способ получения igg

Формула изобретения

1. Способ получения IgG (иммуноглобулина G) из плазмы для медицинских применений, при котором по меньшей мере (1') удаляют альбумин, получая в результате фракцию IgG, (2') очищают эту фракцию IgG на анионите и собирают несвязанную фракцию IgG, (3') очищают эту несвязанную фракцию IgG путем адсорбции на катионите и собирают связанную фракцию IgG, и (4') осуществляют инактивацию вируса во фракции IgG, полученной из фракции IgG, собранной на стадии (3'), отличающийся тем, что

(I) концентрируют фракцию IgG, полученную на стадии (1'),

(II) доводят рН фракции IgG, выделенной с катионита на стадии (3'), до 4±0,1, и предпочтительно поддерживают рН в течение остальных стадий способа меньше 6,0 и

(III) осуществляют инактивацию вируса (стадия 4') путем использования химических продуктов при температуре 30°С±2°С в течение по меньшей мере 4 ч.

2. Способ по п.1, при котором осуществляют стадии:

а) забуферивают свежую плазму;

б) удаляют эуглобулины;

в) удаляют альбумин с последующим осуществлением стадии концентрирования (I), как определено в п.1;

г) очищают фракцию плазмы, полученную после удаления эуглобулинов и альбумина, на анионите и собирают несвязанную фракцию плазмы (фракцию IgG);

д) очищают фракцию IgG, полученную на стадии (г), на катионите и собирают связанную фракцию IgG плазмы, далее проводят стадию (II), как определено в п.1;

е) концентрируют фракцию IgG плазмы, собранную на стадии (д);

ж) инактивируют вирус во фракции IgG плазмы, собранной на стадии (е), при условиях стадии (III), как определено в п.1;

з) удаляют химические продукты для инактивации вируса, добавленные на стадии (ж), путем адсорбции IgG на катионите, и выделения, и собирания связанной фракции IgG плазмы;

и) концентрируют фракцию IgG плазмы, собранную на стадии (з);

к) готовят фракцию IgG плазмы, сконцентрированную на стадии (и), в виде препарата;

л) осуществляют стерильную фильтрацию приготовленной в виде препарата фракции IgG плазмы, полученной на стадии (к).

3. Способ по любому из пп.1 и 2, где концентрирование в соответствии с (I) осуществляют путем ультрафильтрации до объема, меньшего, чем объем исходной плазмы.

4. Способ по любому из пп.2 и 3, при котором доводят ионную силу до приблизительно 1,40 мСм (mS) перед стадией (з).

5. Способ по любому из пп.2-4, при котором на стадии (з) используют ацетатный буфер.

6. Способ по одному или более чем одному из пп.1-5, при котором также уменьшают ионную силу до 0,5 мСм (mS)±0,1 после стадии 3', предпочтительно на стадии (и) по п.2.

7. Способ по п.6, при котором ионную силу уменьшают путем диафильтрации против дистиллированной воды.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способу получения IgG (иммуноглобулина G) для медицинских применений. Способ по данному изобретению обеспечивает IgG продукт, обладающий низкой антикомплементной активностью (АКА).

Предшествующий уровень техники

IgG, получаемый из плазмы человека, широко используется в лечении агаммаглобулинемии, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры и профилактики некоторых заболеваний. Препараты IgG вводят внутримышечно а также внутривенно.

Из уровня техники хорошо известно, что выделенные препараты IgG обладают явными антикомплементными активностями (АКА). Было продемонстрировано, что компоненты, ответственные за эти активности, представляют собой агрегаты IgG, которые образуются или самопроизвольно, или как результат процедуры выделения. Было показано, что эти антикомплементные агрегаты являются вредными при некоторых клинических применениях IgG продуктов. Например, внутривенное введение препаратов IgG может привести к неблагоприятным побочным реакциям, включая анафилактический шок.

Для преодоления проблемы, касающейся АКА в препаратах IgG, были предложены некоторые решения. Например, в US 3966906 описан способ обработки неочищенной гамма-глобулиновой фракции сыворотки пепсином для разрушения агрегатов IgG и уменьшения антикомплементной активности. Однако терапевтический эффект, обеспечиваемый таким препаратом, недопустимо кратковременен, поскольку препарат быстро выводится. Еще один недостаток, связанный с обработанными пепсином иммуноглобулинами, заключается в том, что их Fc-связывающая способность ниже таковой нативных иммуноглобулинов.

Были предприняты попытки стабилизировать обработанные пепсином препараты IgG, например путем использования полиэтиленгликоля (ПЭГ) (см., например, WO 86/06993).

