способ определения активности щелочной фосфатазы в мазках гемолимфы у пчел

Формула изобретения

Способ определения активности щелочной фосфатазы в мазках гемолимфы у пчел, включающий подготовку мазков биологического субстрата, взятие, обработку, фиксацию, промывку, заливку и их инкубирование в среде, состоящей из буферного раствора, дистиллированной воды, нафтилофосфата и красителя нейтрального прочного синего В, при этом для приготовления буферного раствора используют 0,04 М раствор 5,5-диэтилбарбитурат натрия и 0,1 М раствор соляной кислоты 1,13-1,65 мл для обеспечения рН 9,0-9,2, затем осуществляют промывание, дополнительное окрашивание краской нейтральной красной и оценку качественной окраски на щелочную фосфатазу по окраске.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности иммунологии у пчел.

В ветеринарии определение иммунитета у пчел является проблемой, для решения которой необходимо определение микробицидных свойств системы гемолимфы, в частности определения щелочной фосфатазы в платоцитах.

Известно определение щелочной фосфатазы в тканях [Gomori (1952 г.) З.Лойда, Р.Госсрай, Т.Шиблер. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. Пер. с англ. к.б.н. И.Б.Бухвалова, к.м.н. О.В.Копьева, под ред. проф. Н.Т.Райхлина Мир, М., 1982, стр.12, 17, 142-143], где осуществляют подготовку мазков крови, фиксацию и обработку их буфферно-инкубационной смесью, инкубацию мазков крови с последующим высушиванием и микроскопированием.

Также известно определение щелочной фосфатазы в мазках крови и костного мозга человека [см. Kaplow (1955;1963) Ф.Г.Дж. Хейхоу, Д.Кваглино. Гематологическая цитохимия. Лабораторные методы. Пер. с англ. Е.В.Самочатовой, под ред. проф. Н.С.Кисляк. М., Медицина, 1983, стр.143-144], где осуществляют подготовку мазков биологического субстрата, взятие, обработку, фиксацию, промывку, заливку и их инкубирование в среде, состоящей из буферного раствора, дистиллированной воды, нафтилофосфата и нейтрального прочного синего В, промывание, дополнительное окрашивание прочным красным, оценку качественной окраски на щелочную фосфатазу по окраске.

Недостатками данного метода является отсутствие возможности определения активности щелочной фосфатазы, в мазках гемолимфы пчел.

Активность щелочной фосфатазы присуща зрелым клеткам у теплокровных животных, а у пчел по нашим исследованиям присуща как молодым платоцитам, так и зрелым. Определение активности щелочной фосфатазы в мазках гемолимфы имеет важное значение в диагностике иммунобиологической реактивности организма пчел в разные физиологические периоды. Снижение иммунитета влечет за собой нарушение гомеостаза организма и вытекающих из него последствий: снижение сохранности жизнеспособности как взрослых пчел, так и молодняка, работоспособности, репродуктивной способности и т.д.

Техническим решением задачи является расширение технологических возможностей, а именно определение активности щелочной фосфатазы в платоцитах гемолимфы у пчел, уменьшение материальных затрат и времени.

Поставленная задача достигается тем, что в способе определения активности щелочной фосфатазы в мазках гемолимфы у пчел, включающем подготовку мазков биологического субстрата, взятие, обработку, фиксацию, промывку, заливку и их инкубирование в среде, состоящей из буферного раствора, дистиллированной воды, нафтилофосфата и нейтрального прочного синего В, промывание, дополнительное окрашивание прочным красным, оценку качественной окраски на щелочную фосфатазу по окраске, в качестве биологического субстрата используют мазки гемолимфы пчел, а для приготовления буферной смеси используют 0,04 М раствор 5,5-диэтилбарбитурат натрия (веронал натрия) - C₈H₁₁N₂ O₃Na и 0,1М раствор соляной кислоты (НСl) 1,13-1,65 мл, для обеспечения рН 9,0-9,2.

