способ определения чувствительности кератиноцитов больного псориазом к лекарственным препаратам

Формула изобретения

1. Способ определения чувствительности кератиноцитов больного псориазом к лекарственным препаратам, включающий культивирование культур кератиноцитов с использованием питательной среды, отличающийся тем, что культивирование культур кератиноцитов осуществляют с использованием питательной среды без добавления эпителиального фактора роста, после чего в полученную таким образом среду добавляют лекарственные субстанции и/или их смеси и определяют пролиферативную активность клеток полученных культур по сравнению с контрольными клетками культур, культивированных без соответствующих лекарственных субстанций и/или их смесей.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что пролиферативную активность клеток культур определяют по частоте включения в их ядра ³H-тимидина.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что лекарственные субстанции и/или их смеси используют в липосомальной форме.

Описание изобретения к патенту

Изобретение касается методов и веществ, предназначенных для лечения псориаза и связанных с ним заболеваний.

Для оценки новизны и изобретательского уровня заявленного технического решения рассмотрим ряд известных из уровня техники решений аналогичного назначения.

Псориаз - это гетерогенное хроническое воспалительное заболевание кожи неизвестной этиологии. Известно большое число фармацевтических композиций, применяемых при лечении псориаза с различной степенью успешности, которые часто сопровождаются нежелательными побочными эффектами. Более того, применяемые в настоящее время способы лечения псориаза не способны излечить заболевание и их цель заключается лишь в снижении тяжести и распространения поражений кожи.

Из уровня техники известен терапевтический способ лечения псориаза и связанных с ним осложнений, таких как псориатический артрит с использованием диацереина, см. патент РФ № 2266740.

Известны способы получения средств для лечения псориаза на основе лекарственных трав и иного растительного сырья. Так, например, известен способ получения препарата против псориаза, согласно которому 100 мас.ч. чеснока экстрагируют этанолом при 50-60°С, упаривают извлечение и добавляют к сухому остатку смесь измельченных лекарственных растений - чистотела, календулы, коры ивы, затем сырье экстрагируют физиологически пригодным маслом при 50-60°С и целевой продукт отделяют, см. патент РФ 1837884.

Известен способ приготовления средства для лечения заболеваний типа псориаза путем смешения активного вещества со вспомогательными веществами, согласно которому соединение общей формулы R-Y-РО2-X-R1 или его физиологически переносимая соль, где R - радикал насыщенного или ненасыщенного углеводорода, Y - кислород или NH, X - кислород NH или NP2, R1 - С1-С3-алкил или ненасыщенный алкил С2-С3 с одним атомом углерода, замещенным на галоген, смешивают с алкилглицерином, см. патент РФ 1837877.

Известно средство для наружной терапии псориаза, включающее активные и вспомогательные вещества, отличающееся тем, что в качестве активных веществ оно содержит препараты группы метилксантинов и препараты селена, а в качестве вспомогательных веществ - жировую основу, растительное рафинированное масло и воду, при следующем соотношении компонентов, г на 1 г готового продукта: препараты группы метилксантинов - 0,01-0,1; препараты селена - 0,00001-0,0003; жировая основа, растительное рафинированное масло, вода - остальное, см. патент РФ № 2196583. Это средство дополнительно может содержать этмозин в количестве 0,0001-0,01 г на 1 г готового продукта или перекись водорода в количестве 0,001-0,2 г на 1 г готового продукта или препараты кальция, например, хлорид кальция, глюконат кальция, в количестве 0,01-0,1 на 1 г готового продукта или окисленный глутатион (трипептид (L-глутамил-L-цистеинил-глицин) в количестве 0,0001-0,01 г на 1 г готового продукта или ₂-адреноблокаторы, например, пирроксан в количестве 0,005-0,18 г на 1 г готового продукта или тропафен в количестве 0,012-0,12 г на 1 г готового продукта или ₂-адреномиметики, например, савентол в количестве 0,002-0,012 г на 1 г готового продукта или сальбутамол в количестве 0,002-0,012 г на 1 г готового продукта.

Недостаток всех известных способов лечения псориаза заключается в том, что пациентам приходится по методу проб и ошибок подбирать и использовать различные препараты, при этом не существует методики, позволяющей индивидуализировать терапию псориаза до начала лечения, что в конечном счете удлиняет сроки лечения, снижает его эффективность и увеличивает финансовые затраты на лечение.

