антибактериальная композиция, содержащая 4- изопропил-3- метилфенол и ионы цинка

Формула изобретения

1. Антибактериальная композиция для ухода за полостью рта, содержащая антибактериальную систему, включающую 4-изопропил-3-метилфенол (IPMP), источник ионов цинка и С_8-18алкилсульфат щелочного металла, или С_8-18алкиларилсульфонат щелочного металла, или их смесь и перорально приемлемый носитель или эксципиент, и где pH композиции составляет от 5,5 до 7,5.

2. Композиция по п.1, где С_8-18алкилсульфат щелочного металла или С_8-18алкиларилсульфонат щелочного металла представляет собой или SDDBS (додецилбензолсульфонат натрия) или SLS (лаурилсульфат натрия), или их смесь.

3. Композиция по п.1, где источник ионов цинка выбран из хлорида цинка, цитрата цинка, ацетата цинка, сульфата цинка, глюконата цинка, салицилата цинка, лактата цинка, малата цинка, малеата цинка, тартрата цинка, карбоната цинка, фосфата цинка, оксида цинка или сульфата цинка.

4. Композиция по п.1, где IPMP присутствует в количестве от 0,01% до 1,0% по массе от общей массы композиции.

5. Композиция по п.1, где С_8-18алкилсульфат щелочного металла или С _8-18алкиларилсульфонат щелочного металла, или их смесь присутствует в количестве от 0,1% до 15% по массе от общей массы композиции.

6. Композиция по п.1, где цинк, являющийся частью соли, представляющей собой источник ионов цинка, присутствует в количестве от 0,01% до 2,5% по массе от общей массы композиции.

7. Композиция по п.1, содержащая источник фторид-ионов.

8. Композиция по п.7, где источник фторид-ионов представляет собой фторид натрия.

9. Композиция по любому из пп.1-8 в форме зубной пасты.

Описание изобретения к патенту

Данное изобретение относится к композиции, содержащей антибактериальную систему, включающую 4-изопропил-3-метилфенол (IPMP), источник ионов цинка и анионное поверхностно-активное вещество. Подходящие композиции включают дезинфицирующие композиции, фармацевтические композиции или композиции для личной гигиены для ухода за полостью рта, горла и кожей. Особый интерес представляют собой композиции по уходу за полостью рта, содержащие антибактериальную систему, которые применяются в поддержании здоровых десен и зубов и являются полезными в борьбе (то есть способствуют предупреждению, подавлению и/или лечению) с состояниям здоровья полости рта, вызванным или осложненным присутствием бактерий, имеющихся в полости рта. Такие условия включают периодонтальные (десневые) заболевания, зубной кариес (кариозный распад зубов), галитоз (неприятный запах изо рта), зубной налет и зубной камень.

Несколько сотен видов бактерий вместе с некоторыми видами грибов, вирусов и иногда простейшими образуют микрофлору полости рта, наиболее явно видную в виде зернистых, не совсем белых отложений, обнаруживаемых на поверхностях зубов, - который известен как зубной налет. Большую часть времени микрофлора полости рта существует в здоровой и стабильной взаимосвязи с хозяином и даже может приносить пользу, предоставляя защиту - называемую сопротивлением колонизации - против заселения полости рта потенциально патогенными микроорганизмами, которые постоянно попадают при приеме пищи. Однако микрофлора полости рта также представляет собой этиологический агент двух самых распространенных заболеваний, поражающих человека - зубного кариеса (кариозного распада зубов) и периодонтальных (десневых) заболеваний.

Зубной кариес является результатом многократного потребления сахара при еде, который превращается рядом бактерий полости рта (особенно членами группы бактерий Streptococcus и, в частности Streptococcus mutans), находящимися на зубных поверхностях, в молочную кислоту, которая деминерализует зубную эмаль.

Периодонтальные заболевания, напротив, являются результатом накопления зубного налета на десневом крае и ассоциированы с увеличением в количественных отношениях некоторых компонентов микрофлоры (особенно анаэробных бактерий). Такая увеличенная масса налета провоцирует иммунный ответ хозяина, вызывая воспаление десневых тканей, которое может включать кровотечение. Это называется гингивитом. Гингивит может приводить к образованию десневого кармана, когда большее количество бактерий может накапливаться в кармане между зубом и воспаленной десной. Если его оставить без контроля, то такой поддесневой налет может приводить к развитию более серьезного заболевания десен - периодонтита, - что в конечном итоге может приводить к потере зуба. Другие побочные продукты микрофлоры полости рта могут приводить к неприятному запаху изо рта - обычному, но социально мучительному состоянию. Бактериальный налет может более прочно прикрепляться и отвердевать на зубных поверхностях, образуя зубной камень. Диетические компоненты, такие как кофе, чай и красное вино, могут затем послужить причиной окрашивания такого камня неприглядным образом.