Новизна заявляемого способа обусловлена тем, что обеспечивается возможность определения активности щелочной фосфатазы в платоцитах гемолимфы у пчел наиболее быстрым и точным по сравнению с известным методом определения щелочной фосфатазы в сыворотке крови у теплокровных животных как с научной, так и с экономической стороны. Фермент поступает из тканей в форменные элементы гемолимфы и локализуется в цитоплазме платоцитов и в их мембране в виде гранул и во всей цитоплазматической жидкости клеток.

Сущность изобретения поясняется чертежом, где представлены окрашенные гранулы по степеням: фиг.1. 0-я - степень; фиг.2. 1-я степень; фиг.3. - 2-я степень; фиг.4. - 3-я степень; фиг 5. - 4-я степень.

Пример конкретною осуществления способа определения активности щелочной фосфатазы в платоцитах гемолимфы, пчел

Подготовка мазков гемолимфы и фиксация

Для исследования у гемолимфу у пчел берут из сердца, для этого (чтобы ток гемолимфы не замедлился) пчел берут пинцетом и помещают на кусочек поролона, придерживают их пальцами левой руки, затем стерильным тончайшим стеклянным капилляром (диаметром не более 10 мкм) делают прокол по центру спинной части брюшка между 5-го и 6-ом тергитом под углом 10-15 градусом, чтобы капилляр попал в сердце пчелы. Капилляр опускают вглубь до появления в нем прозрачной жидкости (гемолимфы), заполнение капилляра происходит самотоком.

Из гемолимфы делают мазок. Для этого каплю гемолимфы наносят на край сухого обезжиренного стекла, которое удерживают между большим и средним пальцами левой руки. Впереди капли под углом 45° подводят шлифованный край покровного стекла так, чтобы образовавшийся угол между стеклами был равномерно заполнен гемолимфой. Движением правой руки от себя каплю распределяли тонким слоем по предметному стеклу. Хорошим мазком будет такой, в котором гемолимфа располагается на поверхности стекла без просветов, в виде равномерной полоски, не выходящей за ее края. Мазки с гемолимфой сушат на воздухе и фиксируют в парах 40% формалина в течение 3-5 минут. Для этого на дно эксикатора наливают около 150 мл формалина, оставляют под закрытой крышкой на 30 минут для возгонки паров формалина. Затем осторожно снимают крышку и на решетку эксикатора помещают мазки и закрывают крышкой. Таким образом, мазки фиксируются.

Приготовление буфернного раствора

В начале проводят калибровку иономера рН 150. Для приготовления буферной смеси берут: 0,04 М раствор 100 мл 5,5-диэтилбарбитурата натрия (веронал натрия) - С₈Н₁₁N₂О₃ Nа, в который добавляют 0,1 М раствор соляной кислоты (НСl) 1,13-1,65 мл, с помощью которого раствор доводят рН до 9,2. Очень важно получить рН в пределах от 9,0, до 9,2 для активации фермента - щелочной фосфатазы.

Приготовление буферно-инкубационной смеси

Правильное приготовление инкубационной смеси имеет немаловажное значение для дальнейшей окраски мазков. Готовить инкубационную смесь желательно в затемненной комнате. Для этого готовят раствор 1 и 2.

Приготовление раствора 1

Берут 4,5 мг -нафтилфосфата натрия, который постепенно растворяют 4,5 мл буфера веронала натрия и добавляют 1,3 мл ацетона для полного растворения -нафтилфосфата.

Приготовление раствора 2

Берут 4,5-5 мг красителя нейтрального прочного синего В и растворяют его в 5 мл буфере веронала натрия, смешивая их постепенно (рН 9,2).

Полученные растворы смешивают, фильтруют в темноте желательно через стеклянный фильтр.

