средство для подавления продукции энтеротоксинов у стафилококков

Формула изобретения

Применение 2%-ного раствора свекловичного пектина в качестве средства, подавляющего продукцию энтеротоксинов типа А и В стафилококков.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в микробиологической и клинической практике, а также в пищевой промышленности для подавления энтеротоксинообразования у стафилококков

Стафилококки продуцируют 14 иммунологически различных типов энтеротоксинов, имеющих большое значение как факторы патогенности более 100 различных заболеваний, вызванных стафилококками. Энтеротоксины стафилококков (СЭ) обладают: рвотным действием; пирогенностью; способностью увеличивать токсичность эндотоксинов (липополисахаридов, продуктов грамотрицательных бактерий) в 100000 раз [9].

Все СЭ являются суперантигенами и в концентрации от 1 пкг/мл до 1 мкг/мл могут вызывать активацию до 50% Т лимфоцитов и выработку ряда интерлейкинов, которые вызывают интоксикацию и необратимое нарушение нормального функционирования разных систем организма вплоть до летального исхода [15].

Известен микробиологический способ воздействия на стафилококки, при котором в качестве средства подавления продукции энтеротоксинов используют Lactococcus lactis. Однако этот микроорганизм подавляет рост и продукцию СЭ при концентрации стафилококков в среде в количестве не более 10 ³-10⁵ колониеобразующих единиц (КОЕ/мл). Этот способ используется в основном в пищевой промышленности и не применим для подавления энтеротоксинообразования у штаммов стафилококков в медицине из-за возможного патогенетического действия Lactococcus lactis на человека [11, 12].

Известен химический способ воздействия на стафилококки, при котором в качестве средства подавления энтеротоксинообразования в среде используют 12% раствор NaCl [14].

Однако этот способ не может быть использован в медицинской практике потому, что он нефизиологичен. Задачей изобретения является расширение арсенала средств, способных подавлять продукцию стафилококковых энтеротоксинов и физиологичных для организма человека.

Поставленная задача решается тем, что в качестве средства для подавления продукции стафилококковых энтеротоксинов типа А и В используют 2,0% раствор свекловичного пектина.

Известно, что пектины широко используются в медицинской практике для профилактики и лечения различных заболеваний, вызванных микроорганизмами, в том числе стафилококковых инфекций [4, 5].

В патентной и научно-технической литературе сведений о влиянии пектина на продукцию стафилококковых энтеротоксинов не обнаружено.

Для изучения способности подавления энтеротоксинообразования у стафилококков нами исследовано влияние свекловичного пектина на продукцию СЭ. Способность подавлять продукцию СЭ исследовали с помощью модельной микробиологической системы, состоящей из штаммов стафилококков, обладающих способностью продуцировать СЭ, питательной среды для культивирования стафилококков и свекловичного пектина.

Культивирование стафилококков, продуцирующих СЭ, проводили на специальной жидкой питательной среде с ферментативной казеиновой основой [3, 10].

Содержание амминого азота в среде 200 мг %. В среду добавляли 1,0% сердечно- мозговую вытяжку. Устанавливали рН среды 7,2. Затем среду разливали по 4,5 мл и стерилизовали 15 мин при 1 атмосфере и 120°С, после чего в пробирки с питательной средой вносили по 0,5 мл суточной культуры стафилококков, содержащей 10⁷ колониеобразующих единиц (КОЕ/мл), и асептически вносили свекловичный пектин в конечных концентрациях в среде от 1,0 до 3,0%. Выращивание проводили на шуттель-аппарате при непрерывном встряхивании 210 об/мин, в течение 24 часов при 37°С. Сразу после посева из каждой пробирки проводили количественные высевы на чашки Петри с плотной питательной средой Baird-Parker с теллуритом калия количественным методом [13].

После окончания культивирования через 24 часа высев повторяли. Затем микробные клетки удаляли центрифугированием при 10000 об/мин в течение 15 минут. Контролем служили те же штаммы стафилококков, культивируемые в тех же условиях, что и опытные образцы, но без добавления пектина. СЭ в опытных и контрольных образцах определяли методом реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с использованием лиофилизированных эритроцитарных диагностикумов и иммуноферментным методом (ИФА) с использованием иммуноферментных тест-систем для определения стафилококковых энтеротоксинов типов А и В [1, 2, 7, 8].

