способ приготовления комбинированного микробиологического удобрения на основе биогумуса

Формула изобретения

Способ приготовления комбинированного микробиологического удобрения на основе биогумуса, включающий получение биогумуса путем вермикомпостирования органических отходов с использованием дождевых червей и внесение в биогумус микроорганизмов, отличающийся тем, что в качестве органических отходов используют навоз сельскохозяйственных животных, предварительно нейтрализованный до рН 7-8, а в качестве дождевых червей используют гибрид красного калифорнийского червя с дождевыми червями кубанской природной популяции, в количестве 10⁴ на 1 м², при этом вермикомпостирование осуществляют в течение 2-3 месяцев при температуре 16-32°С в естественных условиях, причем после отделения червей из биогумуса виброситом с размером пор 0,5-1,0 см биогумус подсушивают до влажности 50-60%, фасуют в пакеты из полипропилена, в которых автоклавируют в течение 45-75 мин при 0,8-1,2 атм, вносят микроорганизмы, относящиеся к видам Bacillus megaterium var. phosphaticum, Rhizobium japonicum и Agrobacterium radiobacter, в следующем соотношении, %:

Bacillus megaterium var. phosphaticum	10-20
Rhizobium japonicum	20-60
Agrobacterium radiobacter	20-60

и выдерживают до достижения общего титра 5·10¹² .

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии приготовления биоудобрений для растениеводства.

В последние годы все большее применение в сельском хозяйстве находит биогумус - продукт вермикомпостирования различных органических отходов промышленного и сельскохозяйственного производства специально выведенной расой дождевых червей. Биогумус содержит гуминовые и фульвокислоты, макро- и микроэлементы, аминокислоты и гиббереллины и другие биологически активные вещества в доступной растениям форме. Поэтому само по себе применение биогумуса повышает урожайность сельскохозяйственных культур и увеличивает плодородие почв.

Известен способ утилизации органических отходов в биогумус, включающий приготовление субстрата путем смешивания компонентов, одним из которых являются отходы животного происхождения, внесение в него червей и/или их коконов, укладку субстрата в коробку или гряды и компостирование при влажности 65-80% и аэрации, отделение червей от полученного биогумуса. В качестве главного компонента в субстрат вводят скоп, являющийся отходом производства картона, в количестве 20-80% к общей массе субстрата. В качестве отходов животного происхождения применены навоз крупного рогатого скота и/или навоз свиней и помет птиц, применены черви вида Eisenia foetida в количестве 15-25 тыс. особей на 1 м². При низком содержании азота в субстрате после смешивания компонентов вводят добавки азота минеральных удобрений в виде мочевины в количестве не более 5% от общей массы субстрата с одновременной добавкой известняковой муки в количестве, обеспечивающем рН среды готового субстрата не более 8 (пат. РФ №2057743, кл. C 05 F 3/06, 10.04.1996).

Однако данный способ имеет некоторые недостатки. Введение скопа (отходов производства картона) не всегда возможно в связи с отсутствием сырья. Кроме того, широкий диапазон величины его ввода не позволяет стандартизировать процесс вермикомпостирования, так как доля скопа влияет на активность червей. Вызывает сомнение, что мочевина может обеспечивать заявляемый эффект. Кроме того, как и в вышеуказанном аналоге, маловероятно, чтобы полученный таким способом биогумус включал в себя необходимое количество полезных микроорганизмов, в том числе и способных к азотфиксации и повышению усвояемости фосфора.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения биоудобрения, заключающийся в получении биогумуса путем вермикомпостирования сельскохозяйственных и промышленных отходов с использованием дождевых червей, отделения биогумуса от червей и его досушивания, причем из дождевых червей используют червей "Оболенский гибрид", полученных нами путем скрещивания "Красного калифорнийского гибрида" с российской популяцией дождевых червей Eisenia foetida, при этом вермикомпостирование осуществляют при температуре 16-24°С в течение 4-6 месяцев, в полученный биогумус вносят микроорганизмы, обладающие фунгицидными свойствами. В способе микроорганизмы, обладающие фунгицидной активностью, вносят после отделения червей или после дозревания биогумуса, кроме того, в качестве их используют штамм бактерий Bacillus subtilis ИПМ-215 в концентрациях 1·10 ⁹-1·10¹² спор на 1 кг биогумуса или культуру микофильного гриба Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray 16 в концентрациях 1·10⁴-1·10⁸ колониеобразующих единиц на 1 кг биогумуса (пат. РФ №2125549, кл. C 05 F 11/08, 1999 г., бюл. №3. - прототип).