Обработка мазков гемолимфы буферно-инкубационной смесью

На фиксированные формалином мазки гемолимфы наносится равномерным слоем инкубационная смесь, и помещают во влажную камеру, которая готовится следующим образом: для этого берут стерильную чашку Петрии, на дно которой кладут хорошо смоченную дистиллированной водой фильтровальную бумагу и на ее помещают мазки гемолимфы и закрывают крышкой чашки Петрии. Такая влажная камера не дает испаряться инкубационной смеси, включающей в себя легколетучее вещество (-нафтол), за время инкубации, а также позволяет строго соблюдать температурный режим (18-20°С) в термостате, т.к. фермент активен при заданной температуре и экономии инкубационной смеси. Инкубацию проводят в темноте в течение 30 минут при температуре 18-20°С, промывают проточной водой 10 минут, ополаскивают дистиллированной водой несколько раз высушивают, и ядра клеток платоцитов докрашивают в красный цвет краской - 0,5% нейтральным красным, приготовленным на физиологическом растворе, в течение 0,5-1 минуты, затем промывают дистиллированной водой, сушат и по количеству окрашенных гранул в коричневый цвет цитоплазмы платоцитов, мембраны клеток, окрашенных в серо-голубой цвет, определяют активность фермента щелочной фосфатазы по среднему цитохимическому индексу.

Микроскопия мазков

Микроскопию проводят с использованием иммерсионной системы при увеличении (90×15). Активность щелочной фосфатазы определяют по количеству окрашенных гранул и цитоплазмы платоцитов в коричневый цвет, ядра клеток которых докрашены в красный цвет нейтральным красным.

Визуально проводят оценку цитохимической реакции:

0-я степень - окрашено только ядро, цитоплазма ярко-желтого цвета, контуры мембраны слабо окрашены в серо-голубой цвет;

1-я степень - вся цитоплазма диффузно окрашена в желто-коричневый цвет, контуры мембраны окрашены в серо-голубой цвет;

2-я степень - в цитоплазме видны хорошо окрашенные гранулы в коричневый цвет, окрашено более ¹/₄ цитоплазмы, контуры мембраны интенсивно окрашены в серо-голубой цвет;

3-я степень - всю цитоплазму нанимают гранулы, окрашенные в коричневый цвет, но ядро свободно ³/₄ и более цитоплазмы, контуры мембраны интенсивно окрашены в серовато-синий цвет;

4-я степень - гранулы занимают всю цитоплазму и наслаиваются на ядро, окрашены в коричневый цвет, контуры мембраны интенсивно окрашены в синий цвет.

Средний цитохимический индекс выводят по следующей формуле, предварительно подсчитывая 100 платоцитов:

,

где а, б, в, г, д - количество клеток платоцитов соответственно 0, 1, 2, 3, 4-й степени.

Пример расчета среднего цитохимического индекса у пчел Серой горной кавказской породы:

При расчете данного примера неактивных платоцитов, т.e. нулевых (0), было подсчитано в мазке гемолимфы в количестве 65 клеток, первой степени не было найдено, второй степени, 10 клеток, третьей степени - 5 клеток, четвертой степени - 20 клеток.

Таблица 1
Активность щелочной фосфатазы в платоцитах гемолимфы у пчел (М±m; n=10)
Породы пчел	Средний цитохимический индекс
Итало-карпатская помесь первого поколения	0,68±0,03
Карпатская порода	0,73±0,07
Приокская	0,71±0,02
Серая горная кавказская	1,15±0,05

Данная методика позволяет экспресс-методом определить микробицидные свойства системы гемолимфы, в частности определения активности щелочной фосфатазы в платоцитах гемолимфы. Определение активности щелочной фосфатазы в мазках гемолимфы является одним из важных тестов диагностики иммунитета организма пчел. Высокие показатели среднего цитохимического индекса щелочной фосфатазы в платоцитах указывают на состояние иммунного статуса и общее клиническое состояние организма пчел. Чем выше показатели среднего цитохимического индекса щелочной фосфатазы, тем выше ее активность, что указывает невысокий уровень иммунною статуса организма пчел. При снижении активности щелочной фосфатазы, т.е. отсутствии или незначительном количестве 3- и 4-й степени активности платоцитов указывает на снижение иммунного статуса организма, что способствует развитию или предрасположенности к различным заболеваниям и тем самым к снижению жизнеспособности пчел.