способ определения биологического возраста трупа при длительной кровопотере

Формула изобретения

Способ определения биологического возраста трупа при длительной кровопотере, заключающийся в том, что в базальном слое эпидермиса неповрежденной кожи определяют экспрессию иммуногистохимических маркеров Ki67, р53 и bcl-2 на 1 мкм², и при величине Ki67 более 18,0%, величине р53 менее 0,3%, величине bcl-2 более 12,0% делают вывод о биологическом возрасте трупа 5-10 лет; при величине Ki67 7,3-11,6%, величине р53 1,0-2,28%, величине bcl-2 2,5-7,5% делают вывод о биологическом возрасте трупа 35-45 лет; при величине Ki67 менее 3,0%, величине р53 более 5,5%, величине bcl-2 менее 0,5% делают вывод о биологическом возрасте трупа 70-85 лет.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к судебной медицине, в частности к судебно-медицинской экспертизе.

На сегодняшний день не выявлены объективные признаки определения возраста человека при длительной кровопотере, являющейся причиной хронической постгеморрагической анемии.

Известен способ определения возраста человека при помощи гистологического исследования хрящевой и костной ткани. При этом определенные гистологические изменения хряща и костей позволяют разделить весь материал на определенные возрастные группы (Атлас по судебной медицине под редакцией Пиголкина Ю.И., Богомоловой И.Н, 2006, с.303-306).

Недостатки: невозможность использования способа при длительной кровопотере и хронической постгеморрагической анемии, когда нарушаются процессы созревания хрящевой ткани эпифизов, развивается остеопороз и деформация костей скелета вследствие компенсаторной гипертрофии костного мозга (Reimann F, Gedikoglu G, Celik E. et all // Rofo. - 1981. - Vol.135. - № 1. - p.20-24; Korkmaz U, Korkmaz N, Yazici S. et all // Eur. J. Intern Med. - 2012. - Vol.23. - № 2. - P.154-58).

Известен способ определения биологического возраста по срокам окостенения скелета кисти и дистального отдела предплечья по рентгенограммам кистей и лучезапястных суставов (Жуковский М.А., Бухман А.И. Сроки окостенения скелета кисти и дистального отдела предплечья у детей и подростков г. Москвы в кн. Детская эндокринология: Руководство для врачей. М.: Медицина, 1995, с.40; Атлас по судебной медицине под редакцией Пиголкина Ю.И., Богомоловой И.Н., 2006, с.306-308).

Недостатки: невозможность использования способа при длительной кровопотере, хронической постгеморрагической анемии, заболеваниях костно-суставной системы и нарушении обмена кальция, когда нарушается процесс формирования ядер окостенения кисти и лучезапястных суставов (Reimann F., Gökmen М., Inceman S. // Blut. - 1968. - Vol.17. - № 4. - P.214-226; Rutten E.P., Franssen F.M., Spruit M.A., Wouters E.F. // COPD. 2012 Dec 28. [Epub ahead of print]); сложность использования рентгеновских аппаратов в условиях судебно-медицинских отделений.

Известен способ определения биологического возраста человека по состоянию зубов (Попов В.Л., Дудаев А.Л., Прокопчук Н.И. Комплексная методика определения возраста по состоянию зубов с использованием аналоговых ЭВМ. // Судебно-медицинская экспертиза. - 1992. - № 1. - с.6-10.).

Недостатки: невозможность использования способа при длительной кровопотере и хронической постгеморрагической анемии, а также при других видах анемии вследствие выраженных изменений дентина, пульпы и тканей перидонта (Benoist Н.М., Seek Diallo А., Diop S. Et all. // Dakar Med. - 2008. - Vol.53. - № 2. - P.91-98; Hatipoglu M.G., Cagirankaya L.B., et all. // Eur J Dent. - 2012. - Vol.6. - № 1. - P.95-100).

Задачей изобретения является способ определения биологического возраста трупа при длительной кровопотере.

Поставленная задача решается способом определения биологического возраста трупа при длительной кровопотере, заключающимся в том, что в базальном слое эпидермиса неповрежденной кожи определяют экспрессию иммуногистохимических маркеров Ki67, р53 и bcl-2 1 мкм², и при величине Ki67 более 18,0%, величине р53 менее 0,3%, величине bcl-2 более 12,0% делают вывод о биологическом возрасте трупа 5-10 лет; при величине Ki67 7,3-11,6%, величине р53 1,0-2,28%, величине bcl-2 2,5-7,5% делают вывод о биологическом возрасте трупа 35-45 лет; при величине Ki67 менее 3,0%, величине р53 более 5,5%, величине bcl-2 менее 0,5% делают вывод о биологическом возрасте трупа 70-85 лет.

Практически способ осуществляют гистологическим исследованием тканей по (Саркисов Д.С., Перов Ю.Л. Микроскопическая техника. - М.: - Медицина. - 1996 г. - С.4-50, 339-445) следующим образом:

1. Исследуют участки кожи семи областей тела: шеи, груди, спины, ягодицы, передневнутренней поверхности бедра, передней поверхности предплечья и подошвенной поверхности стопы. На шее кусочек кожи вырезают с передней ее поверхности, на 0,5 см ниже проекции нижнего края щитовидного хряща, на груди - по срединной линии на уровне 4-го межреберья, на спине - в межлопаточной области, в проекции остистых отростков 4-5 грудных позвонков по срединной линии, на ягодице - с центральной ее части, на бедре - в области передневнутренней его поверхности на границе верхней и средней трети, на предплечье - на передней его поверхности на середине расстояния между проекцией локтевого и лучезапястного суставов, на подошвенной поверхности стопы - в области свода стопы на середине расстояния между проекцией головок плюсневых костей и пяточного бугра.