Однако данный способ имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, использование указанного гибрида не позволяет повсеместно получать качественный биогумус, так как климатические условия нашей страны очень разнообразны. Во-вторых, вызывает сомнение возможность использования данной технологии в южных регионах России, так как указанный диапазон температур не позволяет в теплые месяцы проводить культивирование данного гибрида, а время культивирования (4-6 месяцев) не позволяет получать достаточное количество биогумуса. Кроме того, дефицит азота и доступного фосфора во многих агроландшафтах требует дополнительного азотного и фосфорного питания, что не может обеспечить предлагаемый препарат. Кроме того, низкий титр препарата требует высоких доз внесения для борьбы с болезнями, что делает экономически не эффективным применение биопрепарата.

Известные способы не позволяют получать биопрепарат с высоким титром полезных микроорганизмов и, обладающий комбинированной азотфиксирующей и фосфоролитической активностями.

Техническим решением задачи является расширение ассортимента биопрепаратов, повышение их биологической активности комбинированного спектра действия за счет нескольких штаммов в составе препарата, улучшение агрохимических показателей почвы за счет питательных веществ, находящихся в биогумусе, наличия у препарата азотфиксирующей (как симбиотической, так и ассоциативной) и фосфоролитической активностей и высокого титра полезных микроорганизмов за счет стимуляции друг друга.

Поставленная задача достигается тем, что в способе приготовления комбинированного микробиологического удобрения на основе биогумуса, включающем получение биогумуса путем вермикомпостирования органических отходов с использованием дождевых червей и внесение в биогумус микроорганизмов, в качестве органических отходов используют навоз сельскохозяйственных животных, предварительно нейтрализованный до рН 7-8, а в качестве дождевых червей используют гибрид красного калифорнийского червя с дождевыми червями кубанской природной популяции в количестве 10⁴ на м², при этом вермикомпостирование осуществляют в течение 2-3 месяцев при температуре 16-32°С в естественных условиях, причем после отделения червей из биогумуса виброситом с размером пор 0,5-1,0 см биогумус подсушивают до влажности 50-60%, фасуют в пакеты из полипропилена, в которых автоклавируют в течение 45-75 мин при 0,8-1,2 атм, вносят микроорганизмы, относящиеся к видам Bacillus megaterium var. phosphaticum, Rhizobium japonicum и Agrobacterium radiobacter, в следующем соотношении, %:

Bacillus megaterium var. phosphaticum	10-20
Rhizobium japonicum	20-60
Agrobacterium radiobacter	20-60

и выдерживают до достижения общего титра 5·10¹².

Заявленный способ приготовления комбинированного микробиологического удобрения на основе биогумуса отличается от прототипа режимами изготовления биогумуса, видами и комбинацией используемых микроорганизмов.

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемых технических решений критерию "новизна".

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение поставленной задачи и не выявлены при изучении патентной и научно-технической литературы в данной и смежной областях науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию "изобретательский уровень".

Способ приготовления комбинированного микробиологического удобрения на основе биогумуса реализуется следующим образом.

Пример 1. Навоз крупного рогатого скота складируется в бурты размером 1·5·1,5 метров. Навоз перелопачивается до достижения им температуры окружающей среды. Для регуляции кислотности используется мел или гашеная известь. Защелачивание проводят послойно до достижения навозом рН 7-8. Если кислотность навоза будет менее 7 ед., то черви развиваться в нем не будут, а значит биогумус не будет образовываться. Если кислотность навоза будет более 8 ед., то черви развиваться также в нем не будут, так как это значение рН для них также не оптимально, кроме того, будет перерасход защелачивающего агента, что приведет к дополнительным расходам на подготовке субстрата для червей. Таким образом, оптимальной кислотностью навоза для развития червей является рН, равная 7,5 ед.