Нами были проведены исследования по определению оптимальной концентрации свекловичного пектина на способность подавлять продукцию стафилококковых энтеротоксинов типов А и В.

Пример №1. Культуру Staphylococcus aureus FRI- 722 (референс, продуцирующий СЭА) и клинический изолят S. aureus №2005 (2005 г) выращивали в питательной среде, содержащей свекловичный пектин в концентрации 1%. После культивирования определяли количество КОЕ/мл и активность в опытных и контрольных пробах. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1
Влияние 1% свекловичного пектина на рост S. aureus штамм FRI-722 и продукцию СЭА
Среда культивирования, штамм-продуцент и концентрация пектина	Количество, КОЕ/мл	Количество СЭ типа А (разведения супернатантов)
		РНГА	ИФА
Контроль S. aureus штамм FRI-722 (без пектинов)	1010	1:8	1:100	+
			1:100	+
Контроль S. aureus штамм 2005 (без пектинов)	10 10	1:16	1:200	-
1% свекловичный пектин S. aureus штамм FRI-722	108	Нативный		+
1% свекловичный пектин S.aureus штамм 2005 (клинический изолят)		1:8	1:10	+
			1:50	+
		1:8	1:10	+
			1:50	+

Добавление в питательную среду 1% свекловичного пектина при культивировании S. aureus вызывало частичное подавление роста стафилококков и продукции СЭА.

Пример №2. Культуру S. aureus FRI- 722 (референс, продуцирующий СЭА) и клинический изолят S. aureus №2005 (2005 г) выращивали в питательной среде, содержащей свекловичный пектин в концентрации 2%. После культивирования определяли количество КОЕ/мл и активность в опытных и контрольных пробах. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2
Влияние 2% свекловичного пектина на рост S.aureus и продукцию СЭА
Среда культивирования, штамм-продуцент и концентрация пектина	Количество, КОЕ/мл	Количество СЭ типа А (разведения супернатантов)
		РНГА	ИФА
Контроль S. aureus штамм FRI-722 (без пектинов)	1010	1:8	1:100	+
Контроль S. aureus штамм 2005 (без пектинов)	1010	1:16
			1:100	+
			1:200	-
2% свекловичный S. aureus FRI-722	107	0	Без разведения	-
2% свекловичный S. aureus штамм 2005 (клинический изолят)	107	0	Без разведения	-

Установлено, что при добавлении в питательную среду при выращивания S. aureus 2% свекловичного пектина происходило подавление роста стафилококков и продукции СЭА.

Пример №3. В опытных образцах в питательную среду вносили свекловичный пектин в концентрации 3%, выращивали культуру S. aureus FRI-722 (референс, продуцирующий СЭА) и клинический изолят S. aureus №2005 (2005 г.), после культивирования определяли количество КОЕ/мл и содержание СЭА в опытных и контрольных пробах. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3
Влияние 3% свекловичного пектина на рост S. aureus и продукцию СЭА
Среда культивирования, штамм-продуцент и концентрация пектина	Количество, КОЕ/мл	Количество СЭ типа А (разведения супернатантов)
		РНГА	ИФА	ИФА
Контроль S. aureus штамм FRI-722 (без пектинов)	1010	1:8	1:100	+
Контроль S. aureus штамм 2005 (без пектинов)	10 10	1:16	1:100	+
				-
			1:200	Содержится
				СЭА
3% свекловичный пектин, S. aureus FRI-722	107	0	Без разведения	-
3% свекловичный пектин, S. aureus штамм 2005 (клинический изолят)	107	0	Без разведения	-
				СЭА не содержится

Установлено, что при добавлении в питательную среду при выращивании S. aureus 3% свекловичного пектина он ингибировал рост стафилококков и подавлял продукцию СЭА как референс-штамма, так и клинического штамма.

