материал для закрытия костных дефектов при реконструктивно-пластических операциях

Формула изобретения

1. Материал для закрытия костных дефектов при реконструктивно-пластических операциях на основе фосфатов кальция, представляющий собой частицы карбонатзамещенного гидроксиапатита с системой взаимосвязанных микро- и макропор, отличающийся тем, что карбонатзамещенный гидроксиапатит общей формулы Са₁₀(PO₄ )×(ОН)_у(СО₃) _z, где 5<Х<6, 0<Y<2, 0<Z<1, содержит от 0,6 до 6,0 мас.% групп СО₃ ^2- с регулируемым атомным отношением кальций/фосфор от 1,5 до 2,1, при этом материал выполнен в форме пористых сферических гранул диаметром от 100 до 1000 мкм, имеющих шероховатый микрорельеф внешней поверхности, и с размерами пор от 0,5 до 15,0 мкм при общей открытой пористости от 50 до 80% и удельной поверхностью от 0,3 до 0,6 м²/г.

2. Материал по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно насыщен аутологичными мезенхимальными стволовыми клетками.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к фосфорсодержащим пористым материалам, предназначенным для изготовления костных имплантатов и/или замещения дефектов при различных костных патологиях.

В настоящее время известен ряд композиционных материалов на основе кальций-фосфатной керамики, используемых в качестве матриксов для клеточных технологий восстановления поврежденных костных тканей.

Известен пример использования в качестве имплантата костной ткани гранулированного гидроксиапатита (далее - ГА) с частичным (1,2 и 2,05%) замещением на карбонатгидроксиапатит (далее - КГА), что сопоставимо с заявляемым материалом по содержанию карбонат групп. Размер зерен указанного материала составляет 0,33 и 0,24 мкм, соответственно (Journal of materials science: materials in medicine 16 (2005) 899-907). Описан эксперимент in vivo на овцах. К недостаткам известного материала при использовании его в качестве имплантата костной ткани относится то обстоятельство, что частицы КГА получены путем спекания керамических тел и последующим измельчением компакта, что приводит к резкому снижению прочности имплантата. Кроме того, малый размер зерен и отсутствие внутренних пор является значительным препятствием для процесса остеогенеза.

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является КГА, представляющий собой пористые тела, полученные путем пропитывания целлюлозных губок порошком КГА с последующим спеканием. Испытание в качестве имплантагов костной ткани проводилось in vivo на новозеландских белых кроликах (Journal of the European Ceramic Society 23 (2003) 2931-2937). Принят за прототип. Данный материал, включающий КГА, имеет взаимосвязанную систему микро- и макропор с общей пористостью до 45%. Соотношение Са/Р в известном КГА составляет 2,01±0,02. Такой материал, используемый в качестве костного заместителя, проявил в эксперименте свойства биорезорбции и ускорения процесса остеогенеза по сравнению с материалом, состоящим из чистого ГА. Однако, как следует из содержания прототипа, имплантируемый материал размещают в костном дефекте в виде керамических частиц неправильной формы, что может вызвать значительные затруднения при заполнении дефектов сложной конфигурации и травмировать окружающую ткань из-за неправильной формы частиц, вызывая воспаления и другие негативные последствия. Кроме того, соотношение Са/Р в прототипе фиксировано равным 2,01±0,02, что не позволяет варьировать химические свойства предлагаемого КГА в требуемых пределах.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи создания синтетического неорганического композиционного материала, предназначенного для замещения различных костных дефектов.

При использовании заявляемого изобретения могут быть достигнуты следующие технические и лечебные результаты:

- биологическая активность имплантируемого материала, в том числе высокие адгезивные свойства по отношению к клеткам;

- сочетание свойств остеокондуктивности и остеоиндуктивности;

- близость химического и фазового состава имплантируемого материала к составу замещаемой ткани;

- регулируемость скорости растворения при его замещении костной тканью:

- возможность трехмерного равномерного заполнения костного дефекга, повторяющего его форму.

Указанные технические и лечебные результаты при осуществлении изобретения достигаются за счет того, что материал для закрытия костных дефектов при реконструктивно-пластических операциях представляет собой частицы КГА с системой взаимосвязанных микро- и макропор.

Особенность изобретения заключается в том, что КГА имеет общую формулу Са₁₀ (PO₄)_×(СО ₃)_у(ОН)_z, где 5<Х<6, 0<Y<2, 0<Z<1, содержит от 0,6 до 6,0 мас.% групп СО₃ ^2- , с регулируемым атомным соотношением кальций/фосфор от 1,5 до 2,1. При этом материал выполнен в форме пористых сферических гранул диаметром от 100 до 1000 мкм, имеющих шероховатый микрорельеф внешней поверхности, и размерами пор от 0,5 до 15,0 мкм при общей открытой пористости от 50 до 80% и удельной поверхностью от 0,3 до 0,6 м²/г;

Сущность изобретения состоит в следующем.

