Получение мутаций или генная инженерия, ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка, использование их хозяев: ......альфа-интерферон – C12N 15/21

Изобретение относится к микробиологической промышленности, медицинской биотехнологии и генной инженерии. Предложен новый способ получения безметионинового интерферона-альфа2b человека. Вначале конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие ген интерферона-альфа2b человека, перед которым расположен сайт протеолиза энтеропептидазой, и трансформируют ими клетки Escherichia coli. Культивируют клетки и выделяют тельца включения синтезированного предшественника. Затем осуществляют частичную ренатурацию выделенного предшественника в присутствии препятствующего замыканию дисульфидных связей дитиоэритриола. Проводят гидролиз предшественника ферментом энтеропептидазой с образованием безметионинового интерферона-альфа2b человека. После завершения реакции гидролиза предшественника проводят полную ренатурацию интерферона-альфа2b человека в присутствии способствующей замыканию дисульфидных связей пары соединений цистин и цистеин. Очистка полученного белка осуществляется методом хроматографии на КМ-сефарозе. 5 ил.

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к рекомбинантной продукции интерферона человека, и может быть использовано для получения рекомбинантного интерферона альфа-2 человека. Способ микробиологического синтеза зрелого интерферона альфа-2 человека осуществляют путем культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae, содержащих инактивирующую мутацию в структурном гене протеиназы YPS1 и/или дополнительные гены протеиназы КЕХ2. Рекомбинантным путем получают штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, способные секретировать зрелый интерферон альфа-2 человека в культуральную среду. Изобретение позволяет увеличить продукцию зрелого интерферона альфа-2 за счет снижения деградации секретируемого интерферона путем инактивации гена протеиназы YPS1 дрожжей, а также за счет улучшения эффективности процессинга предшественника секретируемого интерферона путем увеличения экспрессии протеиназы KEX2 в нативной либо секретируемой форме. 9 н.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения рекомбинантного альфа 16-интерферона человека. Рекомбинантный альфа 16-интерферон получают путем культивирования рекомбинантного штамма дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-2949 в питательной среде. Затем проводят индукцию синтеза целевого белка и удаление клеток. Потом осуществляют концентрирование культуральной среды и проводят осаждение целевого белка при 60% насыщении сульфата аммония. После чего целевой белок очищают последовательно на Сефакриле HR 100 и на диэтиламиноэтил-целлюлозе в присутствии 0,5% детергента Твин-20. Изобретение позволяет упростить технологию получения рекомбинантного альфа 16-интерферона человека и повысить эффективность очистки целевого белка. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано для получения рекомбинантного полипептида интерферона альфа-2b человека. Конструируют in vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую синтетический ген интерферона альфа-2b человека, тандем промоторов А2 и A3 из ранней области бактериофага Т7 и синтетический участок - усилитель трансляции, обуславливающие конститутивный биосинтез целевого белка в клетках трансформированного ею штамма Escherichia coli SGK25 /pIF TREN, с высоким выходом. 2 н.з.п ф-лы, 5 ил.

Изобретение относится к фармации, биотехнологии и касается создания раствора для инъекций на основе интерферона, а также к рекомбинантным штаммам Escherichia coli (E.coli) и плазмидам для его получения. Предлагается новая рекомбинантная мультикопийная плазмидная ДНК pSX50, кодирующая синтез лейкоцитарного альфа-2b интерферона человека, экспрессия которого находится под контролем лактозного и триптофанового промоторов и терминатора транскрипции. В результате трансформации клеток реципиентного штамма Е. coli BL21 рекомбинантной плазмидной ДНК pSX50 получен штамм E.coli SX50 - продуцент рекомбинантного лейкоцитарного альфа-2b интерферона человека с продуктивностью до 0.9-1.0 г альфа-2b интерферона. Способ получения рекомбинантного альфа-2b интерферона основан на использовании созданного рекомбинантного штамма Е. coli SX50 и предусматривает его глубинное культивирование на питательной среде с пониженным содержанием триптофана при непрерывном добавлении питательных субстратов в процессе биосинтеза, механическое разрушение клеток микроорганизма при высоком давлении, растворение агрегированного белка в концентрированном растворе гуанидин гидрохлорида с последующей ренатурацией интерферона в физиологических буферных растворах в присутствии хаотропных агентов и его очисткой с использованием трехстадийной хроматографической очистки интерферона на смолах типа Chelating Scpharose Fast Flow, иммобилизованной ионами Cu ⁺², ионообменной хроматографии на ионообменных смолах типа СМ Sephsrose Fast Flow и гель-фильтрационной хроматографии на смолах типа Superdex 75. Трехстадийная хроматографическая очистка интерферона позволяет получать субстанцию интерферона более 98% чистоты по данным электорофореза в редуцирующих и нередуцирующих условиях и более 95% по данным RF HPLC и не содержащую пирогенов (LAL-тест) в количествах не менее 400 мг с 1 л культуральной среды. Изобретение обеспечивает повышение выхода интерферона и стабильности раствора. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 5 табл., 6 ил.