Для решения проблемы, касающейся высокой АКА, было предложено химически модифицировать препараты IgG. Например, в US 3902262 часть дисульфидных связей в молекуле IgG восстанавливают до групп -SH и затем группы -SH алкилируют.

По вполне понятным причинам желательно получить IgG продукт без ферментативных и других химических модификаций и, насколько возможно, близкий к нативным. Способ, удовлетворяющий этим критериям, был описан в "An improved chromatographic method for production of IgG from human plasma" I. Anderson, L-0 Lindquist, J. Berglof, представленном на "XXIII Congress of the ISBT", Амстердам, Нидерланды, Июль 2-8, 1994). Однако эта процедура также демонстрирует неудовлетворительно высокие уровни АКА и не соответствует требованиям Департамента по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (FDA) и Европейского сообщества (EU) для внутривенных лекарств.

Известные способы изготовления композиций IgG типично включают в себя несколько стадий, выбранных из:

а) забуферивания плазмы, например, или путем того, что плазму подвергают подходящей гель-фильтрационной хроматографии, или путем диафильтрации;

б) удаления эуглобулинов, например, путем осаждения;

в) удаления альбуминовой фракции (альбумина), например, путем связывания альбумина или ему подобного с анионитом, оставляя IgG в несвязанной фракции (фракции IgG);

г) после удаления эуглобулинов и альбумина очистки фракции IgG, полученной на стадии (в), на анионите и собирания несвязанной фракции;

д) очистки фракции плазмы, полученной на стадии (г), на катионите и собирания связанной фракции (адсорбция и выделение IgG);

е) концентрирования фракции плазмы, обогащенной IgG, полученной на стадии (д) (IgG, выделенного с катионита), предпочтительно путем ультрафильтрации;

ж) инактивации вирусов путем добавления химических продуктов для инактивации вирусов, предпочтительно раствора растворитель/детергент (Р/Д), к фракции плазмы, обогащенной IgG, например фракции, полученной на стадии (е);

з) удаления антивирусных химических продуктов, добавленных на стадии (ж), предпочтительно путем адсорбции IgG на катионите, и выделения, и собирания связанной фракции;

и) концентрирования связанной фракции, собранной на стадии (з), например путем ультрафильтрации;

к) приготовления фракции, сконцентрированной на стадии (и), в виде препарата;

л) стерильной фильтрации приготовленного в виде препарата IgG, полученного на стадии (к).

Краткое изложение сущности изобретения

Согласно настоящему изобретению предложен метод решения получения IgG продуктов, обладающих пониженной АКА, путем модифицирования ранее известных способов.

Таким образом, в первом аспекте данное изобретение относится к способу получения IgG из плазмы для медицинских применений, при котором по меньшей мере: (Г) удаляют альбумин, получая в результате фракцию IgG, (2') очищают эту фракцию IgG на анионите и собирают несвязанную фракцию IgG, (3') очищают эту несвязанную фракцию IgG путем адсорбции на катионите и собирают связанную фракцию IgG, и (4') осуществляют инактивацию вируса во фракции IgG, полученной из фракции IgG, собранной на стадии (3'). Этот способ характеризуется тем, что

(I) концентрируют фракцию IgG, полученную на стадии (Г),

(II) доводят рН фракции IgG, выделенной с катионита на стадии (3'), до 4 ± 0,1, и предпочтительно поддерживают рН в течение остальных стадий способа меньше 6,0 и

(III) осуществляют инактивацию вируса (стадия 4') путем использования химических продуктов для инактивации вируса, предпочтительно раствора растворитель/детергент (Р/Д), при температуре 30°С ± 2°С в течение по меньшей мере 4 часов.

Доведение рН до приблизительно 4 на стадии (II) позволяет осуществлять инактивацию вируса при приблизительно 30°С. В

соответствующем более раннем способе, при котором рН составлял 5,5, уровень протеолитической активности при 30°С был неприемлемым.

Предпочтительный вариант способа по данному изобретению включает в себя стадии (а)-(л), представленные выше, где стадия удаления альбумина (в) соответствует (Г), стадия катионообмена (д) соответствует (2') и инактивация вируса (ж) соответствует (3').

