способ выявления сенсибилизации к лекарственным аллергенам

Формула изобретения

Способ определения сенсибилизации к лекарственным аллергенам путем выделения и инкубации фракции лимфоцитов с последующим физико-химическим исследованием образцов, отличающийся тем, что в выделенной и очищенной фракции лимфоцитов, а также плазме или сыворотке крови измеряют уровень спонтанной хемилюминесценции, а затем к каждому образцу добавляют лекарственный аллерген в конечной концентрации, равной разовой терапевтической дозе для данного лекарственного аллергена, деленной на общий объем крови пациента, и при увеличении уровня индуцированной хемилюминесценции после инкубации образцов с лекарственным аллергеном на 20% и более по сравнению с исходным определяют сенсибилизацию к аллергену.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии, и может быть использовано для выявления сенсибилизации к лекарственным препаратам.

Среди всех аллергических заболеваний и состояний особое положение занимает лекарственная аллергия. Клинические осложнения лекарственной непереносимости в значительной степени определяют исход и течение многих заболеваний, затрудняя применение эффективной, а иногда и жизненноважной терапии.

Существующие способы определения сенсибилизации к лекарственным препаратам не позволяют достаточно достоверно и безопасно для больного установить истинную причину. Кожные пробы с медикаментами малонадежны и далеко не безвредны для пациента, так как приводят к развитию тяжелых аллергических реакций, вплоть до анафилаксического шока. Известны тесты in vitro: тест дегрануляции базофилов по Шелли (Shelly, 1963), реакция дегрануляции тучных клеток Schwartz at al, 1965), показатель повреждения нейтрофилов (В.А.Фрадкин, 1962), используемые для диагностики лекарственной аллергии. Однако в большинстве случаев корреляция результатов этих тестов с клиникой оказалась не выше 50%. Вышеупомянутые тесты выявляют аллергические реакции немедленного типа. Аллергия, обусловленная медикаментами, может протекать и по замедленному типу. В таких случаях эти тесты оказываются отрицательными даже при наличии явной аллергии. В настоящее время существует еще ряд методов диагностики лекарственной аллергии in vitro. Г.М.Дизик с соавторами диагносцируют лекарственные аллергозы на основе разницу во времени свертываемости крови с аллергеном и без него (Врачебное дело.1988,-N5,-с.71- 73). В другом методе состояние гиперчувствительности к данному лекарственному препарату устанавливают при повышении количества активных розеток лимфоцитов с эритроцитами барана под влиянием лекарственного антигена на 10% и более по сравнению с контролем (Г.В.Порядин и др. Иммунология. -1988,-N-5,-с.52-54).

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ Г.Б.Афониной с соавторами по авторскому свидетельству СССР N 1569705, G 01 N 33/48, опубл. 07.06.90, бюл. N 21.

По этому способу лимфоциты выделяют из 2 мл гепаринизированной крови (20 ед/мл) на градиенте плотности 1,077 г/см³ по методу Бойум (Boyum). Лимфоциты двукратно отмывают в растворе Хэнкса без индикатора, центрифугируя 5 мин при 1500 об/мин, и подсчитывают число клеток в камере Горяева. Раствором Хэнкса доводят концентрацию клеток до 1,0-1,5 млн/мл и помещают в пластиковые кюветы по 1 мл суспензии клеток. Выдерживают 5 минут в биостате хемилюминометра (ХЛМ 1Ц - 01) при 37^oC. Измеряют уровень спонтанной хемилюминесценции (ХЛ) клеток за 500 с в импульсах в секунду, вносят в пробу 20 мкл раствора аллергена в конечной концентрации 0,01 - 0,05 мкг/мл, разведенного на растворе Хэнкса, инкубируют 10-20 мин в биостате при 37^oC и измеряют ХЛ в течение 500с. При возрастании показателя ХЛ на 11% и более после инкубации с аллергеном диагносцируют сенсибилизацию к данному аллергену.

Однако описанный выше метод разработан авторами (Г.Б.Афонина и др.) для определения сенсибилизации к бытовым, пыльцевым, бактериальным, но не лекарственным аллергенам. А методы, используемые для диагностики именно лекарственной аллергии, малоэффективны и часто не согласуются с клиническими проявлениями повышенной чувствительности к лекарственным препаратам.

Целью предлагаемого изобретения является повышение точности и информативности способа выявления сенсибилизации к лекарственным аллергенам.

Поставленная цель достигается тем, что у больного из вены берут кровь, выделяют, дополнительно очищают фракцию лимфоцитов и плазму (или сыворотку) крови, измеряют их хемилюминесценцию и при увеличении уровня ХЛ после инкубации с лекарственным аллергеном, взятом в определенной концентрации, на 20% и более по сравнению с исходной, определяют сенсибилизацию к аллергену.

Пример конкретного выполнения.

Мононуклеарные клетки крови выделяют из венозной крови, взятой натощак, общепринятым методом (Boyum, 1968) на градиенте плотности фиколл-верографина (d= 1,077 г/см). В качестве консерванта, при заборе крови, используют 2,7%-ный раствор ЭДТА в соотношении объемов ЭДТА:кровь = 1:9. Моно-нуклеары дважды отмывают раствором Хэнкса без фенолового красного, центрифугируя 7-10 мин при 1200-1500 об/мин, и подсчитывают число клеток в камере Горяева. Моноциты удаляют в результате инкубации клеточной суспензии на пластике при 37^oC в атмосфере 5% СО₂ в течение 40-60 мин. В дальнейшем используют взвесь неприлипшых клеток, содержащую 98-100% лимфоцитов. Плазму, оставшуюся после разделения клеток на фиколл-верографине, собирают в чистую посуду и хранят при +4^oC.

