способ получения эмбрионов свиней in vitro

Формула изобретения

Способ получения эмбрионов свиней in vitro, включающий отделение яичников от животных после убоя, их транспортировку, извлечение ооцитов из яичников, культивирование их до стадии метафазы II, подготовку спермы хряка, совместное культивирование ооцитов и сперматозоидов, культивирование оплодотворенных яйцеклеток, отличающийся тем, что яичники отделяют от неподвергнутых ошпарке животных не позднее 30 мин с момента их обездвиживания, трансплантируют яичники в физиологическом растворе, не содержащем антибиотики, при 35-37°С в течение 1 ч, ооциты получают из яичников путем рассечения видимых антральных фолликулов, ооциты разделяют на группы по количеству окружающих слоев кумулюсных клеток, а именно, на ооциты, окруженные 4-5 слоями кумулюсных клеток, 2-3 слоями и 1 слоем кумулюсных клеток; каждую группу ооцитов культивируют в среде, содержащей 10 IU хорионического гонадотропина человека; для оплодотворения ооцитов in vitro используют эякуляторную сперму хряков, разбавленную глюкозо-хелато-цитратно-сульфатным разбавителем, отмытую от семенальной плазмы, разбавленную средой mTBM и проинкубированную в течение 25 мин в условиях инкубатора при 5% CO ₂ и 38,5°С; полученные зиготы культивируют в среде NCSU-23, не содержащей феноловый красный, обогащенной 0,1% аминокислот в течение 6-7 дней; в первые трое суток культивирования в среду NCSU-23 дополнительно вводят 0,17 мМ Na-пирувата и 2,75 мМ Na-лактата.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к клеточной инженерии, в частности к способам культивирования животных клеток, а именно ооцитов и эмбрионов свиней вне организма.

Известен способ получения зародышей свиней после созревания и оплодотворения ооцитов и культивирования зародышей in vitro. [K. Kikuchi, N.Kashiwazaki, J. Noguchi. et.al. Developmental competence, after transfer to recipients, of porcine oocytes matured, fertilized, and cultured in Vitro. Biol. Reprod. 1999. 60; 336-340]. Яичники свиней получали от половозрелых свинок и трансплантировали в лабораторию при 35°С. Ооциты получали методом аспирации фолликулов диаметром 3-5 мм в среде 199 на солях Эрла, обогащенной 20 мМ HEPES и 10% сыворотки плода коров. Ооциты культивировали в среде NCSU-23 10% фолликулярной жидкости свиней, 0.6 mM цистеина, 1 mM dbcAMP (Sigma), 10 IU/ml eCG/ 10 IU/ml hCG (Puberogen 500 U, Japan) в течение 20-22 h, а последующие 20-22 часа без гормонов и dbcAMP. Для оплодотворения использовались замороженные эпидидимальные сперматозоиды, полученные от хряков после их убоя. Размороженные эпидидимальные сперматозоиды готовили методом Swim-up, для чего их проинкубировали в среде ТСМ-199 в течение часа. Сокультивирование созревших ооцитов и проинкубированных сперматозоидов (1×10 ⁶/мл) проводили в среде ВО в течение часа, после чего яйцеклетки освобождали от прилегающих клеток кумулюса и сперматозоидов, и переносили в среду культивирования (среда NCSU-37, содержащая 50 М -меркаптоэтанола). Способ позволяет получать достаточно высокий процент бластоцист свиней, однако он имеет ряд недостатков. К ним относится в первую очередь использование для оплодотворения замороженных эпидидимальных сперматозоидов, что предполагает забой животного, что само по себе нежелательно, так как ограничивает объем получаемой от хряка спермы и сокращает срок его производственного использования. Более того, показано, что после оттаивания сперма хряка имеет большой процент сперматозоидов с разрушенной акросомой и с признаками капацитации. [Green СЕ, Watson PF Comparison of the capacitation-like state of cooled boar spermatozoa with true capacitation. Reproduction 2001. 122. 889-898. // Courtens JL., Paquignon M 1985 Ultrastructure of fresh, frozen, and frozen-thawed spermatozoa of the boar. Proceedings of the First International Conference on Deep Freezing of Boar Semen 1985. 61-87. Eds LA Johnson & K Larsson. Uppsala, Sweden: Swedish University of Agricultural Sciences]. Качество свежей спермы несоизмеримо выше, но она имеет ограниченный срок использования. В практике оплодотворения ооцитов свиней in vitro свежую сперму используют в течение суток с момента получения. [Funahashi H., Romar R. Reduction of the incidence of polyspermic penetration into porcine oocytes by pretreatment of fresh spermatozoa with adenosine and a transient co-incubation of the gametes with caffeine. Reprod. 2004. 128. 789-800].

