гетеробифункциональные полимерные соединения, способ получения полимерных конъюгатов и способ лечения млекопитающих с их использованием

Формула изобретения

1. Гетеробифункциональное полимерное соединение формулы:



где X₁-X₆ независимо означают О, S или NR₁;

R₄₄ и R _44' независимо выбирают из полиалкиленоксидов;

R₁ выбирают из группы, включающей водород, C_1-6 -алкилы, С_3-12-разветвленные алкилы, С_3-8 -циклоалкилы, C_1-6-зaмeщeнныe алкилы, аралкилы и С _3-8-замещенные циклоалкилы;

R_40-43 независимо выбирают из группы, включающей водород, C_1-6-алкилы, С_3-12-разветвленные алкилы, С_3-8-циклоалкилы, C_1-6-замещенные алкилы, С_3-8-замещенные циклоалкилы, арилы, замещенные арилы, аралкилы, C_1-6 -гетероалкилы, замещенные C_1-6-гетероалкилы, C _1-6-алкокси, фенокси и C_1-6-гетероалкокси;

у и у' независимо означают ноль или целое положительное число;

р и р' независимо означают ноль или единицу;

n и n' независимо означают единицу или целое положительное число;

а и b независимо означают ноль или целое положительное число, при условии, что a+b больше или равно двум;

z означает целое положительное число; и

D₁ и D₂ независимо выбирают из группы, включающей В, ОН, уходящие группы, активирующие группы и концевые группы;

где В выбирают из биологически активных составляющих, диагностических агентов и ОН.

2. Соединение по п.1, где указанные концевые группы выбирают из групп, включающих

и ,

где Y_1-6 независимо выбирают из группы, включающей О, S или NR₁;

R_1' выбирают из группы, включающей водород, С_1-6-алкилы, С_3-12-разветвленные алкилы, С_3-8-циклоалкилы, С_1-6-замещенные алкилы, аралкилы и С_3-8 -замещенные циклоалкилы;

R_2-8 независимо выбирают из группы, включающей водород, C_1-6-алкилы, С _3-12-разветвленные алкилы, С_3-8-циклоалкилы, C_1-6-замещенные алкилы, С_3-8-замещенные циклоалкилы, арилы, замещенные арилы, аралкилы, C_1-6 -гетероалкилы, замещенные C_1-6-гетероалкилы, С _1-6-алкокси, фенокси и C_1-6-гетероалкокси;

Ar означает составляющую, которая образует многократно замещенную ароматическую углеводородную или многократно замещенную гетероциклическую группу;

L_1-2 независимо выбирают из бифункциональных линкеров;

каждый из е и f' независимо выбирают из целых положительных чисел;

с, с' и е' независимо означают ноль или целое положительное число;

d, f и d' независимо означают ноль или единицу; и

В' выбирают из группы, включающей уходящие группы, активирующие группы, ОН, биологически активные составляющие и диагностические агенты.

3. Соединение по п.1, где указанную концевую группу выбирают из группы, включающей

,

и ,

где D' означает одну из групп

, ,

, ,

, ,

, ,

,



,

,

,

,



и где В' выбирают из группы, включающей уходящие группы, активирующие группы, ОН, биологически активные составляющие и диагностические агенты.

4. Соединение по п.1, где X₁-X₄ независимо означают О или NR₁;

Х₅-Х₆ оба означают О;

R₁ выбирают из группы, включающей: водород, C_1-6-алкилы и C_1-6замещенные алкилы;

у, р, у' и р' независимо означают 0 или целое число от 1 до 18;

n и n' независимо означают целое число от 1 до 100; и

а и b независимо выбирают из целых чисел от 1 до 20.

5. Соединение по п.1, где X₁-X ₄ независимо означают NR₁;

Х₅ -Х₆ оба означают О;

каждый из R₄₄ и R_44' означает -(CH₂-CH₂ -O)-;

R₁ означает водород или метил;

каждый из у и у' равен 0, 1 или 2;

каждый из р и р' равен 1;

n и n' независимо выбирают из целых чисел от 70 до 80;

а и b независимо выбирают из целых чисел от 5 до 10; и

D₁ и D₂ независимо выбирают из группы, включающей ОН, галогены, направляющие агенты, лекарственные вещества, ферменты, белки, терапевтически активные соединения, красители, хелатообразующие агенты и меченые радиоактивным изотопом соединения.

6. Соединение по п.2, где указанную концевую группу выбирают из группы, включающей:

, ,

, ,

и ,

где В' независимо выбирают из группы, включающей ОН, галогены, направляющие агенты, лекарственные вещества, пептиды, белки, ферменты, олигонуклеотиды, стероиды, липиды, красители, хелатообразующие агенты и меченые радиоактивным изотопом соединения.

7. Соединение по п.1, где указанную уходящую группу выбирают из группы, включающей галогены и N-гидроксисукцинимидил; указанные биологически активные составляющие выбирают из группы, включающей направляющие агенты, лекарственные вещества, пептиды, белки, ферменты, олигонуклеотиды, стероиды и липиды; и указанный диагностический агент выбирают из группы, включающей зеленый флуоресцентный белок (GFP), красители, хелатообразующие агенты и меченые радиоактивным изотопом соединения.

8. Соединение по п.1, где n и n' независимо выбирают из положительных целых чисел, так что среднемассовая молекулярная масса составляет от примерно 4000 до примерно 270000 Да.

