспрессии в клетках, например SV40 промотор (Mulligan и др. Nature (1979) 277: 108), MMLV-LTR промотор, EF1 промотор (Mizushima и др. Nucleic Acid Res. (1990) 18: 5322) и CMV промотор, и более предпочтительно они содержат ген для селекции трансформированных клеток (например, ген устойчивости к лекарственным средствам, что позволяет осуществлять оценку при использовании агента (неомицин, G418, или другие). Векторы с такими характеристиками включают рМАМ, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV и рОР13, например.

Кроме того, для стабильной генной экспрессии и генной амплификации в клетках могут использоваться следующие способы: СНО клетки, дефектные по пути синтеза нуклеиновой кислоты, вводят в вектор, который несет ген DHFR, который компенсирует дефектность (например, pSV2-dhfr (Molecular Cloning 2^ое изд., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)) и амплифицируют вектор при использовании метотрексата (МТХ). Альтернативно, может использоваться следующий способ для временной генной экспрессии: COS клетки с геном, экспрессирующим SV40 T антиген на своих хромосомах, трансформировали в вектор с SV40 точкой начала репликации (pcD и другие). Точки репликации имели происхождение от вируса полиомы, аденовируса, папилломавируса крупного рогатого скота (BPV), при этом другие также могут использоваться. Для амплификации ряда копий гена в хозяйских клетках экспрессионные векторы могут дополнительно нести селективные маркеры, такие как ген аминогликозид трансферазы (АРН), ген тимидинкиназы (ТК), ген ксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы Е.coli (Ecogpt) и ген дегидрофолатредуктазы (dhfr).

Антитела в соответствии с настоящим изобретением, полученные с помощью способов, как описано выше, могут быть изолированы из самой клетки или из среды, окружающей клетки (питательная среда или другое), после чего их очищают до гомогенности. Антитела могут быть изолированы и очищены с помощью способов, которые обычно используются для изоляции и очистки антител, и тип способа не является ограниченным. Например, антитела могут быть изолированы и очищены с помощью приемлемой селекции и параллельной колоночной хроматографии, фильтрации, ультрафильтрации, высаливания, осаждения растворителем, экстракции растворителем, дистилляции, иммунопреципитации, электрофореза в SDS-полиакриламидном геле, изоэлектрофокусирования, диализа, перекристаллизации и других.

Способы хроматографии включают, например, аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель фильтрацию, хроматографию с обратной фазой и адсорбционную хроматографию (Strategies for Protein Purification и Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak и др., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Хроматографические способы, описанные выше, могут осуществляться при использовании жидкостной хроматографии, например ВЭЖХ и ЖХБР. Колонки, которые используются для аффинной хроматографии, включают колонки с белком A и колонки с белком G. Колонки, которые используют белок A, включают, например, Hyper D, POROS и Сефарозу FF (GE Amersham Biosciences). Настоящее изобретение включает антитела, которые являются высокоочищенными при использовании этих способов очистки.

Полученные антитела могут быть очищены до гомогенности. Разделение и очистку антитела можно осуществлять при использовании традиционных способов разделения и очистки, которые используются для обычных белков. Например, антитела могут быть разделены и очищены путем приемлемого выбора и применения хроматографии, такой как аффинная хроматография, фильтрации, ультрафильтрации, высаливания, диализа, электрофореза в SDS полиакриламидном геле, изоэлектрического фокусирования и других способов, без ограничения (Antibodies: A Laboratory Manual, ред. Harlow и David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Колонки, которые используются для аффинной хроматографии, включают, например, колонки с белком A и колонки с белком G.

В одном воплощении антитела в соответствии с настоящим изобретением, поскольку антитела в соответствии с настоящим изобретением функционально заменяет кофактор F.VIII, они предполагаются в качестве эффективных фармацевтических агентов против заболеваний, возникающих в результате снижения активности (функции) этого кофактора. Примеры упомянутых выше заболеваний включают кровотечение, заболевания, сопровождающиеся кровотечением, и заболевания, вызванные кровотечением. В частности, они могут оказывать отличные терапевтические эффекты в случаях гемофилии, при которой расстройства кровотечения являются вызванными дефицитом или снижением функции F.VIII/F.VIIIa. Они предполагаются в качестве отличных терапевтических агентов для гемофилии A, при которой расстройства кровотечения являются вызванными наследственным дефицитом или снижением функции F.VIII/F.VIIIa.