Стадии очистки и/или удаления, описанные выше, предпочтительно осуществляются в виде хроматографии. Подходящие среды для разделения, используемые на этих стадиях, являются гидрофильными в том смысле, что они обладают способностью выставлять поверхности, несущие гидрофильные группы, такие как гидрокси, амидо и так далее, в жидкий образец, содержащий IgG. Подходящие среды для разделения могут быть обнаружены среди сред на основе синтетических полимеров и/или биополимеров (например полисахаридов), несущих гидрофильные группы, на которые ссылались выше. В зависимости от того, на какой стадии способа используются среды, они могут быть незаряженными или могут нести положительно заряженные (например, аммониевые группы) и/или отрицательно заряженные группы (например, карбоксильные группы и группы сульфоновой кислоты). Предпочтительны следующие хроматографические среды:

стадия а): Сефадекс G25;

стадия в): DEAE Сефароза FF;

стадия г): Q Сефароза FF;

стадия д): СМ Сефароза FF;

стадия з): СМ Сефароза FF.

Сефадекс и Сефароза (Amersham, Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Швеция) основаны, соответственно, на поперечно-сшитых декстранах и агарозе. DEAE означает, что основная матрица (поперечно-сшитый декстран) замещена диэтиламиноэтильными группами. Аналогично, Q обозначает четвертичные аммониевые группы, а СМ обозначает карбоксиметильные группы.

Концентрирование, в соответствии с (I), предпочтительно осуществляют непосредственно после удаления альбумина (например, после стадии (в), как определено выше) путем ультрафильтрации до объема, меньшего чем объем исходной плазмы или равного ему.

Для того, чтобы иметь возможность использовать ацетатный буфер на стадии удаления химических продуктов для инактивации вируса (стадия з), ионную силу перед этой стадией доводят до приблизительно 1,40 мСм (mS).

В предпочтительном воплощении этот способ также включает в себя на стадии (1) уменьшение ионной силы до 0,5 мСм (mS)±0,1 предпочтительно путем диафильтрации против дистиллированной воды.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение будет описано более подробно совместно с чертежом, который схематически демонстрирует предпочтительное воплощение способа по изобретению, где отличительные признаки способа, как определено в формуле изобретения, выделены жирным шрифтом.

Исходный материал

В качестве исходного материала может быть использована как восстановленная плазма, свежезамороженная плазма, так и исходная плазма.

Можно идентифицировать следующие подклассы плазмы и использовать в качестве исходного материала.

1. Плазма - криосупернатант, которая была подвергнута хроматографической стадии для адсорбции витамин К-зависимых факторов (FIX, протромбин, FVII, FX).

2. Плазма - криосупернатант, из которой не был удален протромбиновый комплекс.

3. Плазма, которая была пропущена через среду для гель-фильтрации (предпочтительно имеющую пределы эксклюзии, находящиеся в таком же диапазоне, как у Сефарозы 4FF (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Швеция)) для удаления FVIII, и которая прошла хроматографическую стадию для адсорбции витамин К-зависимых факторов (FIX, протромбин, FVII, FX).

4. Плазма, которая была пропущена через среду для гель-фильтрации для удаления FVIII, и из которой не был удален протромбиновый комплекс.

Среда для гель-фильтрации предпочтительно имеет пределы эксклюзии, находящиеся в таком же диапазоне, как у Сефарозы FF (Amersham Pharmacia Biotech AB).

В дополнение, исходный материал может также не содержать ATI II (антитромбин III) и/или фибриноген.

Ниже описаны два не ограничивающие объем данного изобретения примера способов по данному изобретению для очистки IgG. Эти способы, если не указано иначе, осуществляют при комнатной температуре.

Антикомплементную активность (АКА) относится к измерениям в конечном продукте, и ее измеряют в соответствии с Eur. Pharmacopoeia Monograph (1997), стр. 963 (2.6.17), и она не должна превышать 1 титр комплемента, обусловливающий 50% гемолиз (СН₅₀)/мг иммуноглобулина.

Пример 1

625 Л оттаявшей плазмы забуферивают в 0,005 М NaAc (ацетат натрия), рН 7, на колонке диаметром Di=800 мм и высотой слоя Н=600 мм, упакованной Сефадексом G-25 С. Поток составляет более 100 см/ч, предпочтительно 300 см/ч, соответствуя скорости потока 1500 л/ч.

Элюированную плазму собирают в сосуд и при перемешивании добавляют 1 М уксусную кислоту до достижения рН 5,2. Плазму оставляют стоять без перемешивания в течение 4-12 часов при температуре 4-10°С. После стояния образовавшийся эуглобулиновый осадок удаляют путем центрифугирования.

Плазму доводят 1 М NaAc, рН 5,2, до конечной ионной силы I=1,4 мСм (mS) (диапазон I=1,30 -1,50). рН Должен составлять от 5,15 до 5,25.

