способ получения 2,3-дигидроксифенильных производных (варианты)

Формула изобретения

1. Электроферментативный способ получения 2,3-дигидроксифенильных производных общей формулы I

где

R означает незамещенную, монозамещенную или полизамещенную фенильную группу, алкильную группу с числом атомов углерода от одного до шести, атом галогена или нитрильную группу, а R' означает атом водорода или гидроксильную группу, отличающийся тем, что

a) моногидроксифенильное соединение общей формулы II

где R и R' имеют приведенные выше значения, подвергают превращению под действием 2-гидроксибифенил-3-монооксигеназы (HbpA) (E.C. 1.14.13.44) в присутствии NADH и кислорода и

б) образовавшийся NAD⁺ электрохимически восстанавливают до NADH.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что электрохимическое восстановление NAD ⁺ проводят в присутствии окислительно-восстановительного гидридно-родиевого катализатора, образующегося и регенерирующегося на катоде.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве окислительно-восстановительного катализатора применяют родиевый комплекс, превращающийся электрохимическим путем в гидридно-родиевый комплекс при катодном потенциале в области от -650 до -800 мВ, измеренном по отношению к хлорсеребряному электроду (Ag/AgCl, при насыщении) (рН 6-9, температура 20-30°С).

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что используют родиевый комплекс общей формулы III

где Ср означает циклопентадиенильный или пентаметил-циклопентадиенильный остаток и bpy означает 2,2'-бипиридил, причем каждое из пиридильных колец может быть моно- или полизамещенным донорной группой.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что родиевый комплекс формулы III восстанавливают на катоде с образованием гидридно-родиевого комплекса формулы IIIa

который может восстанавливать NAD ⁺.

6. Способ по одному из пп.1-5, отличающийся тем, что для его проведения используют следующие условия:

а) концентрация субстрата от 0,1 до 4 ммоль/л,

б) концентрация NAD⁺ от 0,01 до 0,5 ммоль/л,

в) концентрация родиевого комплекса от 5 мкмоль/л до 0,5 ммоль/л,

г) концентрация HbpA от 10 до 1000 ед./л,

д) концентрация FAD от 0 до 200 мкмоль/л,

е) концентрация каталазы от 0 до 1×10 ⁷ ед./л,

ж) значение рН от 6 до 7,5,

з) температура от 20 до 30°С,

и) катодный потенциал от -650 до -800 мВ,

к) подача кислорода от 20 до 120 см ³(мин·л).

7. Способ электрохимической регенерации NAD(P)H из образовавшегося в результате ферментативного превращения NAD(P)⁺, отличающийся тем, что протекающее с расходованием NAD(P)H окислительное ферментативное взаимодействие окисляющегося субстрата проводят в присутствии NAD(P)H, а образовавшийся при окислении субстрата NAD(P)⁺ электрохимическим путем восстанавливают до NAD(P)H, при этом для проведения ферментативного взаимодействия NAD(P)H-зависимую монооксигеназу (из класса E.C.I.14.-.-) инкубируют с окисляющимся субстратом в присутствии NAD(P)H и в присутствии кислорода, а образовавшийся при восстановительном расщеплении кислорода и при окислении субстрата NAD(P) ⁺ электрохимическим путем восстанавливают до NAD(P)H.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что электрохимическое восстановление NAD(P)⁺ проводят в присутствии гидридно-родиевого окислительно-восстановительного катализатора, обладающего способностью к синтезу и к регенерации на катоде.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что в качестве окислительно-восстановительного катализатора применяют родиевый катализатор и этот родиевый катализатор может быть переведен электрохимическим путем в гидридно-родиевый комплекс при катодном потенциале в пределах от -650 до -800 мВ, измеренном по отношению к хлорсеребряному электроду (Ag/AgCl, при насыщении), (рН 6-9, температура от 20 до 35°С).

10. Способ но п.9, отличающийся тем, что используют родиевый комплекс общей формулы III

где Ср означает циклопентадиенильный или пентаметил-циклопентадиенильный остаток и

bpy означает 2,2'-бипиридил, причем каждое из пиридильных колец может быть моно- или полизамещенным донорной группой.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что родиевый комплекс формулы III восстанавливают на катоде в гидридно-родиевый комплекс формулы IIIa

который может восстанавливать NAD ⁺.

12. Способ по одному из пп.7 - 11, отличающийся тем, что для его осуществления используют следующие условия:

а) концентрация NAD(P)⁺ от 10 мкмоль/л до 0,5 ммоль/л,

б) концентрация родиевого комплекса от 5 до 0,5 ммоль/л,

в) концентрация монооксигеназы от 10 до 1000 ед./л,

г) концентрация FAD от 0 до 200 мкмоль/л,

д) концентрация каталазы от 0 до 1×10 ⁷ ед./л,

е) значение рН от 5 до 9,

ж) температура от 20 до 35°С,

з) катодный потенциал от -650 до -800 мВ,

и) подача кислорода от 20 до 120 см ³(мин·л).