Настоящее изобретение обеспечивает (фармацевтические) композиции, включающие антитела в соответствии с настоящим изобретением, и фармацевтически приемлемые носители. Например, антитела в соответствии с настоящим изобретением, которые узнают как F.IX, так и F.IXa и F.X, и функционально заменяют F.VIII, предполагаются как такие, которые станут фармацевтическими средствами (фармацевтическими композициями) или фармацевтическими агентами для предотвращения и/или лечения кровотечения, заболеваний, сопровождающихся кровотечением, и заболеваний, вызванных кровотечением, и тому подобного.

В контексте настоящего изобретения кровотечение, заболевания, сопровождающиеся кровотечением, и/или заболевания, вызванные кровотечением, предпочтительно относятся к заболеваниям, которые развиваются и/или прогрессируют благодаря снижению или дефициту активности F.VIII и/или активированного фактора коагуляции VIII (F.VIIIa). Такие заболевания включают описанную выше гемофилию A, заболевания, при которых образуется ингибитор против F.VIII/F.VIIIa, приобретенную гемофилию, болезнь фон Виллебранда и другие, но без ограничения таковыми.

Фармацевтические композиции, используемые для терапевтических или превентивных целей, включают антитела в соответствии с настоящим изобретением в качестве активных ингредиентов, могут быть рецептированы путем смешивания, если это является необходимым, с доступными фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями, такими, которые являются неактивными против антитела. Например, могут использоваться стерилизованная вода, физиологический раствор, стабилизаторы, наполнители, антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота), буферы (такие как фосфатный, цитратный, гистидиновый и других органических кислот), антисептики, поверхностно-активные вещества (такие как ПЭГ и Твин), хелатирующие агенты (такие как ЭДТА) и связывающие агенты. Они могут также включать другие полипептиды с низкой молекулярной массой, белки, такие как сывороточный альбумин, желатин и иммуноглобулины, аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, метионин, аргинин и лизин, сахара и углеводы, такие как полисахариды и моносахариды, сахарные спирты, такие как маннитол и сорбитол. Тогда, когда готовят водный раствор для инъекции, то могут использоваться физиологический раствор и изотонические растворы, которые включают глюкозу и другие адъюванты, такие как D-сорбитол, D-манноза, D-маннитол и хлорид натрия, и если это является необходимым, в комбинации с приемлемыми солюбилизирующими агентами, такими, как спирт (например, этанол), полиспирты (такие, как пропиленгликоль и ПЭГ), и неионными поверхностно-активными агентами (такими как полисорбат 80, полисорбат 20, полоксамер 188 и НСО-50). Путем прибавления гиалуронидазы в композицию больший объем жидкости может вводиться подкожно (Expert Opin Drug Deliv. 2007 Jul; 4(4): 427-40).

Если это является необходимым, то антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть инкапсулированы в микрокапсулах (например, таких, которые изготовлены из гидроксиметилцеллюлозы, желатина и поли(метилметакрилата)), или введены в качестве компонентов в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, липосомы, микросферы альбумина, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) (смотри, например, "Remington's Pharmaceutical Science 16-oe изд.", Oslo Ed. (1980)). Способы получения фармацевтических агентов в виде фармацевтических агентов контролированного высвобождения также являются известными, и такие способы могут применяться по отношению к антителам в соответствии с настоящим изобретением (Langer и др., J. Biomed. Mater. Res. 15: 267-277 (1981); Langer, Chemtech. 12: 98-105 (1982); патент США № 3,773,919; публикация европейской патентной заявки ЕР 58,481; Sidman и др., Biopolymers 22: 547-556 (1983); ЕР 133,988).

