способ определения параметров гематоцеллюлярного взаимодействия

Формула изобретения

Способ определения параметров гематоцеллюлярного взаимодействия путем выделения области топографической близости плазмалеммы исполнительной клетки органа к базальному контуру эндотелиоцита(ов), отличающийся тем, что на изображение зоны гематоцеллюлярного взаимодействия наносят прямую линию X, аппроксимирующую суммарную линейную составляющую прилегающих друг к другу контуров базальной плазмалеммы эндотелиоцита(ов) и поверхностной мембраны исполнительной клетки органа, параллельно оси X проводят две прямые на расстоянии Ymax, равном максимальной удаленности прилегающих контуров в предварительно выбранном фрагменте их пространственного сопряжения, находят точки пересечения этих прямых с прилегающими контурами, соединением полученных точек определяют искомые границы, с учетом которых производят необходимые замеры в зоне гематоцеллюлярного взаимодействия.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к метрологии, а именно к количественной морфологии человека и животных, и может быть использовано при стереометрическом анализе ультраструктурной организации гематоцеллюлярных барьеров.

Характерной особенностью зон гематоцеллюлярного взаимодействия является их незначительная протяженность как по отношению к общей площади плазмалеммы исполнительной клетки органа, так и в сравнении с люминальной поверхностью прилегающего(их) к ней эндотелиоцита(ов). В связи с этим при проведении количественного анализа ультраструктурной организации гематоцеллюлярных барьеров возникает необходимость в методически обоснованном определении формальных границ подвергаемой морфометрии зоны гематоцеллюлярного сопряжения.

Разрабатывая способ определения параметров гематоцеллюлярного взаимодействия, мы исходили из следующих соображений. Гематоцеллюлярный барьер представляет собой комплекс проницаемых структур, включающий в качестве обязательных компонентов стенку обменного микрососуда и слой паравазального интерстиция. Средняя толщина окружающей сосуд соединительной ткани является важнейшим параметром гематоцеллюлярного сопряжения. Этот показатель характеризует взаимную удаленность поверхностных мембран эндотелиоцита(ов) и специфически работающей органной клетки в зоне гематоцеллюлярного взаимодействия и непосредственно связан с транспортной функцией гематоцеллюлярной системы. Поэтому при выделении зоны гематоцеллюлярного взаимодействия необходимо учитывать особенности пространственной организации слоя паравазального интерстиция, входящего в состав изучаемого гематоцеллюлярного барьера.

Известен способ определения границ данных грунтов по разнице значений фактических глубин района морских мелководий(измеренных или взятых с морской карты) и "фотометрических" глубин, вычисленных по оптической плотности фотоизображения, например, аэронегатива /1/. На картографической основе, карте или в системе условных координат находят области несовпадения фактических и "фотометрических" глубин, превышающие по величине погрешность фотометрического метода определения глубин, после чего проводят искомые границы по линиям, разграничивающим эти области.

Известный способ не может быть использован при изучении зоны гематоцеллюлярного взаимодействия, поскольку прилегающие друг к другу контуры базальной поверхности эндотелиоцита(ов) и плазмалеммы исполнительной клетки органа визуально различимы и не совпадают на протяжении всей предполагаемой зоны гематоцеллюлярного сопряжения и тем более за ее пределами.

Известен также способ стереометрического определения средней толщины аэрогематического барьера, формирующегося с участием клеточных элементов альвеолярного эпителия легких, прослойки паравазального интерстиция и обменного микрососуда /2/. Этот способ, принятый за прототип, не предусматривает какого-либо стандартизованного отграничения зоны гематоцеллюлярного взаимодействия. Подвергаемая морфометрии зона паравазального интерстиция отбирается произвольно в пределах области топографической близости составных компонентов аэрогематического барьера друг к другу. Недостатком известного способа является низкая точность получаемых результатов.

Для достижения поставленной цели повышения точности отграничивают минимальную зону гематоцеллюлярного сопряжения, которую нельзя расширить без увеличения средней толщины паравазального интерстиция, и подвергают ее морфометрии. Предлагаемый способ позволяет стандартизированно отграничить наиболее эффективную в транспортном отношении зону гематоцеллюлярного взаимодействия, в пределах которой естественная вариабельность толщины паравазального интерстиция не оказывает существенного влияния на взаимную удаленность поверхностных мембран эндотелиоцита(ов) и исполнительной клетки органа.

Способ осуществляют следующим образом. Образцы биологической ткани проводят для трансмиссионной электронной микроскопии общепринятыми методами. Получают двумерные изображения гематоцеллюлярных барьеров, например в виде фотографий (схематически на фиг.1). На каждом из подвергаемых морфометрическому анализу изображений гематоцеллюлярного барьера произвольно выделяют фрагмент 1, протяженность которого существенно больше минимальных значений толщины паравазального интерстиция, но не включает спорные участки (т.е. те участки, которые в последующем могут не войти в зону гематоцеллюлярного взаимодействия в силу своей близости к области расхождения прилегающих контуров поверхностной мембраны эндотелиоцита 2 и плазмалеммы исполнительной клетки органа 3) и наносят прямую линию Х, аппроксимирующую суммарную линейную составляющую контуров 2 и 3. При этом используют метод наименьших квадратов (линию Х проводят таким образом, чтобы сумма квадратов расстояний от всех точек каждого из прилегающих контуров 2 и 3 до данной прямой в пределах фрагмента 1 была минимальна) либо аппроксимацию относительно другого критерия близости. На прямой Х берут некую точку в качестве условного начала отсчета и рассматривают функцию y f(x), где х координата по полученной оси (прямой Х), а y длина перпендикулярного прямой Х отрезка, проходящего через точку х и соединяющего контуры 2 и 3. Допуская наличие в составе данной функции случайной компоненты и гладкой составляющей, выделяют область значений аргумента, внутри которой изменения гладкой компоненты меньше флюктуаций случайной составляющей, и определяют максимальное значение y(y_max) в пределах этой области. После этого параллельно оси Х проводят две прямые линии 4 и 5 на расстоянии y_max и определяют ихточки пересечения с контурами 2 и 3 соответственно (точки 6, 7, 8, 9). Соединением полученных точек друг с другом прямыми линиями (6 соединяют с 8, а 7 с 9) получают искомые границы зоны гематоцеллюлярного взаимодействия.