13. Способ по одному из пп.7 - 12, отличающийся тем, что окислительное ферментативное взаимодействие включает один из следующих далее типов реакций:

а) окисление насыщенных или ненасыщенных алифатических или ароматических атомов углерода, в частности, в результате реакции гидроксилирования, эпоксидирования или окисления по Байеру-Виллигеру;

б) окисление серы или селена;

в) окисление азота или фосфора:

г) окисление галогенидов.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к способу, включающему непрямую электрохимическую регенерацию NAD(P)H из NAD(P) ⁺, который, например, образуется при катализируемом ферментами восстановительном расщеплении кислорода. Соответствующий изобретению способ электрохимической регенерации может, в частности, найти применение в рамках электроферментативных взаимодействий, протекающих с участием NAD(P)H, в частности, при окислительных ферментативных превращениях субстратов при действии монооксигеназ. В частности, объектом изобретения является электроферментативный способ катализируемого монооксигеназами получения 2,3-дигидроксифенильных производных.

Биокатализируемые реакции приобретают постоянно возрастающее значение в лабораторном органическом синтезе и в многочисленных областях промышленного применения. В частности, высокие регио- и стереоселективности, обычные для ферментативных взаимодействий, протекающих одновременно в мягких условиях и с высокими выходами, делают их привлекательными инструментами в планировании синтезов. В отличие от гидролитических ферментов, которые уже находят многоплановое применение, использование окислительно-восстановительных ферментов для энантиоселективных восстановлений и для хемо-, регио- и энантиоселективных окислений, несмотря на их высокий синтетический потенциал, распространено еще не очень широко. В основе этого лежит прежде всего не нашедшая до сих пор удовлетворительного решения проблема эффективной регенерации кофактора. Наряду с установившимися способами регенерации кофакторов с участием сопряженных ферментов [1а, б, в, г] были между тем разработаны и распространены на NAD(P)⁺ - и NAD(P)H - зависимые ферменты и электрохимические способы регенерации [2а, б, в]. Преимущество непрямой электрохимической регенерации кофактора состоит в том, что для этого требуется только фермент, участвующий в образовании продукта, и благодаря этому становится излишней дающаяся часто с большим трудом оптимизация двойной ферментной системы. Кроме того, при этом можно отказаться и от косубстрата.

Монооксигеназы имеют важное синтетическое значение, поскольку они могут регио- и стереоселективно встраивать кислородные функциональные группы в соответствующие субстраты. Для этого они нуждаются в молекулярном кислороде, О-О-связь которого подвергается восстановительному расщеплению с образованием воды [3а, б]. Нативные кофакторы монооксигеназ NADH или NADPH поставляют требуемые для этого восстановительные эквиваленты. Проводившиеся до настоящего способы in vitro с участием монооксигеназ в качестве катализирующих образование продукта ферментов основаны на регенерации кофактора в сопряженном ферментативном процессе с использованием формиатдегидрогеназы [4а, б] (для NADH или соответственно NADPH) или глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы [5] для (NADPH).

Reipa и др. [10] описывают способ электрохимической регенерации путидаредоксина, естественного партнера в окислительно-восстановительной реакции цитохром-CYP-101-монооксигеназы (E.C.1.14.15.1). Для этого предложено применение специального электрода из оксида олова с добавлением сурьмы, который подходит только для восстановления путидаредоксина.

Held и др. [8] описывают биокаталитическое получение 3-фенилпирокатехина с использованием целых клеток Escherichia coli JM 101 (pHDT 461). Этот рекомбинантный микроорганизм предназначен для получения фермента 2-гидроксибифенил-3-монооксиге-назы. В этом случае нет необходимости в электрохимической регенерации израсходованного NADH, поскольку этот кофактор снова регенерируется ферментативной системой неповрежденных клеток Escherichia coli.

Задача настоящего изобретения состояла в том, чтобы разработать бесферментный, селективный и эффективный способ непрямой электрохимической регенерации NAD(P)H, который, например, в сочетании с монооксигеназами может найти применение для окислительного превращения субстратов при восстановительном расщеплении кислорода. Еще одна задача заключалась в разработке способа, который делает возможным ферментативный, катализируемый монооксигеназами синтез 2,3-дигидроксифенильных соединений, например 2,3-дигидроксибифенила, при непрямой электрохимической регенерации NAD(P)H.

Краткое описание изобретения

Поставленные задачи решаются благодаря разработке электроферментативного способа получения 2,3-дигидроксифенильных производных общей формулы I

,

где

R означает незамещенную или от одного до нескольких раз замещенную фенильную группу, алкильную группу с числом атомов углерода от одного до шести, атом галогена или нитрильную группу, а

R' означает атом водорода или гидроксильную группу,

и при этом данный способ состоит в том, что

а) моногидроксифенильное соединение общей формулы II

,

где

R и R' имеют приведенные выше значения,

подвергается превращению под действием 2-гидроксибифенил-3-монооксигеназы (HbpA) (E.C.1.14.13.44) в присутствии NADH и кислорода и

б) образовавшийся NAD⁺ электрохимически восстанавливается до NADH.