Доза фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением может быть приемлемым образом определена с учетом дозированной формы, способа введения, возраста пациента и веса тела, симптомов пациента, типа заболевания и степени развития заболевания, и в конечном счете определяется лечащим врачом. В общем случае суточная доза для взрослого составляет от 0,1 мг до 2000 мг в один прием или в виде нескольких порций. Более предпочтительно доза составляет от 0,2 до 1000 мг/сутки, даже более предпочтительно от 0,5 до 500 мг/сутки, еще более предпочтительно от 1 до 300 мг/сутки, еще более предпочтительно от 3 до 100 мг/сутки и наиболее предпочтительно от 5 до 50 мг/сутки. Эти дозы могут варьироваться, в зависимости от возраста и веса тела пациента, а также способа введения; однако выбор приемлемой дозировки находится в компетенции специалиста в данной области техники. Подобно этому период введения дозировок может быть приемлемым образом определен в зависимости от терапевтического прогресса.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает гены или нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, генная терапия может осуществляться путем встраивания генов или нуклеиновых кислот, кодирующих антитела в соответствии с настоящим изобретением, в векторы генной терапии. Кроме того, для непосредственного введения оголенных плазмид, способы введения включают введение после упаковки в липосомы и т.п, формирование разнообразных вирусных векторов, таких как ретровирусные векторы, аденовирусные векторы, векторы на основе вируса вакцины, векторы на основе поксвируса, векторы на основе аденоассоциированных вирусов и HVJ векторы (смотри: Adolph "Viral Genome Methods" CRC Press, Florida (1996)), или покрытие при использовании шариков носителя, таких как частицы коллоидного золота (WO 93/17706 и другие). Однако до тех пор, пока антитела экспрессируются in vivo и проявляется их активность, для введения может использоваться любой способ. Предпочтительно, достаточная доза может вводиться с помощью приемлемого парентерального пути введения (такого как внутривенная инъекция или инфузия, интраперитонеально, подкожно, интрадермально, внутримышечно, в жировые ткани или молочные железы; путем ингаляции; газоприводной бомбардировки частицами (при использовании электронной пушки и подобных ей); или путем введения через слизистые оболочки, таким как при использовании носовых капель.

Альтернативно, гены, кодирующие антитела в соответствии с настоящим изобретением, могут вводиться в клетки крови, клетки костного мозга, а также могут вводиться ех vivo при использовании липосомальной трансфекции, бомбардировки частицами (патент США № 4,945,050) или вирусной инфекции, и эти клетки могут быть повторно введены пациентам. Любой ген, кодирующий антитело в соответствии с настоящим изобретением, может использоваться в генной терапии, и эти примеры включают гены, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие CDR Q1, Q31, Q64, Q85, Q153, Q354, Q360, Q405, Q458, Q460, Q499, J232, J259, J268, J300, J321, J326, J327, J339, J344, J346, J142, L2, L45, L248, L324, L334, L377, L404, L406, L408 и L180, как описано выше.

Настоящее изобретение также обеспечивает способы для предотвращения и/или лечения кровотечения, заболеваний, сопровождающихся кровотечением, и/или заболеваний, вызванных кровотечением, такие способы включают этап введения антитела или композиции в соответствии с настоящим изобретением. Антитела или композиции могут вводиться, например, с помощью упомянутых выше способов.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает наборы, которые используют упомянутые выше способы, такие наборы включают, по крайней мере, антитело или композицию в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, наборы могут включать упаковку со шприцом, иглу для инъекции, фармацевтически приемлемую среду, пропитанную спиртом вату, липкопластырную повязку, инструкции, описывающие способ применения, и тому подобное.

Настоящее изобретение также относится к применению мультиспецифической молекулы, связывающей антиген, биспецифического антитела или композиция в соответствии с настоящим изобретением в производстве агента для предотвращения и/или лечения кровотечения, заболевания, сопровождающегося кровотечением, или заболевания, вызванного кровотечением.

Кроме того, настоящее изобретение относится к мультиспецифической молекуле, связывающей антиген, биспецифическому антителу или композиции в соответствии с настоящим изобретением для предотвращения и/или лечения кровотечения, заболевания, сопровождающегося кровотечением, или заболевания, вызванного кровотечением.

Все ссылки на документы уровня техники, которые приводятся в данной заявке, являются введенными в это описание в качестве ссылки.

Примеры

Далее настоящее изобретение будет, в частности, описываться со ссылкой на Примеры, но они не должны трактоваться как такие, которые ограничивают его.

[Пример 1] Получение биспецифических антител, обладающих активностью в отношении способствования образования F.Xa

В WO 2006/109592, hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ было получено как биспецифическое антитело, обладающее активностью функционального замещения F.VIII. Однако существует возможность, что это антитело обладает ингибирующим действием на реакцию, в которой F.IXa активирует F.X при использовании F.VIIIa в качестве кофактора.