Как следует из вышеприведенного обсуждения, полное удаление микрофлоры полости рта является невыполнимым и нежелательным. Вместо этого методы нацелены на регулярную очистку полости рта для снижения количеств зубного налета или на сдерживание возобновления роста или развития микрофлоры в полости рта так, чтобы она находилось в состоянии, совместимом со здоровьем зубов и десен.

Регулярная механическая очистка зубов щеткой является ключом для снижения количества зубного налета и тем самым поддержания здоровья десен. В течение многих лет рекомендовалось применение химических агентов в качестве дополнения к такому физико-механическому контролю налета. Химический контроль налета усиливает механический контроль налета посредством непосредственного умерщвления бактерий налета, подавления возобновления роста налета, снижения метаболической активности налета или посредством комбинации всех трех механизмов. Таким образом, налет можно поддерживать на уровнях, которые совместимы со здоровьем десен. При отсутствии проблемы увеличенного десневого налета, десневой край может оставаться плотным, тем самым обеспечивая защиту поддесневых частей зубов и других тканей. Таким образом можно избежать целого ряда эффектов, потенциально вредных для здоровья полости рта.

Соответственно, становится очень желательным включать в продукт для ухода за здоровьем полости рта вещества, которые убивают, подавляют или замедляют рост или метаболизм бактерий, обнаруживаемых в полости рта.

Антибактериальные агенты часто обнаруживают в продуктах ухода за здоровьем полости рта. Обычно включают катионные соединения хлоргексидин, бензалкония хлорид и цетилпиридиния хлорид. Неионогенные соединения включают галогенированные дифенилэфирные соединения, такие как триклозан, галогенированные карбанилиды, такие как трихлоркарбанилид, и фенольные соединения, такие как тимол, IPMP (также известный как 4-изопропил 3-метилфенол, биосол или ларатимол), и их смеси.

Композиции по уходу за здоровьем полости рта, содержащие источник ионов цинка, также известны для применения в улучшении здоровья десен и борьбе с неприятным запахом изо рта.

В JP2006176416 (Lion Corporation) описана композиция по уходу за полостью рта, содержащая IРМР и несущее ион металла цеолитное абразивное вещество. Такие композиции демонстрируют высокие стерилизационные эффекты, в частности в отношении бактериального налета, обнаруживаемого в полости рта.

В US 4022880 (Vinson et аl.) описана композиция для подавления зубного налета и образования камня, включающая композицию, содержащую источник ионов цинка и нетоксичный органолептически приемлемый антибактериальный агент. Применение IРМР не описано.

В GB 1373003 (Unitever Ltd.) описана и заявлена композиция зубной пасты, обладающая активностью против налета и камня, содержащая труднорастворимую в воде цинковую соль и поверхностно-активную смесь алкилсульфата щелочного металла либо с алкарилсульфонатом щелочного металла, либо с сульфонатом алкилового эфира щелочного металла. Такие композиции демонстрируют пониженные вяжущие свойства.

В US 5316758 (Morishima et аl.) описана композиция по уходу за полостью рта, которая демонстрирует эффекты подавления зубного налета и предупреждения гингивита, содержащая неионогенный противомикробный агент (такой как триклозан, тимол или IPMP) и некоторые амфотерные поверхностно-активные агенты. Было показано, что такие композиции остаются во рту в течение длительных периодов.

В US 2008/0253976 (Procter & Gambte) описаны композиции для индивидуального ухода за полостью рта, горла и кожей, содержащие смесь первого компонента, выбранного из цитраля, нераля, гераниаля, гераниола и нерола, и второго компонента, выбранного из эвкалиптола, эвгенола и карвенола, где смесь описана как демонстрирующая как антибактериальную, так и противовоспалительную активности, и, как утверждается, особенно эффективна против воспалительных заболеваний, опосредованных бактериями, таких как гингивит.Возможно смесь может также содержать дополнительные противомикробные и/или противовоспалительные компоненты, включая, среди многих других потенциальных агентов IРМР.

В US 2007/0053849 (Procter & Gambte) описаны местные композиции по уходу за полостью рта, содержащие комбинацию противовоспалительного агента с антибактериальным агентом. Примеры противовоспалительных агентов включают витаминные соединения; куркуминоиды; масла и экстракты из специй и растительного сырья; масла и экстракты из тимьяна, орегано и шалфея; масло мелии; флавоноиды и флавоны; и фенольные соединения из растительных источников. Примеры антибактериальных агентов включают цетилпиридиния хлорид, агент на основе ионов двухвалентного олова, агент на основе ионов цинка, агент на основе ионов меди, агент на основе ионов железа, триклозан, аскорбилстеарат, олеоилсаркозин, диоктилсульфосукцинат, алкилсульфат и их смеси. Применение IPMP не описано.

В настоящее время обнаружено, что композиция, содержащая IРМР, источник ионов цинка и анионное поверхностно-активное вещество, имеет улучшенную антибактериальную активность по сравнению с композициями, содержащими один агент IPMP, источник ионов цинка или анионное поверхностно-активное вещество.