Задачей изобретения является создание принципиально новой методики определения чувствительности кератиноцитов больного псориазом к лекарственным препаратам, обеспечивающей возможность быстрого определения конкретного для данного пациента препарата или смеси препаратов, которые в состоянии обеспечить эффективное лечение данного пациента.

Сущность заявляемого изобретения выражается в следующей совокупности существенных признаков, достаточной для достижения указанного выше обеспечиваемого изобретением технического результата.

Способ определения чувствительности кератиноцитов больного псориазом к лекарственным препаратам, включающий культивирование культур кератиноцитов с использованием питательной среды, отличающийся тем, что культивирование культур кератиноцитов осуществляют с использованием питательной среды без добавления эпителиального фактора роста, после чего в полученную таким образом среду добавляют лекарственные субстанции и/или их смеси и определяют пролиферативную активность клеток полученных культур по сравнению с контрольными клетками культур, культивированных без соответствующих лекарственных субстанций и/или их смесей.

В этом заключается совокупность существенных признаков изобретения, обеспечивающая получение указанного выше технического результата.

Кроме того, изобретение имеет ряд дополнительных факультативных признаков, а именно:

- пролиферативную активность клеток культур определяют по частоте включения в их ядра ³Н-тимидина.

- лекарственные субстанции и/или их смеси используют в липосомальной форме.

Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, совокупности признаков которых совпадают с совокупностью отличительных признаков всех независимых объектов заявленного изобретения, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию "новизна".

Отдельные отличительные признаки заявленного изобретения (питательные среды, факторы роста, липосомальные формы лекарств) известны из уровня техники, однако заявителю не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии данных отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат. В связи с этим, по мнению заявителя, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию "изобретательский уровень".

Технический результат, получаемый при использовании заявленного изобретения, заключается в том, что установлено, что пролиферативная активность культур кератиноцитов, выращенных с пораженных и непораженных участков кожи, практически не отличается друг от друга, и культуры способны долгое время самоподдерживаться без добавления специальных ростовых факторов. Определение пролиферативную активность клеток полученных культур с добавлением лекарственных субстанций и/или их смесей по сравнению с клетками культур, культивированных без применения лекарственных субстанций и/или их смесей позволяет быстро и надежно определить конкретный лекарственный препарат и/или конкретную смесь препаратов, которые для конкретного пациента обеспечивают эффективное подавление пролиферативной активности культур кератиноцитов.

Способ реализуют следующим образом.

Выделение первичных культур кератиноцитов человека осуществляют по методу Рейнвальда и Грина (Rheinwald J.G.and Green Н., 1975) в модификации авторов изобретения. Лоскуты кожи брались в стерильных условиях под местной анестезией у больных псориазом из очагов поражения и с неизмененных участков. Они помещались для хранения в среду ДМЕМ («Sigma», США) с 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (СЭКРС) («Биолот», Россия) при +4°С до начала эксперимента. Кусочки кожи промывали в растворе Хенкса с антибиотиками, измельчали механически, помещали в 0,25% раствор трипсина-ЭДТА («Sigma», США) на 30 мин при 37°С и постоянном перемешивании, после чего в течение 1 мин давали осесть крупным конгломератам. Надосадочную жидкость удаляли, заменяя равным объемом свежего раствора. Полученное содержимое центрифугировали при 3000 об/мин 15 мин, отделяли супернатант, после чего полученные клетки помещали в среду ДМЕМ, содержащую 20% СЭКРС, и культивировали в стандартных условиях в 96-луночных планшетах и чашках Петри 40 мм в течение трех суток. Далее 2 раза в неделю осуществляли смену среды. В этих условиях кератиноциты образовывали колонии, вытесняя фибробласты. Такая система может быть использована для изучения не только для дифференцировки клеток кожи и различных ее патологических изменений, но и для тестирования лекарственных препаратов, влияющих на эпидермис.

Для оценки пролиферативной активности клеток применялся радиометрический метод с использованием счетчика радиоактивности «Tracor Analytic Delta 300» (США). Влияние липосомальных препаратов и их смесей оценивали по включению в клетки меченых предшественников синтеза ДНК. С этой целью клетки высевали на 96-луночные планшеты в концентрации 1×10³ на 100 мкл полной культуральной среды, после чего добавляли в каждую лунку по 100 мкл исследуемых препаратов. Одновременно вносили ³Н-тимидин в концентрации 1 мкКu на лунку. Через 18 часов инкубации удаляли супернатанты, клетки дважды промывали раствором Хенкса, после чего клеточную массу растворяли в 0,2% додецил-сульфата натрия (50 мкл) и переносили в виалы для оценки радиоактивности. Все эксперименты по определению пролиферативной активности кератиноцитов проводили в 4-х параллельных пробах. Сравнение проводили между культурами до и после применения липосомальных препаратов.