Известен способ обеспечения созревания, оплодотворения ооцитов и культивирования эмбрионов свиней in vitro, взятый в качестве прототипа [Abeydeera LR, Day BN. Fertilization and subsequent development in vitro of pig oocytes inseminated in a modified tris-buffered medium with frozen-thawed ejaculated spermatozoa. Biol. Reprod. 1997 57: 729-734]. Яичники получали от половозрелых свинок и трансплантировали в лабораторию в физиологическом растворе с антибиотиками при 25-28°С. Ооциты получали методом аспирации и культивировали в среде NCSU-23, содержащей 0.67 мМ цистеина, 10% фолликулярной жидкости свиней 10 UI eCG (лиофинизированный препарат сыворотки жеребых кобыл) и 10 UI hCG (хорионический гонадотропин человека), в течение 20-22 часов и далее в этой же среде, но без гормонов еще 20-22 часа. Для оплодотворения использовалась замороженно-оттаянная эякулярная сперма хряка. После оттаивания сперму дважды центрифугировали с фосфатным буфером в модификации Дюльбекко, содержащем 0.1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и антибиотики, и один раз со средой оплодотворения (мТВМ). После подходящего разведения сперму вносили в капли среды оплодотворения, содержащей созревшие оголенные ооциты. Через 5-6 часов соинкубации яйцеклетки отмывали от сперматозоидов и переносили в среду культивирования (NCSU-23). Данный способ предполагает использование эякулярной спермы хряка, что обеспечивает длительное использование одних и тех же хряков, а значит и повторяемость получаемых результатов. Однако замораживание спермы отрицательно влияет на ее качество и оплодотворяющую способность. По этой причине перед оплодотворением с ооцитов удаляют клетки кумулюса, хотя присутствие клеток кумулюса благоприятно влияет на оплодотворяемость ооцитов и на их дальнейшее эмбриональное развитие [Suzuki K., Eriksson B., Shimizu E. et al. Effect of hyaluronan on monospermic penetration of porcine oocytes fertilized in vitro. int. J. Androl. 2000.. 23.13-21]. Эффективность метода также снижается использованием для выделения ооцитов метода аспирации фолликулов. Часть ооцитов при этом теряется, особенно из мелких фолликулов, что снижает выход ооцитов более чем на 50%.

Технический результат изобретения заключается в повышении доли выхода ооцитов, достигших метафазы II деления мейоза, оплодотворенных ооцитов, достигших эмбрионального развития до стадии морулы/бластоцисты in vitro, а также удешевление способа за счет использования менее дорогих отечественных препаратов, по сравнению с импортными.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ получения эмбрионов свиней in vitro, включающий отделение яичников от животных после убоя, их транспортировку, извлечение ооцитов из яичников, культивирование их до стадии метафазы II, подготовку спермы хряка, сокультивирование ооцитов и сперматозоидов, наконец, культивирование оплодотворенных яйцеклеток, отличающийся тем, что яичники отделяют от неподвергнутых ошпарке животных не позднее 30 минут с момента их обездвиживания, трансплантируют яичники в физиологическом растворе, не содержащем антибиотики, при 35-37°С в течение 1 часа, ооциты получают из яичников путем рассечения видимых антральных фолликулов, ооциты разделяют на группы по количеству окружающих слоев кумулюсных клеток, а именно на ооциты, окруженные 4-5 слоями кумулюсных клеток, 2-3 слоями и 1 слоем кумулюсных клеток, каждую группу ооцитов культивируют в среде, содержащей 10 IU хорионического гонадотропина человека; для оплодотворения ооцитов in vitro используют эякуляторную сперму хряков, разбавленную глюкозо-хелато-цитратно-сульфатным разбавителем, отмытую от семенальной плазмы, разбавленную средой mTBM и проинкубированной в течение 25 минут в условиях инкубатора при 5% СО₂ и 38.5°С; полученные зиготы культивируют в среде NCSU-23, не содержащей феноловый красный, обогащенной 0.1% существенных и несущественных аминокислот в течение 6-7 дней. В первые трое суток в среду NCSU-23 дополнительно вводят 0.17 мМ Na-пирувата и 2.75 мМ Na-лактата.

Пример.

Была оценена общая эффективность усовершенствованного метода созревания, оплодотворения и развития эмбрионов свиней in vitro, определенная по проценту созревших, оплодотворенных ооцитов и норме развития эмбрионов до стадии морулы/бластоцисты.