Без привязки к теории, считается, что анионное поверхностно-активное вещество увеличивает проницаемость клеточной стенки бактерий в полости рта, позволяя таким бактериям захватывать IPMP и ионам цинка, что приводит к их гибели или замедляет их рост или метаболизм.

Кроме того, было обнаружено, что композиция, содержащая IРМР, обладает значительной противовоспалительной активностью, которая усиливается в результате присутствия источника ионов цинка.

Согласно настоящему изобретению предлагается композиция, содержащая антибактериальную систему, включающую IРМР, источник ионов цинка и анионное поверхностно-активное вещество.

В одном воплощении композиция по настоящему изобретению представляет собой дезинфицирующую композицию.

В другом воплощении композиция по настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

Подходящие фармацевтические лекарственные формы для перорального введения включают таблетки и капсулы. Подходящие фармацевтические лекарственные формы для местного введения включают крема и мази, которые можно наносить на кожу.

Примеры фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов описаны в Handbook of Pharmaceutical Excipients (например Fourth Edition, 2003, опубликованный Pharmaceuticat Press).

В другом воплощении композиция по настоящему изобретению представляет собой композицию для индивидуального ухода за полостью рта, горлом или кожей, содержащую носитель или эксципиент, приемлемый для применения в индивидуальном уходе. Примеры подходящих лекарственных форм для индивидуального ухода и носителей или эксципиентов описаны в US 2008/0253976 (Procter & Gambte), содержание которого включено в данное описание изобретения посредством ссылки.

В предпочтительном воплощении композиция по настоящему изобретению представляет собой композицию по уходу за полостью рта, содержащую перорально приемлемый носитель или эксципиент.

Композиции по настоящему изобретению показывают особенно хорошую бактериальную гибель организмов, наиболее часто обнаруживаемых в полости рта, как показано данными ниже.

Следовательно, такие композиции по уходу за полостью рта являются полезными в сохранении здоровых десен и зубов и полезны в противодействии состояниям здоровья в полости рта, вызываемым или обостряемым присутствием бактерий, находящихся в полости рта. В частности, композиции по уходу за полостью рта по настоящему изобретению могут содействовать поддержанию десен плотно прижатыми к зубам, тем самым блокируя бактерии налета и защищая зубы выше и ниже поверхности десен, то есть обеспечивая полную защиту зубов.

Кроме того, композиции по изобретению помогают предупреждать или удалять осажденные на поверхности пятна с естественных зубов и зубных протезов.

Дополнительное выгодное свойство композиций по изобретению включает противодействие галитозу (неприятный запах изо рта или неприятное дыхание), который возникает в полости рта.

Подходящим образом IРМР присутствует в количестве от 0,01% до 1,00%, например от 0,04 до 0,20% или от 0,05% до 0,10% по массе от общей массы композиции.

Подходящим образом источник ионов цинка, определенный как доля цинка в соответствующей соли, присутствует в количестве от 0,01% до 2,50%, например от 0,04% до 0,70% по массе от общей массы композиции.

Подходящим образом источник ионов цинка представляет собой цинковую соль, такую как хлорид цинка, цитрат цинка, ацетат цинка, сульфат цинка, глюконат цинка, салицилат цинка, лактат цинка, малат цинка, малеат цинка, тартрат цинка, карбонат цинка, фосфат цинка, оксид цинка или сульфат цинка. Дополнительные цинковые соли упоминаются в указанном выше патенте Vinson et al. (US 4022880).

Предпочтительная цинковая соль представляет собой хлорид цинка.

Композиции по настоящему изобретению могут содержать буферный агент, который может образовывать комплекс с ионами цинка, таким образом содействуя уменьшению любых нежелательных взаимодействий с эксципиентами композиции, которые в противном случае могли бы снижать доступность ионов цинка. Примеры таких буферизующих агентов включают буфер лимонная кислота/цитрат натрия. Подходящим образом они присутствуют в количестве, которое обеспечивает значение рН композиции по настоящему изобретению менее рН 7,5, например менее рН 6,5.

Подходящим образом анионное поверхностно-активное вещество присутствует в количестве от 0,1% до 15%, например от 0,5% до 2,5% или, например, от 0,75% до 2,0% по массе от общей массы композиции.

Подходящие примеры анионных поверхностно-активных веществ включают С _8-18 алкилсульфаты щелочных металлов (например лаурилсульфат натрия, SLS), С_8-18 алкиларилсульфонаты щелочных металлов (например додецилбензолсульфонат натрия, SDDBS), соль щелочных металлов сульфированных моноглицеридов С_8-18 алкилжирных кислот (например кокосовый моноглицерид сульфоната натрия), С _8-18 алкилсульфоацетаты щелочных металлов (например лаурилсульфоацетат натрия) и саркозинатные, изетионатные и тауратные соли щелочных металлов, такие как лаурилсаркозинат натрия, лауроилсаркозинат натрия, миристоилсаркозинат натрия, пальмитоилсаркозинат натрия, стеароилсаркозинат натрия, олеоилсаркозинат натрия и лауроилизетионат натрия.