Кроме того, эти задачи решаются благодаря разработке способа регенерации NAD(P)H при протекающем с расходованием NAD(P)H окислительном ферментативном превращении субстрата, в ходе которого расходующее NAD(P)H окислительное ферментативное взаимодействие окисляющегося субстрата проводят в присутствии NAD(P)H и предпочтительно с участием в реакции кислорода, а образующийся при окислении субстрата NAD(P) ⁺ электрохимически восстанавливают до NAD(P)H. Так, например, зависимую от NAD(P)H монооксигеназу (из класса E.C.1.14.-.-) можно инкубировать вместе с окисляющимся субстратом в присутствии NAD(P)H и в присутствии кислорода, а образовавшийся при восстановительном расщеплении кислорода и окислении субстрата NAD(P) ⁺ электрохимически восстанавливать до NAD(P)H.

Настоящее изобретение впервые позволяет проводить не связанную с ферментом непрямую электрохимическую регенерацию NADH или соответственно NADPH в рамках расходующих кислород реакций, например реакций, катализируемых монооксигеназами. Благодаря непрямой электрохимической регенерации кофактора становится возможным превращение субстрата по непрерывной схеме.

Понятие "непрямой" электрохимической регенерации NAD(P)H в рамках настоящего изобретения понимается как регенерирование кофактора через подходящий для этого окислительно-восстановительный катализатор, который переносит требуемые для восстановления электроны от катода на окисленный кофактор.

Детальное описание изобретения

Первым объектом изобретения является электроферментативный способ получения 2,3-дигидроксифенильных производных общей формулы I

где

R означает незамещенную или от одного до нескольких раз замещенную, например атомами галогенов, например атомами фтора, хлора, брома или иода, нитрильной или гидроксильной группой, в частности гидроксильной группой, фенильную группу, означает алкильную группу с числом атомов углерода от одного до шести, например это метальная, этильная, н-пропильная или изопропильная группа, н-бутильная, изобутильная или трет.-бутильная группа, а также н-пентильная или н-гексильная группа или же в каждом отдельном случае их разветвленные аналоги, означает атом галогена, например атом фтора, хлора, брома или иода, или же означает нитрильную группу, а

R' означает атом водорода или гидроксильную группу, причем R' находится в м- или в n-положении, предпочтительно в n-положении к 2-гидроксильной группе фенильного кольца,

и при этом данный способ состоит в том, что

а) моногидроксифенильное соединение общей формулы II

где

R и R' имеют приведенные выше значения,

подвергается превращению под действием 2-гидроксибифенил-3-монооксигеназы (HbpA) (E.C.1.14.13.44) в присутствии NADH и кислорода и

б) образовавшийся NAD⁺ электрохимически восстанавливается до NADH.

Предпочтительно, когда электрохимическое восстановление NAD⁺ проводят в присутствии гидридно-родиевого окислительно-восстановительного катализатора, который образуется на катоде и регенерируется. Окислительно-восстановительный катализатор при этом предпочтительно представлен растворимым родиевым комплексом, который может быть электрохимически переведен в гидридно-родиевый комплекс при катодном потенциале в пределах от -650 до -800 мВ, измеренном по отношению к хлорсеребряному электроду (Ag/AgCl, при насыщении) (рН=6-9, температура 20-60°С, в частности от примерно 20 до 35°С, например около 30°С). Особое предпочтение отдается использованию при проведении катализируемой HbpA реакции родиевого комплекса общей формулы III

где

Ср означает циклопентадиенильный или пентаметилциклопентадиенильный остаток

и

bpy означает 2,2'-бипиридил, причем каждое из пиридильных колец может быть от одного до нескольких раз, в частности один раз, замещено донорной группой, при этом донорная группа выбрана из метальной группы, метоксигруппы и ацетамидогруппы.

В предпочтительном варианте каждое пиридильное кольцо может нести эти заместители в 4- или в 5-положении. В частном случае пиридильные кольца замещены одинаковыми донорными группами.

В рамках соответствующего изобретению способа при катализе с участием HbpA родиевый комплекс формулы III восстанавливается на катоде в способный к восстановлению NAD⁺ гидридно-родиевый комплекс формулы IIIa

где Ср и bpy имеют приведенные выше для формулы III значения.

