способ количественной оценки результатов иммуноферментного анализа

Формула изобретения

Способ количественной оценки результатов иммуноферментного анализа с использованием прозрачного плоскодонного стрипа, отличающийся тем, что стрип, лунки которого содержат продукты иммуноферментной реакции, помещают в фиксирующее приспособление, представляющее собой экран с цилиндрическими сквозными отверстиями, соответствующими дну лунок стрипа, и обеспечивающие прохождение светового потока к лункам стрипа и его отражение, затем определяют оптическую плотность полученного отражения с разрешением от 400х600 до 600х600 dpi и по ее величине оценивают результаты анализа.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к иммунологии, в частности к оценке результатов иммунологических анализов.

Цель изобретения - обеспечение возможности детектирования колориметрических результатов исследований без использования специализированных приборов.

Предшествующий уровень техники.

Известны многочисленные устройства для количественной детекции содержимого лунок плоскодонных плашек (патенты US 4710031, US 5671290, US 4810096, JP 10274624A2).

Наиболее близкий аналог предлагаемого изобретения описан в патенте US 4710031 на "Microtiter plate reader". Предлагается ридер для плоскодонных плашек, который позволяет проводить визуальную экспертизу содержимого массива лунок плашки. Ридер включает средства поддержки плашки с лунками и имеет светоизлучающую поверхность, расположенную сверху. Области светоизлучения расположены таким образом, что соответствуют измеряемым на плашке лункам. Устройства ввода светового сигнала расположены снизу под плашкой и таким образом, чтобы обеспечить выборочную юстировку лунок.

Однако все предлагаемые аппараты не являются универсальными и зачастую представляют из себя закрытые или частично закрытые системы.

Сущность изобретения

Предлагаемые способ и приспособление позволяют проводить количественную оценку результатов иммуноферментного анализа с помощью регистрации и обработки оптического сигнала от лунок иммунологических плоскодонных стрипов с любым размером лунок. После проведения иммуноферментного анализа в зависимости от его результатов изменяется окраска содержимого лунок стрипа. Так как это изменение зависит от наличия аналита в исследуемом образце, измерение оптической плотности лунок позволяет оценить количество аналита в исследуемых образцах. Для измерения оптической плотности нами предложен следующий метод. Стрип, содержащий окрашенные продукты иммуноферментного анализа, помещали в фиксирующее прспособление таким образом, что дно лунок стрипа было обращено в сторону источника света и оптического датчика сканера. При этом лунки стрипа находились параллельно оси перемещения оптического датчика сканера. Световой пучок от источника света через прорези в фиксирующем устройстве попадал на дно лунок стрипа и, отражаясь от них, регистрировался датчиком. Полученный сигнал поступал со сканера в компьютер, формируя изображение дна лунок стрипа. Эти изображения обрабатывали с помощью программы "SigmaScan Pro 5"(Copyright 1987-1999 SPSS Inc.). Эта программа преобразует суммарную оптическую плотность изображения в числовую форму.

Мы использовали планшетный сканер с оптическим разрешением от 400600 до 600600 dpi. Выбор данного диапазона разрешения был обусловлен двумя факторами: при меньшем оптическом разрешении для точной регистрации оптической плотности разрешение недостаточно, а при большем существенно увеличиваются системные требования к компьютеру и возрастает время анализа изображения из-за многократно большего размера файла со сканированным изображением. Сканирование изображений производили в различных режимах, подбирая оптимальный. Для фиксации стрипа на планшете сканера и минимизации оптических искажений полученного изображения, что приводит к искажению результатов, мы использовали специальное фиксирующее приспособление. Фиксирующее приспособление представляет собой прозрачный экран с прорезями, позволяющими фиксировать плоскодонный стрип вдоль оси перемещения оптического датчика сканера.