Подходящим образом анионное поверхностно-активное вещество представляет собой С_8-18 алкилсульфат щелочного металла, С_8-18 алкиларилсульфонат щелочного металла или саркозинат щелочного металла или их смесь.

Наиболее подходящие анионные поверхностно-активные вещества для применения по настоящему изобретению представляют собой SDDBS, SLS, лаурилсаркозинат натрия и их смеси, предпочтительно в суммарной концентрации от 0,1% до 2,5%, более предпочтительно от 0,5% до 2.0%, еще более предпочтительно от 1,0% до 1,5% по массе от общей массы композиции.

Подходящим образом рН композиции составляет от рН 5,0 до 8,0, например от 5,0 до 7,5, например от 5,5 до 6,5.

В дополнение к вышеуказанным ингредиентам, композиции по настоящему изобретению могут содержать один или более активных агентов, обычно применяемых в композициях зубных паст, например источник фторида, десенсибилизирующий агент, агент против налета; агент против камней, отбеливающий агент, агент против неприятного запаха изо рта, противовоспалительный агент, антиоксидант, противогрибковый агент, ранозаживляющий агент или смесь по меньшей мере двух из них. Такие агенты могут быть включены в концентрациях, обеспечивающих желательный терапевтический эффект.

Подходящие источники фторид-ионов для применения в композициях по настоящему изобретению включают фторид щелочного металла, такой как фторид натрия, монофторфосфат щелочного металла, такой как монофторфосфат натрия, фторид олова, или аминный фторид в количестве, обеспечивающем от 25 до 3500 млн^-1 фторид-ионов, предпочтительно от 100 до 1500 млн^-1. Обычным источником фторида является фторид натрия, например, композиция может содержать от 0,1 до 0,5% по массе фторида натрия, например 0,204% по массе (что равно 927 млн^-1 фторид-ионов), 0,2542% по массе (что равно 1150 млн^-1 фторид-ионов) или 0,315% по массе (что равно 1426 млн^-1 фторид-ионов).

Такие фторид-ионы способствуют стимулированию реминерализации зубов и могут повышать устойчивость к кислотам твердых тканей зубов для борьбы с кариесом, патологической стираемостью зубов (то есть кислотным износом) и/или износом зубов.

Для лечения повышенной чувствительности зубов композиции по настоящему изобретению могут содержать десенсибилизирующий агент. Примеры десенсибилизирующих агентов включают агент, блокирующий канальцы, или агент, десенсибилизирующий нерв, и их смеси, например, как описано в W002/15809 (Block). Примеры десенсибилизирующих агентов включают соль стронция, такую как хлорид стронция, ацетат стронция или нитрат стронция, или соль калия, такую как цитрат калия, хлорид калия, бикарбонат калия, глюконат калия и особенно нитрат калия.

Десенсибилизирующий агент, такой как калиевая соль, обычно составляет от 2% до 8% от общей массы композиции, можно использовать, например, 5% по массе нитрата калия.

Композиции по настоящему изобретению могут содержать отбеливающий агент, например выбранный из полифосфата, например триполифосфат натрия (STP), и/или любое присутствующее дополнительное кремниевое абразивное вещество может иметь превосходные очищающие свойства. STP может присутствовать в количестве от 2% до 15%, например от 5% до 10% по массе от общей массы композиции. Примеры превосходно очищающих кремниевых абразивных веществ включают такие присутствующие на рынке вещества, как Zeodent 124, Tixosil 63, Sorbosil AC39, Sorbosil AC43 и Sorbosil AC35, которые могут присутствовать в подходящих количествах, например вплоть до 20%, например от 5 до 15% по массе от общей массы композиции.

Композиции по настоящему изобретению содержат дополнительные препаратообразующие агенты, такие как абразивные вещества, загустители, увлажнители, вкусоароматизаторы, подсластители, опалесцирующие или красящие агенты, консерванты и воду, выбранные из обычно применяемых для этих целей в области композиций для гигиены полости рта.

Чтобы способствовать пенообразующим свойствам композиции, в дополнение к анионному поверхностно-активному веществу можно использовать цвиттер-ионные, амфотерные и неионные или низкоионные поверхностно-активные вещества.

Примеры амфотерных поверхностно-активных веществ включают длинноцепочечные алкил-бетаины, такие как продукт, продаваемый под торговой маркой "Empigen ВВ" от Albright & Witson, длинноцепочечные алкил-амидоалкилбетаины, такие как кокамидопропилбетаин, алкил-амфо-(ди)ацетаты или низкоионные поверхностно-активные вещества, такие как метилкокоилтаурат натрия, который продается под торговой маркой Adinol CT в Croda, или смесь по меньшей мере двух из них.

Подходящим образом дополнительное поверхностно-активное вещество или поверхностно-активные вещества присутствует/присутствуют в интервале от 0,1% до 15%, например от 0,5% до 10% или от 1,0% до 5% по массе от общей массы композиции.