В качестве кольчатых червей используется гибрид красного калифорнийского червя с дождевыми червями кубанской природной популяции, полученный при совместном культивировании гибрида красного калифорнийского червя с кубанской популяцией кольчатых навозных червей. Это связано тем, что гибрид красного калифорнийского червя очень чувствителен к условиям внешней среды и требует оптимальной температуры, определенных качеств субстрата, что делает его не технологичным в наших условиях. В тоже время, кольчатые навозные черви, обитающие в почве, хотя и всеядны, но низкопродуктивны и сохраняют инстинкт к миграции, что делает их неудобным объектом для вермикомпостирования. Поэтому использование адаптированной породы обеспечивает достаточно высокую степень продуктивности червей и одновременно низкую восприимчивость к внешним условиям среды.

Готовый к использованию навоз заселяют червями из расчета 10 тыс. червей на 1 м² , предварительно проверив тестом "50 червей", который позволяет оценить качество субстрата. Заселение производится вечером или в пасмурный день, так как черви не выносят прямых солнечных лучей. Навалы с заселенным червями субстратом сверху накрывают травой для защиты от солнца и снижения испарения воды. Навалы периодически поливают, рыхлят верхний слой субстрата. Вермикомпостирование осуществляют в течение 2-3 месяцев. Если время культивирования составляет менее 2 месяцев, то гибрид красного калифорнийского червя и кольчатого червя кубанской популяции не переработает субстрат, а значит выход биогумуса будет незначительный. Если время культивирования составляет более 3 месяцев, то гибрид красного калифорнийского червя и кольчатого червя кубанской популяции, переработав весь субстрат, начтет угнетаться и терять продуктивность, а кроме того, это увеличивает время процесса приготовления биопрепарата, что увеличивает его себестоимость. Поэтому оптимальное время культивирования червей в субстрате составляет 2,5 месяца. Оптимальное культивирование червей в субстрате осуществляют при температуре 24°С. Если температура культивирования составляет менее 16°С, то метаболизм и рост гибридных червей замедляются, а значит и эффективность конверсии субстрата в биогумус будет низкая. Если температура культивирования составляет более 32°С, то рост вермикультуры также будет низким.

В результате роста и размножения червей происходит переработка навоза в биогумус. Отделение червей осуществляют на механических виброситах, причем остающиеся на сите черви используются для последующего получения биогумуса из следующей партии навоза. При этом оптимальным является размер пор сита 0,75 см, что позволяет получать чистый биогумус, свободный от частиц не переработанного субстрата и остатков мусора. Если величина пор сита будет менее 0,5 см, то скорость просеивания будет низка, что увеличит время технологической операции. Если величина пор сита будет более 1,0 см, то вместе с частицами биогумуса в емкость с готовым продуктом будут попадать и частицы не переработанного субстрата, что будет негативно сказываться на качестве готового продукта.

Полученный биогумус подсушивается в потоке горячего воздуха до влажности 55% и складируется в крафт-мешки. Если влажность готового биогумуса будет менее 50%, то будет происходит перерасход теплоносителя при сушке продукта и это потребует дополнительного ввода воды для комфортного развития вносимых в биогумус микроорганизмов. Если влажность готового биогумуса будет более 60%, то качество готового продукта ухудшится, так как получаемое удобрение потеряет сыпучесть, а кроме того, аэрация субстрата будет низкая, что приведет к замедленному развитию микроорганизмов.

Полученный вышеуказанным способом биогумус используется одновременно в качестве и носителя, и субстрата для развития и размножения азотфиксирующими и фосфоролитическими микроорганизмами. По мере необходимости биогумус из крафт-мешков расфасовывается по полипропиленовым пакета в зависимости от объемов использования от 1 кг до 5 кг в пакет. Пакеты закрываются ватно-марлевыми пробками и стерилизуются в автоклаве при режиме 1 атм в течение одного часа, что является оптимальным режимом стерилизации. Если время стерилизации будет менее 45 мин, а давление в автоклаве менее 0,8 атм, то полной стерилизации субстрата не произойдет и в нем останутся микроорганизмы, которые будут мешать росту и развитию вносимых в последствии микроорганизмов, а значит и нужного титра микроорганизмы не достигнут, что снизит качество препарата. Если время стерилизации будет более 75 мин, а давление в автоклаве более 1,2 атм, то за счет жесткого режима автоклавировния в субстрате (биогумусе) образуются вещества, токсичные для бактерий, и качество препарата снизится, кроме того, себестоимость микробиологического препарата будет высокая за счет перерасхода теплоносителей.

