способ терапевтического воздействия на организм

Формула изобретения

1. Способ терапевтического воздействия на организм путем облучения фракции циркулирующей в организме жидкости, обогащенной лимфоцитами, ультрафиолетовым излучением (УФИ) в присутствии фотоактивного химического агента с последующим возвращением облученной фракции в организм, отличающийся тем, что указанную выше облученную фракцию вводят в лимфатическую систему организма.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве фотохимического агента используют 8-метоксипсорален, бергаптен, изопат, изокимпинеллин или их комбинации, пирен, холестерилолеат, акридин, порфирин, протопорфирин, флюоресцеин, родамин, 16-диазокортизон, эпидиум, комплексы переходных металлов с блеомицином, комплексы переходных металлов с дегликоблиомицином, органоплатиновые комплексы.

3. Способ терапевтического воздействия на организм с использованием фотоактивного химического агента и УФИ, отличающийся тем, что в лимфатический сосуд вводят световолокно и соединяют его с источником УФИ.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве фотоактивного химического агента используют 8-метоксипсорален.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к иммунологии, а именно к способам модификации иммунной системы млекопитающих для подавления функционирующей популяции иммунокомпетентных клеток (лимфоцитов). Изобретение может быть использовано при терапии заболеваний людей и животных, в частности при некоторых онкологических заболеваниях (лейкозов, кожных Т-клеточных лимфом и др.) и при аутоиммунных заболеваниях (гепатите В, ревматоидном артрите и др.).

Для лечения заболеваний, связанных с нарушением функционирования иммунной системы, известны способы, заключающиеся в подавлении лимфоцитов.

Известен способ терапевтического воздействия на организм, описанный в патенте PCT/GB 88/00951, включающий в себя забор лимфы у пациента из грудного протока, облучение ее ультрафиолетовыми лучами и возвращение облученной лимфы в лимфатическую систему пациента.

Под действием ультрафиолетового излучения лимфоциты претерпевают прямое деструктивное изменение, приводящее в итоге к их гибели. Ввиду того, что большая часть лимфоцитов представлена патологическими клонами, то и разрушению в основном подвергаются патологические лимфоциты. Это приводит к терапевтическому эффекту.

Однако облученные таким способом лимфоциты не обладают достаточной иммуногенностью. То есть при введении их в лимфатическую систему, здоровые иммунокомпетентные клетки лимфоидной ткани при контакте с такими лимфоцитами не способны осуществлять реакцию, приводящую к возникновению иммунного ответа, направленного на разрушение или подавление функциональной и метаболической активности таких патологических клеток самим организмом.

Для того чтобы достичь эффективного подавления патологических лимфоцитов самим организмом, в биологическую жидкость, обогащенную лимфоцитами, вводят фотоактивный химический агент, специфичный к рецепторным сайтам в/на компонентах указанной биологической жидкости, активируемый ультрафиолетовым излучением и способный при активации указанным ультрафиолетовым излучением к образованию фотоаддуктов с рецепторными сайтами компонентов указанной биологической жидкости, обеспечивая таким образом химическое связывание между указанным фотоактивированным химическим агентом и указанными рецепторными сайтами.

Добавленный в биологическую жидкость, обогащенную лимфоцитами, фотоактивный химический агент сорбируется на клеточных мембранах, мембранах ядер клеток и их содержимом, а также на компонентах межклеточной жидкости. Под действием ультрафиолетового излучения фотоактивный химический агент переходит в активное состояние и становится высокореакционноспособным. Некоторые фотоактивные химические агенты, например из класса фурокумаринов, в таком состоянии образуют ковалентные сшивки между пиримидиновыми основаниями комплементарных цепей ДНК в клеточном ядре, блокируя возможность расхождения цепей ДНК при делении клеток. Таким образом предотвращается пролиферация лимфоцитов.

