Способы измерения или испытания, использующие ферменты или микроорганизмы, составы для них, способы получения подобных составов: ..фосфатазу – C12Q 1/42

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии. Предложен способ выявления в гене BRCA1 мутаций сдвига рамки считывания и нонсенс-мутаций, заключающийся в создании рекомбинантных плазмид, в которых амплифицированный фрагмент гена находится в единой трансляционной рамке с геном щелочной фосфатазы Е.соli (phoA). Сконструирован плазмидный вектор pPhoA-frame, который содержит последовательность ДНК, кодирующую щелочную фосфатазу E.coli. Внутрь этой последовательности встроен фрагмент ДНК, содержащий сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции BglII, StuI, ApaI, SacII и предназначенный для клонирования фрагментов гена BRCA1 (полилинкер). Амплифицированный фрагмент гена BRCA1 встраивается в плазмидный вектор pPhoA-frame в единой трансляционной рамке с phoA. Наличие в исследуемом фрагменте гена мутаций, нарушающих целостность рамки считывания, оценивается визуально по отсутствию окраски колоний клеток E.coli, трансформированных полученной рекомбинантной плазмидой, на индикаторной чашке, содержащей субстрат для щелочной фосфатазы. Предлагаемый способ позволяет выявлять только значимые для развития патологии мутации, так как исключается детекция полиморфных вариантов, не приводящих к появлению стоп-кодонов и в большинстве случаев не оказывающих существенного влияния на функцию белка. Метод позволяет выявить наличие любых, в том числе и неизвестных, мутаций, нарушающих целостность рамки. Способ может быть использован для выявления в генах человека мутаций сдвига рамки трансляции и нонсенс-мутаций, ответственных за развитие ряда онкологических заболеваний. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 2 пр.

Способ детекции сибиреязвенного патогена в окружающей среде и биологических жидкостях основан на функциональной детекции активности одного из компонентов сибиреязвенного токсина, слабой протеазы летального фактора сибирской язвы (LF). Примененный принцип высокочувствительной детекции протеолитической активности LF базируется на системе амплификации сигнала, происходящего от акта разрезания субстрата, при помощи находящегося в составе субстрата вспомогательного фермента щелочной фосфатазы Escherichia coli (АР). В составе рекомбинантного субстрата LF помимо щелочной фосфатазы и специфической для LF субстратной последовательности RRKKVYPYPME находятся пептид, биотинилирующийся in vivo и in vitro при помощи биотин-лигазы E.coli и обеспечивающий иммобилизацию субстрата на твердой фазе (поверхности плашек) за счет взаимодействия с авидином и его производными, и последовательности шести гистидинов для очистки рекомбинантного субстрата из периплазмы E.coli при помощи металл-хелатной смолы. Способ по изобретению обладает высокой чувствительностью, с использованием флюоресцеин дифосфата позволяет детектировать до 1 пМ летального фактора, быстротой в исполнении, высокой специфичностью, низким риском ложноположительных сигналов. 1 ил.

Изобретение относится к биотехнологии, белковой и генной инженерии. Конструируют рекомбинантную плазмиду pETPHOFus, обеспечивающую синтез субстрата летального фактора сибирской язвы в составе одного полипептида с мутированным репортерным ферментом щелочной фосфатазы Escherichia coli. Данный слитый полипептид представляет собой новый высокочувствительный субстрат летального фактора сибирской язвы. Кроме того, предлагается штамм Escherichia coli BL-PHOFus, продуцент слитого полипептида. Штамм обеспечивает высокий выход синтезируемого белка не менее 30 мг на 1 литр жидкой культуры без ферментации. Получаемый субстрат летального фактора сибирской язвы обладает повышенной чувствительностью и специфичностью к расщеплению LF и способен детектировать протеолитическую активность летального фактора сибирской язвы в концентрации до 1 пМ. Данное изобретение может найти применение при клинической диагностике заболевания сибирской язвой; для обнаружения природных очагов сибирской язвы; для скрининга библиотек химических соединений и поиска ингибиторов активности летального фактора сибирской язвы. 2 н.п. ф-лы, 4 ил.

Изобретение относится к биотехнологии. В тестируемую пробу вводят щелочную фосфатазу, выделенную из яйцеклеток морского ежа, и предварительно инкубируют в течение 10-15 мин при комнатной температуре. Добавляют n-нитрофенилфосфат натрия и инкубируют в течение 30 мин при температуре 25°С или 37°С. Получают окрашенное соединение в качестве продукта реакции. Оценивают степень ингибирования фермента по величине оптической плотности продукта гидролиза субстрата при длине волны 400 нм с помощью ультрафиолетового ридера, используя 96-луночные планшеты. Способ позволяет визуально определить степень ингибирования фермента, интегрально оценить присутствие в воде тяжелых металлов, пестицидов и других токсикантов и увеличить количество одновременно исследуемых проб. 3 табл.

Способ относится к области ветеринарной медицины, в частности биохимии. Способ заключается в обработке мазков буферной смесью, промывании дистиллированной водой, высушивании, дополнительном окрашивании 0,5% раствором метиленовым синим, промывании, высушивании и определении активности фермента по количеству окрашенных гранул. Способ позволяет расширить технологические возможности в области иммунологических исследований. 5 ил., 1 табл.

Способ относится к области ветеринарной медицины, в частности биохимии. Способ заключается в обработке мазков буферной смесью, инкубации в темноте 2 часа, промывании дистиллированной водой, высушивании, дополнительном окрашивании 0,5% метиленовым синим, промывании, высушивании, определении активности фермента по количеству окрашенных гранул. Способ позволяет расширить технологические возможности в области иммунологических исследований. 5 ил., 1 табл.

Способ относится к области ветеринарной медицины, в частности биохимии. Способ заключается в подготовке мазков, их фиксации, промывке, заливке и инкубировании в среде, состоящей из буферного раствора, дистиллированной воды, нафтилофосфата и красителя нейтрального прочного синего В, промывании, дополнительном окрашивании и оценке качественной окраски. Способ позволяет расширить технологические возможности и снизить трудоемкость. 5 ил., 1 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной медицины. Способ заключается во взятии мазков, их обработки, фиксации, заливки и инкубировании в среде, состоящей из буферного раствора, нафтилофосфата и красителя нейтрального прочного синего В, дополнительном окрашивании нейтральной красной краской, оценке качественной окраски. Способ позволяет уменьшить материальные затраты и время. 5 ил., 1 табл.