Яичники получали от половозрелых свинок и взрослых свиноматок через небольшой разрез в брюшной полости в течение 20 минут с момента обездвиживания. Яичники отсекали до проведения термической обработки тушек, помещали в термос с транспортной средой, в качестве которого использовался прогретый до 28-35°С физиологический раствор без антибиотиков, и транспортировали в лабораторию в течение часа. В лаборатории яичники освобождали от близлежащих тканей и промывали многократно в физиологическом растворе с антибиотиками, после этого яичники помещали в чашку Петри со средой ТСМ 199-HEPES, содержащей 4 мг/мл BSA, где проводили рассечение видимых фолликулов специальным устройством, представляющим собой зажатое в пинцет с загнутым концом лезвие размером 1 см × 2 см. Полученные ооциты не менее трех раз промывали в среде ТСМ 199-HEPES и трижды - в среде созревания, разделяли на группы по количеству окружающего их слоев кумулюсных клеток. Выделяли ооциты, окруженные 4-5 слоями кумулюса, ооциты, окруженные 2-3 слоями и ооциты, окруженные 1 слоем кумулюсных клеток. Разделение ооцитов на группы обеспечивает синхронизацию их созревания, увеличивает выход ооцитов, достигших метафазы II деления мейоза, повышает их оплодотворяемость и улучшает их последующее эмбриональное развитие. После этого каждые 50-60 ооцитов культивировали в 500 мкл среды NCSU-23, содержащей 10% фолликулярной жидкости свиней, 10 IU eCG и 10 IU хорионического гонадотропина человека (произведенным Московским эндокринным заводом). Через 20-22 часа созревания ооциты трижды промывали в среде без гормонов и переносили в 500 мкл каплю той же среды и дополнительно культивировали еще 20-22 часа.

Созревшие ооциты переносили в 50 мкл капли mTBM, содержащей 1 мМ кофеина, за 30 минут до помещения туда сперматозоидов. Для оплодотворения ооцитов in vitro использовали полученную от хряков эякулярную сперму, разбавленную глюкозо-хелато-цитратно-сульфатным разбавителем. Использование данного разбавителя, с одной стороны, обеспечивает высокую норму оплодотворения ооцитов и их последующее эмбриональное развитие, равно как и импортные аналоги, но стоит гораздо дешевле, а с другой - позволяет сохранять оплодотворяющую способность спермы в течение 5 дней при 16-20°С.

В день оплодотворения 1 мл разбавленной спермы центрифугировали дважды с раствором PBS и один раз со средой оплодотворения при 1900 об/мин в течение 4 минут. После чего осадок разбавляли свежей средой оплодотворения (раствор mTBM, дополненный 1 мМ кофеина) и инкубировали в течение 25 минут в условиях инкубатора при 5% СО₂ и 38.5°С. Этот прием способствует адаптации спермы после центрифугирования и увеличивает количество активно передвигающихся сперматозоидов и, как следствие, повышает оплодотворяемость ооцитов и норму развития эмбрионов свиней in vitro.

Через 6-8 часов соинкубации яйцеклетки тщательно отмывали от сперматозоидов и клеток кумулюса в среде ТСМ 199-HEPES и трижды в каплях среды для культивирования эмбрионов. После этого каждые 15-20 предполагаемых зигот помещали в 50 мкл каплю той же среды, покрытой минеральным маслом. Культивирование проводили в среде NCSU-23, не содержащей феноловый красный, дополненной 0.1% существенных и несущественных аминокислот в течение 6-7 дней. Данные модификации среды вследствие удаления токсических веществ способствуют улучшению эмбрионального развития оплодотворенных яйцеклеток.

Более того, первые трое суток в среду NCSU-23 дополнительно вводили 0.17 мМ Na-пирувата и 2.75 мМ Na-лактата. По окончанию культивирования определяли стадию развития.

Созревание, оплодотворение, подготовку спермы и культивирование эмбрионов проводили в условиях инкубатора при температуре 38,5°С, 5% СО₂ в воздухе и максимальной влажности. Результаты представлены в таблице.

Предложенный способ позволяет повысить выход зрелых ооцитов до 80%, их оплодотворяемость in vitro до 77%, при этом стадии морулы/бластоцисты достигали 25.7% эмбрионов. По данным Abeydeera LR и Day BN. (1997) эти показатели составляют соответственно 80%, 40-51% и 19-23%.

По сравнению с прототипом, предложенный способ является менее затратным.

Таблица Результаты созревания, оплодотворения ооцитов и культивирования эмбрионов свиней in vitro
Показатели	Количество, n	Доля (%)
Получено яичников	126	-
Получено ооцитов методом рассечения видимых фолликулов, всего	4290	-
Получено ооцитов, пригодных к созреванию	3150	73.4
Получено пригодных к созреванию ооцитов на один яичник	25	-
Созрело ооцитов	2520	80.0
Оплодотворилось ооцитов	1941	77.0
Достигло стадии 8-32 клеток	874	45.0
Достигло стадии морулы/бластоцисты	602	31.01