Одновременно под действием УФИ сорбированный на рецепторных сайтах в/на компонентах биологической жидкости фотоактивный химический агент либо значительно интенсифицирует фотохимические реакции, протекающие под действием УФИ (кислородозависимые свободнорадикальные реакции липидов клеточных мембран), что приводит к изменению рецепторного поля мембран и их антигенных детерминант, либо повышает степень специфического воздействия агента (когда в качестве такого агента используются комплексы носитель-фотоактивная группа, а носителем является биологически активное соединение, обладающее специфическим подавляющим действием на иммунокомпетентные клетки - антитела, кортизон и др.). Таким образом, в ходе указанных процессов терапевтический эффект достигается тем, что прямо разрушаются или подавляются функциональная и метаболическая активность обрабатываемых клеток, что ведет к "механическому" снижению содержания клеток в обрабатываемой жидкости, с другой стороны, введение обработанных клеток и их фрагментов с сильно измененными (из-за образования под действием облучения фотоаддуктов с участием компонентов клеток и молекул фотоактивного химического агента) антигенными структурами в организм приводит к формированию иммунологического ответа организма, направленного на подавление популяции патологических клеток. Ввиду того, что клоны патологических клеток по количеству клеток значительно превосходят здоровые, а также потому, что именно в них наиболее сильно проходят метаболические процессы, фотохимическому воздействию в первую очередь подвергаются патологические клетки и именно они способны вызывать после образования ковалентно связанных устойчивых фотоаддуктов и введении их в организм системный иммунный ответ, направленный против них.

В патенте США № 613322 описан способ терапевтического воздействия на организм, включающий в себя забор крови у пациента, отделение от нее центрифугированием фракции красных кровяных клеток и большей части плазмы с получением фракции, в которой клеточный компонент преимущественно представлен лимфоцитами. Затем производят облучение указанной фракции, обогащенной лимфоцитами, ультрафиолетовым излучением в присутствии растворенного фотоактивного химического агента, который вводят в организм пациента за 2 ч до начала забора крови. Далее облученную таким образом фракцию вводят обратно в кровеносную систему пациента.

При введении указанной облученной фракции крови в кровеносное русло находящиеся в ней иммуногенные фотоаддукты, образованные под действием УФИ с участием компонентов обрабатываемой жидкости и молекул фотохимического агента, не имеют возможности взаимодействовать со здоровыми интактными лимфоцитами, циркулирующими в крови, так как, во-первых, для осуществления указанного терапевтического воздействия основная часть (до 75%) из имеющихся в кровеносной системе пациента лимфоцитов должна подвергаться облучению, а во-вторых, наличие других клеточных элементов крови, прежде всего эритроцитов, содержание которых значительно выше, препятствует непосредственному контакту иммуногенных фотоаддуктов со здоровыми клетками. Основной же иммунный ответ, вызванный появлением в организме измененных антигенных структур при введении фотоаддуктов обратно в кровеносную систему, локализован в основном в пределах селезенки. Но даже в селезенку попадает лишь ограниченная часть этих иммуногенных фотоаддуктов, что связано с тем, что значительная часть таких иммунореагентов, находящихся в крови, фиксируется на поверхности макрофагов, а так как вся кровь проходит через печень, где находится большое число макрофагов, основная часть введенных в кровь иммуногенных аддуктов оказывается в печени, а также в почках и легких, и лишь оставшаяся часть (до 10% от всего количества) приходится на селезенку.

Это снижает терапевтический эффект от воздействия облучения.

Целью данного изобретения является повышение терапевтического воздействия на живой организм, имеющий лимфатическую систему.

Другой целью изобретения является создание способа терапевтического воздействия на организм, обеспечивающего более интенсивное подавление патологических клеток и их пролиферации.

Еще одной целью изобретения является создание способа терапевтического воздействия на организм, обеспечивающего более мощный иммунный ответ организма на введение в него иммуногенных фотоаддуктов.

Согласно изобретению способ модификации иммунной системы предусматривает получение из указанного организма биологической жидкости, в которой клеточный компонент преимущественно представлен лимфоцитами, и облучение ее ультрафиолетовыми лучами. Перед облучением в организм per os (или иным способом (внутривенно и т.д.)) вводят растворимый в указанной биологической жидкости фотоактивный химический агент. Фотоактивный химический агент можно вводить и непосредственно в биологическую жидкость перед облучением. После облучения биологическую жидкость вводят в лимфатическую систему организма.