Пример №4. Культуру S. aureus FRI-722 (референс, продуцирующий СЭА) выращивали в питательной среде, содержащей 12% NaCl (прототип), после культивирования определяли количество КОЕ/мл и содержание СЭА в опытных и контрольных пробах. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4
Влияние 12% раствора NaCl на рост S. aureus и продукцию стафилококкового энтеротоксина типа А
Среда культивирования, штамм-продуцент и концентрация пектина	Кол-во, КОЕ/мл	Кол-во СЭ типа А (разведения супернатантов)		Содержание СЭА ИФА
		РНГА	ИФА
Контроль S. aureus штамм FRI-722 (без пектинов)	1010	1:8	1:100	+
12% раствор NaCl S. aureus штамм FRI-722 (прототип)	109	0	Без разведения	-

Как видно из таблицы 4, при химическом способе воздействия на продукцию СЭА происходит подавление образования энтеротоксина типа А. Этот способ является эффективным, но не физиологичным для применения в лечебной практике, т.к. может привести к шоку и летальному исходу.

Пример №5. Культуру S. aureus S6 715Н (референс, продуцирующий СЭВ) выращивали в среде, содержащей 1% концентрацию свекловичного пектина, определяли количество КОЕ/мл и активность в опытных и контрольных пробах. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5
Влияние 1% свекловичного пектина на рост S. aureus и продукцию СЭВ
Среда культивирования, штамм - продуцент и концентрация пектина	Количество, КОЕ/мл	Количество СЭ типа В (разведения супернатантов)
		РНГА	ИФА разведения	ИФА
Контроль S. aureus S6 715H (без пектинов)	10 10	1:4096	1:10	+
			1:50	+
			1:100	+
			1:200	+
			1:400	+
1% свекловичный пектин S. aureus S6 715Н	108	0	Нативный	+
			1:50	+
			1:10	-
				СЭВ содержится

Установлено, что при добавлении в питательную среду при выращивании S. aureus S6 715H 1% концентрации свекловичного пектина он не оказывал существенного влияния на продукцию стафилококкового энтеротоксина типа В и не обладал существенным бактерицидным действием на популяцию стафилококков (см. таблицу 5).

Пример №6. Культуру S. aureus S6 715Н (референс, продуцирующий СЭВ) выращивали в среде в присутствии 2% свекловичного пектина. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6
Влияние 2% свекловичного пектина на рост S. aureus и продукцию СЭВ.
Среда культивирования, штамм - продуцент и концентрация пектина	Количество, КОЕ/мл	Количество СЭ типа В (разведения супернатантов)
		РНГА	ИФА	ИФА
Контроль S. aureus S6 715H (без пектинов)	1010	1:4096	1:10	+
			1:50	+
			1:100	+
			1:200	+
			1:400	+
2% свекловичный пектин, S. aureus S6 715H	108	0	Нативный	+
				+
			1:10	-
			1:50
				СЭВ содержится

Установлено, что при добавлении в питательную среду при выращивании S. aureus S6 715Н 2% концентрации свекловичного пектина он вызывал частичное ингибирование роста стафилококков. Показано, что 2% концентрация свекловичного пектина лишь частично подавляет продукцию энтеротоксина типа В. Этот штамм (S. aureus S6 715Н) при выращивании в питательной среде без добавления пектина образует энтеротоксин типа В, который выявляется иммуноферментным методом в разведении 1:400 (контроль), в то же время этот же штамм S. aureus S6 715Н, который выращивали в присутствии свекловичного пектина частично (по сравнению с контролем), продуцировал энтеротоксин, который выявляли иммуноферментным методом всего лишь в разведении 1:10.

Таким образом в данном случае по сравнению с контролем выявлено подавление энтеротоксинообразования СЭВ в 40 раз.

