способ получения суммы тритерпеновых гликозидов (варианты)

Формула изобретения

1. Способ получения суммы тритерпеновых гликозидов из голотурии, предусматривающий выделение целевого продукта из сырья и его очистку, отличающийся тем, что в качестве сырья используют выварочные воды - отходы переработки голотурии, из которых гликозиды осаждают совместно с полисахаридбелковым комплексом при подкислении до pH 2,8 или при добавлении 1%-ного хитозана в качестве флокулянта, экстрагируют их из осадка водным спиртом или другим водорастворимым растворителем и последовательно очищают путем обращенно-фазовой хроматографии на колонках с гидрофобным сорбентом и последующей адсорбционной хроматографии.

2. Способ получения суммы тритерпеновых гликозидов из голотурии, предусматривающий выделение целевого продукта из сырья и его очистку, отличающийся тем, что в качестве сырья используют выварочные воды - отходы переработки голотурии, которые подвергают высушиванию до порошка, экстрагируют гликозиды из порошка смесью растворителей хлороформ - этанол - вода 100 : 100 : 17 соответственно и очищают путем обращенно-фазовой хроматографии на колонках с гидрофобным сорбентом и последующей адсорбционной хроматографии.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве гидрофобного сорбента используют Полихром-1.

4. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве гидрофобного сорбента используют амберлит ХАД.

5. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что адсорбционную хроматографию на колонках с силикагелем осуществляют дважды.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается получения биологически активного препарата - суммы тритерпеновых гликозидов из промышленных отходов переработки дальневосточной голотурии кукумария японская.

Сумма тритерпеновых гликозидов, выделенная из выварочных вод кукумарии японской (препарат КД), является одним из наиболее активных препаратов среди известных иммуномодуляторов (Седов А.М., Елкина С.И. и др. Способность тритерпеновых гликозидов из голотурий стимулировать антибактериальную устойчивость на модели экспериментального сальмонеллеза мышей. Ж. Микробиология, эпидемиология и иммунобиология, 1984, N 5, с. 55-58; Седов А.М., Шепелева И. Б. и др. Влияние кукумариозида (тритерпенового гликозида из голотурий Cucumaria japonica) на развитие иммунного ответа мышей на корпускулярную коклюшную вакцину, там же, 1984, N 9, с. 100-104). Препарат КД усиливает резистентность организма к заболеваниям, вызываемым рядом грамотрицательных микроорганизмов, и к некоторым вирусным болезням (Седов А.М., Аполлонин А. В. и др. Стимуляция тритерпеновыми гликозидами голотурий неспецифической антибактериальной резистентности мышей к условно-патогенным грамотрицательным микроорганизмам. Антибиотики и химиотерапия, 1990, т. 35, N 1, с. 23-26). Он используется в ветеринарии для профилактики ряда заболеваний сельско-хозяйственных животных и пушных зверей и снижения падежа молодняка (ТУ 08064-19-04-95; Наставление к применению N 10.07.184-95; Регистрационное удостоверение N P 004-2.0105; Номер Государственной Регистрации препарата: ПВР 2.01.0001-95).

Целевые вещества содержатся в выварочных водах в небольших количествах (от 5 до 30 г в 1 т выварочных вод в зависимости от используемого сырья и разбавления при варке).

Известен способ получения тритерпеновых гликозидов из голотурии Stichopus japonica Selenka, заключающийся в экстракции голотурии метанолом и выделении целевого продукта из экстракта на колонке с окисью алюминия в системе бутанол-толуол-вода (Химия природных соединений. 1968, N 4, с. 253-254). Способ трудоемок и связан с использованием токсичных и пожароопасных растворителей. Его применение исключает использование ценного исходного материала для пищевых и лечебно-профилактических целей.

Известен способ получения тритерпеновых гликозидов из голотурий Тихого океана, предусматривающий выделение целевого продукта и очистку его путем переосаждения в виде комплекса с холестерином ("Comp.Biochem.Physiol., 1973, Vol. 44В, рр. 325-336). Этот способ трудоемок и не обеспечивает достаточно высокого выхода продукта. В этом случае также не возможно использование в пищу голотурий, взятых для выделения гликозидов.

В качестве прототипа выбран способ получения тритерпеновых гликозидов из голотурии Cucumaria Frondosa, включающий обезжиривание лиофильно высушенных животных смесью петролейный эфир-хлороформ, с последующей экстракцией метанолом и концентрированием экстракта в вакууме. С целью очистки сухой экстракт растворяют в воде и многократно экстрагируют бутанолом. Концентрирование бутанольного экстракта в вакууме дает сырую смесь гликозидов ("Journal of Natural Products", 1984, Vol. 47, N 2, PP.320-324).

Все известные способы получения тритерпеновых гликозидов из голотурий связаны с использованием в качестве сырья ценного пищевого продукта. Предлагаемый способ получения тритерпеновых гликозидов в отличие от способа прототипа предполагает использование выварочных вод - промышленных отходов переработки голотурии кукумарии японской, что позволяет утилизировать отходы и сохранить ценное пищевое сырье. Способ предполагает использование либо выварочных вод, либо порошка, полученного сушкой выварочных вод на распылительной сушилке.

Выварочные воды из кукумарии представляют собой желтый или желтовато-коричневый с синим отливом вязкий непрозрачный раствор, содержащий не менее 20 - 30 г органического остатка на 1 кг. Выварочные воды содержат следующие соединения: кислые мукополисахариды, полисахариды, богатые остатками фукозы, белки, аминокислоты и пептиды, ганглиозиды, фосфолипиды, сульфат холестерина, тритерпеновые гликозиды, стероидные гликозиды, стерины, жирные кислоты, триглицериды.