По завершении процедуры формализованного выделения подвергаемой морфометрии области гематоцеллюлярного сопряжения необходимо удостовериться в том, что отобранный ранее фрагмент 1 не выходит за пределы отграниченной области. В противном случае (пример изображен на фиг.2) корректируют выбор фрагмента 1 и повторяют всю процедуру определения границ зоны гематоцеллюлярного взаимодействия.

С учетом полученных границ проводят стереометрическое исследование ультраструктурной организации соответствующего гематоцеллюлярного барьера известными способами. В зависимости от характера решаемой задачи формируют пакет необходимых параметров: измеряют, например, среднюю толщину гематоцеллюлярного барьера, паравазального интерстиция или сопряженного фрагмента эндотелиоцита(ов), определяют длины прилегающих контуров, форму сопряженных поверхностей, представительство ультраструктурных компонентов трансмурального массопереноса, оценивают степень ориентировки барьеров в биологической ткани на основании определения углов отклонений оси Х каждого гематоцеллюлярного барьера от произвольно выбранной направляющей линии, вычисляют относительный объем паравазального интерстиция в структуре всего межклеточного пространства, удельные и общие площади прилегающих поверхностей.

Пример. С целью верификации предлагаемого способа проведен стереометрический анализ ультраструктурной организации гематоцеллюлярного барьера, формирующегося в зоне условного контакта териоидных С-клеток с перифолликулярными гемокапиллярами. Фрагменты щитовидных желез 18 беспородных крыс-самцов 52-недельного возраста последовательно фиксировали в растворахглютаральдегида (3% ) и тетраоксида осмия (1%) на фосфатном буфере (рН 7,4) с последующим обезвоживанием в батарее спиртов восходящей концентрации и заключением в смесь смол эпон-аралдит (фирма "Fluka", США). Полученные на микротоме "LKB 111" (Швеция) ультратонкие срезы контрастировали по E.S.Reynolds (1963). Фотографирование и количественную оценку препаратов проводили на трансмиссионных электронных микроскопах "ЭМВ-100АК" (СССР) и "JEM-100B" (Япония).

Для сопоставления точности известного (прототип) и предлагаемого способов формальные границы зоны гемато-С-целлюлярного взаимодействия в щитовидной железе определяли произвольно и с использованием вышеописанной процедуры определения формальных границ гематоцеллюлярного взаимодействия. Для того, чтобы уменьшить степень искажения результатов морфометрии возможной неперпендикулярностью ультратонких срезов по отношению к продольной оси прилегающего к С-клетке (юкста-С-целлюлярного) микрососудистого фрагмента, необходимые геометрические построения в зоне гемато-С-целлюлярного взаимодействия производили при выполнении условия: S/L0,90 (т.е. коэффициент вариации меньше 5%), где S длина малой, а L большой осей базального контура кровеносного микрососуда, аппроксимируемого по базальной поверхности круглым цилиндром.

Длины контуров сосудистого полюса кальцитониноцита и прилегающего к нему фрагмента базальной поверхности эндотелиальной клетки перифолликулярного гемокапилляра вычисляли методом случайных секущих. С привлечением полученных данных определяли среднюю толщину интерстициальной составляющей гемато-С-целлюлярного барьера по известной в аналитической геометрии формуле средней толщины слоя в модификации E. R.Weibel /2/. При этом площадь измеряемого фрагмента гемато-С-целлюлярного интерстиция определяли методом точечного счета. Для вычисления абсолютных величин указанных параметров гемато-С-целлюлярного взаимодействия использовали соответствующие поправочные коэффициенты. Ультраструктурную оценку механизмов трансмурального массопереноса в юкста-С-целлюлярной зоне эндотелиоцита осуществляли путем определения среднего количества микропиноцитозных везикул на поперечном срезе гемокапилляра.

Результаты стереометрического анализа ультраструктурной организации гемато-С-целлюлярного комплекса в щитовидной железе представлены в таблице. Полученные данные свидетельствуют о достоверно более низкой погрешности результатов исследования при использовании предлагаемого способа определения параметров гематоцеллюлярного взаимодействия.

Дополнительная оценка точности и релевантности известного и предлагаемого способов производилась по тесноте, выявляемой с помощью одномерного корреляционного анализа статистической связи между средней толщиной интерстициальной составляющей тиреоидного гемато-С-целлюлярного барьера и сывороточным содержанием кальцитонина (гормона инкретируемого С-клетками щитовидной железы). При этом концентрации кальцитонина в сыворотке крови определяли радиоиммунологическим методом с помощью наборов "RIA-mat Calcitonin 11" (фирма "Mallinckrodt Diagnostika", ФРГ), а контроль качественной однородности статистической совокупности проводили с помощью анализа совместного распределения случайных величин.

Высокая погрешность известного способа не позволила выявить указанную корреляцию (r -0,13; P > 0,05). Использование предлагаемого способа, напротив, показало наличие сильной корреляционной связи (r +0,83; P < 0,05).

Таким образом, предлагаемый способ отличается от известного значительно большей точностью и может быть использован для измерения различных параметров гематоцеллюлярного взаимодействия.