Плазму в течение 6 циклов наносят, 25 - 30 г альбумина на литр геля, на колонку с Di=1000 мм и Н=150 мм, упакованную DEAE Сефарозой FF и уравновешенную 0,020 М NaAc, рН 5,2. Линейная скорость потока составляет больше 60 см/ч, предпочтительно 120 см/ч, соответствуя скорости потока 942 л/ч. В уравновешивающем буфере IgG проходит через колонку, тогда как альбумин адсорбируется. После 3 циклов колонку промывают 1,7 Ос (Ос=объем слоя) 0,15 М NaAc, рН 4,0 + 0,5 М NaCI, 0,5 Ос 0,5 М NaOH и 1,7 Ос 0,15 М NaAc, pH 4,0.

Фракцию IgG объемом приблизительно 2350 л концентрируют путем ультрафильтрации до конечного объема, меньшего или равного 625 л, предпочтительно 400 - 500 л. Эта процедура должна быть начата на самой поздней стадии, когда с колонки с DEAE Сефарозой будет собрана вся фракция.

рН Раствора IgG доводят до 6,5 (6,45 - 6,55) 1 M NaOH, и ионную силу доводят до 1,40 мСм (mS) (1,30 - 1,50 мСм (mS)) путем добавления воды для инъекции (ВДИ).

Раствор IgG в течение 6 циклов наносят на колонку с Di=1000 мм и Н=150 мм, упакованную Q Сефарозой FF и уравновешенную 0,020 M NaAc, рН 6,5. Линейная скорость потока составляет больше 30 см/ч, предпочтительно 100 см/ч, соответствуя 785 л/ч. После 3 циклов колонку промывают 0,5 Ос 0,5 М NaOH и 1,7 Ос 0,15 М NaAc, рН 4,0. Разрыв (break) во фракции, содержащей IgG, непосредственно адсорбируют на следующей колонке с Di=800 мм и Н=80 мм и упакованной СМ Сефарозой FF. Когда фракция IgG со всех 6 циклов прокачана, колонку промывают 10 Ос 0,01 М глицинового буфера, рН 7,0. IgG затем элюируют 7 Ос 0,1 М глицин + 0,15 М NaCI, рН 9,0.

рН Раствора доводят до 4,0±0,1 1 М НАс (уксусной кислотой) и концентрируют путем ультрафильтрации до приблизительно 5% IgG.

К раствору IgG при перемешивании добавляют химические продукты для инактивации вируса, а именно тритон Х-100 и три(n-бутил)фосфат (TNBP). Эту смесь переносят в инкубационный сосуд для тепловой обработки при 30°С±2°С в течение 4-16 часов. Ионную силу раствора доводят до 1,40 мСм (mS) путем разбавления ВДИ и наносят в течение 1 цикла на другую колонку с Di=800 мм и Н=80 мм, упакованную CM Сефарозой FF и уравновешенную 0,020 М NaAc буфером, рН 4,0. Линейная скорость потока составляет более 40 см/ч, предпочтительно 80 см/ч, соответствуя 400 л/ч. После нанесения колонку промывают 10 Ос 0,01 М глицинового буфера, рН 7,0, для удаления химических продуктов для инактивации. IgG элюируют 7 Ос 0,1 М глицин + 0,15 М NaCI, рН 9,0, при такой же скорости потока и рН доводят до 4,0, используя 1 М HCI. Раствор затем концентрируют путем ультрафильтрации до 5 - 7% IgG и ионную силу доводят путем диафильтрации до 0,5 мСм (mS)±0,2 мСм (mS). Наконец, раствор доводят до 5,0%.

Готовят раствор следующего состава в виде препарата:

- Сахароза 1 г/г IgG

- IgG 5%

- рН4,0

- ионная сила 0,5 мСм (mS)±0,2 мСм (mS).

После стерильной фильтрации, наполнения и укупоривания этот раствор готов для доставки или хранения.

Было обнаружено, что АКА различных партий, измеренная в соответствии с тем, как определено выше, составляет 0,5 - 0,7 CH₅₀/Mr иммуноглобулина.

Пример 2

625 Л оттаявшей плазмы забуферивают в 0,005 М NaAc (ацетат натрия), рН 7, на колонке диаметром Di=800 мм и высотой слоя Н=600 мм, упакованной Сефадексом G-25 С. Поток составляет больше чем 100 см/ч, предпочтительно 300 см/ч, соответствуя скорости потока 1500 л/ч.