Полученный порошок содержит те же вещества, что и выварочные воды и дополнительно продукты окисления и термической деструкции липидов, белков и кислых полисахаридов.

Варка кукумарии производится в неподкисленной воде непосредственно перед изготовлением из варенной кукумарии консервов или других пищевых продуктов. Сами воды в их производстве не используются и сливаются в море.

Сущность предлагаемого способа заключается в выделении целевого продукта из сырья и его очистку. В качестве сырья используют выварочные воды - отходы переработки голотурии, из которых гликозиды либо осаждают совместно с полисахарид-белковым комплексом при подкислении до pH 2,8, или при добавлении 1% хитозана в качестве флокулянта, или выварочные воды подвергают высушиванию до порошка, экстрагируют гликозиды из осадка или порошка этиловым спиртом или смесью среднеполярных растворителей и очищают гликозиды методом обращенно-фазовой хроматографии на колонках с гидрофобным сорбентом, в качестве которого используют либо Полихром-1, либо амберлит ХАД, с последующей адсорбционной хроматографией на колонках с силикагелем, которую проводят дважды.

Использование в качестве исходного сырья выварочных вод в предлагаемом способе получения суммы тритерпеновых гликозидов предполагает соответствующие операции и условия их проведения, позволяющие наиболее полно и с высокой степенью очистки выделить продукт.

Таким образом, предлагаемый способ получения отличается от известных способов не только используемым сырьем, но и операциями выделения и очистки.

Получение суммы тритерпеновых гликозидов иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение суммы тритерпеновых гликозидов из выварочных вод.

Выварочные воды (50 л) освобождают от механических примесей, фильтруя их через сито или ткань, и подкисляют до pH 2.8, добавляя 500 мл 10% серной кислоты небольшими порциями при перемешивании в течение 5 мин. Подкисленный раствор оставляют на 24 ч после чего декантируют водный слой. Осадок заливают этиловым спиртом (2 объема спирта на 3 объема осадка) и перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего фильтруют и собирают надосадочную жидкость-экстракт. Осадок вновь заливают спиртом, перемешивают в течение часа и вновь отделяют надосадочную жидкость. Полученную жидкую фазу присоединяют к экстракту.

Объединенный экстракт нейтрализуют прибавлением водного раствора соды до pH 6 и концентрируют на роторном испарителе в вакууме водоструйного насоса, добавляя небольшими порциями н-бутиловый спирт, чтобы исключить вспенивание, и поддерживая температуру раствора в интервале 50-60^oC. Остаток представляет собой темную стекловидную массу.

Вместо спирта можно использовать ацетон, метанол или другой водорастворимый среднеполярный растворитель,

Остаток растворяют в воде и пропускают раствор через колонку с Полихромом-1, (0,5 кг сорбента). Промывают колонку водой до отрицательной реакции на хлорид-анион. После этого колонку промывают 0,5-0,75 л 50% спирта. Водно-спиртовый элюат концентрируют в вакууме. Получают 2 г очищенного препарата с содержанием до 30% белка.

Очистку от белка осуществляют, растворив полученный препарат в 50 мл смеси этилового спирта, хлороформа и воды, взятых в соотношении 100:100:17, соответственно, при интенсивном перемешивании в течение 1 ч и фильтруя раствор через стеклянный фильтр Шотта объемом 500 мл, наполовину заполненный суспензией силикагеля КСК. Затем фильтр промывают 500 мл указанной системы растворителей. Фильтрат, содержащий тритерпеновые гликозиды-кукумариозиды, концентрируют, упаривая в вакууме. Содержание белка уменьшается до 10%. Повторная операция очистки кукумариозидов на фильтре позволяет снизить содержание белка до 3%. Выход препарата 0,8 г.

Пример 2. Получение суммы тритерпеновых гликозидов из порошка выварочных вод.

1 кг порошка, полученного при высушивании выварочных вод с помощью подходящей сушилки (распылительной, с температурой в активной зоне не выше 150-200^oC, барабанной и т.п.), интенсивно перемешивают с 1 л смеси хлороформ-спирт-вода 100:100:17, и полученную массу профильтровывают на воронке Бюхнера в вакууме водоструйного насоса через бумажный или тканевый фильтр. Остаток на фильтре промывают в слабом вакууме еще 1 л этой же системы. Экстракт концентрируют на роторном испарителе в вакууме при 40^oC. Остаток, представляющий темную стекловидную массу, растворяют в воде при интенсивном перемешивании в течение 1 ч и фильтруют через бумажный фильтр. Водный раствор, содержащий кукумариозиды, пропускают через колонку с амберлитом ХАД. Элюируют кукумариозиды 50% спиртом. Водно-спиртовый элюат концентрируют в вакууме. Окончательную очистку проводят фильтрацией через силикагель (дважды) в системе хлороформ-этиловый спирт-вода 100:100:17. Выход целевого продукта 0,5 г с содержанием белка менее 3%.

Полученный продукт - сумма тритерпеновых гликозидов, состоящая из более десяти компонентов, представляет собой чуть желтоватый мелкокристаллический, слегка гигроскопичный порошок, хорошо растворимый в воде, в 50% этаноле, пиридине.

Препарат обладает сильной иммуностимулирующей активностью и разрешен для применения в ветеринарии для профилактики заболеваний пушного зверя, свиней, собак и других животных.