Предпочтительно, когда соответствующее изобретению получение дигидроксизамещенных соединений формулы I проводят в следующих далее условиях:

а) концентрация субстрата (соединение формулы II) от 0,01 до 50 ммолей/л, в частности от 0,1 до 4 ммолей/л,

б) концентрация NAD⁺ от 0,01 до 5 ммолей/л, в частности от 0,01 до 0,5 ммоля/л,

в) концентрация родиевого комплекса от 1 мкмоля/л до 5 ммолей/л, в частности от 5 мкмолей/л до 0,5 ммоля /л,

г) концентрация HbpA от 1 до 5000 единиц/л, в частности от 10 до 1000 единиц/л,

д) концентрация флавинадениндинуклеотида (FAD) от 0 до 200 мкмолей/л, в частности от 0 до 20 или от 1 до 20 мкмолей/л,

е) концентрация каталазы от 0 до 1×10 ⁷ единиц/л,

ж) значение рН от 4 до 9, в частности от 6 до 7,5,

з) температура от 10 до 40°С, в частности от 20 до 35°С или около 30°С,

и) катодный потенциал от -600 до -900 мВ, в частности от -650 до -800 мВ,

к) подача кислорода от 20 до 120 см³/(мин·л) путем барботирования или, в частности, без барботирования через проницаемые для кислорода мембраны или шланги, как это, например, описано в [11].

Подходящие для реализации изобретения электродные системы описаны в [12] и [13]. В качестве представляющих, но не ограничивающих объем притязаний, примеров подходящих анодно-катодных пар можно назвать такой углеродный катод/платиновый анод, как, в частности, углеродный катод в форме цилиндра (угольный фетр, Sigraflex^®) и анод из платиновой проволоки.

Превращаемые в соответствии с изобретением субстраты формулы II в общем случае представляют собой доступные соединения и они могут быть приобретены коммерческим путем или получены обычными для органической химии способами. В качестве примеров, которые не могут ограничивать объем притязаний, можно назвать: 2-гидрокси-алкилбензолы с числом атомов углерода в алкильной группе от одного до шести, галогензамещенные 2-гидроксибензолы, 2-гидроксибензонитрил и 2,5-дигидроксизамещенные аналоги этих производных бензола; 2-гидроксибифенил и замещенные несколькими гидроксильными группами бифенилы, например 2,4-, 2,5- или 2,6-ди-гидроксибифенил, 2,n'-дигидроксибифенилы (здесь n' означает 2, 3 или 4) или же 2,n',m'-тригидроксибифенилы (при этом n' и m' отличаются друг от друга и означают в каждом отдельном случае 2, 3 или 4).

В соответствии с изобретением предпочтение отдается использованию в качестве окислительно-восстановительных катализаторов [CpRh(bpy)Cl]Cl-комплексов. Получение этих комплексов общеизвестно и оно проводится так, как это описано в [14] или [15]. Образующиеся из них после электрохимического восстановления при -700 мВ (по отношению к Ag/AgCl_насыщ. ) или же после химического восстановления формиатом гидридно-родиевые комплексы быстро и количественно переводят NAD(P) ⁺ в активную по отношению к ферментам 1,4-NAD(Р)Н-форму [2, 6].

В качестве типичного примера подходящих ферментов можно назвать представляющую класс флавин-зависимых монооксигеназ 2-гидроксибифенил-3-монооксигеназу (HbpA, Е.С.1.14.13.44) из Р. azelaica, которая нуждается в NADH в качестве кофактора [7]. Этот фермент находится в виде гомотетрамера с общей массой 256 кДа, и в соответствии со схемой 1 он катализирует селективное орто-гидроксилирование целого ряда -замещенных фенольных производных. Химическим путем эту реакцию нельзя провести со сравнимой селективностью.

Схема 1: Принцип протекания реакции с HbpA

Предпочтительно, когда катализируемая HbpA реакция протекает в водной реакционной среде, значение рН которой установлено с помощью обычных, не оказывающих отрицательного влияния на протекание реакции и на электрохимический процесс буферных соединений, например таких, как HEPES [N-(2-гидроксиэтил)-пиперазин-N'-(2-этансульфонат)], PIPES [пиперазин-1,4-бис(2-этансульфонат)] и, в частности, буфер на основе фосфата калия и буфер на основе гидрохлорида ТРИС. Концентрация буфера при этом лежит в пределах от примерно 20 ммолей/л до 0,2 моля/л, в частности от примерно 20 ммолей/л до 50 ммолей/л. Значение рН предпочтительно устанавливают в пределах от примерно 6 до 8, в частности около 7,5.

Реакционная среда может содержать и такие другие обычные добавки, как, например, солюбилизатор для субстрата, кофакторы, например FAD или FMN, для используемого фермента и другие подобные им вещества.

При использовании чувствительных к окислению ферментных систем может иметь смысл использование антиоксидантов. Если, например, по условиям проведения процесса происходит образование пероксида водорода, который может оказывать отрицательное влияние на активность фермента, то реакцию можно проводить в присутствии каталазы, добавленной, например, в концентрации 1·10 ⁵ единиц/л.

Еще один объект изобретения относится к способу электрохимической регенерации NAD(P)H, применяемому при протекающем с расходованием NAD(P)H окислительном ферментативном превращении субстрата, причем протекающее с расходованием NAD(P)H окислительное ферментативное превращение вступающего в реакцию окисления субстрата проводят в присутствии NAD(P)H и предпочтительно с расходованием кислорода, а образовавшийся при окислении субстрата NAD(P)⁺ электрохимически восстанавливают в NAD(P)H. Предпочтительно этот способ подходит для проведения в рамках реакций, катализируемых монооксигеназами. При этом NAD(P)H-зависимую монооксигеназу (из класса E.C.1.14.-.-) инкубируют с вступающим в реакцию окисления субстратом в присутствии NAD(P)H и в присутствии кислорода, а образовавшийся при восстановительном расщеплении кислорода и при окислении субстрата NAD(P)⁺ электрохимически восстанавливают до NAD(P)H.