Подходящие увлажнители для применения в композициях по изобретению включают глицерин, ксилитол, сорбитол, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль, или смеси по меньшей мере двух из них; где увлажнитель может присутствовать в интервале от 10% до 80%, например от 20% до 70%, или от 30% до 60% по массе от общей массы композиции.

Композиции согласно настоящему изобретению можно приготовить посредством смешивания ингредиентов в подходящих относительных количествах в любом порядке, который является удобным, и, если необходимо, регулирования рН для получения конечного желательного значения.

рН измеряют, когда композиция суспендирована с водой в массовом отношении композиции к воде 1:3.

Понятно, что композиции по настоящему изобретению можно также применять вне полости рта для очистки зубных протезов и подобного.

Пероральную композицию по настоящему изобретению обычно готовят в форме зубных паст, спреев, жидкостей для полоскания рта, гелей, леденцов, жевательных резинок, таблеток, пастилок, растворимых порошков, пероральных полосок, трансбуккальных пластырей, раневых повязок, зубных адгезивов и тому подобного.

Когда композиция представлена в форме зубной пасты, она подходит для содержания в многослойной тубе или насосе, которые обычно используют в данной области техники, и дозирования из них. Дополнительные примеры могут включать системы доставки мешочек-в-баллоне или мешочек-на-клапане, в которых используют пенообразующий агент, такой как пентан или изопентан.

Обычный способ изготовления композиции по данному изобретению включает смешивание ингредиентов подходящим образом в вакууме вплоть до получения гомогенной смеси и регулирование рН, если это необходимо.

Далее изобретение будет описано посредством следующих неограничивающих примеров.

Пример 1

Противомикробное тестирование

Тест на МIС (минимальная ингибирующая концентрация)

Метод

МIС композиции веществ определяли следующим методом.

Свежую культуру тестируемого инокулята каждой бактерии разбавляли стерильным 0,1% специальным пептонным раствором для получения концентрации приблизительно 10⁶ колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл. Тестируемые образцы вещества разбавляли стерильным триптон-соевым бульоном (TSB) с получением исходного раствора, обычно 1% или 2% (10000 или 20000 млн^-1). Однако очевидно, что концентрация исходного раствора вещества при желании может варьироваться, чтобы исследовать другой интервал концентраций. Каждый ряд стандартного 96-луночного пластмассового микротитрационного планшета (маркированный А-Н) выделяли для одного образца, то есть восемь образцов на планшет. Ряд Н содержал только TSB для применения в качестве бактериального контроля для указания степени помутнения, возникающей в результате бактериального роста в отсутствие какого-либо тестируемого вещества.

200 мкл исходного разведения вещество асептически переносили в 1-ую и 7-ую лунку соответствующего ряда. Все другие тестируемые лунки наполняли 100 мкл стерильного TSB, используя 8-канальную микропипетку. Содержимое каждой лунки в колонке 1 перемешивали всасыванием образцов вверх и вниз в наконечниках пипетки, затем 100 мкл переносили в колонку 2.

Те же самые стерильные наконечники пипетки использовали для переноса 100 мкл из каждой лунки в колонке 7 в соответствующую лунку в колонке 8. Затем этот комплект из восьми наконечников сбрасывали в дезинфицирующий раствор. Используя восемь свежих стерильных наконечников, процесс повторяли путем переноса 100 мкл из колонки 2 в колонку 3 (и в 8 и 9). Процесс продолжали, пока все лунки в колонках 6 и 12 не содержали по 200 мкл. После перемешивания в колонках 6 и 12 100 мкл отбрасывали из лунок в отходы. Наконец добавляли 100 мкл предварительно разбавленной бактериальной тестируемой культуры (приблизительно 10⁶ КОЭ/мл), получая, таким образом, конечный объем 200 мкл в каждой лунке.

"Холостой" планшет получали для каждого набора из восьми образцов точно таким же образом, за исключением того, что вместо бактериальной культуры добавляли 100 мкл стерильного TSB. Данный планшет использовали в качестве контрольного планшета, относительно которого можно было считывать тестируемый(е) планшет(ы).

Затем тестируемые и контрольные планшеты герметично закрывали, используя автоклавную ленту, и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Лунки исследовали через 24 часов в отношении помутнения для определения того, подавляло вещество рост или нет. Затем планшеты считывали в подходящем считывающем устройстве для микротитрационных планшетов, измеряя поглощение на длине волны 540 нм в качестве меры помутнения в результате бактериального роста. Контроль, неинокулированный планшет для каждого набора образцов, считывали первым, а затем считывающее устройство для планшетов программировали, чтобы использовать контрольные считывания относительно холостого для всех других считываний планшетов для инокулированных планшетов с теми же самыми наборами тестируемых веществ (то есть, исключая помутнение из-за вещества и возможные цветовые изменения во время инкубирования). Таким образом, полученные скорректированные считывания являлись показателями поглощения в результате помутнения из-за бактериального роста.