Вначале было отмечено, что кератиноциты, выделенные из пораженных участков кожи больных псориазом, пролиферировали более интенсивно и на 20-е сутки культивирования образовали 80-90% монослоя, в то время как кератиноциты, выделенные с неизмененных участков кожи этих же больных, образовали не более 40% монослоя. В дальнейшем стало ясно, что клетки, выделенные с непораженного участка кожи, под воздействием эпителиального фактора роста, содержащегося в питательной среде, резко усиливали активность пролиферации, которая по своей интенсивности приближалась к той, которую проявляли клетки, выделенные из очагов поражения, и в дальнейшем степень их пролиферации не отличалась друг от друга.

Частота включения Н³-тимидина в кератиноциты пораженных и непораженных участков эпидермиса составила 3178я126 и 2750я195 имп/мин соответственно и не имела достоверных отличий.

Все эксперименты по определению пролиферативной активности проводили в 4 параллельных пробах в каждой выращенной культуре, при этом было отмечено, что вне зависимости от разведения лекарственного вещества, т.е. в очень широких концентрационных пределах, направленность действия всех препаратов оставалась одинаковой по скорости ингибирования пролиферации. Первоначально, после добавления препаратов в культуру клеток, никаких заметных изменений не последовало. Тогда была использована питательная среда, уже не содержащая эпителиального фактор роста. Парадоксально, но не одна из культур при этом не погибла, продолжая активно размножаться. Повторные эксперименты, проведенные уже в этих условиях, продемонстрировали следующие результаты действия лекарственных средств.

Отсутствие в питательной среде эпителиального фактора роста позволило лекарственным субстанциям и/или их смесям подавлять пролиферативную активность кератиноцитов, а также позволило количественно определить чувствительность культур кератиноцитов к каждой лекарственной субстанции и/или к каждой их смеси.

Пролиферативная активность кератиноцитов существенно подавлялась при добавлении липосомальных: пентоксифиллина, пирроксана, селенита натрия, сальбутамола, глутатиона окисленного (р<0,005). Этмозина гидрохлорид, хлорид кальция и флуороурацил практически не влияли на пролиферацию кератиноцитов.

Влияние лекарственных веществ на пролиферацию кератиноцитов неизмененного участка кожи больных было аналогичным и не отличалось при сравнении их действия радиометрическим методом (таблица).

Наиболее сильным ингибитором пролиферации оказался пентоксифиллин, который уменьшал пролиферативную активность кератиноцитов как из пораженных, так и непораженных участков кожи более чем в 4,2 и 3,6 раза соответственно. Такая же эффективность в ингибировании пролиферации отмечена у пирроксана - в 4,2 и 3,4 раза. Далее следует селенит натрия - в 3,2 и 2,4 раза. Сальбутамол и глутатион окисленный обладали несколько менее выраженным влиянием на пролиферацию 2.5/1.7 и 2.2/1.9 раза соответственно, причем окисленный глутатион подавлял пролиферацию непораженных кератиноцитов несколько более эффективно, чем сальбутамол. Этмозин обладал крайне незначительной активностью, а хлорид кальция и флуороурацил антипролиферативным действием практически не обладали. Следует также отметить, что липосомальные препараты оказывали несколько более выраженное влияние на культуры клеток, выделенные из пораженных участков кожи. Отчасти полученные нами результаты совпали с ожидаемыми, но некоторые оказались неожиданными.

Сравнительная характеристика подавления пролиферативной активности культур кератиноцитов при использовании отдельных липосомальных препаратов
Препарат	Пораженный участок(n 8), имп/мин	Непораженный участок(n 8), имп/мин	Уменьшение по сравнению с контролем (во сколько раз)
Контроль	3178я126	2750я195
Пентоксифиллин	750я85*	750я100*	4.2/3.6
Этмозин	2530я400	2200я350	1.2/1.2
Селенит натрия	980я20*	1150я500*	3.2/2.4
Сальбутамол	1250я180*	1600я90*	2.5/1.7
Кальция хлорид	2580я300	2250я200	1.2/1.2
Глутатион (ОГ)	1400я100*	1420я90*	2.2/1.9
Пирроксан	750я70*	800я100*	4.2/3.4
Флуороурацил	3000я250	2500я380	1.0/1.1
* - изменения достоверны по сравнению с контролем (р<0,005)

Для получения липосомальных лекарственных эмульсий в качестве основного субстрата использовался соевый лецитин производства «Штерн» (Германия), на 98% состоящий из различных классов фосфолипидов, и кристаллический холестерин производства «Merk» (Германия). Для получения липосомальных сферических структур применялся ротационный испаритель «Ротадест» (Венгрия) и ультразвуковой диспергатор УЗДН-2Т (Россия). Таким образом, изготавливались моноламеллярные липосомы размером до 100 нм.