Для засева биогумуса используют посевной материал из коллекции чистых культур Федерального государственного учреждения "Краснодарский биоцентр". Пробирку с лиофилизированной чистой культурой Rhizobium japonicum В-2437 оживляют с помощью питательного раствора. Производят засев оживленной культуры в колбы на 750 мл по 200-250 мл питательной среды, представляющей собой гороховый отвар, который дополнительно содержит сахарозу и минеральные соли. Затем полученный маточный раствор засевают в бутыли объемом 5 литров, содержащие по 2,0-2,5 литра питательной среды, включающей в себя кукурузный экстракт, мелассу и минеральные соли. Аналогичным образом производят оживление, засев и наработку жидкой культуры Agrobacterium chroococcum 321. Пробирку с чистой культурой Bacillus megaterium var. phosphaticum 319 оживляют, производят засев в питательную среду, представляющую собой раствор кукурузного экстракта, мелассы, сульфата аммония и мела.

Полученные таким образом рабочие растворы штаммов Rhizobium japonicum В-2437, Agrobacterium chroococcum 321 и Bacillus megaterium var. phosphaticum 319 засевают стерильно в биогумус из расчета конечного общего титра микроорганизмов 5·10 ⁹. Если микроорганизмов вида Rhizobium japonicum В-2437 будет менее 20%, то эффективного симбиотического процесса азотфиксации с бобовыми растениями не произойдет. Если микроорганизмов вида Rhizobium japonicum В-2437 будет более 60%, то соотношение симбиотических и ассоциативных штаммов азотфиксирующих бактерий и фосфоролитических микроорганизмов будет не оптимальным, и эффективного взаимодействия с растениями этих штаммов не произойдет, и качество препарата будет низким. Таким образом, оптимальным содержанием в препарате представителей вида Rhizobium japonicum B-2437 будет 40%. Если микроорганизмов вида Agrobacterium chroococcum 321 будет менее 20%, то эффективного ассоциативного процесса азотфиксации с растениями не произойдет. Если микроорганизмов вида Agrobacterium chroococcum 321 будет более 60%, то соотношение симбиотических и ассоциативных штаммов, а также фосфоролитической бактерии Bacillus megaterium var. phosphaticum 319 будет не оптимальным, и эффективного взаимодействия с растениями этих штаммов не произойдет, и качество препарата будет низким. Таким образом, оптимальным содержанием в препарате представителей рода Agrobacterium будет 40%. Если микроорганизмов вида Bacillus megaterium var. phosphaticum 319 будет менее 10%, то эффективного лизиса труднорастворимых форм фосфора не происходит и качество препарата будет низким. Если микроорганизмов вида Bacillus megaterium var. phosphaticum 319 будет более 20%, то соотношение симбиотических и ассоциативных штаммов азотфиксирующих бактерий и фосфоролитических микроорганизмов будет не оптимальным и эффективного лизиса труднорастворимых форм фосфора препарат производить не будет, а значит качество его будет низким. Таким образом, оптимальным содержанием в препарате представителей вида Bacillus megaterium var. phosphaticum 319 будет 15%.

Перемешивание биогумуса и засеянных азотфиксирующих и фосфоролитических микроорганизмов производят механически таким образом, чтобы не повредить полипропиленовые пакеты. Затем засеянные пакеты помещают в термостатируемое помещение с комнатной температурой.

По истечении 10-14 дней проверяю титр посеянных микроорганизмов, который должен увеличиться на 2-3 порядка за счет совместного роста бактерий на биогумусе и достигать 5·10¹².

Дальнейшее хранение препаратов в неповрежденных пакетах в течение 3-х месяцев не снижало суммарного титра азотфиксирующих микроорганизмов препарата ниже 9·10 ¹⁰, что связано с оптимальным содержанием в биогумусе необходимых для азотфиксирующих и фосфоролитических микроорганизмов питательных веществ и стимуляцией микроорганизмами друг друга за счет синтеза веществ. Результаты экспериментов представлены в таблице 1.