Как показано на Фиг.1, антитела, которые связываются с F.IX/F.IXa или F.X, могут ингибировать образование F.IXa-F.VIIIa комплекса (Фактор Хаза (F.Хаза)), или ингибировать активность F.Хазы (активация F.X). Далее будет упомянуто, что ингибирование образования F.Хазы и/или ингибирование активности F-Хазы будет упоминаться как ингибиторное воздействие F.Хазы. Ингибиторное воздействие F.Хазы представляет собой ингибирование реакции коагуляции, в которой F.VIIIa служит в качестве кофактора, который может супрессировать остаточную функцию F.VIII у пациента или функцию введенной композиции F.VIII. Таким образом, является желательным, чтобы активность в отношении способствования образованию F.Xa, которая представляет собой задачу биспецифического антитела, была высокой, в то время как ингибиторное воздействие F.Хазы было низким. В частности, для пациентов, поддерживающих F.VIII функцию, и пациентов, получающих лечение при использовании композиции F.VIII, является более желательным, чтобы активность в отношении способствования образованию F.Xa и ингибиторное воздействие F.Хазы были разделены настолько, насколько это является возможным.

Однако ингибирующее воздействие F-Хазы достигается благодаря связыванию с антигеном (F.IXa и/или F.X), что представляет собой фундаментальное свойство антитела. С другой стороны, биспецифическое антитело, обладающее активностью в отношении способствования образованию F.Xa (функциональное замещение F.VIII), также требует связывания с антигенами (F.IXa и F.X). Таким образом, предполагается, что является чрезвычайно трудным получить биспецифические антитела, которые не имеют ингибирующего воздействия F.Хазы, но обладают активностью в отношении способствования образованию F.Xa (функциональное замещение F.VIII). Подобно этому предполагается, что является чрезвычайно сложным снизить ингибирующее воздействие F.Хазы, одновременно повышая активность в отношении способствования образованию F.Xa путем введения аминокислотных замен в биспецифическое антитело.

Авторы в соответствии с настоящим изобретением получили гены для приблизительно 200 типов антител против человеческого F.IXa и человеческого F.X соответственно при использовании способа, известного квалифицированному специалисту в данной области техники, который представляет собой способ получения генов из антителопродуцирующих клеток животных, иммунизированных с помощью антигена (человеческий F.IXa или человеческий F.X), и введения аминокислотных замен, в случае необходимости. Каждый ген антитела встраивали в экспрессионный вектор клетки животных.

40000 или более биспецифических антител, таких как комбинации анти-F.IXa антитела и анти-F.X антитела временно экспрессировали путем одновременной трансфекции экспрессионного вектора H цепи антитела против F.IXa человека, экспрессионного вектора H цепи антитела против F.X человека и экспрессионного вектора совместно разделяемой L цепи антитела в клетки животных, такие как НЕК293Н клетки. В качестве контроля для сравнения получали биспецифическое антитело hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ (SEQ ID NOs: 165/166/167), описанное в WO 2006/109592.

Поскольку мутации, упомянутые в WO 2006/106905 или WO 1996/027011, были введены в CH3 домен каждой Н цепи, предполагается, что в основном экспрессируются биспецифические антитела. Антитела в супернатанте культуры клеток очищали с помощью способа, известного квалифицированному специалисту в данной области техники, при использовании белка A.

Изобретатели в соответствии с настоящим изобретением измеряли активности в отношении способствования образованию F.Xa этих антител с помощью способа, описанного ниже. Все реакции осуществляли при комнатной температуре.

Пять мкл раствора антитела, разведенного с помощью забуференного Трис физиологического раствора, содержащего 0,1% сывороточного альбумина крупного рогатого скота (далее в заявке упоминается как TBSB), смешивали с 2,5 мкл 27 нг/мл человеческого фактора 1Ха бета (Enzyme Research Laboratories) и 25 мкл 6 МЕ/мл Novact (зарегистрированный товарный знак) М (Kaketsuken) и потом инкубировали в планшете на 384 ячейки при комнатной температуре в течение 30 минут.