Основным требованием к материалам, используемым в качестве матриксов для клеточных технологий восстановления поврежденных костных тканей, является их биологическая активность. Под понятием биологическая активность подразумевается способность синтетического материала активно взаимодействовать с окружающими тканями с образованием непосредственной связи с ними, проявляя остеокондуктивность и/или остеоиндуктивность. Остеокондуктивность - это способность материала к адгезии и связыванию остеогенных клеток, обеспечению биологических потоков, неоваскуляризации и поддержанию процессов пролиферации и дифференцировки клеток из окружающей живой ткани с образованием непосредственной связи с костной тканью и постепенным замещением новообразующейся тканью. Остеоиндуктивность - это способность материала индуцировать на его поверхности дифференцировку клеток из окружающих некостных тканей в остеообразующие клетки (хондроциты, остеобласты). Сочетание остеокондуктивного и остеоиндуктивного поведения возможно при условии, когда материал оказывает влияние на функции клеток, например, усиливая эффективность дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в остеообразующие при культивировании первых на биоактивном материале. Заявляемый материал полностью соответствует указанным требованиям, что подтверждено результатами экспериментов in vitro и in vivo, приводимыми ниже.

При разработке материалов для реконструкции костных тканей целесообразно достичь максимальной близости химического и фазового состава имплантируемого материала к составу замещаемой ткани. С этой точки зрения особый интерес для применения в качестве биологически активного материала представляют собой КГА. Установлено, что биологический апатит костных и зубных тканей содержит значительные количества карбонат групп. В зависимости от возраста человека, содержание групп СО₃ ^2- в костных тканях достигает от 2,3 до 8,0 мас.%. Известны оценки того, что минеральная составляющая эмали, дентина и костной ткани содержит, соответственно, 3,5, 5,6 и 7,4 мас.% групп СО₃ ^2-. Карбонатные группы создают решеточные искажения, микронапряжения и дефекты кристаллической решетки, что способствует увеличению резорбируемости материала и усилению способности к остеоинтеграции. Заявляемый материал содержит от 0,6 до 6,0 мас.% групп СО ₃ ^2-.

Важным критерием при выборе материала для имплантата является кинетика растворения керамики внеклеточными жидкостями организма (кинетика биорезорбции). Установлено, что оптимальная кинетика биорезорбции, соответствующая кинетике остеогенеза в процессе замещении матрикса новообразующейся костной тканью, имеет место при атомном соотношении кальций/фосфор от 1,5 до 2,1. Разработанная технология позволяет регулировать указанное атомное соотношение, что, в конечном счете, позволяет достичь технического эффекта регулируемости скорости биорезорбции.

Заявляемый материал выполнен в форме гранул, имеющих сферическую форму с шероховатой внешней поверхностью, диаметром от 100 до 1000 мкм, и размерами пор от 0,5 до 15,0 мкм при общей открытой пористости от 50 до 80% и удельной поверхностью от 0,3 до 0,6 м²/г. Гранулы имеют систему открытых взаимосвязанных пор.

Использование сферических гранул, имеющих указанные размеры, позволяет осуществить трехмерное равномерное заполнение костного дефекта, повторяющее его форму. Гранулы меньшей величины (менее 100 мкм) представляют собой порошок, частицы которого при внесении в костный дефект слипаются друг с другом, образуя непроницаемую массу. Излишняя величина гранул (более 1000 мкм) снижает площадь контакта с окружающей биологической тканью, вызывает затруднения их размещения в дефектах неправильной формы.

Пористость, особенно наличие взаимосвязанной системы пор, усиливает адгезивные свойства материала. Наличие мелких пор, с диаметром ˜5,0 мкм, создает условия для проникновения в имплантат внеклеточной жидкости из окружающих тканей. Взаимосвязанная система более крупных пор с размерами 10,0-15,0 мкм создает оптимальные условия для замещения матрикса остеогенными клетками, неоваскуляризации и поддержания процессов пролиферации и дифференцировки клеток из окружающей живой ткани с образованием непосредственной связи с костной тканью и постепенным замещением новообразующейся тканью. На этапе предподготовки биоимплантата, включающего культивирование мезенхимальных стволовых клеток (далее МСТ), пористость гранул приобретает особое значение, поскольку с увеличением пористости увеличивается культуральная поверхность матрикса. Шероховатость внешней поверхности гранул обеспечивает повышение их адгезивных свойств по отношению к остеообразующим клеткам. Удельная поверхность менее 0,3 м²/г неэффективна для адгезии; при удельной поверхности более 0,6 м²/г гранулы имеют малый размер и склонны к образованию агломератов и плотной массы, что затрудняет заполнение ими костного дефекта.