Таблица 1 Титр микроорганизмов Rhizobium japonicum B-2437, Agrobacterium chroococcum 321 и Bacillus megaterium var. phosphaticum 319 при использовании биогумуса по предлагаемому способу в процессе хранения
Компоненты предлагаемого препарата	0 месяцев хранения	1 месяц хранения	3 месяца хранения
Rhizobium japonicum B-2437	2,2·1012	5,3·1011	5,3·1010
Agrobacterium radiobacter 321	2,4·1012	4,1·10 11	4,1·1010
Bacillus megaterium var. phosphaticum 319	8,5·1011	7,8·1010	8,7·109

Пример 2. Согласно способу приготовления комбинированного микробиологического удобрения на основе биогумуса по примеру 1, в качестве сырья для культивирования червей используют куриный помет с добавлением измельченной соломы.

Пример 3. Согласно способу приготовления комбинированного микробиологического удобрения на основе биогумуса по примеру 1, в качестве сырья для культивирования червей используют конский навоз.

Пример 4. Согласно способу приготовления комбинированного микробиологического удобрения на основе биогумуса по примеру 1, в качестве сырья для культивирования червей используют навоз телят на откорме с добавлением измельченной соломы.

Результаты определений количества бактерий Rhizobium japonicum В-2437, Agrobacterium chroococcum 321 и Bacillus megaterium var. phosphaticum 319 в биогумусе разного происхождения представлены в таблице 2.

Таблица 2 Общий титр микроорганизмов Rhizobium japonicum В-2437, Agrobacterium chroococcum 321 и Bacillus megaterium var. phosphaticum 319 при использовании в биогумуса разного качества
№	Вариант	Титр культуры Rhizobium japonicum В-2437, Agrobacterium chroococcum 321 и Bacillus megaterium var. phosphaticum 319
1	вариант 1	1,2·10 12
2	вариант 2	9,4·1011
3	вариант 3	5,3·1011
4	вариант 4	8,2·1011

Результаты лабораторных испытаний по примерам 1, 2, 3, 4 показали, что независимо от происхождения отходов животноводства биогумусом, полученным на их основе, обеспечивается высокий титр азотфиксирующих и фосфоролитических бактерий, необходимый для получения качественного комбинированного микробиологического удобрения на основе биогумуса.

Кроме того, следует отметить, что технология получение биогумуса - это простой процесс, а сырье (органические отходы сельского хозяйства) общедоступно. Одновременно с получением биогумуса решается и проблема защиты окружающей среды, что актуально особенно в аграрных регионах с развитым животноводством.

Результаты анализа химического состава биогумуса и перегноя, полученных из навоза крупного рогатого скота представлены в таблице 3.

Таблица 3 Химическая характеристика биогумуса и перегноя (%)
Наименование	Биогумус	Перегной
Кислотность среды	6,7	7,8
Органические вещества	44,9	23,6
Гуминовые кислоты	3,4	2,3
Фульвокислоты	2,2	0,6
Органический углерод	3,31	1,7
Азот	3,22	1,54
Фосфор	0,49	0,35
C:N	1,04	1,10
Электрическая проводимость мера относительной солености почвы или количества растворимых солей	12,1	3,60

Как видно из таблицы, использование биогумуса позволяет не только обеспечить высокие показатели концентрации азотфиксирующих и фосфоролитических бактерий, но и использовать биогумус как высокоэффективный источник питательных веществ для роста растений (данные химического состава биогумуса приводятся в сравнении с составом перегноя).

Не следует забывать и о том, что использование биогумуса в качестве наполнителя для препарата, получаемого предлагаемым способом, не только обеспечивает растения полезными микроорганизмами, но и само по себе является источником питательных веществ за счет биогумуса. Следует отметить, что препараты на основе биогумуса при использовании для обработки семян бобовых практически не требуют прилипателя и позволяют равномерно распределить бактерии по поверхности семян, что в целом повышает биологическую активность предлагаемого препарата.

Таким образом, способ получения комбинированного бактериального удобрения для растений на основе биогумуса не только позволяет получить высокий титр азотфиксирующих и фосфоролитических микроорганизмов за счет наличия в нем питательных веществ, а также этот эффект обеспечивается одновременным культивированием трех родов микроорганизмов, которые способны стимулировать рост и развитие друг друга. Кроме того, предлагаемый препарат способен активизировать бобовые растения и их семена за счет наличия питательных и ускоряющих веществ самого биогумуса, обеспечивая тем самым расширение ассортимента биопрепаратов, и, наконец, частично решить проблемы утилизации отходов животноводства за счет возможности размещение малотоннажных производств непосредственно в регионах.