Ферментативную реакцию в этом смешанном растворе инициировали путем прибавления 5 мкл 24,7 мкг/мл человеческого фактора Х (Enzyme Research Laboratories) и через десять минут прибавляли 5 мкл 0,5 М ЭДТА для остановки реакции. Цветную реакцию инициировали путем прибавления 5 мкл раствора окрашивающего субстрата. Спустя 50 минут проведения цветной реакции изменения в поглощении при длине волны 405 нм измеряли при использовании SpectraMax 340PC³⁸⁴ (Molecular Devices). Активность в отношении способствования образованию F.Xa указывали в виде значения, полученного путем вычитания поглощения реакционного раствора, свободного от антитела, из поглощения реакционного раствора, содержащего антитело.

ТВСР (TBSB, содержащий 93,75 мкМ раствора фосфолипида (SYSMEX СО.), 7,5 мМ CaCl₂ и 1,5 мМ MgCl ₂) использовали в качестве растворителя для человеческого фактора IXa, Novact (зарегистрированный товарный знак) М, и человеческого фактора X. Раствор окрашивающего субстрата S-2222 (CHROMOGENIX) растворяли в очищенной воде при концентрации 1,47 мг/мл и затем использовали в этом анализе.

Для оценки ингибиторного воздействия F.Хазы антител изобретатели в соответствии с настоящим изобретением измеряли влияния на активацию F.X с помощью F.IXa в присутствии F.VIIIa при использовании следующего способа. Все реакции осуществляли при комнатной температуре.

Пять мкл раствора антитела, разведенного с помощью забуференного Трис физиологического раствора, содержащего 0,1% сывороточного альбумина крупного рогатого скота (далее в заявке упоминается как TBSB), смешивали с 2,5 мкл 80,9 нг/мл человеческого фактора IXa бета (Enzyme Research Laboratories) и потом инкубировали в планшете на 384 ячейки при комнатной температуре в течение 30 минут.

Дополнительно прибавляли 2,5 мкл 1,8 МЕ/мл F.VIIIa (способ получения будет описан ниже) и через 30 секунд ферментную реакцию в этом смешанном растворе инициировали путем прибавления 5 мкл 24,7 мкг/мл человеческого фактора X (Enzyme Research Laboratories). Через шесть минут прибавляли 5 мкл 0,5 М ЭДТА для остановки реакции. Цветную реакцию инициировали путем прибавления 5 мкл раствора окрашивающего субстрата. Через 14 минут проведения цветной реакции изменения в поглощении при длине волны 405 нм измеряли при использовании SpectraMax 340PC ³⁸⁴ (Molecular Devices). Ингибиторное воздействие F.Хазы антитела указывали в виде значения, полученного путем вычитания поглощения реакционного раствора, свободного от антитела, из поглощения реакционного раствора, содержащего антитело.

F.VIIIa получали путем смешивания 5,4 МЕ/мл Когината (зарегистрированный товарный знак) FS (Bayer HealthCare) и 1,11 мкг/мл человеческого тромбина альфа (Enzyme Research Laboratories) при объемном соотношении 1:1, подвергая инкубации при комнатной температуре в течение одной минуты и прибавляя потом 7,5 ед./мл Гирудина (Merck KgaA) при количестве, которое составляет половину объема смешанного раствора. Приготовленный раствор определялся как такой, который имеет концентрацию 1,8 МЕ/мл FVIIIa, и через одну минуту после прибавления Гирудина его использовали для анализов.

ТВСР (TBSB, содержащий 93,75 мкМ раствора фосфолипида (SYSMEX СО.), 7,5 мМ CaCl₂ и 1,5 мМ MgCl₂) использовали в качестве растворителя для человеческого фактора IXa, человеческого фактора X, Когината (зарегистрированный товарный знак) FS, человеческого тромбина альфа и Гирудина. Раствор окрашивающего субстрата S-2222 (CHROMOGENIX) растворяли в очищенной воде при концентрации 1,47 мг/мл и затем использовали в этом анализе.

