способ фотодинамической инактивации бактерий

Формула изобретения

1. Способ фотодинамической инактивации бактерий, включающий воздействие светом, отличающийся тем, что воздействуют синим светом в спектральном диапазоне 440-480 нм, с дозой облучения 120 Дж/см².

2. Способ фотодинамической инактивации бактерий, включающий воздействие светом, отличающийся тем, что воздействуют фиолетовым светом в спектральном диапазоне 400-420 нм, с дозой облучения 40 Дж/см² .

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, санитарии и гигиене. Оно может быть использовано при лечении инфекций, возникающих после хирургического вмешательства; при лечении гнойных ран и воспалений; для борьбы с внутрибольничными инфекциями, обусловленными эковарами.

Кроме того, предлагаемый способ может применяться с профилактическими, антибактериальными целями в местах большого и постоянного скопления людей: в поликлиниках, школах, на транспорте. Его можно использовать для борьбы с инфекциями и обеззараживания помещений в агропромышленных комплексах, а также для обеззараживания бытовой техники - холодильников, диспенсеров и кондиционеров.

В основе оптических методов фотоинактивации бактерий (за исключением УФ-облучения, которое воздействует непосредственно на ДНК) лежит явление, открытое О.Раабом и X. фон-Таппайнером в 1900 году. Суть открытия заключалась в следующем: когда интенсивность света в поле микроскопа была достаточно большой, окрашенные акридином или другими флуоресцирующими красителями, такими как хинин, метил фосфин и эозин, клетки парамеции прекращали движение и погибали, причем спектр действия этого эффекта соответствовал спектрам поглощения красителей.

Это была первая публикация о возможности фотоинактивации возбудителей инфекционных заболеваний в видимом диапазоне спектра [1]. Явление было названо фотодинамическим действием. Фотодинамические реакции - это такие реакции окисления субстратов кислородом, которые не идут в темноте, но осуществляются при добавлении красителя и его освещении. При этом краситель (фотосенсибилизатор) не расходуется, его роль состоит в том, что он делает реакцию окисления чувствительной к свету. К фотодинамическому действию чувствительны практически все биологические объекты: позвоночные и беспозвоночные животные, простейшие, высшие и низшие растения, микроорганизмы, растительные и микробные вирусы, внутриклеточные органеллы, биополимеры, биологические молекулы различных размеров. Важное прикладное значение фотодинамического действия делает это явление одним из главных фотобиологических явлений в природе. Бактерии, будучи прокариотическими клетками с простым строением, являются объектом весьма чувствительным к фотодинамическому действию.

В настоящее время фотодинамическая терапия (ФДТ) широко применяется как в лечении злокачественных опухолей, так и неопухолевых заболеваний [2, 3, 4]. В последние годы стали проводиться исследования по антибактериальной фотодинамической терапии (АФДТ) [5].

В антибактерикальной фотодинамической терапии (АФДТ) применяют разработанные для ФДТ рака фотосенсибилизаторы: Фотофрин в США; Фотосан в Германии; Фотогем в России. В самое последнее время в АФДТ стали применять новый фотосенсибилизатор на основе алюминия-сульфофталацианина - Фотосенс [6].

Во всех существующих в настоящее время методиках фотоинактивации бактерий используют экзогенные (внесенные извне) фотосенсибилизаторы. Например, в ближайшем прототипе (Патент РФ RU 2164427) предлагаемого способа процедура АФДТ заключалась в следующем: после 24-часовой аппликации салфетки, смоченной раствором фотосенсибилизатора, инфицированные раны облучали красным некогерентным светом газоразрядной лампы, снабженной узкополосным светофильтром (длина волны 600-700 нм), АТО-1-150 в дозе 42 Дж/см² [7]. В качестве фотосенсибилизатора в [7] применяли Фотосенс в концентрациях 125; 250; и 500 мкг/мл.

Способ фотоинактивации бактериальной флоры, применяемый в прототипе, имеет ряд недостатков: необходимо предварительно нанести или ввести фотосенсибилизатор, который является достаточно дорогим препаратом; затем после проведения процедуры облучения необходимо удалить фотосенсибилизатор. Нанесение раствора фотосенсибилизатора на большие площади или его распыление в больших объемах представляется весьма проблематичным. При обработке оптическим излучением объектов, помещенных в запаянные пластиковые пакеты, например консервантов крови и кровезаменителей, также невозможно предварительное внесение извне фотосенсибилизаторов.

С другой стороны, практически во всех биологических объектах присутствуют эндогенные (находящиеся внутри) фотосенсибилизаторы. Это - порфирины и флавины; они, по-видимому, являются самыми древними элементами живой материи. Порфирины поглощают в фиолетовой области спектра (400-420) нм, а флавины - в синей - (440-480) нм.