Таким образом, за счет трехмерной укладки пористых керамических гранул в костном дефекте достигается оптимальный режим репаративного остеогенеза. При этом шероховатость поверхности отдельных гранул значительно увеличивает общую площадь поверхности, и следовательно, площадь для активной клеточной экспансии. Тем самым шероховатость поверхности гранул обеспечивает им матриксные качества - способствует миграции остеобластов с заселением отдельных гранул и формированием зрелой костной ткани. Пористость создает условия для эффективного неоваскулогенеза.

Заявляемый материал в полной мере отвечает требованиям биосовместимости, предъявляемым к материалам для имплантации, то есть отсутствию цитотоксических и других отрицательных реакций при контакте с живой тканью. Заявляемый материал обладает остеогенным эффектом, иммунной инертностью.

Указанные качества заявляемого материала подтверждены экспериментальными результатами, проведенными in vitro и in vivo.

Эксперименты in vitro no оценке динамики нарастания клеток на образцах заявляемого материала выполнены на модели клеточной линии иммортализованных нормальных фибробластов человека (далее ФЧ), полученной из Коллекции Типовых Клеточных культур Медико-Генетического научного центра РАМН. Жизнеспособность ФЧ в динамике эксперимента оценивали с помощью МТТ метода. При исследовании острой токсичности КГА с 0,6% и 6,0% замещения анионами СО₃ ^2- было установлено отсутствие токсических проявлений этих материалов в отношении перевивной культуры ФЧ - после культивирования в течение суток культуры ФЧ выживало 70-85% клеточной популяции. Авторами изобретения были также исследованы матриксные свойства указанных КГА при долгосрочном культивировании на них ФЧ. Установлено, что при регулярной смене ростовой среды дважды в неделю количество ФЧ на этих материалах монотонно увеличивалось вплоть до 28-х суток наблюдения. Учитывая, что через сутки после инкубации с этими материалами выжило 70-85% от инициального пула клеток, к окончанию эксперимента популяция ФЧ увеличилась на образцах 0,6% и 6,0% замещения анионами СО₃ ^2- в 9 и 7 раз соответственно.

В экспериментах in vivo при подкожной трансплантации мышам заявляемых биокерамических материалов установлено, что на изученных сроках наблюдения исследуемые биокерамические материалы не вызывали реакции воспаления, макро- и микропризнаков отторжения, что свидетельствует об их биосовместимости. Через две недели после подкожной трансплантации было обнаружено, что гранулы КГА, имеющие сферическую форму разных размеров и шероховатую наружную поверхность, окружены зрелой соединительной тканью. Внутреннее пространство гранул разрежено и имеет многочисленные полости, которые активно заселяются фибробластами. Параллельно процессу инкапсулирования каждой гранулы КГА и конгломерата гранул в целом, активно наблюдается процесс неоваскуляризации. Фибробласты начинают формировать вокруг себя соединительную ткань с отложением межклеточного матрикса. В этих островках «юной» соединительной ткани также начинается процесс неоваскуляризации.

Таким образом, результаты исследования матриксных качеств гранул КГА с различной степенью замещения анионами СО₃ ^2- свидетельствуют об их пригодности для замещения костных дефектов (см. таблицу).

Биомедицинские показатели гранул КГА в зависимости от их физико-химических характеристик
Образец №	Размер гранул, мкм	Содержание СО 3 2-, масс.%	Соотношение Са/Р	Пористость, %	Размер пор, мкм	Результат
1	<100	3,0	1,8	70	0,5-10	Слипание и агломерирование гранул
2	100	3,0	1,8	65	0,5-10	Удовлетворительный результат*
3	500	3,0	1,8	74	0,5-10	Удовлетворительный результат*
4	1000	3,0	1,8	80	0,5-10	Удовлетворительный результат*
5	1000	0,1	1,8	59	0,5-10	Низкая скорость резорбции
6	1000	7,0	2,5	60		Слишком высокая скорость резорбции
7	1000	3,0	1,8	68	0,5	Недостаточные адгезивные свойства
8	1000	3,0	1,4	80	>10	Назкая шероховатость поверхности и низкая динамика нарастания клеток
9	1000	4,5	2,2	65	0,5-10	Удовлетворительный результат*
10	1000	3,0	1,8	83	0,5-10	Гранулы непрочные
11	1000	3,0	1,7	47	0,5-10	Не происходит эффективного заполнения клетками
8	>1000	3,0	1,7	65		Неэффективно заполнение костного дефекта
* - по результатам испытаний in vitro выраженные матриксные качества поверхности образцов.