Активности в отношении способствования образованию F.Xa каждого из биспецифических антител указаны на Фиг.3 и 4, а ингибиторное воздействиен F.Хазы каждого из биспецифических антител является представленным на Фиг.5. Были обнаружены различные аминокислотные замены, которые повышают активность в отношении способствования образованию F.Xa, но, как и ожидалось, большинство аминокислотных замен, которые повышают активность в отношении способствования образованию F.Xa, также повышали ингибиторное воздействие F.Хазы, и супрессия ингибиторного воздействие F.Хазы при повышении активности в отношении способствования образованию F.Xa была чрезвычайно сложна.

При таких обстоятельствах изобретатели в соответствии с настоящей заявкой получили Q1-G4k/J268-G4h/L45-k, Q1-G4k/J321-G4h/L45-k, Q31-z7/J326-z107/L2-k, Q64-z55/J344-z107/L45-k в качестве биспецифических антител с высокой активностью в отношении способствования образованию F.Xa и низким ингибиторным воздействием F.Хазы. Кроме того, Q1-G4k (SEQ ID NO: 1), 031-z7 (SEQ ID NO: 2) и Q64-z55 (SEQ ID NO: 3) были получены в качестве Н цепей антитела против человеческого F.IXa, J268-G4h (SEQ ID NO: 4), J321-G4h (SEQ ID NO: 5), J326-z107 (SEQ ID NO: 6, и J344-z107 (SEQ ID NO: 7) были получены в качестве прототипных Н цепей антитела против человеческого F.X, и L2-k (SEQ ID NO: 8) и L45-k (SEQ ID NO: 9) были получены в качестве прототипных совместно разделяемых L цепей антитела. Знак перед дефисом в наименовании последовательности обозначает вариабельный участок, а знак после дефиса обозначает константный участок. Каждое наименование биспецифического антитела обозначается путем приведения наименований последовательностей каждой цепи, которая подвергается трансфекции.

Большинство биспецифических антител, обладающих активностью в отношении способствования образованию F.Xa, близкой таковой для hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ, имели высокое ингибиторное воздействие Р.Хазы, как предполагалось, но эти биспецифические антитела (Q1-G4k/J268-G4h/L45-k, Q1-G4k/J321-G4h/L45-k, Q31-z7/J326-z107/L2-k, Q64-z55/J344-z107/L45-k) были обнаружены как такие, которые имеют более высокие активности в отношении способствования образованию F.Xa и более низкое ингибиторное воздействие F.Хазы, чем hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ, описанное в заявке WO 2006/109592. Изобретатели в соответствии с настоящей заявкой осуществляли исследования на дополнительное повышение активности в отношении способствования образованию F.Xa и снижения ингибиторного воздействия F.Хазы при использовании этих четырех антител в качестве прототипных антител. Скрининг биспецифических антител, которые имеют повышенную активность в отношении способствования образованию F.Xa и сниженное ингибиторное воздействие F.Хазы, указаны на Фиг.2.

[Пример 2] Получение модифицированного антитела

Изобретатели в соответствии с настоящей заявкой осуществили введение различных комбинаций аминокислотных мутаций, которые влияют на активность в отношении способствования образованию F.Xa и ингибиторное воздействие F.Хазы, обнаруженное в Примере 1, для каждой из цепей прототипного антитела с помощью способа, известного квалифицированному специалисту в данной области техники, такого как ПЦР, для введения мутаций и оценки комбинаций модифицированных цепей в большом объеме для скрининга на аминокислотные замены, которые будут дополнительно повышать активность в отношении способствования образованию F.Xa и снижать ингибиторные воздействия F.Хазы четырех прототипных антител.

Каждое из модифицированных биспецифических антител с аминокислотными заменами временно экспрессировали и очищали с помощью способов, подобных таким для прототипного антитела. Активности в отношении способствования образованию F.Xa антитела измеряли при использовании следующего способа. Все реакции осуществляли при комнатной температуре.

Пять мкл раствора антитела, разведенного с помощью забуференного Трис физиологического раствора, содержащего 0,1% сывороточного альбумина крупного рогатого скота (далее в заявке упоминается как TBSB), смешивали с 2,5 мкл 27 нг/мл человеческого фактора 1Ха бета (Enzyme Research Laboratories), и потом смешивали с 2,5 мкл 27 нг/мл человеческого фактора 1Ха бета (Enzyme Research Laboratories) и 2,5 мкл 6 МЕ/мл Novact (зарегистрированный товарный знак) М (Kaketsuken), инкубировали в планшете на 384 ячейки при комнатной температуре в течение 30 минут.