Результаты теста на МIС

Организм	MIC (частей на миллион)
	IРМР	SDDBS	глюконат Zn
Streptococcus mufans	1250	10	6250
Staphylococcus aureus	156	20	6250
Escherichia соli	312	625	1560

Результаты теста на МIC представлены выше и показывают, что все протестированные агенты обладают некоторыми присущими им противомикробными эффектами. Эти эффекты значительно варьируются среди разных бактериальных штаммов, причем S.mutans и S.aureus являются очень чувствительными к поверхностно-активному веществу SDDBS, но относительно толерантным к IРМР и цинку. Напротив, E.соli является относительно нечувствительной к действиям SDDBS, но более восприимчивой к IРМР и цинку.

Тестирование суспензии на время гибели микробов

Способ, описанный в данном описании изобретения, позволяет оценивать противомикробную эффективность in vitro посредством тестирования суспензии на время гибели микробов. Суспензию тестируемого организма в присутствии или в отсутствие раствора интерферирующих веществ добавляют к образцу продукта, который был разбавлен в жесткой воде. Смесь поддерживают при 20°С или других температурах, подходящих для использования продукта. После подходящего времени контакта отбирают аликвоту тестируемой смеси. Противомикробную активность аликвоты сразу же нейтрализуют способом разведения-нейтрализации. Подсчитывают число выживших организмов из тестируемой смеси и из суспензии тестируемого организма и рассчитывают уменьшение количества жизнеспособных микроорганизмов.

Вещества

5% об./об. кровяного агара (ВА) (для Streptococcus mutans, Actinomyces viscosus и Fusobacterium nucleatum)

Триптон-соевый агар (для Escherichia coli, Staphylococcus aureus)

Разбавитель - 0,1% пептон,

Среда для нейтрализации - летиновый бульон

Жесткая вода (375 млн^-1 в виде СаСО₃)

Раствор А

Растворяют 19,84 г безводного МgCl ₂ и 43,24 г безводного СаСl₂ в очищенной воде и доводят до 1 литра, используя мерную колбу.

Раствор В

Растворяют 35,02 г NaHCO₃ в очищенной воде и разбавляют до 1 л, используя мерную колбу.

К 600 мл очищенной воды добавляют 6 мл раствора А и 8 мл раствора В. Разбавляют до 1 л, используя мерную колбу. Стерилизуют итоговый раствор пропусканием его через мембранный фильтр с эффективным размером пор 0,45 мкм. Конечный рН раствора должен быть равен 7,0±0,2 при 25°С и регулируется, если необходимо, с использованием 0,5 М НСl или 0,5 М NaOH.

Условия тестирования

Растворяют 3 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) (Sigma, A-3425) в 100 мл очищенной воды. Стерилизуют пропусканием через мембранный фильтр с эффективным размером пор 0,45 мкм.

Получение тестируемых культур

Из рабочих культур, хранящихся при 2-8°С, первичные культуры Streptococcus mutans, Escherichia coli, Actinomyces viscosus и Fusobacterium nucleatum и Staphylococcus aureus) выращивают на скосах подходящего агара.

Переносят несколько петель роста из вторичной культуры в подходящий разбавитель (0,1% пептон или другие) и гомогенизируют перемешиванием на вортексе. Регулируют концентрацию полученной суспензии так, чтобы оптическая плотность раствора при 550 нм равнялась приблизительно 0,2.

Получают ряд десятичных серийных разведений тестируемых суспензий (используя 0,1% пептон) от 1:10 до 1:100000. Подсчеты планшета-дубликата выполняют посредством посева заливкой (S.auresus) или посева размазыванием (S.mutans, F.nucleatum, A.viscosus) 0,1 мл аликвот соответствующих разведений. Планшеты инкубируют в течение подходящих периодов (приблизительно 24 часов для S.aureus, E.coli; приблизительно 72 часов для S.mutans, F.nucleatum, и A.viscosus). После инкубирования подсчитывают каждый планшет для расчета и регистрируют среднее значение КОЭ/мл исходной суспензии.

Образцы и зубные пасты тестируют при разведении ¼ (25% масс./масс.). Сначала образцы или зубные пасты готовят в жесткой воде в концентрации в 1,25 раза больше, чем требуется в данном тесте. Это обеспечивает возможность разведения продукта, происходящего во время тестирования. Образцы готовят в стерильных контейнерах, и следует приготовить объем, достаточный для тестирования каждого организма (8 мл на организм).

Оценку микробиоцидной активности выполняют при комнатной температуре, приблизительно 20+/-2°С, добавляют 1 мл суспензии тестируемого организма к 1 мл искусственной слюны и затем перемешивают на вортексе в течение 5 секунд. Отставляют приблизительно на 2 минуты. Добавляют 8 мл тестируемого продукта, включают таймер и немедленно перемешивают на вортексе в течение 5 секунд. После подходящего времени контакта (30 секунд или 120 секунд) отбирают аликвоту объемом 1 мл и добавляют к 9 мл среды для нейтрализации с получением разведения 1:10. Это разведение перемешивают на вортексе в течение 5 секунд и оставляют для нейтрализации в течение по меньшей мере 5 минут. Кроме того, готовят серийные разведения нейтрализованной смеси - 1 мл в 9 мл, и 0,1 мл аликвоты распределяют соответствующим образом в чашки с посевом заливом (Е.соli, S.aureus), или в чашки с посевом размазыванием (F.nucleatum, S.mutans, A.viscosus). После соответствующего инкубирования регистрируют количество бактерий на планшетах, в идеале при разведениях 30-300 колоний на планшет с агаром. Все эксперименты следует повторить с независимо полученными бактериальными суспензиями.