9. Соединение по п.1, где n и n' независимо выбирают из положительных целых чисел, так что среднемассовая молекулярная масса составляет от примерно 6800 до примерно 130000 Да.

10. Соединение по п.1, где n и n' независимо выбирают из положительных целых чисел, так что среднемассовая молекулярная масса составляет от примерно 6800 до примерно 38000 Да.

11. Соединение по п.1, где указанную уходящую группу выбирают из группы, включающей галогены, активированные карбонаты, карбонилимидазол, циклические имидтионы, изоцианаты, N-гидроксисукцинимидил, паранитрофенол, N-гидроксифталимид, N-гидроксибензотриазолил, имидазол и тозилаты.

12. Соединение по п.2, где В' выбирают из группы, включающей: малеимид и остатки гидроксилсодержащих или аминсодержащих соединений.

13. Соединение по п.12, где В' выбирают из группы, включающей антрациклины, даунорубицин, доксорубицин, п-гидроксианилиниприт, цитозин, ara-С, гемцитибин, камптотецин, ванкомицин, пауллонес, паклитаксел, цисплатин, винкристин, винбластин.

14. Соединение по п.1, выбираемое из группы, включающей:



,





,



,

и

,

где В и В' выбирают из группы, включающей уходящие группы, активирующие агенты, ОН, биологически активные агенты и диагностические агенты;

SCA означает одноцепочечный связывающий антиген, моноклональное антитело или их соответствующий фрагмент; и

n и z означают положительные целые числа.

15. Соединение по п.1, выбираемое из группы, включающей:













и



где SCA означает одноцепочечный связывающий антиген, моноклональное антитело или их соответствующий фрагмент; и n и z означают положительные целые числа.

16. Соединение по п.1, выбираемое из группы, включающей:

,



,

17. Соединение по п.1, описываемое формулой







где D₁₀ и D₁₁ независимо выбирают из группы, включающей ОН, галогены, направляющие агенты, лекарственные вещества, ферменты, белки, терапевтически активные соединения, красители, хелатообразующие агенты, меченые радиоактивным изотопом соединения, либо D₁₀ и D₁₁ вместе образуют концевую группу формулы:

;

Y_7-9 независимо выбирают из группы, включающей О, S или NR_1";

R_1" означает водород или метил;

R_9-18 независимо выбирают из группы, включающей водород, С_1-6-алкилы, С_3-12-разветвленные алкилы, С_3-8-циклоалкилы, С_1-6-замещенные алкилы, С_3-8-замещенные циклоалкилы, арилы, замещенные арилы, аралкилы, C_1-6 -гетероалкилы, замещенные C_1-6-гетероалкилы, С _1-6-алкокси, фенокси и C_1-6-гетероалкокси;

L_3-4 независимо выбирают из бифункциональных линкеров;

Q выбирают из составляющих, активно транспортируемых в клетку-мишень, гидрофобных составляющих, бифункциональных связующих составляющих и комбинации указанных составляющих;

l, k, m и о независимо означают целые положительные числа;

j и h независимо означают ноль или положительное целое число;

g, i и q независимо означают ноль или единицу; и

В' выбирают из группы, включающей уходящие группы, активирующие группы, ОН, биологически активные составляющие и диагностические агенты.

18. Соединение по п.17, описываемое формулой



.

19. Соединение по п.18, выбираемое из группы, включающей:



и



где В' выбирают из группы, включающей уходящие группы, активирующие группы, ОН, биологически активные составляющие и диагностические агенты.

20. Соединение по п.19, где В' выбирают из группы, включающей малеимид и остатки гидроксилсодержащих или аминсодержащих соединений.

21. Соединение по п.19, где В' выбирают из группы, включающей антрациклины, даунорубицин, доксорубицин, п-гидроксианилиниприт, цитозин, ara-С, гемцитибин, камптотецин, ванкомицин, пауллонес, паклитаксел, цисплатин, винкристин, винбластин.

22. Способ получения полимерного конъюгата по п.1, включающий:

а) взаимодействие соединения формулы (i)



где A₁ означает активирующую группу;

Т означает защитную группу;

X₁, Х ₃ и Х₅ независимо означают О, S или NR₁ ;

R₄₄ означает полиалкиленоксид;

р' равно нулю или единице;

в условиях, подходящих для образования соединения формулы iii:

;

b) взаимодействие соединения формулы (iii) с активирующим агентом в условиях, подходящих для образования соединения формулы (iv):

,

где А₂ означает активирующую группу;

c) превращение защитной группы (Т) в формуле (iv) в активирующую группу, в условиях, подходящих для образования соединения формулы (v):

,

где А₃ означает активирующую группу;

d) взаимодействие соединения формулы (v) с биологически активной составляющей, диагностическим агентом или концевой группой, в условиях, подходящих для образования соединения формулы (vi):

,

где D₂ означает биологически активную составляющую, диагностический агент или концевую группу; и

e) взаимодействие активирующей группы А₃ соединения формулы (vi) с биологически активной составляющей, диагностическим агентом или концевой группой.

23. Способ по п.22, дополнительно включающий стадию снятия защиты соединения формулы (iii).

24. Способ по п.22, где t и t' независимо выбирают из целых чисел от примерно 1 до примерно 30.