В соответствии с предпочтительным вариантом реализации изобретения электрохимическое восстановление NAD(P)⁺ проводят в присутствии предпочтительно растворимого гидридно-родиевого окислительно-восстановительного катализатора, который может образовываться и регенерироваться на катоде.

Соответствующий изобретению способ предпочтительно использует в качестве окислительно-восстановительного катализатора для регенерации NAD(P)H родиевый катализатор, который при катодном потенциале в пределах от -650 до -800 мВ, измеренном по отношению к хлорсеребряному электроду (Ag/AgCl, при насыщении) (рН=6-9, температура 20-60°С, в частности от примерно 20 до 35°С, например около 30°С) может быть переведен в гидридно-родиевый комплекс.

Для регенерации NAD(P)H в соответствующем изобретению способе предпочтение отдается использованию родиевых комплексов общей формулы III'

где

Ср означает циклопентадиенильный или пентаметилциклопентадиенильный остаток и

bpy означает 2,2'-бипиридил, причем каждое из пиридильных колец может быть от одного до нескольких раз, в частности один раз, замещено донорной группой, при этом донорная группа выбрана из метильной группы, метоксигруппы и ацетамидогруппы. Кроме того, в качестве донорной группы может выступать остаток, представляющий собой производное полиэтиленгликоля, например производное полиэтиленгликоля от 2000 до 20000. В предпочтительном варианте каждое пиридильное кольцо может нести один такой заместитель в 4-или в 5-положении. В частном случае пиридильные группы замещены одинаковыми донорными группами.

Родиевый комплекс формулы III' восстанавливается на катоде в гидридно-родиевый комплекс формулы IIIa'

где Cp и bpy имеют приведенные выше для формулы III' значения, причем этот гидридно-родиевый комплекс может восстанавливать NAD⁺.

Предпочтительно, когда соответствующий изобретению способ регенерации NAD(P)H реализуют в следующих далее условиях:

а) концентрация NAD(P) ⁺ от 0,01 до 5 ммолей/л, в частности от 0,01 до 0,5 ммоля/л,

б) концентрация родиевого комплекса от 1 мкмоля/л до 5 ммолей/л, в частности от 5 ммолей/л до 0,5 ммоля/л,

в) концентрация монооксигеназы от 1 до 5000 единиц/л, в частности от 10 до 1000 единиц/л,

г) концентрация кофактора (например, FAD) от 0 до 200 мкмолей/л, в частности от 0 до 20 или от 1 до 20 мкмолей/л,

д) концентрация каталазы от 0 до 1×10 ⁷ единиц/л,

е) значение рН от 4 до 9, в частности от 6 до 7,5,

ж) температура от 10 до 40°С, в частности от 20 до 35°С или примерно 30°С,

з) катодный потенциал от -600 до -900 мВ, в частности от -650 до -800 мВ,

и) подача кислорода от 20 до 120 см³ /(мин·л) путем барботирования или, в частности, без барботирования через проницаемые для кислорода мембраны или шланги, как это, например, описано в [11].

Реагирующие в соответствии с изобретением субстраты представляют собой в общем случае доступные соединения, и они могут быть приобретены коммерческим путем или получены обычными для органической химии способами.

В соответствии с изобретением предпочтение отдается использованию в качестве окислительно-восстановительных катализаторов [CpRh(bpy)Cl]Cl-комплексов. Получение этих комплексов общеизвестно и оно проводится так, как это описано в [14] или [15]. Образующиеся из них после электрохимического восстановления при -700 мВ (по отношению к Ag/AgCl _насыщ.) или же после химического восстановления формиатом гидридно-родиевые комплексы быстро и количественно переводят NAD(P)⁺ в активную по отношению к ферментам 1,4-NAD(P)Н-форму [2, 6].

Предпочтительно, когда реакция протекает в водной реакционной среде, значение рН которой установлено на соответствующую величину с помощью обычных, не оказывающих отрицательного влияния на протекание реакции и на электрохимический процесс буферных соединений, например таких, как HEPES [N-(2-гидроксиэтил)-пиперазин-N'-(2-этансульфонат)], PIPES [пиперазин-1,4-бис(2-этансульфонат)] и, в частности, буфер на основе фосфата калия и буфер на основе гидрохлорида ТРИС. Концентрация буфера при этом лежит в пределах от примерно 20 ммолей/л до 0,2 моля/л, в частности от примерно 20 ммолей/л до 50 ммолей/л. Значение рН предпочтительно устанавливают в пределах от примерно 6 до 8, в частности около 7,5.