Следовательно, воздействуя на инфицированные участки фиолетовым или синим светом, можно получить антибактериальный эффект без дополнительной предварительной обработки поверхности экзогенным фотосенсибилизатором.

Цель заявляемого изобретения заключается в реализации фотодинамического антибактериального действия за счет оптического возбуждения фотосенсибилизаторов в синем и фиолетовом диапазонах спектра.

Задачей изобретения является создание способа фотодинамической инактивации бактерий при лечении гнойных ран; для борьбы с внутрибольничными инфекциями; для обеззараживания мест сосредоточения большого количества людей: в поликлиниках, школах, казармах, на транспорте и т.д.

Для обработки внутренних поверхностей бытовой техники: холодильников; кондиционеров; диспенсеров и микроволновых печей.

Способ осуществляют следующим образом: при необходимости проведения дезинфекции облучают обсемененную бактериями поверхность синим (440-480) нм, или фиолетовым (400-420) нм светом с дозами облучения: 120Дж/см² и 40 Дж/см² соответственно.

Простейшие виды фотобиологического действия излучения (например, гибель бактерий) достаточно строго подчиняются закону Бунзена-Роско, который гласит: «... количество продуктов фотохимической реакции определяется только дозой света, малые плотности мощности облучения могут компенсироваться большим временем облучения и, наоборот...» [8].

где D - доза облучения, Дж/м ²

Р - плотность мощности облучения, Вт/м ²

t - время облучения, с.

Следовательно, для фотоинактивации бактерий в зависимости от характера задачи можно использовать либо малые интенсивности облучения и длительное время облучения, либо кратковременные высокие интенсивности облучения.

Источник синего света и длительность сеанса облучения выбирают в зависимости от объекта, обсемененного бактериальной микрофлорой: гнойные раны; медицинский инструмент; поверхности холодильников, кондиционеров, диспенсеров и т.д. облучают с помощью светодиодных облучателей. Стены, пол и потолки в лечебных учреждениях; вода в бассейнах; внутренние поверхности салонов общественного транспорта; места содержания скота в животноводческих комплексах обрабатываются излучением газоразрядных ламп с узкополосным редкоземельным люминофорным покрытием; спектр излучения такой «монохроматической» лампы представлен на чертеже.

Световой поток, создаваемый современным светоизлучающим диодом, в спектральной области 440-480 нм составляет 6 люменов; световой поток от лампы с узкополосным люминофорным покрытием, например от лампы ЛГ40, составляет 1000 люмен [9]. Таким образом, локальное облучение удобно проводить, используя светодиодный источник излучения, а облучение больших поверхностей - с помощью газоразрядных люминесцентных ламп.

Эффективность предлагаемого способа фотодинамической инактивации подтверждается следующими примерами.

Для проведения опытов была создана матрица из 110 светоизлучающих диодов; матрица обеспечивала равномерное облучение чашек Петри с бактериальной культурой с плотностью мощности облучения -4 мВт/см².

Спектральная область излучения матрицы (440-480) нм.

В ряде опытов для облучения бактериальных культур использовали ртутную дуговую лампу с узкополосным редкоземельным люминофорным покрытием и светофильтром, излучающую в спектральном диапазоне (400-420) нм.

Выполнены опыты по фотодинамической инактивации следующих штаммов бактерий: Escherichia coli (ATCC 25922); Staphylococcus aureus (ATCC 25923); Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).

Опыты по фотодинамической инактивации бактерий проводили следующим образом.

Подготавливали микробную суспензию каждой культуры: E.coli; S. aureus и P.aeruginosa. Процедурой стандартных разведений (шесть разбавлений) в изотоническом растворе (0,9% NaCl в дистиллированной воде) доводили концентрацию суспензии до 150 КОЕ/мл (КОЕ-колониеобразующая единица; мл-миллилитр). Отбирали по 0,2 мл каждой суспензии (E.coli, S.aureus, и P.aeruginosa) в чашки Петри; использовали по две чашки на каждую суспензию - одну облучали, другая была контрольной.

Облучение осуществляли:

1) в камере бытового холодильника при температуре 5°С в течение 12-24 часов; контрольную чашку Петри выдерживали в тех же условиях в темноте. Затем облученную суспензию и контрольную суспензию высевали на агар в другие чашки Петри и помещали эти чашки в термостат с температурой 37°С, на 20 часов. После выдержки в термостате проводили подсчет колоний как в облученных образцах, так и в контрольных. Одновременно осуществляли контроль воздуха помещения: открытая чашка Петри с нанесенным агаром выдерживалась в помещении в течение 24 часов, а затем размещалась в термостате при Т=37°С на 20 часов.