Элюированную плазму собирают в сосуд и при перемешивании добавляют 1 М уксусную кислоту до достижения рН 5,2. Плазму оставляют стоять без перемешивания в течение 4-12 часов при температуре 4-10°С. После стояния образовавшийся эуглобулиновый осадок удаляют путем центрифугирования.

Плазму доводят 1 М NaAc, рН 5,2, до конечной ионной силы 1=1,4 мСм (mS) (диапазон 1=1,30 -1,50). рН Должен составлять от 5,15 до 5,25.

Плазму в течение 6 циклов наносят, 25 - 30 г альбумина на литр геля, на колонку с Di=1000 мм и Н=150 мм, упакованную DEAE Сефарозой FF и уравновешенную 0,020 М NaAc, рН 5,2. Линейная скорость потока составляет больше 60 см/ч, предпочтительно 120 см/ч, соответствуя скорости потока 942 л/ч. В уравновешивающем буфере IgG проходит через колонку, тогда как альбумин адсорбируется. После 3 циклов колонку промывают 1,7 Ос (Ос=объем слоя) 0,15 М NaAc, рН 4,0 + 0,5 М NaCI, 0,5 Ос 0,5 М NaOH и. 1,7 Ос 0,15 М NaAc, pH 4,0.

Фракцию IgG объемом 2350 л концентрируют путем ультрафильтрации до конечного объема, меньшего или равного 625 л, предпочтительно 400 - 500 л. Эта процедура должна быть начата на самой поздней стадии, когда с колонки с DEAE Сефарозой будет собрана вся фракция.

рН Раствора IgG доводят до рН 6,5 (6,45 - 6,55) 1 M NaOH и ионную силу доводят до 1,40 мСм (mS) (1,30 - 1,50 мСм (mS)) путем добавления воды для инъекции (ВДИ).

Раствор IgG в течение 4 циклов наносят на колонку с Di=1000 мм и Н=150 мм, упакованную смешанным слоем: DEAE Сефароза FF и Аргинин-Сефароза FF в соотношении 60%/40%, и уравновешенную 0,020 M NaAc, рН 6,5. Линейная скорость потока составляет больше 30 см/ч, предпочтительно 100 см/ч, соответствуя 785 л/ч. После 2 циклов колонку промывают 0,5 Ос 0,5 М NaOH и 1,7 Ос 0,15 М NaAc, рН 4,0. Разрыв (break) во фракции, содержащей IgG, непосредственно адсорбируют на следующей колонке с Di=800 мм и Н=80 мм и упакованной СМ Сефарозой FF. Когда фракция IgG со всех 6 циклов прокачана, колонку промывают 10 Ос 0,01 М глицинового буфера, рН 7,0. IgG затем элюируют 7 Ос 0,1 М глицин + 0,15 М NaCI, рН 9,0.

рН Раствора доводят до 4,0±0,1 1 М НАс (уксусной кислотой) и концентрируют путем ультрафильтрации до приблизительно 5% IgG.

К раствору IgG при перемешивании добавляют химические продукты для инактивации вируса, а именно тритон Х-100 и три(п-бутил)фосфат (TNBP). Эту смесь переносят в инкубационный сосуд для тепловой обработки при 30°С±2°С в течение 4-16 часов. Ионную силу раствора доводят до 1,40 мСм (mS) путем разбавления ВДИ и наносят в течение 1 цикла на другую колонку с Di=800 мм и Н=80 мм, упакованную CM Сефарозой FF и уравновешенную 0,020 М NaAc буфером, рН 4,0. Линейная скорость потока составляет более 40 см/ч, предпочтительно 80 см/ч, соответствуя 400 л/ч. После нанесения колонку промывают 10 Ос 0,01 М глицинового буфера, рН 7,0, для удаления химических продуктов для инактивации. IgG элюируют 7 Ос 0,1 М глицин + 0,15 М NaCI, рН 9,0, при такой же скорости потока и доводят до рН 4,0, используя 1 М HCI. Раствор затем концентрируют путем ультрафильтрации до 5 - 7% IgG и ионную силу доводят путем диафильтрации до 0,5 мСм (mS)±0,2 мСм (mS). Наконец, раствор доводят до 5,0%.

Раствор готовят в виде препарата, как указано в примере 1. После стерильной фильтрации, наполнения и укупоривания этот раствор готов для доставки или хранения. Было обнаружено, что АКА различных партий, измеренная в соответствии с тем, как определено выше, составляет 0,5 - 0,7 CH₅₀/мг иммуноглобулина.