Реакционная среда может содержать и такие другие обычные добавки, как, например, солюбилизатор для субстрата, кофакторы, например FAD или FMN, для используемого фермента и другие подобные им вещества.

При использовании чувствительных к окислению ферментных систем может иметь смысл применение антиоксидантов. Если, например, по условиям проведения процесса происходит образование пероксида водорода, который может оказывать отрицательное влияние на активность фермента, то реакцию можно проводить в присутствии каталазы, добавленной, например, в концентрации 1·10 ⁵ единиц/л.

Соответствующий способ регенерации NAD(P)H может быть предпочтительно применен для следующих типов реакций, включающих окислительное ферментативное превращение:

а) окисление насыщенных или ненасыщенных алифатических или ароматических атомов углерода, в частности это реакции гидроксилирования, эпоксидирования или окисление по Байеру-Виллигеру;

б) окисление серы или селена;

в) окисление азота или фосфора:

г) окисление галогенидов.

Нелимитирующим примерами типа реакций а) служат:

1) гидроксилирование алифатического углерода

Эта реакция описана, например, в патенте Японии №75/54957 (Takeda).

2) -Гидроксилирование длинноцепочечных жирных кислот, катализируемое цитохром-Р450-монооксигеназой, например, описанное в заявке на патент ФРГ №19935115.5 (БАСФ АГ).

3) Гидроксилирование аллильных или бензильных атомов углерода

H.Fretz, W.D.Woggon, R.Voges, Hel. Chim. Acta, 1989, 72, 391-400.

H.L.Holland, T.S.Manoharan, F.Schweizer, Tetrahedron: Asymmetry, 1991, 2, 335-338.

4) Эпоксидирование:

S.W.May, B.J.Abbot, J. Biolog. Chem., 1973, 248, 1725-1730

5) Окисление по Байеру-Виллигеру

Roberts и др., J. Mol. Cat. В Enzymatic, 1998, 4, 111 сл.

6) Окисление гетероароматических соединений

Катализ в каждом случае осуществляется циклогексанон-монооксигеназой, это описано в работах C.T.Walsh и др., Angenw. Chem., 1988, 100, 242, и Roberts и др., J. Mol. Cat. В Enzymatic, 1998, 4, 111.

Кроме того, объектом изобретения является применение окислительно-восстановительного катализатора в соответствии с приведенным выше определением для непрерывного или для периодического процесса электрохимической регенерации NAD(P)H, предпочтительно для проведения протекающих с поглощением кислорода реакций, в частности для реакций окисления, катализируемых монооксигеназами, в частности для реакций окисления указанного выше типа.

И, наконец, настоящее изобретение относится к биореакторам для непрерывного или периодического проведения протекающих с поглощением кислорода реакций, в частности для катализируемых монооксигеназами электроферментативных реакций, включающих в одном реакционном объеме электродную пару и жидкую однофазную или двухфазную реакционную среду, содержащую в соответствии с приведенным выше для каждого отдельного случая определением фермент, в частности монооксигеназу, субстрат, NAD(P)H в качестве кофактора и окислительно-восстановительный катализатор, причем на катоде создается электродный потенциал, который достаточен для переноса окислительно-восстановительных эквивалентов (электронов) на окислительно-восстановительный катализатор.

Для ознакомления с биореакторами соответствующего типа можно сослаться, например, на их описание в работах [16] и [17].

Функционирование реактора и проведение процесса могут быть приведены в соответствие с требованиями осуществляемой окислительно-восстановительной реакции специалистом. Однофазные или двухфазные реакционные среды также могут быть использованы также, как, впрочем, и компартментация реакционного пространства. Двухфазные реакционные системы могут быть, например, предпочтительными при взаимодействии субстратов и/или при образовании продуктов, которые нерастворимы или плохо растворимы в водной реакционной среде. В этом случае, например, субстрат может находиться в органической среде. Он непрерывно поступает в водную фазу, реагирует в ней, а образовавшийся продукт может снова перейти в органическую фазу. Компартментация позволяет, например, разделить в пространстве и во времени ферментативную реакцию и реакцию на электродах. Кроме того, предпочтение отдается введению кислорода в газообразном виде, в частности введению газа без образования пузырьков, и для ознакомления с этим способом можно сослаться, например, на описание в работе Rissom [4б].

Изобретение более детально иллюстрируется на примерах в прилагаемых схемах.

Фиг.1 представляет собой схематическое представление соответствующего изобретению электроферментативного процесса, протекающего с образованием 2,3-дигидроксибифенила с одновременной электрохимической регенерацией NADH, при этом на катоде идут образование и регенерация гидридно-родиевого (III) окислительно-восстановительного катализатора. После переноса гидрид-иона на NAD ⁺ и образования NADH он восстанавливает монооксигеназу, например простетическую FAD-группу в 2-гидроксибифенил-3-монооксигеназе с образованием активной FADH₂-функции. Эта восстановленная форма фермента катализирует затем в присутствии кислорода оксигенирование субстрата, например превращение 2-гидроксибифенила в 2,3-дигидроксибифенил.