Ферментативную реакцию в этом смешанном растворе инициировали путем прибавления 5 мкл 24,7 мкг/мл человеческого фактора Х (Enzyme Research Laboratories) и через две минуты прибавляли 5 мкл 0,5 М ЭДТА для остановки реакции. Цветную реакцию инициировали путем прибавления 5 мкл раствора окрашивающего субстрата. Через 20 минут проведения цветной реакции изменения в поглощении при длине волны 405 нм измеряли при использовании SpectraMax 340PC³⁸⁴ (Molecular Devices). Активности в отношении способствования образованию F.Xa указывали в виде значения, полученного путем вычитания поглощения реакционного раствора, свободного от антитела, из поглощения реакционного раствора, содержащего антитело.

ТВСР (TBSB, содержащий 93,75 мкМ раствора фосфолипида (SYSMEX СО.), 7,5 мМ CaCl ₂, и 1,5 мМ MgCl₂) использовали в качестве растворителя для человеческого фактора IXa Novact (зарегистрированный товарный знак) М и человеческого фактора X. Раствор окрашивающего субстрата S-2222 (CHROMOGENIX) растворяли в очищенной воде при концентрации 1,47 мг/мл и затем использовали в этом анализе.

Ингибиторное воздействие F.Хазы антитела также подвергали оценке при использовании описанных выше способов.

Активности в отношении способствования образованию F.Xa каждого из модифицированных биспецифических антител указаны на Фиг.4, а ингибиторное воздействие F.Хазы каждого из биспецифических антител являются представленными на Фиг.5.

Изобретатели в соответствии с настоящей заявкой получили Q85-G4k/J268-G4h/L406-k, Q85-G4k/J321-G4h/L334-k, Q64-z7/J344-z107/L406-k и Q64-z7/J326-z107/L334-k в качестве биспецифических антител с высокой активностью в отношении способствования образованию F.Xa и низким ингибиторным воздействием F-Хазы. Кроме того, они обнаружили Q64-z7 (SEQ ID NO: 10) и Q85-G4k (SEQ ID NO: 11) в качестве H цепи антитела против F.IXa человека и L334-k (SEQ ID NO: 30) и L406-k (SEQ ID NO: 33) в качестве совместно разделяемых L цепей антитела с повышенной активностью в отношении способствования образования F.Xa. Предполагается, что ингибиторное воздействия F.Хазы слегка повышалось, активности в отношении способствования образованию F.Xa повышались в значительной мере для Q85-G4k/J268-G4h/L406-k, Q85-G4k/J321-G4h/L334-k, Q64-z7/J344-z107/L406-k и Q64-z7/J326-z107/L334-k. Поскольку эти модифицированные антитела имели очень высокие активности в отношении способствования образованию F.Xa по сравнению с повышением ингибиторного воздействия F.Хазы, активности в отношении способствования образованию F.Xa и ингибиторное воздействие F.Хазы могут быть дополнительно разделены по сравнению с прототипными антителами. Таким образом, были обнаружены комбинации, которые супрессируют ингибиторное воздействие F.Хазы и повышают активности в отношении способствования образованию F.Xa.

В то время как более высокая активность в отношении способствования образованию F.Xa является предпочтительной для открытого прототипного антитела для функционального замещения F.VIII биспецифическими антителами, более низкое ингибиторное воздействие F.Хазы рассматривалось как благоприятное для клинического применения у пациентов, которые поддерживают функции F.VIII, или пациентов, которые получают лечение при использовании F.VIII композиции. Таким образом, были осуществлены дополнительные модификации для получения биспецифических антител, в которых ингибиторное воздействие F.Хазы не повышается, в то время как активность в отношении способствования образованию F.Xa дополнительно увеличивается.