ШТАММ Escherichia coli BL21 (DE3)[pAYC-ET-(hIFN- 2b)-IacI]-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АЛЬФА-2b ИНТЕРФЕРОНА И СПОСОБ ЕГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к штамму Escherichia coli - продуценту рекомбинантного лейкоцитарного интерферона альфа-2b, и может быть использовано для получения препарата человеческого интерферона медицинского назначения. Путем генноинженерной технологии конструируют штамм Escherichia coli BL21 (DE3) [pAYC-ET-(hIFN- 2b)-lacI] - продуцент рекомбинантного лейкоцитарного альфа-2b интерферона человека. Полученный штамм культивируют на среде М9, содержащей 10-20 г/л гидролизата казеина, антибиотик - стрептомицин в дозе 20-40 мг/л, 5-10 г/л дрожжевого экстракта и 0,05-0,1 таблетки витаминно-минерального препарата "Centrum". Причем культивирование проводят с введением в среду индуктора интерферона 1,2-изопропил-тио-бета-галактозида в дозе 0,1-0,2 г/л или лактозы в дозе 6-8 г/л при поддержании постоянной концентрации глюкозы в среде на уровне 0,01-0,03 г/л и рН 6,7-6,8, а после индуцирования регулирование рН и содержания глюкозы производят дискретным введением в питательную среду глюкозосодержащей добавки, объемом 100 мл на 1 л среды культивирования, содержащей в своем составе следующие ингредиенты (% мас.): кислотный гидролизат казеина - 20-25, дрожжевой экстракт - 10-15, глюкоза - 20-50 и магний сернокислый семиводный - 0,1-0,6. Использование нового штамма и технологии его культивирования позволяет повысить выход интерферона до 40 г с 1 л культуральной жидкости. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантного лейкоцитарного интерферона альфа-2b человека и может быть использовано в медицине. Интерферон альфа-2b человека получают путем культивирования трансформированного штамма E.coli BL21 (DES) [pAYC-ET-(hIFN- 2b)-lacI] в питательной среде, разрушения клеток микроорганизма, удаления ДНК и РНК, концентрирования полученного продукта отмывкой белка, центрифугирования и денатурации образовавшегося осадка в растворе гуанидин гидрохлорида в присутствии 0,05-0,15 мас.% метионина с последующей ренатурацией интерферона в присутствии 0,3-0,5 М аргинина, и его очистки последовательно на катионите Солоза КГ 20/30, Sp-целлюлозе и фенил-Сефарозе CL 4В. Изобретение позволяет существенно повысить выход лейкоцитарного интерферона альфа-2В человека медицинского назначения. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 5 табл.

Изобретение относится к генной инженерии, конкретно к получению слитого белка Fc-фрагмента иммуноглобулина и интерферона-альфа, и может быть использовано для лечения гепатита. Конструируют слитый белок, содержащий в направлении от N-конца к С-концу Fc-фрагмент иммуноглобулина, полученный из IgG1 или IgG3, и целевой белок, включающий, по меньшей мере, один интерферон-альфа. Fc-фрагмент и целевой белок соединяют между собой непосредственно или с помощью полипептидного мостика. Слитый белок используют для получения фармацевтической композиции для лечения заболеваний печени, а также в способе адресования интерферона-альфа в ткани печени. Изобретение позволяет получить слитый белок, обладающий биологической активностью интерферона-альфа, обеспечивающий его концентрирование в печени и имеющий повышенную растворимость, более длительное время полужизни в сыворотке и повышенное связывание со своим рецептором. 6 н. и 4 з.п. ф-лы, 5 ил.

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано для получения рекомбинантного интерферона -2b человека. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pES4-4, которая имеет молекулярную массу 3,64 МДа (5917 п.о.) и состоит из Ndel/BamHI-фрагмента ДНК, содержащего последовательность искусственного гена рекомбинантного интерферона -2b человека, гена -лактамазы и Ndel/BamHI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ22b(+), содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7. Плазмида pES4-4 содержит в качестве генетического маркера ген -лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных этой плазмидой клеток Е. coli к ампициллину, и уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта Ndel: XbaI -38 п.о., HpaI-1332 п.о., PstI-4065 п.о., PvuI-4190 п.о., XhoI-5363 п.о. Полученной плазмидой трансформируют клетки Escherichia coli и получают штамм E. coli BDEES4 - суперпродуцент рекомбинантного интерферона -2b человека. Изобретение позволяет получать рекомбинантный интерферон -2b человека с высоким выходом и по упрощенной технологии. 2 н.п. ф-лы, 2 ил.

Изобретение относится к генной инженерии, биотехнологии, медицине, фармакологии. Новая рекомбинантная мультикопийная плазмидная ДНК pSX50, кодирующая синтез лейкоцитарного альфа-2b интерферона человека, экспрессия которого находится под контролем лактозного и триптофанового промоторов и терминатора транскрипции. В результате трансформации клеток реципиентного штамма Е. coli BL21 рекомбинантной плазмидной ДНК pSX50 получен штамм Е. coli SX50 - продуцент рекомбинантного лейкоцитарного альфа-2b интерферона человека с продуктивностью до 0.9-1.0 г альфа-2b интерферона с 1 л культуральной среды. Способ получения рекомбинантного альфа-2b интерферона основан на использовании созданного рекомбинантного штамма Е. coli SX50 и предусматривающий его глубинное культивирование на питательной среде с пониженным содержанием триптофана при непрерывном добавлении питательных субстратов в процессе биосинтеза, механическое разрушение клеток микроорганизма при высоком давлении, растворение агрегированного белка в концентрированном растворе гуанидин гидрохлорида с последующей ренатурацией интерферона в физиологических буферных растворах в присутствии хаотропных агентов и его очисткой с использованием трехстадийной хроматографической очистки интерферона на смолах типа Chelating Sepharose Fast Flow иммобилизованной ионами Cu ⁺², ионообменной хроматографии на ионообменных смолах типа СМ Sephsrose Fast Flow и гель фильтрационной хроматографии на смолах типа Superdex 75. Способ позволяет получать субстанцию интерферона более 99% чистоты по данным электрофореза в редуцирующих и нередуцирующих условиях при окрашивании гелей серебром и более 98% по данным RF HPLC и не содержащую пирогенов (LAL-тест) в количествах не менее 400-800 мг с 1 л культуральной среды. 3 н. и 3 з.п ф-лы, 6 ил.