способ определения активности бактериальных токсинов

Формула изобретения

Способ определения активности бактериальных токсинов, включающий воздействие исследуемым токсином в разных разведениях на биологический объект с последующей оценкой результата воздействия, отличающийся тем, что в качестве объекта воздействия используют люминесцирующие бактерии, входящие в набор "Эколюм" (БиоХимМак), при этом осуществляют инкубацию исследуемого токсина с люминесцирующими бактериями в течение не менее 30 мин, оценку активности проводят до степени ингибирования свечения бактерии.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано при производстве бактериальных токсинов и антитоксинов, а также в научно-исследовательской работе.

Известен способ определения активности экзотоксинов на модели 10-дневных крольчат (Datta N.K. Habbu M.K. Experimental cholera in Infant Rabbits anethed for chemotherapentic Investigation. -Br. J. Pharmacol, 1955, v. 10, p. 153). Недостатками способа являются: невозможность определить количество титруемого токсина, длительность получения ответа (2-е суток) высокая стоимость исследования.

Известен способ определения токсина на лигированных петлях подвздошной кишки взрослых кроликов (Burrous W. Musteiris C.M. Cholera infection and toxin in the rabbit ilal loop. J. Infct. Dis. 1966, v. 116, p. 183). Метод достаточно информативный, однако дорогостоящий, сложный в исполнении ответ через 18 часов.

Известен способ определения активности токсина синдрома токсического шока стафилококков на модели кроликов при внутривенном введении (Reeves M.W. Arko R.V. Chandler F.W. et al. Affinity purification of staphylococcal toxic shook syndrome toxin and pathologic effects in rabbits. Infect. Immun. 1986, v. 51, p. 431 439). Способ дорогостоящий, трудный в исполнении.

Известен способ титрования токсина при внутрикожном введении взрослым кроликам (Croug S. P. Yamamoto K. Takeda et al. Production of cholera like enterotoxin by vibrio cholera non-01 strain isolated from the environment. - In: Proc. Cholera Res. Symp. Honolulu, Hawaii, 1965 Washington 1965, p. 153). Способ прост в исполнении, однако требует дорогостоящих животных, время получения ответа 18 часов.

Для упрощения, удешевления способа и сокращения времени исследования на люминесцирующие бактерии воздействуют экзотоксинами и определяют активность токсинов по степени ингибирования свечения бактерий.

Изобретение иллюстpируется следующими примерами.

Пример 1. В пробирку, содержащую исследуемый очищенный концентрированный экзотоксин холерного вибриона, выпускаемого Саратовским институтом "Микроб" серия 4, в количестве 0,1 мл вносят смесь, состоящую из 0,8 мл 2% NaCl и 0,1 мл раствора люминесцирующих бактерий (количество бактерий предусмотрено инструкцией и входит в набор "Эколюм", выпускаемый СП БиоХимМак, предназначенный для определения содержания химических соединений, характерных для промышленных сбросов в окружающую среду). Смесь инкубируют в течение 30 мин при t 37^oC. Контролем служат: холероген, нейтрализованный антихолерогенной сывороткой производства Саратовского института "Микроб" серия 2 с титром 3000 АЕ; холероген, разрушенный двухчасовым кипячением; а также физраствор, в котором разводят люминесцирующие бактерии.

Параллельно активность токсина и контролей проверяют на моделях изолированной петли кишечника взрослых кроликов и в кожной пробе Крейга.

Содержимое пробирок переносят в кюветы и регистрируют интенсивность свечения на хемилюминометре ПХЛ-1. Результаты исследования представлены в табл. 1.

Таким образом, очищенный концентрированный токсин активностью 1600 АЕ кишечных единиц и 5600 АЕ в пробе Крейга подавляет свечение бактерий.

Пример 2. В пробирку, содержащую 0,1 мл частично очищенного концентрированного экзотоксина, выпускаемого Саратовским институтом "Микроб" серия 6, добавляют в количестве 0,1 мл смесь, состоящую из 0,8 мл 2% NaCl и 0,1 мл раствора люминесцирующих бактерий. Смесь инкубируют в течение 30 мин при t 37^oC. Контролями являются: холероген, нейтрализованный антихолерогенной сывороткой производства Саратовского института "Микроб" серия 2 с титром 3000 АЕ; холероген, разрушенный двухчасовым кипячением; а также физ. раствор. Параллельно активность токсина и контролей проверяют на моделях изолированной петли кишечника взрослых кроликов и в кожной пробе Крейга. Пробы переносят в кюветы и регистрируют интенсиность свечения на хемилюминометре ПХЛ-1. Результаты исследований представлены в табл.2. Табл.2 свидетельствует о том, что менее активные токсины также подавляют свечение бактерий.