Для измерения концентрации аналита в исследуемых образцах измеряется оптическая плотность лунок, в которых был проведен иммуноферментный анализ образцов аналита с известной концентрацией в серийных разведениях. После измерения оптической плотности с помощью полученных данных строится калибровочная кривая. Оптическая плотность исследуемых образцов наносится на график калибровочной кривой для вычисления концентрации аналита в них.

Изобретение поясняется чертежами, где:

на фиг. 1 показано фиксирующее приспособление для плоскодонных стрипов, вид сверху;

на фиг.2 - фиксирующее приспособление, вид сбоку;

на фиг.3 - фиксирующее приспособление, вид спереди.

На фиг. 1 изображен один из конструктивных вариантов фиксирующего приспособления для стрипов. Приспособление состоит из прозрачного экрана 1, в котором вырезаны вдоль оси перемещения оптического датчика сканера фиксатора для стрипов 2. На фиг.2 и 3 изображено это же приспособление в разрезе по осевой линии, фронтальная и боковая проекции соответственно.

Пример

В лунки стандартного 8-луночного плоскодонного стрипа помещали серийные разведения конъюгата кроличьих антител с пероксидазой хрена. Затем в эти лунки добавляли равное количество смеси тетраметилбензидина с перекисью водорода в цитратном буфере с рН 4,7. Через 10 минут реакцию останавливали добавлением в лунки 50% Н₂SO₄. Окрашенный стрип помещали в плашечный фотометр "Multiscan EX" и учитывали результат реакции при длине волны 450 нм. Затем стрип помещали в фиксирующее приспособление и сканировали изображение стрипа с разрешением 400600 и 600600 dpi. Полученное изображение анализировали при помощи программы "SigmaScan Pro 5"(Copyright 1987-1999 SPSS Inc.), используя для оценки всю поверхность изображения дна лунок стрипа с применением синего программного светофильтра. Как параметр для оценки использовали среднюю оптическую плотность. Полученные данные по светопропусканию преобразовали по формуле А=1/D, где А - оптическая плотность в относительных единицах, а D - среднее светопропускание в относительных единицах. Данные, полученные при разрешениях 400600 и 600600 dpi, практически совпали. При попытке получения данных с разрешением менее 400600 dpi изображение утрачивало четкость, что затрудняло его обработку, а при разрешении более чем 600600 dpi числовые значения данных практически не изменялись, но значительно увеличивался объем файлов, что затрудняло работу с ними. Полученные оптические плотности нанесли на графики. После их сравнения выяснилось, что оба графика (и со сканера, и с "Multiscan EX") равномерно монотонны и позволяют использовать их в качестве калибровочной кривой для оценки иммуноферментного анализа. Различие состояло в том, что кривая, полученная с "Multiscan EX", имела более логарифмический характер, что менее удобно для измерений, связанных с крайними областями этой кривой.

Серийные разведения конъюгата были использованы для построения калибровочной кривой. Использовались разведения 1:1600; 1:3200; 1:6400; 1:12800; 1: 25600. Затем были приготовлены разведения 1:2000; 1:5000; 1:10000, использованные как исследуемые образцы. Иммуноферментный анализ лунок калибровочной кривой и исследуемых лунок проводили одновременно, затем измеряли оптическую плотность в них двумя способами: на "Multiscan EX" и с помощью обработки изображения лунок, помещенных в фиксатор на планшетном сканере, как было описано выше. С помощью полученных данных строили калибровочные кривые оптических плотностей. Затем оптическую плотность исследуемых лунок наносили на соответствующие графики калибровочных кривых. Таким образом были получены данные концентраций конъюгата в образцах. Результаты эксперимента приведены в таблице.

Из таблицы видно, что погрешность при измерении обоими методами находится в пределе 6%. Так как измерение оптической плотности результатов иммуноферментного анализа с помощью "Multiscan EX" считается стандартным, можно утверждать, что измерения с помощью сканера с предложенным нами фиксирующим приспособлением также может быть использовано для таких измерений.