В результате этого были получены Q153-G4k/J232-G4h/L406-k, Q354-z106/J259-z107/L324-k, Q360-G4k/J232-G4h/L406-k, Q360-z118/J300-z107/L334-k, Q405-G4k/J232-G4h/L248-k, Q458-z106/J346-z107/L408-k, Q460-z121/J327-z119/L334-k, Q499-z118/J327-z107/L334-k, Q499-z118/J327-z107/L377-k, Q499-z118/J346-z107/L248-k, Q499-z121/J327-z119/L404-k, Q499-z121/J339-z119/L377-k и Q153-G4k/J142-G4h/L180-k в качестве биспецифических антител с высокой активностью в отношении способствования образованию F.Xa и низким ингибиторным воздействием F.Хазы. Кроме того, изобретатели обнаружили Q153-G4k (SEQ ID NO: 12), Q354-z106 (SEQ ID NO: 13), Q360-G4k (SEQ ID NO: 14), Q360-z118 (SEQ ID NO: 15), Q405-G4k (SEQ ID NO: 16), Q458-z106 (SEQ ID NO: 17), Q460-z121 (SEQ ID NO: 18), Q499-z118 (SEQ ID NO: 19) и Q499-z121 (SEQ ID NO: 20) в качестве H цепи антитела против F.IXa человека, J232-G4h (SEQ ID NO: 21), J259-z107 (SEQ ID NO: 22), J300-z107 (SEQ ID NO: 23), J327-z107 (SEQ ID NO: 24), J327-z119 (SEQ ID NO: 25), J339-z119 (SEQ ID NO: 26), J346-z107 (SEQ ID NO: 27), J142-G4h (SEQ ID NO: 170) в качестве H цепи антитела против F.X человека с повышенной активностью в отношении способствования образованию F.Xa, и L248-k (SEQ ID NO: 28), L324-k (SEQ ID NO: 29), L377-k (SEQ ID NO: 31), L404-k (SEQ ID NO: 32), L408-k (SEQ ID NO: 34), и L180-k (SEQ ID NO: 171) в качестве совместно разделяемых L цепей антитела.

Поскольку эти антитела имеют очень высокие активности в отношении способствования образованию F.Xa, в то время как имеют супрессированное ингибиторное воздействие F-Хазы, они могут обладать очень полезными свойствами для пациентов, поддерживающих функцию F.VIII, которые получают лечение при использовании F.VIII композиции. Поскольку антитела имеют длительные периоды полураспада и могут вводиться подкожно, эти биспецифические антитела могут иметь огромную ценность для пациентов с гемофилией A по сравнению с существующей замещающей терапией путем внутривенного введения существующих F.VIII композиций для лечения гемофилии A.

Сравнение последовательностей вариабельных участков каждой из цепей, используемых в Примере 1 и Примере 2, является представленным на Фиг.6A-D. Например, для повышения активности в отношении способствования образованию F.Xa биспецифического антитела следующие аминокислоты были определены как важные: в H цепи антитела против F.IXa человека изолейцин в положении 34, аспарагин, глутамин, или серин в положении 35, серин в положении 49, аргинин в положении 61, глутаминовая кислота в положении 62, серин или треонин в положении 96, лизин или аргинин в положении 98, серин или глутаминовая кислота в положении 99, фенилаланин или тирозин в положении 100, глицин в положении 100b, тирозин в положении 102, и другие; в H цепи антитела против F.X человека аспарагиновая кислота в положении 35, аргинин в положении 53, лизин в положении 73, глицин в положении 76, лизин или аргинин в положении 96, тирозин в положении 98, тирозин в положении 100, гистидин в положении 100a и другие; в совместно разделяемой L цепи антитела лизин или аргинин в положении 27, глутаминовая кислота в положении 30, аргинин в положении 31, глутамин в положении 32, аргинин или глутамин в положении 50, серин в положении 52, аргинин в положении 53, лизин в положении 54, глутаминовая кислота в положении 55, серин в положении 92, серин в положении 93, пролин в положении 94, пролин в положении 95, и другие (аминокислоты вариабельного участка являются пронумерованными в соответствии с нумерацией Кабат (Kabat EA и др. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH).

Промышленная применимость

Настоящее изобретение обеспечивает мультиспецифические связывающие антиген молекулы, которые имеют высокую активность функционального замещения F.VIII, представляющие собой антитела, которые узнают как фермент, так и его субстрат. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает мультиспецифические связывающие антиген молекулы с высокой активностью функционального замещения F.VIII и низким ингибиторным воздействием F.Хазы, где антитела узнают как фермент, так и его субстрат.

Поскольку гуманизированные антитела могут в общем случае иметь высокую стабильность в крови и низкую иммуногенность, мультиспецифические антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть весьма многообещающими.