Пример 3. В пробирку, содержащую неочищенный концентрированный экзотоксин, в количестве 0,1 м вносят cмесь, состоящую из 0,8 мл 2% NaCl и 0,1 мл люминесцирующих бактерий. Смесь инкубируют в течение 30 мин при t - 37^oC. Контролями служат холероген, нейтрализованный антихолерогенной сывороткой, производства Саратовского института "Микроб" серия 2 с титром 3000 АЕ, холероген, разрушенный двухчасовым кипячением, а также физ. раствор. Параллельно активность токсина контролируют в биопробах. Результаты исследований представлены в табл.3.

Из табл. 3 видно, что неочищенный концентрированный холероген также подавляет свечение бактерий.

Пример 4. В пробирку, содержащую активную надосадочную жидкость токсинообразующего штамма V. Cholrae 569 В в количестве 0,1 мл вносят смесь, состоящую из 0,8 мл 2% NaCl и 0,1 мл люминесцирующих бактерий. Активная надосадочная жидкость была получена методом Burrows W. Musteikis G.M. Cholera infection and toxin in the rabbit ileal loop. J. Infect. Dis. 1966, v. 116, p. 183. Cмесь инкубируют в течение 30 мин при t 37^oC. Контролями служат активная надосадочная жидкость в смеси с антихолерогенной сывороткой производства Саратовского института "Микроб" серия 2 с титром 3000 АЕ и кипяченная в течение 2-х часов активная надосадочная жидкость. Результаты представлены в табл.4.

Пример 5. Предлагаемым способом определяют активность нескольких серий очищенного и частично очищенного токсинов холерных вибрионов. Контролем служит активность, определяемая методом Крейга (см. табл.5).

Таким образом, независимо от очистки препарата прослеживается четкое совпадение результатов, получаемых предлагаемым способом и стандартым способом на животных.

Пример 6. Изучение активности экзотоксина токсического шока (ЭТШ).

В пробирку, содержащую 0,1 мл ЭТШ вносят смесь, состоящую из 0,8 мл 2% NaCl и 0,1 мл люминесцирующих бактерий. Смесь инкубируют при t 37^oC. Контролем служит ЭТШ в смеси с антитоксической сывороткой (полученной по методу Текутьева С.И. Карницкой Н.В. Изучение ЭТШ, выделенного из штамма S. aureus FRI-1169. Сб. Бактериальные токсины. Юрмала 1989, т. 2, с. 130-131).Результаты исследований представлены в табл.6.

Данные табл. 6 свидетельствуют о том, что ЭТШ подавляет свечение бактерий.

Пример 7. Описанным выше способом определяют возможность нейтрализации ЭТШ специфической антитоксичной сывороткой. Результаты определений представлены в табл.7. Они свидетельствуют о том, что специфическая сыворотка нейтрализует действие ЭТШ. Таким образом, предлагаемый способ позволяет определять активность не только холерогена, но и других токсинов.

Оптимальной оказалась экспозиция 60 мин. Более длительное воздействие нецелесообразно, а менее длительное не дает достоверных результатов (см.табл.8).

Пример 8. С целью подтверждения специфичности реакции проводились опыты с эндотоксинами клебсиелл и холерного вибриона, а также другими биологически активными веществами.

В пробирку, содержащую 0,1 мл раствора вещества, вносят смесь, состоящую из 0,8 мл 2% NaCl и 0,1 мл раствора люминесцирующих бактерий. Смесь инкубируют в течение 60 мин при t 37^oC. Результаты исследований представлены в табл.9.

Из табл.9 видно, что подавление свечения является специфичным свойством экзотоксинов, поскольку другие биологически активные вещества белковой и липополисахаридной природы не инкубирует свечение, а в некоторых случаях его стимулирует.

Таким образом, предлагаемый способ прост в исполнении, дешев и позволяет получить ответ в течение 1 1,6 часов.