Получение мутаций или генная инженерия, ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка, использование их хозяев: ....экспрессионные системы, использующие регуляторные последовательности, выделенные из lac-оперона – C12N 15/72

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу специфического отбора высокоаффинных молекул ДНК (ДНК-аптамеров) к рекомбинантному белку-мишени. Указанный способ включает синтез единой полипептидной цепи рекомбинантного белка, содержащего в своем составе фрагмент глютатион-S-трансферазы, целевой белок-мишень, пептидную последовательность, расщепляемую летальным фактором B. anthracis, и пептид, биотинилирующийся in vivo под действием фермента биотин-лигазы E.coli, связывание полученного рекомбинантного полипептида с библиотекой олигонуклеотидов и иммобилизацию белка на парамагнитных частицах, несущих глютатион, промывку парамагнитных частиц с иммобилизованным полипептидом от несвязавшихся олигонуклеотидов в потоке жидкости, отщепление белка-мишени со связанными ДНК-аптамерами с поверхности парамагнитных частиц летальным фактором B. anthracis, выделение и амплификацию аффинной к рекомбинантному белку-мишени последовательности ДНК в полимеразной цепной реакции и получение набора одноцепочечных ДНК-аптамеров, специфичных к белку-мишени. Изобретение позволяет эффективно получать высокоаффинные специфичные ДНК-аптамеры к рекомбинантным белкам-мишеням. 4 ил., 4 пр.

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии. Предложен способ выявления в гене BRCA1 мутаций сдвига рамки считывания и нонсенс-мутаций, заключающийся в создании рекомбинантных плазмид, в которых амплифицированный фрагмент гена находится в единой трансляционной рамке с геном щелочной фосфатазы Е.соli (phoA). Сконструирован плазмидный вектор pPhoA-frame, который содержит последовательность ДНК, кодирующую щелочную фосфатазу E.coli. Внутрь этой последовательности встроен фрагмент ДНК, содержащий сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции BglII, StuI, ApaI, SacII и предназначенный для клонирования фрагментов гена BRCA1 (полилинкер). Амплифицированный фрагмент гена BRCA1 встраивается в плазмидный вектор pPhoA-frame в единой трансляционной рамке с phoA. Наличие в исследуемом фрагменте гена мутаций, нарушающих целостность рамки считывания, оценивается визуально по отсутствию окраски колоний клеток E.coli, трансформированных полученной рекомбинантной плазмидой, на индикаторной чашке, содержащей субстрат для щелочной фосфатазы. Предлагаемый способ позволяет выявлять только значимые для развития патологии мутации, так как исключается детекция полиморфных вариантов, не приводящих к появлению стоп-кодонов и в большинстве случаев не оказывающих существенного влияния на функцию белка. Метод позволяет выявить наличие любых, в том числе и неизвестных, мутаций, нарушающих целостность рамки. Способ может быть использован для выявления в генах человека мутаций сдвига рамки трансляции и нонсенс-мутаций, ответственных за развитие ряда онкологических заболеваний. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 2 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана плазмида, кодирующая эстеразу Psychrobacter cryohalolentis K5 ^T и содержащая NdeI/XhoI - фрагмент ДНК плазмиды рЕТ32а длиной 5,366 т.п.о., включающий промотор бактериофага Т7, усилитель трансляции гена 10 бактериофага Т7, терминатор транскрипции бактериофага Т7, ген bla -лактамазы, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой рРС023 клеток к ампициллину, участок ori инициации репликации; и Ndel/Sall - фрагмента ДНК размером 0,869 т.п.о., содержащего ген, кодирующий зрелую форму эстеразы Psychrobacter cryohalolentis K5^T с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, представленной в описании, с С-концевым гексагистидиновым линкером. Представлен штамм бактерий Escherichia coli, модифицированный указанной плазмидой, - продуцент полипептида с активностью эстеразы Psychrobacter cryohalolentis K5^T. Изобретение позволяет увеличить уровень биосинтеза эстеразы до 20% от суммарного клеточного белка. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 5 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению белков, обладающих нейромодуляторным действием по отношению к никотиновым ацетилхолиновым рецепторам человека, и может быть использовано в медицине. Пептид SLURP-1 получают путем трансформации компетентных клеток Escherichia coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pET22b(+)/SLURP-1. Изобретение позволяет повысить эффективность синтеза белка SLURP-1 в клетках Escherichia coli. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 6 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Представлена плазмида, определяющая синтез щелочной фосфатазы СmАР, включающая NcoI/SacI-фрагмент плазмиды pET-40b(+) (Novagen) и фрагмент ДНК, размером 1530 пар оснований, содержащий химерный ген, состоящий из структурной части гена СmАР, адаптированной по N-концу для экспрессии в клетках E.coli, и нуклеотид, кодирующий специфическую последовательность для протеазы TEV. Описан штамм E.coli Rosetta(DE3), трансформированный указанной плазмидой, - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной щелочной фосфатазы СmАР. Предложен способ получения рекомбинантной щелочной фосфатазы СmАР, включающий стадии: инкубирования указанного штамма-продуцента в жидкой питательной среде LB в течение 12 ч при 20°С, осаждения бактериальных клеток центрифугированием, дезинтеграции суспензии клеток в буфере, центрифугирования экстракта, хроматографии надосадочной жидкости на колонке с металлоафинной смолой, элюции белка, концентрирования активных фракций ультрафильтрацией, инкубирования с протеазой TEV, концентрирования раствора белка и выделения целевого продукта гель-фильтрацией. 3 н.п. ф-лы, 1 ил., 3 пр.