В настоящее время получила развитие концепция, основанная на использовании стромальных стволовых клеток, пролиферация и дифференцировка которых обеспечивает регенерацию тканей. Для реализации данной технологии большое значение имеют параметры и свойства матриксов для культивирования клеток с последующей их имплантацией в тканевый дефект.

Для получения биоимплантата гранулы КГА были насыщены аутологичными МСК. Для этого паспортизованная по имуннофенотипу, морфологии и пролиферативной активности культура МСК 1-3 пассажей была перенесена в культуральную емкость, содержащую гранулы КГА в полной ростовой среде в количестве 5-50 тыс. клеток на см² . Количество клеточной массы определялось величиной удельной поверхности керамического материала и предполагаемым объемом тканевого дефекта. Установлено, что по истечении 5-8 суток совместного культивирования биоимплантат (МСК, иммобилизованные на КГА матриксе) может быть использован для интраоперационного замещения костного дефекта любой конфигурации и объема.

Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют о том, что заявляемый материал для закрытия костных дефектов при реконструктивно-пласгических операциях отвечает критериям патентоспособности и обладает значительными преимуществами по сравнению с известными материалами того же назначения.

Авторами были также проведены исследования in vivo, касающиеся возможности закрытия костного дефекта голени крысы гранулированной КГА керамикой, и керамикой, насыщенной аутологичными МСК. Для этого было сформировано 3 группы животных:

1 гр. - дефект голени - контрольная группа для изучения спонтанного закрытия дефекта;

2 гр. - имплантация в дефект гранул КГА, предварительно насыщенных полной ростовой средой;

3 гр. - закрытие дефекта голени крысы биоимплантатами - гранулами КГА с иммобилизованными аутологичными МСК III пассажа.

Для создания костного дефекта крысам- самцам линии Wistar под общим наркозом формировали окончатый дефект верхнего кортикального слоя голени длиной 5-7 мм. Содержимое костного канала под дефектом удаляли до нижнего кортикального слоя. Затем дефект полностью заполняли гранулированной КГА биокерамикой. Для предотвращения периостальной физиологической регенерации надкостницу по краям дефекта срезали. Операцию заканчивали послойным ушиванием раны. В сроки 3, 7, 9, 12 недель, 6, 9 и 12 месяцев по 3 животных каждой группы выводили из эксперимента. Ткани зоны дефекта с окружающими тканями использовали для приготовления гистологических препаратов.

Динамика замещения дефекта голени крыс гранулами КГА представлена на фиг 1a - 1 г (увел.× 100), окраска - гематоксилин-эозин.

Установлено, что уже через 3 недели после травмы гранулы КГА без аутологичных МСК стимулировали остео- и хондрогенез. (Фиг.1а), причем эти процессы протекали параллельно с биорезорбцией вещества гранул. В результате в зоне костномозгового канала и на месте верхнего кортикального слоя гранулы сетчатой структуры оказались «вмурованными» в юную костную ткань с очагами гемопоэза, а в зоне формирующейся надкостницы - окружены волокнистой соединительной тканью. К 7- 9-й неделям процесс остеогенеза нарастал (Фиг.1б, в), к 13 неделям остатки гранул были замурованы в зрелую костную ткань (Фиг.1г). Таким образом, гранулированный КГА продемонстрировал выраженные остеокондуктивные свойства: даже в крупном очаге гемопоэза остатки гранул были окружены ободком формирующейся костной ткани.

В 3-й группе животных (закрытие дефекта гранулами КГА, насыщенными аутологичными МСК) процессы репаративного остеогенеза протекали активнее, чем во 2-й опытной группе: уже через 2 недели после имплантации наблюдалась активная оссификация с очагами гемопоэза в промежутках между «разреженными» гранулами, которая свидетельствовала о формировании губчатой костной ткани, причем эти процессы к 7-й - 9-й неделям визуализировались и внутри резорбирующихся гранул (Фиг.2а, б). В эти же сроки был отмечен и процесс физиологического ремоделирования костной ткани:

скопления многоядерных остеокластов вокруг остатков отдельных гранул во внутреннем слое надкостницы.

Таким образом установлено, что пористые гранулы КГА без аутологичных МСК и нагруженные аутологичными МСК обладают остеокондуктивными и остеоиндуктивными потенциями. Важно при этом отметить, что данный биоматериал не угнетает морфогенетических потенций окружающих тканей и стимулирует репаративную регенерацию.