2. Кусочки фиксируют в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 24 часов.

3. Материал промывают в проточной воде в течение 30 минут, а затем подвергается обезвоживанию и заливке в парафин по следующей схеме: спирт 60,0% - 2 часа, спирт 70,0% - 2 часа, спирт 96,0% - 2 часа, спирт 96,0% - 2 часа, спирт + ксилол (1:1) - 2 часа, ксилол + парафин (1:1) - 2 часа, парафин I 56° - 2 часа, парафин II 56° - 1 час.

4. Кусочки заливают в парафиновые блоки.

5. На ротационном микротоме изготавливают гистологические срезы толщиной 4-6 микрон.

6. Срезы подвергают депарафинизации и антигенной демаскировке в 0,1 М цитратном буфере pH 6,0 в течение 30 минут (Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека / под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. - Казань: Титул, 2004).

7. Осуществляют обработку срезов первичными антителами Monoclonal Mouse а Hu Ki67 Clone ММ1 (фирма Novocastra), Monoclonal Mouse a Hu bcl-2 Clone bcl-2/100/D5 (фирма Novocastra), Monoclonal Rb a Hu p53 Clone 318-6-11 (фирма Dako) (Петров С.В., Райхлин H.T., см. выше).

8. Срезы обрабатывают реагентами системы визуализации En Vision + System-HRP (DAV), code К4010 (фирма Dako) (Петров С.В., Райхлин Н.Т., см. выше).

10. Полученные данные обрабатывают статистически по методу Стьюдента-Фишера с 95%-ным уровнем статистической достоверности с определением средней арифметической М, средней ошибки средней арифметической m, средней ошибки относительных величин m_p и коэффициента достоверности разности t. Также статистическую обработку производят с использованием таблиц сопряженности, критерия ² и метода множественных сравнений с поправкой Бонферрони (Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. - М.: Практика, 1998. - 459 с).

С помощью данных методов изучались ткани кожи, полученные при судебно-медицинском исследовании 100 трупов (56 лиц мужского пола и 44 лиц женского пола в возрасте от 5 до 85 лет, не имеющих повреждений и патологических изменений кожи, при наличии признаков длительной кровопотери и хронической постгеморрагической анемии. Длительность кровопотери выясняли с помощью способа определения длительности терминального периода при острой кровопотере (патент на изобретение Российской Федерации № 2453844).

Проведенный статистический анализ установил, что иммуногистохимические маркеры Ki67, bcl-2, р53 можно использовать для определения биологического возраста человека при наличии признаков длительной кровопотери и хронической постгеморрагической анемии.

Способ определения биологического возраста трупа по фрагментам неповрежденной кожи апробирован на кафедре судебной медицины Первого Московского Государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова и имеет большое практическое значение.

Пример 1.

Согласно акту судебно-медицинского исследования на месте происшествия были обнаружены фрагменты расчлененного трупа.

По данным фрагментам было затруднительно определить биологический возраст трупа.

При судебно-медицинском исследовании выявлена хроническая язва тела желудка с признаками незначительно выраженного кровотечения, в тонкой и толстой кишке определялось небольшое количество крови. С помощью способа определения длительности терминального периода при острой кровопотере (патент на изобретение Российской Федерации № 2453844) обнаружены морфологические признаки длительной кровопотери и хронической постгеморрагической анемии.

Учитывая наличие хронической постгеморрагической анемии, было невозможно использовать стандартные способы определения биологического возраста человека.

При иммуногистохимическом исследовании в базальном слое эпидермиса выявлена позитивная экспрессия следующих маркеров: Ki67 от 1,5 до 2,0%; р53 от 7,0 до 9,8%; bcl-2 от 0,2 до 0,3%.

На основании указанных признаков был сделан вывод, что расчлененные фрагменты трупа принадлежат лицу старческого возраста 70-85 лет (нормативные данные для этой возрастной группы составляют: Ki67 менее 3,0%, р53 более 5,5%, bcl-2 менее 0,5%).

Пример 2.

Согласно акту судебно-медицинского исследования на месте происшествия был обнаружен труп с ожогами лица и шеи 3-й-4-й степени. Ожоговая травма не позволяла определить биологический возраст трупа.

При судебно-медицинском исследовании выявлены признаки хронической наркотической интоксикации, в нижней трети пищевода определялись варикозно расширенные вены с незначительно выраженным кровотечением, в тонкой и толстой кишке обнаружено небольшое количество крови. С использованием способа определения длительности терминального периода при острой кровопотере (патент на изобретение Российской Федерации № 2453844) были выявлены морфологические признаки длительной кровопотери и хронической постгеморрагической анемии.

Учитывая наличие хронической постгеморрагической анемии, было невозможно использовать стандартные способы определения биологического возраста человека.

При иммуногистохимическом исследовании в базальном слое эпидермиса неповрежденной ожогами кожи выявлена позитивная экспрессия следующих маркеров: Ki67 8,2%; р53 1,5%; bcl-2 5,6%.

На основании указанных признаков был сделан вывод, что биологический возраст трупа составляет 35-45 лет (нормативные данные для этой возрастной группы составляют: Ki67 7,3-11,6%, р53 1,0-2,28%, bcl-2 2,5-7,5%).

Способ по изобретению позволяет определить биологический возраст человека и более объективно решать задачи, поставленные перед судебно-медицинским экспертом следственными органами.