Изобретение относится к области генной и белковой инженерии и касается рекомбинантной плазмидной ДНК pER-Hir, кодирующей гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием [Leu1, Thr2]-63-десульфатогирудина, штамму Escherichia coli ER2566/pER-Hir - продуценту указанного белка и способу получения генно-инженерного [Leu1, Thr2]-63-десульфатогирудина. Представленная рекомбинантная плазмидная ДНК состоит из SapI/BamHI-фрагмента ДНК плазмиды pTWIN-1, содержащей промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, ген -лактамазы (Ар), ген модифицированного мини-интеина Ssp DnaB, со встроенной в него последовательностью хитин-связывающего домена, и SapI/BamHI-фрагмента ДНК, содержащего последовательность гена рекомбинантного [Leu1, Thr2]-63-десульфато-гирудина-1, содержащую в качестве генетического маркера ген -лактамазы (Ар), и уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии влево от сайта BamHI: NruI - 186 п.о., NdeI - 594 п.о., XbaI - 882 п.о., EcoRV - 2913 п.о., HpaI - 2966 п.о. Изобретения позволяют получить рекомбинантный белок [Leu1, Thr2]-63-десульфатогирудин-1, который используют в качестве лекарственного препарата, применяемого для предотвращения гиперкоагуляции крови. 3 н.п. ф-лы, 1 ил.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в пищевой, фармацевтической и химической промышленности. Рекомбинантная плазмидная ДНК обеспечивает синтез флуоресцирующего мутантного белка GFP из Aequorea victoria в Rec + штаммах E.coli под контролем регуляторной области гена recA Proteus mirabilis. Применение изобретения обеспечивает повышенную чувствительность обнаружения ряда повреждающих ДНК факторов химической природы, а также повреждающих воздействий физической природы. 2 н.п. ф-лы, 12 ил.

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности. Предложен слитый белок бета-галактозидазы и целлюлозосвязывающего домена эндоглюканазы CelD из Anaerocellum thermophilium. Сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pLACspCBD, обеспечивающая его экспрессию в клетках Е.coli. Получен штамм Е.coli - продуцент указанного слитого белка. Разработан способ получения данного слитого белка в иммобилизованном виде путем обработки целлюлозы гидролизатом указанного штамма Е.coli. Иммобилизованный слитый белок используют для ферментативного расщепления лактозы. Применение изобретения позволяет упростить переработку молочных продуктов. 5 н.п. ф-лы, 1 ил.