25. Способ по п.22, где D₂ означает концевую группу, и указанную концевую группу дополнительно активируют и подвергают взаимодействию с биологически активной составляющей или диагностическим агентом.

26. Способ по п.22, где указанную биологически активную составляющую выбирают из группы, включающей направляющие составляющие, лекарственные вещества, пептиды, белки, полипептиды, олигонуклеотиды, стероиды, липиды и ферменты.

27. Способ по п.22, где указанный диагностический агент выбирают из группы, включающей красители, хелатообразующие агенты и меченые радиоактивным изотопом соединения.

28. Способ по п.22, где концевую группу в дальнейшем активируют и подвергают взаимодействию с биологически активной составляющей или диагностическим агентом.

29. Способ доставки биологически активной составляющей в клетку млекопитающего, включающий введение млекопитающему соединения по п.1, где, по меньшей мере, один из D₁ и D₂ означает В, и В означает остаток биологически активной составляющей.

30. Соединение по п.1,

где Х₃ и Х₄ оба означают NH;

Х₅ и Х₆ оба означают О;

каждый из R₄₄ и R_44' означает полиэтиленгликоль; и

р, р', у и у' все означают 0.

31. Соединение по п.1,

где Х₃ и Х₄ оба означают NH;

каждый из X₁, Х₂, Х₅ и Х₆ означает О;

каждый из R₄₄ и R_44' означает полиэтиленгликоль;

R ₄₀-R₄₃ означают Н;

каждый из у и у' означает 2; и

R₁ выбирают из группы, включающей водород, C_1-6-алкилы, С_3-12-разветвленные алкилы, С_3-8-циклоалкилы, С_1-6-замещенные алкилы, аралкилы и С_3-8-замещенные циклоалкилы;

R_40-41 независимо выбирают из группы, включающей водород, C_1-6-алкилы, С_3-12-разветвленные алкилы, С_3-8-циклоалкилы, С_1-6-замещенные алкилы, С_3-8-замещенные циклоалкилы, арилы, замещенные арилы, аралкилы, C_1-6-гетероалкилы, замещенные C _1-6-гетероалкилы, С_1-6-алкокси, фенокси и C _1-6-гетероалкокси;

n означает 1 или целое положительное число;

у означает ноль или целое положительное число;

t означает целое положительное число; и

р равно нулю или единице;

с соединением формулы (ii):



где Х₂, Х₄ и Х₆ независимо означают О, S или NR₁;

R_44' означает полиалкиленоксид;

R₁ выбирают из группы, включающей водород, C_1-6-алкилы, С_3-12 -разветвленные алкилы, С_3-8-циклоалкилы, C_1-6 -замещенные алкилы, аралкилы и С_3-8-замещенные циклоалкилы;

R_42-43 независимо выбирают из группы, включающей водород, С_1-6алкилы, С_3-12-разветвленные алкилы, С_3-8-циклоалкилы, C_1-6-замещенные алкилы, С_3-8-замещенные циклоалкилы, арилы, замещенные арилы, аралкилы, C_1-6-гетероалкилы, замещенные C _1-6-гетероалкилы, C_1-6-алкокси, фенокси и C _1-6-гетероалкокси;

n' означает целое положительное число;

у' означает ноль или целое положительное число;

t' означает целое положительное число; и

р и р' независимо означают 0 или 1.

32. Соединение формулы:



где X₁-Х₆ независимо означают О, S или NR₁;

R₄₄ и R _44' независимо выбирают из полиалкиленоксидов;

R₁ выбирают из группы, включающей водород, С_1-6 -алкилы, С_3-12-разветвленные алкилы, С_3-8 -циклоалкилы, С_1-6-замещенные алкилы, аралкилы и С _3-8-замещенные циклоалкилы;

R_40-43 независимо выбирают из группы, включающей водород, С_1-6-алкилы, С_3-12-разветвленные алкилы, С_3-8-циклоалкилы, С_1-6-замещенные алкилы, С_3-8-замещенные циклоалкилы, арилы, замещенные арилы, аралкилы, C_1-6 -гетероалкилы, замещенные С_1-6-гетероалкилы, С _1-6-алкокси, фенокси и C_1-6-гетероалкокси;

у, р, у' и р' независимо означают ноль или целое положительное число;

n и n' независимо означают 0 или целое положительное число;

а и b независимо означают ноль или целое положительное число, при условии, что а+b больше или равно двум;

z означает целое положительное число; и

D₁ и D₂ независимо выбирают из группы, включающей В, ОН, уходящие группы, активирующие группы и концевые группы;

где В выбирают из биологически активных составляющих, диагностических агентов и ОН;

причем указанные уходящие группы выбирают из галогенов, активированных карбонатов, карбонилимидазола, циклических имидтионов,

изоцианатов, N-гидроксисукцинимидила, пара-нитрофенола, N-гидроксифталимида, N-гидроксибензотриазолила, имидазола и тозилатов; и указанные концевые группы выбирают из группы, состоящей из:

и

где Y_1-6 независимо выбирают О, S или NR_1';

R_1' выбирают из группы, включающей водород, С_1-6-алкилы, С _3-12-разветвленные алкилы, С_3-8-циклоалкилы, C_1-6-замещенные алкилы, аралкилы и С_3-8 -замещенные циклоалкилы;