Фиг.2 представляет влияние молекулярного кислорода на образование NADH при непрямой электрохимической регенерации без продувки воздухом, с продувкой воздухом 10 см³/мин).

Фиг.3 представляет предполагаемый механизм гидридоокисления.

Фиг.4 представляет влияние содержания кислорода на образование 2,3-дигидрокси-бифенила при непрямой электрохимической регенерации кофактора ( без подачи кислорода в раствор, через 1 час после начала постоянной подачи кислорода).

Фиг.5 представляет сравнение скорости превращения при химическом и непрямом электрохимическом образовании гидридно-родиевого комплекса ( окислительно-восстановительная, химическая регенерация с формиатом в качестве восстановителя, непрямая электрохимическая регенерация).

Фиг.6 представляет схематическое изображение подходящего реактора для периодического проведения процесса, включающего объем для проведения реакции с мешалкой, кольцевой катод, расположенный по центру анод, электрод сравнения, подвод сжатого воздуха в реакционную среду.

Пример 1. Электроферментативное окисление 2-гидроксибифенила до 2,3-дигидрокси-бифенила.

В соответствии с Фиг.1 электроферментативное взаимодействие проводят в электролитической ячейке периодического действия, схематически представленной на Фиг.6. В роли катода при этом выступает цилиндрический электрод из углеродного фетра (объем около 27 см³). Благодаря включению платинового противоэлектрода в шланг для диализа (масса от 10 кДа через него не проходит) достигаются условия разделенной ячейки.

С помощью подключенного через шланг хлорсеребряного электрода (Ag/AgCl_насыщ.) устанавливают катодный потенциал -750 мВ. В 100 мл фосфатно-калиевого буфера (50 ммолей/л, рН 7,5) растворяют кофактор окисления NAD⁺ (0,2 ммоля/л), [Cp*Rh(bpy)Cl]²⁺ (0,1 ммоля/л), FAD (20 мкмолей/л), каталазу (250000 единиц), HbpA (19 единиц), а также субстрат (2 ммоля). Реакция протекает при температуре 30°С в течение пяти часов.

Протекание реакции контролируют с помощью ВЭЖХ на колонке RP-18, используя для элюирования смесь метанола с водой (0,1% фосфорной кислоты) 60:40.

Пример 2. Влияние растворенного кислорода на регенерацию NADH.

Поскольку кислород участвует в осуществлении последовательности реакций, влияние растворенного кислорода на компоненты системы должно быть исследовано. При этом оказывается, что кислород ингибирует образование NADH с участием гидридно-родиевого комплекса как при его получении химическим путем через формиат, так и при его получении в соответствии с изобретением электрохимическим путем (Фиг.2). Как ясно следует из фиг.2, при введении кислорода, например со скоростью 10 см³/мин, скорость образования NADH снижается от 1,1 ммолей/л·ч до 0,27 ммолей/л·ч. При введении 15 см³/мин обнаружить образование NADH уже не удается. Однако ингибирование носит обратимый характер, поскольку после прекращения подачи кислорода скорость образования NADH снова быстро возрастает до ее оптимального значения. Точно также и концентрация NADH достигает ее максимального значения. Удалось установить, что продуктом реакции гидридно-родиевого комплекса с молекулярным кислородом является пероксид водорода, схему образования которого можно представить себе в соответствии с фиг.3. Кроме того, при приложенном потенциале пероксид водорода образуется также в результате прямого восстановления кислорода на катоде. Поэтому целесообразно прибавлять каталазу, так как она разлагает пероксид водорода при ферментативном взаимодействии.

Пример 3. Влияние подачи кислорода на степень превращения

Приведенные на фиг.3 результаты показывают, что степень превращения при реакциях без внешнего подвода кислорода по истечении короткого времени перестает расти, достигнув значения около 20% (светлые круги или соответственно черные квадраты до примерно 1 часа). После начала подачи кислорода по истечении 1 часа (8 см ³/мин) скорость превращения, а вместе с ней и образование продукта возрастают до величины 1,1 ммоля/л·ч (202 мг/л·ч). Переменные значения для медиатора составляют 11 ч ^-1. Аналогичные значения получают в тех случаях, когда гидридно-родиевый комплекс образуется химическим путем из формиата натрия. На фиг.5 показаны скорости превращения для непрямой электрохимической регенерации кофактора в названных условиях, но при постоянном подводе кислорода со скоростью 10 см³/мин, а для протекающего с участием формиата окислительно-восстановительного процесса - это концентрация формиата натрия 160 ммоль/л при прочих одинаковых условиях. Производительность составляет около 50% от уже оптимизированного ферментативного способа или соответственно способа in vitro с сопряженной ферментативной регенерацией NADH (390 мг/л·ч) [8].

Скорость реакции лимитируется не образованием гидридно-родиевого комплекса на катоде, а конкурентным ингибированием окислительно-восстановительного катализатора параллельной реакцией с молекулярным кислородом (фиг.4).