Пример №7. Культуру S. aureus S6 715 H (референс, продуцирующий СЭВ) выращивали в питательной среде, содержащей 3% концентрацию свекловичного пектина, и после окончания культивирования определяли количество КОЕ и активность в опытных и контрольных пробах в соответствии, как описано выше. Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7
Влияние 3% свекловичного пектина на рост S. aureus и продукцию СЭВ
Среда культивирования, штамм-продуцент и концентрация пектина	Количество, КОЕ/мл	Количество СЭ типа В (разведения супернатантов)
		РНГА	ИФА	ИФА
Контроль S. aureus S6 715H (без пектинов)	1010	1:4096	1:10	+
			1:50	+
			1:100	+
			1:200	+
			1:400	+
3% свекловичный пектин S. Aureus S6 715H	108	0	Нативный	-
			1:10	-
			1:50	-
				СЭВ не содержится

Установлено, что при добавлении в питательную среду при выращивании S. aureus S6 715H 3% свекловичного пектина он частично ингибировал рост стафилококков и подавлял продукцию СЭВ.

Пример №8. Культуру S. aureus S6 715 H (референс, продуцирующий СЭВ) выращивали в питательной среде, содержащей 12% NaCl (прототип), после культивирования определяли количество КОЕ/мл и содержание СЭВ в опытных и контрольных пробах. Результаты представлены в таблице 8.

Таблица 8
Влияние 12% раствора NaCl на рост S. aureus и продукцию стафилококкового энтеротоксина типа В
Среда культивирования, штамм продуцент и концентрация пектина	Кол-во, КОЕ/мл	Кол-во СЭ типа А (разведения супернатантов)		Содержание СЭВ
		РНГА	ИФА	ИФА
Контроль S. aureus S6 715H (без пектинов)	1010	1:4096	1:10	+
			1:50	+
			1:100	+
			1:200	+
			1:400	+-
12% раствор NaCl S. aureus штамм S6 715Н (прототип)	109	0	Без разведения	-

Как видно из таблицы 8, при химическом способе воздействия на стафилококки происходит подавление образования энтеротоксина типа В. Этот способ является эффективным, но не физиологичным для применения в лечебной практике, т.к. может привести к шоку и летальному исходу

Нами были проведены опыты по исследованию влияния свекловичного пектина на выживаемость мышей, зараженных энтеротоксигенными штаммами стафилококков, продуцирующими энтеротоксины типов А и В.

Для опыта были сформированы две группы по 20 белых беспородных мышей весом 12-14 г. Первую группу мышей заражали энтеротоксигенным штаммом S. aureus 722 по 0,5 мл культуры, содержащей 10 КОЕ/мл (продуцирующей энтеротоксин типа А), 10 мышей составляли контрольную группу, которым не вводили пектин, а 10 мышей составляли опытную группу, которым через сутки ежедневно в течение 14 суток внутрибрюшинно вводили по 0,5 мл 2% раствора свекловичного пектина.

Вторую группу мышей заражали энтеротоксигенным штаммом S. aureus S6 715Н (продуцирующим энтеротоксин В) по 0,5 мл культуры, содержащей 10⁸ КОЕ/мл. 10 мышей составляли контрольную группу, которым не вводили пектин, а другие 10 мышей составляли опытную группу, которым через сутки ежедневно в течение 14 суток внутрибрюшинно вводили по 0,5 мл 2% свекловичного пектина. Полученные данные представлены в таблице 9.

Таблица 9
Влияние свекловичного пектина на выживание мышей, зараженных энтеротоксигенными культурами S.aureus, продуцирующими энтеротоксины типов А и В
Субстанции, которые вводили мышам	Кол-во контрольных мышей		Опыт, мыши
	Взято мышей	Погибшие	Взято мышей	Погибшие
S. aureus 722 (продуцент СЭА)	10	4	10	0
Свекловичный пектин	-	-	+	0
S.aureus S6 715Н (продуцент СЭВ)	10	5	10	0
Свекловичный пектин	-	-	+	0

Как видно из таблицы 9, при использовании свекловичного пектина ни одно опытное животное не погибло, в то время как в контрольных группах погибло 4 и 5 животных соответственно.

Таким образом, можно сказать, что свекловичный пектин способствует выживанию зараженных энтеротоксигенными штаммами S. aureus 722 (продуцент энтеротоксина типа А) и S. aureus S6 715 Н (продуцент СЭВ).