R_2-8 независимо выбирают из группы, включающей водород, С_1-6-алкилы, С _3-12-разветвленные алкилы, С_3-8-циклоалкилы, С_1-6-замещенные алкилы, С_3-8-замещенные циклоалкилы, арилы, замещенные арилы, аралкилы, C_1-6 -гетероалкилы, замещенные C_1-6-гетероалкилы, С _1-6-алкокси, фенокси и C_1-6-гетероалкокси;

Ar означает составляющую, которая образует многократно замещенную ароматическую углеводородную или многократно замещенную гетероциклическую группу;

L_1-2 независимо выбирают из бифункциональных линкеров;

е и f' независимо выбирают из положительных целых чисел;

с, с' и е' независимо означают ноль или положительное целое число;

d, f и d' независимо означают ноль или 1; и

В' выбирают из уходящих групп, активирующих групп, биологически активных составляющих, диагностических агентов и ОН;

причем указанные уходящие группы выбирают из галогенов, активированных карбонатов, карбонилимидазола, циклических имидтионов, изоцианатов, N-гидроксисукцинимидила, пара-нитрофенола, N-гидроксифталимида, N-гидроксибензотриазолила, имидазола и тозилатов;

при условии, что n и n' являются положительными целыми числами, когда а и b оба являются положительными целыми числами.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение касается синтеза гетеробифункциональных полимерных конъюгатов высокой молекулярной массы, полезных в обеспечении направленной доставки терапевтических средств. Описаны также способы получения и применения этих конъюгатов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Направление к мишени и доставка лекарственных средств становится все более важной, в особенности в связи с применением цитотоксических средств для лечения рака. Для селективно направленной доставки терапевтических средств при лечении раковых опухолей у людей и других млекопитающих используют ряд методов. Направляющие составляющие, такие как моноклональные антитела (mAb) или соответствующие фрагменты, конъюгируют с линейными полимерами через функциональные группы боковых цепей. Однако такой подход обычно приводит к пониженному сродству при связывании с рецепторами по причине изменения химических свойств антител или по причине складчатой конфигурации полимеров, вовлекающих направляющую составляющую в статистически спирально свернутую структуру. В идеале, новый конъюгат должен совмещать в себе направляющую функциональность и имеющую лечебно-профилактическое значение составляющую.

Недавно были открыты гетеробифункциональные полимерные конъюгаты, содержащие направляющую функциональную группу на одном конце и терапевтическую составляющую (например, химиотерапевтическое средство) - на противоположном конце, смотри патентную заявку США 2002/0197261 А1. Используемые полимерные конъюгаты содержат полимерный спейсер, связанный с полимерным носителем, содержащим множественные функциональные группы в боковых цепях, позволяющие присоединять разнообразные лекарственные молекулы (например, поли(1-глутаминовую кислоту)) с одной стороны, и другая сторона полимерного спейсера связана с направляющей составляющей. Однако молекулярная масса полимерного спейсерного участка весьма низкая.

Описаны способы получения высокомолекулярных гетеробифункциональных полимерных конструкций, смотри патентную заявку США 2002/0072573 А1. Однако эти способы включают полимеризацию мономеров, которая сама по себе не идеальна по причине нежелательной полимерной дисперсности. Другие предшествующие способы включают анионное этоксилирование и трудновыполнимые стадии очистки. Попытка получения высокомолекулярных полимерных субстратов с использованием вышеуказанных способов привела к плохому качеству и низкому выходу требуемого продукта.

По причине неадекватности рассматриваемых способов существует потребность в улучшенных способах получения высокомолекулярных гетеробифункциональных полимерных субстратов, обеспечивающих высокий выход и высокую чистоту субстратов и в то же самое время сохраняющих низкую полимерную дисперсность. Желательно также получить соединения, включающие гетеробифункциональные полимерные субстраты в качестве средств направленной доставки терапевтически активных соединений. Настоящее изобретение ориентировано на эти потребности.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно одному из аспектов изобретения представлены соединения формулы (I)

где:

X₁-Х ₆ независимо означают О, S или NR₁;

R₄₄ и R_44' независимо выбирают из полиалкиленоксидов;

R₁ выбирают из группы, включающей водород, C_1-6-алкилы, С_3-12-разветвленные алкилы, С_3-8-циклоалкилы, C_1-6-замещенные алкилы, аралкилы и С_3-8-замещенные циклоалкилы;

R_40-43 независимо выбирают из группы, включающей водород, C_1-6-алкилы, С_3-12-разветвленные алкилы, С_3-8-циклоалкилы, C_1-6-замещенные алкилы, С_3-8-замещенные циклоалкилы, арилы, замещенные арилы, аралкилы, C_1-6-гетероалкилы, замещенные C_1-6 -гетероалкилы, C_1-6-алкокси, фенокси и C_1-6 -гетероалкокси;

y и y' независимо означают ноль или целое положительное число;

p и p' независимо означают ноль или единицу;

n и n' независимо означают единицу или целое положительное число;

а и b независимо означают ноль или целое положительное число, при условии, что a+b больше или равно двум;

z означает 1 или целое положительное число;

D ₁ и D₂ независимо выбирают из В, уходящих групп, активирующих групп, OH и концевых групп и

В выбирают из биологически активных составляющих, диагностических агентов и ОН.