Аллергены для исследований готовят из коммерческих лекарственных препаратов таким образом, чтобы после внесения 0,02 мл раствора аллергена конечная концентрация препарата составляла разовую терапевтическую дозу (для данного лекарственного препарата), деленную на общий объем крови пациента. В качестве аллергенов используют антибиотики, анестетики, сульфаниламиды, белковые, витаминные и другие препараты.

К 1 мл взвеси лимфоцитов добавляют 0,1 мл 10^-3 М раствора люминола, инкубируют 15 минут при 37^oC и измеряют уровень спонтанной хемилюминесценции (СХЛ) в течение 1 минуты. Затем в каждую кювету добавляют 0,02 мл соответствующего лекарственного препарата, взятого в предварительно отработанной концентрации. Пробы инкубируют в термостате при 37^oC в течение 30 минут и периодически, с интервалом в 5 минут, регистрируют индуцированную хемилюминесценцию (ИХЛ). Регистрацию ХЛ проводят на установке для радиобиохимических исследований "БЕТА 2" при красном свете. При возрастании показателя ИХЛ относительно СХЛ на 20% и более диагносцируют сенсибилизацию к данному лекарственному препарату. Это первая часть предлагаемого способа выявления сенсибилизации к лекарственным препаратам, условно называемая клеточный тест, выполняется непосредственно в день забора крови.

Далее в кювету (вместо суспензии клеток) помещают 1 мл плазмы или сыворотки крови, добавляют 0,1 мл 10^-3 М раствора люминола и повторяют все разделы методики, описанной выше для клеточного теста. Это вторая часть метода - гуморальный тест, может выполняться в течение 1-2 суток после забора крови.

У больных с лекарственной аллергией положительные реакции на лекарственные аллергены могут давать и клеточными гуморальный тесты. Причем сочетание положительных реакций может быть различным: усиление интенсивности ХЛ на определенный аллерген может наблюдаться одновременно в обоих тестах и только в одном из них. Что позволяет не только выявить состояние сенсибилизации и спектр возможных аллергенов, но также установить преимущественный тип реагирования (реакции клеточного и гуморального типа), что может оказаться решающим в дальнейшей диагностике и терапии.

Всего было обследовано 50 человек из числа лиц, находившихся на лечении в клинике Нижегородского НИИЭМ по поводу заболеваний желудочно-кишечного тракта и желчевыводящих путей. Среди больных были выделены три группы. Первую группу (20 чел) составили больные, имевшие в анамнезе признаки лекарственной непереносимости или аллергические реакции иной этиологии. Вторую группу (14 человек) составили больные, не имевшие в анамнезе аллергических реакций, но предъявившие в процессе лечения жалобы на ухудшение самочувствия, лихорадочное состояние, зуд, кожные высыпания. В третью группу (16 чел) вошли больные без аллергического анамнеза, с хорошей переносимостью применяемых лекарственных средств.

В результате проведенных исследований получены следующие данные. При обследовании первой группы больных предлагаемым методом подтверждена сенсибилизация к препаратам, вызывавшим ранее лекарственную аллергию (диагноз поставлен врачом-аллергологом на основе анамнеза, кожные пробы невозможны ввиду их опасности для больного). У этих же больных выявлено состояние сенсибилизации к ряду других как близких, так и совершенно отличных по химическому составу лекарственных препаратов.

Пример 1. Больной У. находился на лечении в клинике ННИИЭМ с диагнозом вирусный гепатит В. В ходе лечения появился зуд и кожные высыпания. В анамнезе аллергическая реакция на пенициллин, установленная в детском возрасте. В настоящий момент антибиотики пеницилинового ряда не получал. Хемилюминометрия лимфоцитов и плазмы крови подтвердила наличие сенсибилизации к пенициллину, сохранившуюся в течение 10 лет. Кроме того, выявлено состояние сенсибилизации к витаминам группы В.

Во второй группе у 11 из 14 человек предлагаемым способом выявлено состояние сенсибилизации к некоторым из получаемых препаратов.

Пример 2. Больной М. находился на лечении в клинике ННИИЭМ с диагнозом хронический эрозивный гастродуоденит со сниженной секреторной и кислотообразующей функцией, обострение, хронический холецистохолангит, обострение. В ходе лечения у больного появился кожный зуд. Хемилюминометрия лимфоцитов и плазмы крови по предлагаемому способу показала сенсибилизацию больного к витаминам группы В и сульфопрепаратом (прирост уровня ХЛ на 200% и 50% соответственно). На другие применяемые препараты (гентамицин, новокаин, нистатин) увеличения уровня ХЛ не отмечено. Отмена соответствующих препаратов привела к исчезновению клинических признаков лекарственной непереносимости. У остальных 3-х больных из этой группы, несмотря на наличие клинических симптомов, сходных с проявлениями лекарственной аллергии, состояния сенсибилизации к получаемым ими лекарственным препаратам не выявлено (уровень ХЛ не изменился). При дополнительном обследовании этих больных установлено, что причиной "аллергической симптоматики" (крапивница, зуд, сыпь) могли быть сахарный диабет у одного, бытовая аллергия у другого и пирогенная реакция на внутривенное введение альбумина у третьего больного.

В третьей группе у всех 16 обследованных больных хемилюминометрия лимфоцитов и плазмы крови не выявила положительных реакций ни на один из получаемых лекарственных препаратов.

Таким образом, предлагаемый метод выявления сенсибилизации к лекарственным аллергенам прост, объективен, безопасен для больного, позволяет с точностью до 100% выявить спектр возможных аллергенов, расширяет возможности врача-клинициста в коррекции проводимой терапии.