2) в термостате при температуре 37°С в течение 12-24 часов; контрольную чашку Петри выдерживали в тех же условиях в темноте. Облученную и контрольную суспензию высевали на агар в другие чашки Петри, которые помещали в термостат с температурой 37°С на 20 часов. После выдержки в термостате проводили подсчет колоний как в облученных образцах, так и в контрольных.

3) при комнатной температуре (19-21°С), в разных опытах, в течение - от 0,5 часа до 10 часов.

После облучения контрольную и облученную суспензии высевали на агар в другие чашки Петри, затем эти чашки помещали в термостат при температуре 37°С и выдерживали там в течение 20 часов. После выдержки в термостате проводили подсчет колоний в облученных и контрольных образцах. Результаты опыта при Т=5°С представлены в таблице 1.

Таблица 1 Фотодинамическая инактивация бактерий при температуре холодильной камеры Т=5°С
№ опыта	Род бактерии.	Доза облучения, Дж/см2	Длина волны, облучения, нм	Источник облучения.	Температура окружающ. среды.	Результат (КОЕ)	Контроль (КОЕ)*	Примечание
1	E.coli	117	440-480	Светодиодн. матрица	+5°С	0	14
2	S.aureus	117	440-480	Светодиодн. матрица	+5°С	0	16
3	P.aemginosa	117	440-480	Светодиодн. матрица	+5°С	0	15

Результаты опыта при температуре 37°С (логарифмическая фаза размножения бактерий) представлена в таблице 2.

Таблица 2 Фотодинамическая инактивация бактерий при температуре термостата Т=37°С
№ опыта	Род бактерии	Доза облучения, Дж/см2	Длина волны облучения, нм	Источник облучения.	Температура окружающей среды.	Результат (КОЕ)	Контроль (КОЕ)*	Примечание
1	E.coli	117	440-480	Светодиодн. матрица	37°С	7	50
2	S. aureus	117	440-480	Светодиодн. Матрица	37°С	8	16
3	P.aeruginosa	117	440-480	Светодиодн. матрица	37°С	8	52

Результаты опыта при комнатной (19-21°С) температуре представлены в таблице 3.

Таблица 3 Фотодинамическая инактивация бактерий при комнатной температуре Т=19°С
№ опыта	Род бактерий	Доза облучения Дж/см2	Длина волны нм	Источник облучения	Температура окружающ. среды	Результат (КОЕ)	Контроль (КОЕ)*	Примечание
1	Е. coli	38	400-420	Ртутн. лампа + фильтр	(19-21)°С	6	31
2	E.coli	98	440-480	Светодиодн. матрица	(19-21)°С	8	31
3	S. aureus	14,4	400-420	Ртутн. Лампа + фильтр	(19-21)°С	1	14
4	S. aureus	58	440-480	Светодиодн матрица	(19-21)°С	1	14

Из представленных примеров следует, что облучение фиолетовым (400-420 нм) светом при дозах, превышающих 40 Дж/см² и синим (440-480 нм) светом при дозах, превышающих 120 Дж/см², приводит к фотоинактивации бактерий. Облучение красным светом (640-670 нм) при тех же дозах облучения не приводит к инактивации бактерий.

Источники информации

1. А.А. Красновский мл. Фотодинамическое действие и синглетный кислород, 2004, том 49, вып.2, с.305-321.

2. T.J. Dougherty " Photodynamic therapy for the treatment of cancer" Conference on Lasers and Electro-Optics Technical Digest. June 19-22, Anhcim (California), 1984, p.214

3. В.А. Дуванский. Фото динамическая терапия в комплексном лечении больных с острыми гнойными заболеваниями мягких тканей. Лазерная медицина, 2003, том 7, вып.3-4, стр.41-45.

4. Т.Maish, R-M Szeimies, G.Jori, C.Abels " Antibacterial photodynamic therapy in dermatology", Photochemical and Photobiological Sciences, 2004, 3(10), p.907-917.

6. И.Г.Меерович, В.В.Жердева и др. Фотодинамическая активность дибиотилинированного сульфофталоцанина алюминия in vitro и in vivo. Лазерная медицина, 2003, том 6, вып.2, стр.38-41.

5. N.A.Romanova, L.Y.Brovko, L.Moore et all. " Assessment of Photodynamic Destruction of Escerichia coli and Listeria monocytogenes by Using ATP Bioluminescence", Applied and Environmental Microbiology, November 2003, Vol.69, No.11, p.6393-6398.

7. У.М.Корабоев, М.П.Толстых, В.А.Дуванский, Д.Н.Усманов. Изучение антибактериальной активности фотодинамической терапии в эксперименте. Лазерная медицина, 2001, том 5, вып.2, стр.27-29.

8. Справочная книга по светотехнике. "Гл. 16.4 Установки фотобиологического действия", стр.465-469. Москва: Энергоатомиздат, 1995 г.