В предпочтительном варианте осуществления, X₁-Х₆ независимо означают О или NR ₁; R₁ означает водород, а и b независимо выбирают из целых чисел приблизительно от 1 до 20, y и y' независимо означают 0, 1 или 2, каждый из p и p' равен 1, D₁ и D₂ независимо выбирают из уходящих групп и концевых групп и В, где В означает биологически активную составляющую, такую как лекарственное вещество, амино- или гидроксилсодержащий остаток, диагностический агент, такое как краситель, хелатообразующий агент или меченное радиоактивным изотопом соединение, уходящую группу или активирующую группу.

Применительно к настоящему изобретению под термином "остаток" следует понимать ту часть биологически активного соединения, которая остается после протекания реакции замещения, при которой присоединяется пролекарственный носитель.

Применительно к настоящему изобретению подразумевается, что термин "алкил" включает линейные, разветвленные, замещенные C_1-12-алкилы, С_3-8-циклоалкилы или замещенные циклоалкилы и т.д.

Некоторые из основных преимуществ настоящего изобретения включают новые высокомолекулярные гетеробифункциональные полимерные конъюгаты, обеспечивающие увеличение циркуляционного времени полужизни и растворимости нативных или немодифицированных молекул, а также способы получения таких конъюгатов, где для поддержания высокой чистоты не требуется стадия хроматографии. Другое преимущество способов по настоящему изобретению состоит в сохранении низкой дисперсии полимеров при увеличении молекулярной массы полимерных конъюгатов. Другое преимущество настоящего изобретения состоит в том, что специалист получает возможность регулировать структуру лекарственного конъюгата, который может иметь одинаковые или различные группы с обеих сторон полимерного участка. Это преимущество позволяет специалисту получать предназначенное для определенной цели соединение, содержащее доставляющую или направляющую функциональность и терапевтическую функциональность в одном и том же конъюгате в зависимости от конкретной потребности.

Также рассматриваются способы получения и применения указанных соединений и конъюгатов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1-9 схематически иллюстрируют способы получения описанных в примерах соединений по настоящему изобретению.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

А. Формула (I)

Согласно одному из аспектов изобретения представлены соединения формулы (I)

где:

X₁-X ₅ независимо означают О, S или NR₁;

R₄₄ и R_44' независимо выбирают из полиалкиленоксидов;

R₁ выбирают из группы, включающей водород, C_1-6-алкилы, С_3-12-разветвленные алкилы, С_3-8-циклоалкилы, C_1-6-замещенные алкилы, аралкилы и С_3-8-замещенные циклоалкилы;

R_40-43 независимо выбирают из группы, включающей водород, C_1-6-алкилы, С_3-12-разветвленные алкилы, С_3-8-циклоалкилы, C_1-6-замещенные алкилы, С_3-8-замещенные циклоалкилы, арилы, замещенные арилы, аралкилы, C_1-6-гетероалкилы, замещенные C_1-6 -гетероалкилы, C_1-6-алкокси, фенокси и C_1-6 -гетероалкокси;

y и y' независимо означают ноль или целое положительное число;

p и p' независимо означают ноль или единицу;

n и n' независимо означают единицу или целое положительное число;

а и b независимо означают ноль или целое положительное число, при условии, что a+b больше или равно двум;

z означает 1 или целое положительное число;

D ₁ и D₂ независимо выбирают из В, уходящих групп, активирующих групп, ОН и концевых групп и

В выбирают из биологически активных составляющих, диагностических агентов и ОН.

В предпочтительном варианте осуществления соединения формулы (I):

X₁-Х₆ независимо означают О или NR₁;

R ₁ выбирают из группы, включающей водород, C_1-6 -алкилы, C_1-6-гетероалкилы, аралкилы и C_1-6 -замещенные алкилы;

y и y' независимо означают 0 или целое число от 1 до 18;

p и p' независимо равны 0 или 1;

n и n' независимо выбирают из целых чисел от 0 до 100;

а и b независимо выбирают из целых чисел от 1 до 20 и

z означает целое положительное число.

Более предпочтительно,

X ₁-X₄ независимо означают NR₁;

каждый из X₅-Х₆ означает О;

каждый из R₄₄ И R_44' означает -(СН₂-СН₂-O)-;

R₁ означает водород или метил;

каждый из y и y' независимо означает 0, 1 или 2;

каждый из p и p' равен 1;

n и n' независимо выбирают из целых чисел от 70 до 80;

а и b независимо выбирают из целых чисел от 5 до 10;

z означает целое положительное число;

D₁ и D₂ независимо выбирают из группы, включающей: ОН, галогены, направляющие агенты, лекарственные вещества, ферменты, белки, терапевтически активные соединения, красители, хелатообразующие агенты и меченные радиоактивным изотопом соединения.

По еще одному предпочтительному варианту осуществления соединения формулы (I) D₁ и D₂ независимо выбирают из концевых групп, таких как

и

где:

Y_1-6 независимо означают О, S или NR₁;

R_1' означает водород или метил;

R_2-8 независимо выбирают из группы, включающей водород и C_1-6-алкилы;

Аr означает составляющую, которая образует многократно замещенную ароматическую углеводородную или многократно замещенную гетероциклическую группу;

L_1-2 независимо выбирают из бифункциональных линкеров;

каждый из е и f' независимо выбраны из положительных целых чисел, например каждый равен единице;

с, с' и е' независимо означают ноль или целое положительное число, например единицу;

d, f и d' независимо означают ноль или единицу и

В' выбирают из уходящих групп, активирующих групп, ОН, биологически активных составляющих и диагностических агентов.