Для подтверждения процесса нейтрализации получают серийные разведения 1:10 тестируемых организмов с получением концентрации приблизительно 10⁵ КОЭ/мл. К 8 мл "Тестируемого Образца" добавляют 1 мл стерильной очищенной воды и 1 мл синтетической слюны. Это "раствор для подтверждения". 1 мл воды добавляют к 9 мл среды для нейтрализации (положительный контроль) и 1 мл "раствора для подтверждения" - к другим 9 мл среды для нейтрализации (тест). Через приблизительно 5 минут нейтрализации в каждый добавляют 0,1 мл разбавленной суспензии тестируемого организма, и смеси перемешивают на вортексе и оставляют по меньшей мере на 5 минут. Нейтрализованную смесь разбавляют 1:10 в разбавителе и подсчеты планшета-дубликата выполняли как для неразбавленного, так и для разведения 1:10, используя подходящий агар и условия инкубирования. После инкубирования подсчитывают каждый планшет и регистрируют среднее значение КОЭ/мл присутствующего организма. Нейтрализацию считают подтвержденной, если подсчеты контроля и теста находятся в пределах 0,3 Log10 КОЭ/мл друг от друга. Если нейтрализация не является подтвержденной, разведение может быть увеличено до 1 в 100.

Среднее количество выживших организмов рассчитывают для каждого тестируемого и соответствующего контрольного образцов, и выражают в виде Log с основанием 10 (Log счет). Когда планшеты не имеют выживших организмов, для расчета принимают, что счет имеет в таком разведении 0,5 колоний. Затем рассчитывают "lоg гибель" вычитанием log выживших организмов тестируемого раствора из log счета необработанного контрольного раствора. Данные представлены ниже. Среднее значение log гибели определяют как среднее значений log гибели, определенных в независимых экспериментах.

В анализе времени гибели микробов вещества тестировали как по отдельности, так и в различных комбинациях. В данных тестах использовали ряд микроорганизмов, включающий организмы, типичные для зубного налета (Streptococcus mutans, Fusobacterium nucleatum, Actinomyces viscosus) и стандартные эталонные организмы (Escherichia соli и Staphylococcus aureus), типичные фекальные или кожные бактерии, соответственно.

Данные по времени гибели микробов в 30 с и 120 с для каждого организма показаны по очереди на Фиг.1 для Streptococcus mutans, Fusobacterium nucleatum и Actinomyces viscosus и для Escherichia соli и Staphylococcus aureus на Фиг.2.

Данные по времени гибели микробов

Данные представлены для трех организмов полости рта: F.nucleatum, S.mutans, A.viscosus (Фиг.1) и для двух стандартных организмов Е.соli. S.aureus (Фиг.2). Тестировали следующие растворы:

IPMP 1/4 разведение 0,1% масс./масс. в 10% этаноле

SDDBS 1/4 разведение 1% масс./об. вод.

Глюконат цинка 1/4 разведение 1,25% масс./об. вод.

Описание графических материалов

Фиг.1. Время гибели бактерий

Фиг.2. Время гибели бактерий

Фиг.3. Время гибели Streptococcus mutans: SLS против зубной пасты SDDBS/SLS/IPMP/хлорид цинка

Фиг.4. Время гибели Streptococcus mutans: SLS против SLS/IPMP против зубной пасты SLS/IPMP/цитрат цинка

Результаты

Фиг.1.

Для A.viscosus результаты как для IPMP, так и цинка по отдельности демонстрируют гибель <0,5 log во всех случаях. SDDBS продемонстрировал значительную гибель >3 log единиц как в 30 с, так и в 120 с. Комбинация IPMP/Zn/SDDBS вызывала гибель >4 log единиц как в 30 с, так и в 120 с (Фиг.1).

Для одного F.nucleatum IPMP продемонстрировал ограниченные эффекты. Как цинк (гибель примерно 1 log), так и SDDBS (гибель вплоть до >3 log) продемонстрировали значительные эффекты. Комбинация трех агентов также вызывала максимальную гибель, при этом более высокий уровень IPMP в комбинации с SDDBS/цинк вызывал максимальную гибель даже в более короткий момент времени чем 30 с (Фиг.1).

Для S.mutans как IPMP, так и цинк вызывали незначительную гибель (<0,5 log единиц). SDDBS вызывал очень высокие уровни гибели, демонстрируя максимальную гибель >5 log в момент времени 120 с. Тройная комбинация IPMP(0,1%)/Zn/SDDBS продемонстрировала наилучший эффект (>4,5 log гибели) (Фиг.1).