Из таблицы 9 видно, что 2% концентрация свекловичного пектина является физиологичной и не обладает побочным действием на макроорганизм [6].

Показано, что свекловичный пектин в 2% концентрации обладает способностью подавлять продукцию стафилококковых энтеротоксинов типов А и В и влиять на выживание мышей, зараженных S. aureus 722 (продуцент СЭА) и S.aureus S6 715Н (продуцент СЭВ).

Таким образом, нами предлагается средство для подавления продукции энтеротоксинов типов А и В у стафилококков - 2% концентрация свекловичного пектина, которое является физиологичным в отличие от химического способа и может быть использовано в медицине для борьбы со стафилококками y ожоговых больных, у пациентов с диагнозом дисбактериоз кишечника и синдром раздраженного кишечника и других заболеваниях стафилококковой этиологии при обнаружении у них энтеротоксигенных штаммов стафилококков, а также в ветеринарии и пищевой промышленности при производстве сыров.

Литература

1. Акатов А.К., Флуер Ф.С., Михеева Г.В, Павлова И.П,. Шаханина К.Л, Бобкова Е.В., Мельников Н.В. Тест-система иммуноферментная для определения стафилококкового энтеротоксина типа А. ВФС 42-235, ВС 89, 1989.

2. Акатов А.К., Флуер Ф.С., Михеева Г.В, Шаханина К.Л. Тест-система иммуноферментная для определения стафилококкового энтеротоксина типа В. ВФС 42-236, ВС 89, 1989.

3. Бобкова Е.В., Мельников Н.В., Флуер Ф.С. Способ получения основы питательной среды для приготовления стафилококкового энтеротоксина типа А. Авт. свид. №1356455 от 1 августа 1987.

4. Лазарева Е.Б., Меньшиков Д.Д. «Опыт и перспективы использования пектинов в лечебной практике. Ж. «Антибиотики и химотерапия». 1999. - Т.44. №2. - С.37-40.

5. Потиевский Э.Г., Дроздов В.Н. «Антибактериальное действие пектина в эксперименте и клинике». Омск, 1997. - 96 с.

6. Рекомендуемым уровням потребления пищевых и биологически активных веществ. Методические рекомендации. М., 2004 г.

7. Флуер Ф.С., Акатов А.К., Михеева Г.В. Создание эритроцитарных диагностикумов для определения стафилококковых энтеротоксинов. В сб. НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, 1990. Там же. - С.89-94. Сообщение 1.

8. Флуер Ф.С., Михеева Г.В., Акатов А.К. Создание эритроцитарных диагностикумов для определения стафилококковых энтеротоксинов. В сб. НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, 1990. Там же. - С.95-99. Сообщение 2.

9. Bohach G.A., Fast D.J., Nelson R.D et al. Staphylococcal and streptococcal pyrogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses Crit. Rev. Microbiol. 1990. 17. 251-272, 1997.

10. Gasman Е. Serological studies of staphilococcal Enterotoxins. Public Health Repts. 1958, 73, 599-609.

11. Daminelli P Dinamica della sapravivenza di Staphylococcus aureus in fromaggi tipo crecenza ed Italico artificalminati Le Sclezione Veterinaria. 1999. 11. 815-829.

12. Hamama A El Hankouri N El Ayadi M Fate of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in the presence of nisin producing Lactococcus lactis strain during manufacture of Iben Moroccan traditional fresh cheese Int. Dairy. J. 2002. 12. 933-938.

13. Мейнелл Дж., Мейнелл Э. «Экспериментальная микробиология». Пер с англ. - Мир, 1967. - 347 с; Gould J С Quantity and quality in the diagnosis of urinary tract infection. Brit. J. Urol. 1965. V.37. 1. P.1.

14. Notermans, S. and Heuvelman, C.J. (1983). Combined effects of water activity, pH, and suboptimal temperature on growth and enterotoxin production. J. Food Sci.48: 1832-1835.

15. Yokomizo Y., Mori Y Shimoji Y. et al. Vet. Med. Sci. 1995. V.57. 2. P.299-305.