Согласно другому предпочтительному аспекту изобретения представлены полимерные конъюгаты формулы (Iа)

где:

Y_7-9 независимо означают О или NR_1";

R_1" означает водород или метил;

R_9-18 независимо означают водород или C_1-6 -алкилы;

L_3-4 независимо выбирают из бифункциональных линкеров;

Q выбирают из составляющих, активно транспортируемых в клетку-мишень, гидрофобных составляющих, бифункциональных связующих составляющих и комбинации указанных составляющих;

l, k, m и о независимо означают целые положительные числа;

каждый из j и h независимо означает ноль или единицу;

каждый из g и i независимо означает ноль или единицу;

q означает ноль или единицу;

В' выбирают из уходящих групп, активирующих групп, ОН, биологически активных составляющих и диагностических агентов;

D₁₀ и D₁₁ могут быть выбраны из той же группы, что указана для D₁, или вместе образуют концевую группу формулы

Согласно еще одному предпочтительному аспекту изобретения D₁ и D₂ независимо выбирают из концевых групп, таких как

где D' означает одну из групп

где В' выбирают из уходящих групп, активирующих групп, ОН, биологически активных составляющих и диагностических агентов.

В. Связующие составляющие L_1-4 (линкеры)

Как указано выше, изобретение может включать бифункциональные связующие составляющие L ₁-L₄. Предпочтительно, L₁-L₄ независимо выбирают из следующего неограничивающего списка:

-(СН₂)₃,

-(CH ₂)₃NH-C(O),

-(CH₂ )₃NH-,

-C(O)(CR₃₄R ₃₅)_а'О(CR₃₆R₃₇) _b'

-NH(СН₂СН₂ O)_a'(CH₂)_b'NR₃₈ -,

-NH(CH₂CH₂O)_a' -,

-NH(CR₃₄R₃₅)_a' O-,

-С(О)(CR₃₄R₃₅) _a'NHC(O)(CR₃₆R₃₇)_b' NR₃₈-,

-С(O)O(СН₂) _a'O-,

-С(O)(CR₃₄R₃₅ )_a'NR₃₈-,

-С(O)NH(СН ₂СН₂O)_a'(CH₂) _b'NR₃₈-,

-С(О)О-(CH ₂CH₂O)_a'NR₃₈-,

-С(О)NH(CR₃₄R₃₅)_a' O-,

-С(O)O(CR₃₄R₃₅} _a'O-,

-C(O)NH(CH₂CH ₂O)_a'-,

где:

R₃₄ -R₃₈ независимо выбирают из группы, включающей водород, C_1-6-алкилы, С_3-12-разветвленные алкилы, С_3-8-циклоалкилы, C_1-6-замещенные алкилы, С_3-8-замещенные циклоалкилы, арилы, замещенные арилы, аралкилы, C_1-6-гетероалкилы, замещенные C_1-6 -гетероалкилы, C_1-6-алкокси, фенокси и C_1-6 -гетероалкокси;

R₃₉ выбирают из группы, включающей: водород, C_1-6алкилы, С_3-12-разветвленные алкилы, С_3-8-циклоалкилы, C_1-6-замещенные алкилы, С_3-8-замещенные циклоалкилы, арилы, замещенные арилы, аралкилы, C_1-6-гетероалкилы, замещенные C _1-6-гетероалкилы, C_1-6-алкокси, фенокси и C _1-6-гетероалкокси, NO₂, галогеналкилы и галогены;

a' и b' независимо выбирают из целых положительных чисел.

С. Описание Ar-составляющей

Согласно некоторым аспектам изобретения, можно заметить, что Ar-составляющая представляет собой составляющую, которая при включении в формулу (I) образует многократно замещенную ароматическую углеводородную или многократно замещенную гетероциклическую группу. Отличительная особенность состоит в том, что Ar-составляющая имеет ароматическую природу. Обычно, чтобы быть ароматическими, -n электроны должны распределяться внутри "облака" как выше, так и ниже плоскости циклической молекулы. Кроме того, число -электронов должно удовлетворять правилу Хюккеля (4n+2). Специалисту понятно, что мириады составляющих удовлетворяют ароматическому требованию к составляющей формулы (I) и, таким образом, пригодны для употребления по изобретению.

Некоторые конкретные примеры ароматических групп включают

где R_62-67 независимо выбирают из той же группы, что указана для R₂.

Другие предпочтительные ароматические углеводородные составляющие включают, не в плане ограничения,

где Z и Е независимо означают CR ₆₈ или NR₆₉ и J означает О, S или NR₇₀ , где R_68-70 выбирают из той же группы, что указана для R₂, или R_68-70 означают циано, нитро, карбоксил, ацил, замещенный ацил или карбоксиалкил. Рассматриваются также изомеры пяти- или шестичленных циклов, равно как бензо- и дибензосистемы и родственные соединения. Для специалиста в данной области также очевидно, что ароматические циклы могут быть, необязательно, замещены гетероатомами, такими как О, S, NR₁ и т.д., таким образом, что будет выполняться правило Хюккеля. Кроме того, ароматические или гетероциклические структуры могут, необязательно, быть замещены галогеном (галогенами) и/или боковыми цепями, в общепринятом для данной области понятии этого термина.