При таком способе терапевтического воздействия на организм образованные под действием ультрафиолетового излучения с участием компонентов обрабатываемой жидкости и молекул фотохимического агента иммуногенные фотоаддукты попадают в среду со значительным содержанием здоровых интактных лимфоцитов и, следовательно, имеют возможность интенсивно взаимодействовать с ними. Это приводит к немедленному возникновению на уровне популяции здоровых иммунокомпетентных клеток, циркулирующих в лимфе. В результате происходит гораздо более эффективное подавление патологических лимфоцитов, циркулирующих в организме, что значительно усиливает терапевтическое воздействие. Более того, перемещаясь с лимфой в грудной проток и далее в кровь, образованные фотоаддукты проходят через целый ряд регионарных лимфоузлов, которые в ответ на такой стимул формируют генерализованный иммунный ответ, вовлекая в него всю лимфоидную систему. Это также способствует более интенсивному подавлению патологических клеток. Тем самым повышается эффективность терапевтического воздействия на организм.

В качестве биологической жидкости, в которой клеточный компонент преимущественно представлен лимфоцитами, можно использовать непосредственно лимфу из лимфатической системы пациента, фракцию лимфы, обогащенную лимфоцитами, или фракцию крови, обогащенную лимфоцитами.

В другом вариант изобретения облучение производят непосредственно в одном из сосудов лимфатической системы организма.

Фотоактивный химический агент может представлять собой:

1) какой-либо из активных фурокумаринов или их комбинацию, метиленовый синий, пирен, холестерилолеат, протопорфирин, порфирин, акридин, флюоресцеин, родамин, 16-диазокортизон, этидиум, комплексы переходных металлов с блеомицином, комплексы переходных металлов с дегликоблеомаицином, органоплатиновые комплексы;

2) полипептид, выбранный из группы, включающей в себя интерлейкин, трансферин, тимопоэтин, инсулин, антитела, моноклональные антитела, с которыми ковалентно связан фотоцитотоксический химический агент;

3) липосому, связанную с полипептидом, в которой находится фототоксический химический агент, выбранный из группы, включающей в себя фурокумарины, пирен, холестерилолеат, акридин, порфирин, протопорфирин, флюоресцеин, родамин, 16-диазокортизон, этидиум, комплесы переходных металлов с блеомицином или с дегликоблеомицином, органоплатиновые комплексы.

Терапевтическое воздействие осуществляют следующим образом.

В организм вводят одно из перечисленных выше соединений (внутривенно, per os, эндолимфатически или иным способом). Через некоторое время концентрация введенного агента становится достаточной для осуществления процедуры облучения. Из организма отбирают биологическую жидкость, основной клеточный компонент которой представлен лимфоцитами и в которой присутствует растворенный фотоактивный химический агент. Для этого можно забрать у пациента кровь, известным образом с помощью центрифугирования отделить фракцию, содержащую в основном лимфоциты, а фракции, не содержащие лимфоцитов, вернуть обратно в кровеносную систему пациента. После этого фракцию крови, обогащенную лимфоцитами, помещают в кювету. Фотоактивный химический агент можно добавлять непосредственно в эту кювету и на этой стадии осуществления способа, не ввода агент предварительно в организм. Как известно из патента США № 613322, в качестве такого агента может быть выбрано любое, из перечисленных выше соединений. Растворенный в биологической жидкости, обогащенной лимфоцитами, фотоактивный химический агент сорбируется на поверхности мембран клеток и клеточных элементов, а также, если агент способен проникать в клеточное ядро и имеет сродство к ДНК, - на участках ДНК.

Затем проводят облучение биологической жидкости (фракции крови) в кювете ультрафиолетовым излучением с длиной волны от 200 до 800 нм, которая варьируется в зависимости от используемого фотоактивного химического агента. Облучение можно осуществлять с помощью ртутных ламп, ксеноновых ламп, лазеров.

В случае агентов, интеркалировавших в темновую стадию между парами оснований ДНК, действие излучения приводит к необратимой деструкции ДНК или образованию ковалентных сшивок между основаниями из комплементарных цепей ДНК с участием фотохимического агента.