В соответствующем изобретению непрерывном электроферментативном процессе отрицательный эффект растворенного кислорода на непрямую электрохимическую регенерацию NADH должен быть легко исключен путем компартментации всей системы по отдельным модулям. Благодаря разделению в пространстве и во времени следующей за электрохимическим этапом дозированной подачи требуемого для протекания ферментативной реакции кислорода его ингибирующий эффект на регенерацию NADH снижается до минимума.

Стабильность во времени для проведенных по периодической схеме электролизов может быть улучшена благодаря снижению денатурирующего эффекта, сопровождающего введение газа через барботаж. На границе раздела фаз жидкость/газ возникают сдвигающие эффекты, которые в сравнительно короткие сроки приводят к денатурации фермента. В опытах сравнения удалось показать, что HbpA при термостатировании при 30°С и при перемешивании (скорость 250 оборотов в минуту) даже по истечении 12 часов сохраняет более 85% ее начальной активности. С началом нагнетания воздуха активность в зависимости от скорости подачи снижается в течение одного часа до 70%. Благодаря применению оборудованного мембраной реактора для проведения ферментативных процессов [9] продуцирующий фермент может быть защищен от отрицательного влияния вводимого гетерогенным путем кислорода, в результате чего достигается высокая стабильность протекания процесса во времени. В частности, благодаря применению двухфазного способа ведения процесса и следующего из этого дозированного подвода субстрата in situ, а также экстракции пирокатехинового продукта, появляется возможность осуществления процесса по эффективной непрерывной схеме.

В соответствии с изобретением удалось впервые успешно провести катализируемое флавинзависимой монооксигеназой взаимодействие с непрямой электрохимической регенерацией NADH.

Настоящее изобретение создает основу для вовлечения монооксигеназ в органические синтезы как в лабораторном масштабе, так и в случае промышленного применения. Этот класс окисляющих ферментов представляет большой интерес в синтетическом отношении, поскольку они, например, могут вводить гидроксильные функциональные группы в ароматические системы, а также в неактивированные чистые углеводороды. Кроме того, они могут переносить кислород на гетероатомы или на двойные связи с образованием эпоксидов. В дополнение к этому они катализируют реакции окисления по Байеру-Виллигеру. Во всех случаях становятся доступными чистые энантиомеры продуктов.

Основополагающая электрохимическая концепция регенерации NAD(P)H представляет собой эффективную и легко осуществимую альтернативу использовавшимся до настоящего времени процессам in vivo или таким способам, которые включают ферментативные системы для регенерации. Удалось доказать общую применимость зависящих от кислорода монооксигеназ в том числе и в указанных условиях проведения взаимодействия.

Список литературы

[1] a) Hummel, W., и др., Eur. J. Biochem. 1989, 184, 1-13; б) Shaked, Z., и др., J. Am. Chem. Soc. 1980, 102, 7104-7108; в) Abril, O., и др., Bioorg. Chem. 1989, 17, 41-52; г) Seelbach, К., и др., Tetrahedron Lett. 1996, 37, 1377-1380.

[2] a) Hilt, G., и др., Liebigs Ann. / Recueil 1997, 2289-2296; 6) Westerhausen, D., и др., Angew. Chem. 1992, 104, 1496-1498; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1992, 31, 1529-1531; в) Ruppert, R., и др., Tetrahedron Lett. 1987, 52(28), 6583-6586.

[3] a) Walsh, C.T., Acc. Chem. Res. 1980, 13, 148-155; б) Walsh, C.T. и др., Angew. Chem. 1988, 100, 342-352; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1988.

[4] a) Hummel, W., и др.; Appl. Microbiol Biotechnol. 1986, 25, 175-185; б) Rissom, R. и др., Tetrahedron Asymmetry 1997, 15(8), 2523-2526.

[5] Wong, C.-H., и др., J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 4890-4899.

[6] a) Steckhan, E. и др., Organometallics, 1991, 10, 1568-1577; 6) Ruppert, R. и др., J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1988,1150-1151.

[7] Suske, W.А. и др., J. Biol. Chem., 1997, 272(39), 24257-242565.

[8] Held, M. и др., Biotechnol. Bioeng., 1999, 62(6), 641-648.

[9] Wandrey, C., Chem. Ing. Tech. 1976, 48, 537.

[10] Reipa, V. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 13554-13558.

[11] Schneider и др., Enzyme Microbiol. Technol., 1995, 17, 839.

[12] Sawyer, D.T., Electrochemistry for Chemists, 2-е изд., Уайли-Интерсайенс; Нью-Йорк.

[13] Kissinger, Р.Т., Laboratory Techniques in Electroanalytical Chemistry, Марсель Деккер, Инк.; Нью Йорк/Базель.

[14] Кölle, U. и др., Angew. Chem. 1987, 99, 572.

[15] Кölle, U. и др., Chem. Ber. 1989, 122, 1869.

[16] Kragl, U. и др., Chem. Ing. Tech., 1992, 499.

[17] Brielbeck, В. и др., Biocatalysis, 1994, 10, 49.