D. Полиалкиленоксиды

Обращаясь к формуле (I), можно заметить, что R₄₄ представляет собой полимерную составляющую, такую как полиалкиленоксид. Подходящие примеры таких полимеров включают полиэтиленгликоли, которые, по существу, не являются антигенными. Также полезны полипропиленгликоли, такие как описаны в патенте США № 5643575. Другие ПЭГи, полезные в способах по изобретению, описаны в Shearwater Polymers, Inc. catalog "Polyethylene Glycol and Derivatives 2001". Содержание каждой из указанных публикаций включено здесь в качестве ссылки.

Хотя ПАОи и ПЭГи могут существенно расходиться по среднемассовой молекулярной массе, предпочтительно, R₄₄ имеет среднемассовую молекулярную массу в пределах от примерно 2000 до примерно 136000 Да в большинстве вариантов осуществления изобретения. Более предпочтительно, R₄₄ имеет среднемассовую молекулярную массу в пределах от примерно 3400 до примерно 65000 Да при наиболее предпочтительной среднемассовой молекулярной массе в пределах от примерно 3400 до примерно 20000 Да.

Включенные в рамки изобретения полимерные вещества преимущественно являются водорастворимыми при комнатной температуре. Неограничивающий список таких примеров включает гомополимеры полиалкиленоксида, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ) или полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные полиолы, сополимеры и блоксополимеры, при условии, что сохраняется водорастворимость блоксополимеров.

E. D₁, D₂ , B и B' группы формулы (I)

1. Уходящие группы

В тех вариантах формулы (I), когда D₁ , D₂ независимо выбирают из уходящих групп, пригодные составляющие включают, но не в порядке ограничения, группы, такие как галогены, активированные карбонаты, такие как гидроксисукцинимидилкарбонат, карбонил имидазол, циклические имидтионы, изоцианаты, N-паранитрофенол, N-гидроксифталимид, N-гидроксибензотриазолил, имидазол, тозилаты,

Другие подходящие уходящие группы очевидны для специалиста в данной области.

Применительно к настоящему изобретению под уходящими группами понимают те группы, которые способны к взаимодействию с нуклеофилом, находящемся на требуемой мишени, т.е. на биологически активной составляющей, бифункциональном спейсере, промежуточном соединении и т.д. Мишени, таким образом, содержат замещаемую группу, такую как NH₂ -группы, находящиеся в белках, пептидах, ферментах, природных и химически синтезированных терапевтических молекулах, таких как доксорубицин.

2. Активирующие группы

Для вариантов формулы (I), где D₁, D₂, В и В' независимо означают активирующие группы. Неограничивающие примеры таких функциональных групп включают малеимидил, винил, остатки винилсульфона, гидрокси, амино, карбокси, меркапто, гидразид, карбазат и тому подобное. Будучи соединенной с полимерным конъюгатом, функциональная группа (например, малеимид) может быть использована для присоединения полимерного конъюгата к мишени, такой как цистеиновый остаток полипептида, аминокислоты или пептидного спейсера и т.д.

3. Биологически активные составляющие

В тех случаях формулы (I), когда D₁, D₂ , В или В' представляют собой остатки амин- или гидроксилсодержащего соединения. Неограничивающий список таких приемлемых соединений включает остатки органических соединений, ферментов, белки, полипептиды и т.д. Органические соединения включают, не в порядке ограничения, такие составляющие, как антрациклиновые соединения, включающие даунорубицин, доксорубицин; п-аминоанилиниприт, мелфалан, Ara-C (цитозинарабинозид) и родственные соединения-антиметаболиты, например гемцитабин и т.д. Альтернативно, составляющая может представлять собой остаток амин- или гидроксилсодержащего сердечно-сосудистого агента, противоопухолевого агента, такого как камптотецин и паклитаксел, антиинфекционного, противогрибкового, такого как нистатин, флуконазол и амфотерицин В, анксиолетического агента, желудочно-кишечного агента, активирующего центральную нервную систему агента, анальгезирующего агента, средства от бесплодия, противозачаточного средства, противовоспалительного агента, стероидного агента и т.д.

В дополнение к вышеперечисленному, биологически активная составляющая может также представлять собой остаток фермента, белка, полипептида, одноцепочечных антигенсвязывающих белков (SCA's) моноклональных антител, таких как СС49, соответствующего фрагмента и т.д. Также рассматриваются SCA's моноклональных антител. Подходящие белки включают, но не в порядке ограничения, полипептиды, ферменты, пептиды и тому подобное, содержащие, по меньшей мере, одну группу, приемлемую для присоединения к полимеру, например -амино, цистинилтио, N-концевую амино, охватывающие вещества, обладающие физиологической и фармакологической активностями, а также способные катализировать взаимодействия в органических растворителях.