В результате образуются прочные комплексы с выраженными измененными устойчивыми антигенными свойствами. Применение связанных с фотоактивными химическими группами (фотоактивированных) известных природных соединений и фармакопрепаратов, для которых на мембранах клеток имеются соответствующие им рецепторные сайты (антитела, природные полипептиды (интерлейкин, трансферин и др.), кортизон и др.) приводит к более мощному проявлению их биологического действия, направленного на прямое разрушение или подавление функциональной и метаболической активности клеток-мишеней, следствием чего является формирование в облученной жидкости фотоальтерированных нежизнеспособных клеток и их фрагментов, способных при введении в лимфатическую систему вызывать реакцию со стороны здоровых компонентов лимфоидной ткани. Вследствие того, что метаболические процессы, свойственные живой клетке, протекают значительно более интенсивно в патологических клетках, чем в здоровых, деструкции и потере функциональной активности подвергаются в первую очередь патологические клетки.

В том случае, когда обработка биологической жидкости ультрафиолетовым излучением проводится в присутствии фотоактивного химического агента, обладающего свойствами фотосенсибилизатора, например псоралена, в среде с незначительным содержанием кислорода (в частности, при слабом вакуумировании образца биологической жидкости перед обработкой) фотохимические реакции в жидкости приобретают направленность в сторону образования диаддуктов псоралена с нитями ДНК и формирования в жидкости наряду с ингибированием процессов деления обработанных клеток искусственных однородных структур, которые способны вызывать со стороны здоровых лимфоцитов сильную реакцию, направленную против указанных однородных антигенных структур.

Если необходимо инициировать поливалентный иммунный отклик организма, то обработку биологической жидкости целесообразно проводить при повышенном содержании кислорода для интенсификации кислородозависимых реакций фотохимических агентов в биологическом субстрате. Это легко достичь, производя облучение жидкости с растворенным в ней фотосенсибилизатором в емкости, в которую под давлением подается кислород. При этом в жидкости в ходе реакций радикальной природы происходят разрушение многих клеточных структур и изменение клеточной поверхности значительного числа иммунокомпетентных клеток, образование многочисленных клеточных фрагментов, ковалентно связанных с молекулами фотоагента и обладающих иммуногенными свойствами.

Затем обработанную фракцию крови вводят в лимфосистему. Для этого катетеризируют лимфососуд известным способом. Целесообразно делать это на одной из конечностей.

При введении обработанной жидкости в лимфатическую систему наблюдается выраженный иммунный ответ. Возможность контакта иммуногенных фотоаддуктов с определенными группами клеток лимфоидных органов обусловлена анатомическим положением этих клеток. В случае введения иммуногенного фотоаддукта эндолимфатически (или в окружающую лимфоузлы жировую клетчатку, или в лимфоузлы, что технически более сложно) этот иммунореагент доставляется лимфой в дренирующие данную область лимфоузлы, где он взаимодействует с макрофагами медулярной области и дендритными клетками лимфоидных фолликулов и почти полностью проходит через регионарные лимфатические узлы, что вызывает мощный генерализованный иммунный ответ всей системы. В лимфе отсутствуют компоненты, способные экранировать находящиеся в ней интактные здоровые лимфоциты от взаимодействия с иммуногенным фотоаддуктом, в результате чего развивается реакция со стороны здоровых клеток, направленная на подавление патологических клеток. При этом достичь значительного терапевтического эффекта можно, используя небольшие количества иммунореагента.

При эндолимфатическом введении обработанных клеток в организм имеется возможность непосредственного взаимодействия иммуногенных фотоаддуктов со здоровыми иммунокомпетентными клетками in vivo, например, путем антиидиотипических реакций. Кроме того, не исключено, что сильный иммунный отклик может быть связан с инициацией прямо в лимфосистеме реакции смешанной культуры лимфоцитов, особенно если обработка клеток производилась при повышенной концентрации кислорода.

Точки пунктации лимфатических сосудов целесообразно выбирать на конечностях, так как в соответствии с анатомическим строением лимфатической системы до того как попасть в кровеносную систему введенный фрагмент иммуногенных фотоаддуктов неизбежно будет продвигаться через всю систему регионарных лимфоузлов, которых на его пути достаточно много, вызывая мощный иммунный отклик. При этом значительно увеличиваются вероятность и длительность взаимодействия с ним здоровых клеток, что усиливает иммунный ответ.