Были приготовлены и использованы липосомальные эмульсии: пентоксифиллина, этмозина гидрохлорида (морицизин), пирроксана, кальция хлорида, глутатиона окисленного, сальбутамола и флуороурацила. Эти препараты обладают разным механизмом действия. Они хорошо известны и широко применяются парентерально для лечения сердечно-сосудистых, неврологических, аллергических, онкологических и других заболеваний. Они позволяют предположить возможность воздействия на патогенетические механизмы возникающих нарушений в кератиноцитах при псориазе за счет стабилизации метаболического потенциала клетки, регуляции митотической активности и механизмов апоптоза. Концентрации использованных липосомальных препаратов, вводились в клеточную питательную среду из расчета их возможного последующего включения в состав наружного средства.

Результаты исследований показали, что некоторые из использованных препаратов целесообразно использовать в липосомальной форме в составе наружных средств для лечения вульгарного псориаза.

Основываясь на результатах проведенных исследований, нами были изготовлены пять липосомальных лекарственных комбинаций из числа препаратов, наиболее активно подавлявших пролиферацию кератиноцитов:

- Смесь № 1 - пентоксифиллин, селенит натрия, пирроксан;

- Смесь № 2 - пентоксифиллин, этмозин, селенит натрия;

- Смесь № 3 - пентоксифиллин, селенит натрия, сальбутамол, пирроксан;

- Смесь № 4 - пентоксифиллин, сальбутамол, пирроксан

- Смесь № 5 - пентоксифиллин, селенит натрия

Полученные липосомальные комбинации исследовались на культурах выращенных как с пораженных, так и с интактных участков кожи.

Результаты полученных исследований позволяют сказать, что пролиферация кератиноцитов в культурах клеток, полученных как с патологически измененных, так и с неизмененных участков кожи больных псориазом значительно подавлялась (р<0,001) при использовании всех перечисленных смесей, однако наиболее эффективной оказалась смесь № 1, подавлявшая пролиферацию в 36 и 24 раза соответственно. Комбинации из липосомальных: пентоксифиллина, селенита натрия и пирроксана, а также из пентоксифиллина, селенита натрия и этмозина наиболее целесообразны для использования в наружной терапии псориаза, так как наиболее эффективно подавляют пролиферацию в культурах кератиноцитов больных псориазом.

Таким образом, практика использования заявленного изобретения позволила сделать следующие выводы:

- культуры кератиноцитов, выращенные из пораженных и непораженных участков кожи больных псориазом, обладают высокой пролиферативной активностью и которую они способны долгое время поддерживать без добавления специальных ростовых факторов;

- пролиферативная активность культур кератиноцитов, выращенных с пораженного и непораженного участков кожи, практически не отличается друг от друга;

- самоподдержание культуры кератиноцитов в среде, лишенной фактора роста, свидетельствует о том, что одно (или несколько) биологически активных веществ, стимулирующих пролиферацию клеток, продуцируется самими кератиноцитами;

- наиболее ярким антипролиферативным действием обладают: пентоксифиллин, пирроксан, селенит натрия, глутатион окисленный и сальбутамол (в порядке убывания), предварительно заключенные в липосомальную форму;

- комбинации из липосомальных: пентоксифиллина, селенита натрия и пирроксана, а также из пентоксифиллина, селенита натрия и этмозина наиболее целесообразны для использования в наружной терапии псориаза, так как наиболее эффективно подавляют пролиферацию в культурах кератиноцитов больных псориазом;

- заявленный метод определения чувствительности кератиноцитов больного псориазом к различным препаратам и их смесям, может быть использован не только для тестирования лекарств, влияющих на эпидермис, но и для изучения пролиферативно-дифференцировочных процессов других клеток кожи с последующим созданием новых лекарственных препаратов с целью индивидуализации и оптимизации наружной терапии.