Фиг.2

Для E.соli ни один из трех агентов по отдельности не вызывал высоких уровней гибели микробов (гибель <0,3 log единиц во всех случаях). Тройная комбинация, напротив, продемонстрировала синергетические эффекты, особенно с более высоким уровнем IPMP в комбинации со смесью SDDBS/цинк, продемонстрировав гибель 1,3 log единиц в 30 с и почти 2 log единиц в 120 с (Фиг.2).

Для S.aureus как один IPMP (при 0,1%), так и один SDDBS вызывали значительную гибель (>2 log). Один цинк не был эффективен. Тройная комбинация давала наилучшие результаты с>4 log гибели микробов во всех случаях и максимальную гибель (>5 log) как в моменты времени 30 с, так и 120 с при более высоком уровне IPMP (Фиг.2).

Время гибели микроорганизмов для зубных паст

Губительный эффект комбинации IPMP/хлорид цинка /SDDBS/SLS (суммарно 1,0% поверхностно-активного вещества) по сравнению со стандартной зубной пастой SLS (1,5% поверхностно-активного вещества) представлен на Фиг.3. Данные, представленные выше, показывают, что преимущество тройных комбинаций IPMP и цинковой соли вместе с поверхностно-активным веществом также обнаруживается в композициях зубных паст.

Фиг.4

Сравнение смеси SLS/IPMP/цитрат цинка с SLS/IPMP и стандартной SLS зубной пастой представлено на Фиг.4. Данные, представленные выше, показывают, что преимущество тройных комбинаций IPMP и цинковой соли вместе с поверхностно-активным веществом также обнаруживается в полных зубных пастах.

Вывод

Вышеприведенные данные демонстрируют значительный полезный эффект комбинирования поверхностно-активных веществ, таких как SDDBS, SLS или обоих, с цинком и IPMP для получения лучших антибактериальных эффектов в разных антибактериальных тестах подавления роста (MIC) или анализах времени гибели микроорганизмов, как в простых растворах, так и в композициях зубных паст.

Примеры 2-5

Композиция зубной пасты	Пример 2	Пример 3	Пример 4	Пример 5
Сырье	% масс./масс.	% масс./масс.	% масс./масс.	% масс./масс.
Сорбитол, жидкость (некристаллизующаяся)	27,65	27,65	27,65	27,65
Глицерин (98%)	4,00	4,00	4,00	4,00
Полиэтиленгликоль 300 (ПЭГ 6)	4,00	4,00	4,00	4,00
Диоксид кремния, стоматологический (Zeodent 113)	14,00	14,00	14,00	14,00
Диоксид кремния, стоматологический (Zeofree 153 В)	9,00	9,00	9,00	9,00
Натрия лаурилсульфат	0,75	0,75	1,50	1,50
Натрий додецилбензолсульфоновая кислота	0,75	0,75	-	-
Ксантановая камедь ("ксант", Keftro) F)	0,80	0,80	0,80	0,80
Каррагинан ("карра", GenuviscoTPH-1)	0,40	0,40	0,40	0,40
Сахарин натрий	0,30	0,30	0,30	0,30
Фторид натрия	0,24	0,243	0,20	0,10
Хлорид цинка	0,50	0,50	0,50	0,50
Диоксид титана	1,00	1,00	1.00	1,00
Вкусоароматизатор	1,50	1,50	1,50	1,50
Тринатрийцитрат двухводный	1,84	1,84	-	1,84
Изопропилметилфенол	0,05	0,10	0,05	0,1
Лимонная кислота (безводная)	-	-	0,03	0,03
Очищенная вода	до 100	до 100	до 100	до 100

Примеры 6-9

Композиция жидкости для полоскания рта	Пример 6	Пример 7	Пример 8	Пример 9
Сырье	% масс./масс.	% масс./масс.	% масс./масс.	% масс./масс.
Сорбитол, жидкость (некристаллизующаяся)	10,00	15,00	10,00	-
Глицерин (98%)	10,00	15,00	10,00	10,00
Полиэтиленгликоль 60
гидрогенизированное	1,50	1,50	1,50	1,00
касторовое масло
Натрий додецилбензолсульфоновая	1,00	1,50	1,00	0,50
кислота
Сахарин натрий	0,03	0,03	0,03	0,03
Фторид натрия	0,06	0,06	0.06	0,06
Хлорид цинка	0,05	0,15	0,10	0,10
Вкусоароматизатор	0,20	0,20	0,20	0,25
Тринатрийцитрат двухводный	1,00	0,70	0,60	0,50
Изопропилметилфенол	0,10	0,05	0,01
Метилпарабен	0,15	0,10	0,15	0,15
Пропилпарабен	0,15	0,10	0,15	0,15
Бисаболол	0,05	0,01	0,05	0,05
Очищенная вода	до 100	до 100	до 100	до 100