Заявляемый способ был осуществлен следующим конкретным образом.

Пример 1. Корова черно-пестрой породы. Диагноз: Острый лимфолейкоз, сопровождающийся значительным повышением общего количества лимфоцитов в крови - 35 тыс. на 1 мл.

Из яремной вены у коровы шприцем емкостью 300 мл забирали 250 мл крови, которую стабилизировали гепарином - 15 ед. на 1 мл. Забранную кровь разделяли на фракции центрифугированием в течение 20 мин при скорости вращения ротора сепаратора 2000 об/мин.

Обогащенную лимфоцитами фракцию собирали в стерильный флакон объемом 25 мл. Оставшиеся плазму и эритроцитарную массу перемешивали и вводили обратно в кровеносное русло коровы с помощью шприца через точку первоначальной пунктации. Процедуру повторяли еще 7 раз, в результате во флакон было набрано 200 мл суспензии лимфоцитов в плазме.

Затем в емкость с суспензией добавляли 40 мг псоберана (препарат, содержащий смесь 8-метоксипсоралена и бергаптена) и в течение 10 мин перемешивали в специальном встряхивающем устройстве. Далее суспензию облучали, пропуская через кювету размером 140 мм 25 мм 1 мм при энергетической освещенности в плоскости кюветы 2 мВт/см². Скорость движения суспензии через кювету составляла 20 мл/мин. Почти 90% энергетической освещенности в плоскости кюветы создавалось излучением УФА с максимумом вблизи 350 нм.

Затем дренировали лимфатический сосуд на задней конечности и устанавливали катетер, в который вводили облученную суспензию со скоростью 1,5 мл/мин.

Процедуру проводили с интервалом в 10-15 дней еще 5 раз. Уже после 3-й процедуры у животного наблюдалось улучшение клинической картины. После окончания курса лечения содержание лимфоцитов в крови составило 8 тыс. клеток на 1 мл. На протяжении времени наблюдения в 11 месяцев эта величина практически не изменилась.

Пример 2. Больной К., 16 лет, поступил с диагнозом: Острый Т-клеточный лейкоз в стадии обострения. К моменту поступления страдал заболеванием в течение 2-х лет, на протяжении которых получил 3 курса лечения на основе традиционной химиотерапии. Содержание бластных клеток в крови составляло до 30%.

За 5 часов до процедуры больному вводили внутривенно раствор, содержащий 30 мг 8-метоксипсоралена. Производили дренирование лимфатического протока на левой ноге в области паха и устанавливали катетер. На всю длину катетера вводили световолокно с высоким коэффициентом пропускания в области УФА, оптически связанного через систему фокусирующих линз с точечным источником на основе ксеноновой лампы и обеспечивающим энергетическую освещенность на выходном торце световолокна 1,7 мВт (диаметр световолокна 0,8 мм) в области УФА. Время облучения за один сеанс составляло до 120 мин. Интервал между сеансами - от 7 до 14 дней. Всего были проведены 6 сеансов. После каждого сеанса в течение нескольких дней больной получал до 200 мг аллопуринола в день.

По окончании курса лечения в периферической крови бластных клеток обнаружено не было. Лейкоформула была типична для лейкозных больных в стадии ремиссии.

Пример 3. Больной Т., 39 лет, поступил с диагнозом: Бронхиальная астма в стадии затихающего обострения при дыхательной недостаточности.

За 4-6 часов до проведения процедур пациенту давали 30-40 мг бероксана - per os. Катетеризировали лимфопроток на ноге в области паха слева. На всю длину канала катетера вводили световод, соединенный с источником ультрафиолета. На выходном торце световолокна энергетическая освещенность составляла 2 мВт (диаметр световолокна 0,8 мм). Время облучения в течение одной процедуры составляло от 40 до 60 мин. Процедуры проводились с интервалом в 10 дней. Проведены 5 процедур.

Уже после первой процедуры исчезали заложенность носа и риноречя. Резко снижалась частота приступов удушья, уменьшалось количество отделяемой мокроты. По окончании лечения наблюдались устойчивая ремиссия и улучшение переносимости физических нагрузок.