Представляющие интерес белки, полипептиды и пептиды включают, но не в порядке ограничения, гемоглобин, сывороточные белки, такие как факторы крови, включающие факторы VII, VIII и IX; иммуноглобулины, цитокины, такие как интерлейкины, т.е. IL-1-IL-13 и т.д., -, - и -интерфероны, факторы, стимулирующие колониеобразование, включающие гранулоцитарные колониестимулирующие факторы, тромбоцитарные факторы роста и фосфолипаза-активирующий белок (FLAP). Другие белки, представляющие общий биологический или терапевтический интерес, включают инсулин, растительные белки, такие как лектины и рицины, факторы некроза опухолей и родственные белки, факторы роста, такие как трансформирующие факторы роста, такие как TGF или TGF , и эпидермальные факторы роста, гормоны, соматомедины, эритропоэтин, пигментные гормоны, гипоталамические рилизинг-факторы, антидиуретические гормоны, пролактин, хорионический гонадотропин, фолликулостимулирующий гормон, тиреостимулирующий гормон, тканевой активатор плазминогена и тому подобное. Представляющие интерес иммуноглобулины включают IgG, IgE, IgM, IgA, IgD и соответствующие фрагменты.

Некоторые белки, такие как интерлейкины, интерфероны и факторы, стимулирующие колониеобразование, также существуют в негликозилированной форме, обычно как результат применения рекомбинантных технологий. Негликозилированные варианты также входят в число белков по настоящему изобретению.

Представляющие интерес ферменты включают углевод-специфические ферменты, протеолитические ферменты, оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы и лигазы. В число неограничиваемых отдельными ферментами примеров представляющих интерес ферментов входят аспарагиназа, аргиназа, аргининдезаминаза, аденозиндезаминаза, супероксиддисмутаза, эндотоксиназы, каталазы, химотрипсин, липазы, уриказы, аденозиндифосфотаза, тирозиназы и билирубиноксидаза. Представляющие интерес углевод-специфические ферменты включают глюкооксидазы, глюкодаэы, галактозидазы, глюкоцереброзидазы, глюкоуронидазы и т.д.

В рамки объема изобретения также входит любой участок биологического полимера, проявляющего биоактивность in vivo. Такие участки включают аминокислотные последовательности, нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК), пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК), фрагменты антител, одноцепочечные связывающие белки, смотри, например, патент США № 4946778, раскрытие которого включено здесь в качестве ссылки, связывающие молекулы, включающие слияния антител или фрагментов, поликлональные антитела, моноклональные антитела и каталитические антитела.

Белки или их части могут быть получены и выделены с применением известных специалистам в данной области методик, таких как метод культивирования тканей, метод экстракции из источников животного происхождения или метод рекобинантных ДНК. Также рассматриваются трансгенные источники белков, полипептидов, аминокислотных последовательностей и тому подобного. Такие материалы получают от трансгенных животных, например мышей, свиней, коров и проч., где белки экспрессируются в молоке, крови или тканях. Трансгенные насекомые и системы бакуловирусной экспрессии также рассматриваются в качестве источников. Кроме того, мутантные формы белков, такие как мутантные интерфероны, также входят в рамки объема настоящего изобретения и приложенных пунктов.

Другими белками, представляющими интерес, являются белки-аллергены, такие как аллерген к пыльце амброзии, антиген Е, аллерген к яду пчелы медоносной, клещевой аллерген и тому подобное. Приведенный выше перечень иллюстрирует белки, приемлемые по настоящему изобретению. Очевидно, что белки, относящиеся к вышеуказанным, но конкретно не названные, имеющие приемлемую аминогруппу, также рассматриваются как входящие в рамки объема настоящего изобретения и приложенных пунктов.

Согласно предпочтительному аспекту изобретения, амино- или гидроксилсодержащее соединение представляет собой биологически активное соединение, пригодное для применения в лечении или диагностике животных, например млекопитающих, включая людей, в состояниях, при которых показана такая терапия. Вышеперечисленные соединения рассматриваются как иллюстративные, а не ограничивающие в отношении соединений, которые могут быть модифицированы. Для специалиста в данной области очевидно, что другие такие соединения/композиции могут быть подобным образом модифицированы без осуществления лишнего эксперимента. Подразумевается, что те биологически активные материалы, которые конкретно не названы, но содержат подходящие соединительные группы, также входят в рамки объема настоящего изобретения и приложенных пунктов.

Единственные ограничения на типы амино- или гидроксилсодержащих молекул, входящих в число пригодных, это наличие, по меньшей мере, одной (первичной или вторичной) амино- или гидроксил-группы, способной взаимодействовать и образовывать связь с полимерным конъюгатом, и малосущественная утрата биоактивности после высвобождения пролекарственной системы и регенерации исходного соединения.

4. Диагностические агенты

В тех вариантах формулы (I), где D₁, D₂ , В и В' означает диагностический агент, неограничивающий список подходящих средств включает красители, хелатообразующие агенты или меченные радиоактивным изотопом соединения и другие меченые соединения, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP).

F. Q-составляюшие и функция указанных составляющих

По одному из аспектов изобретения Q означает L ₅-C(=Y₁₀), где L₅ означает бифункциональный линкер, выбираемый из группы, означающей L_i, L ₂, L₃ и L₄, и Y₁₀ выбирают из тех же групп, что определяют Y_1-9. Согласно данному аспекту изобретения группа Q служит в качестве соединения между группами В' и остатком полимерного конъюгата.

Согласно другому аспекту изобретения Q означает составляющую, которая активно транспортируется в клетку-мишень, гидрофобную составляющую и комбинации указанных составляющих. Хотя Q предпочтительно является моновалентной, Q необязательно может быть бивалентной или многовалентной, что обеспечивает присоединение более чем одной В' группы к полимерному конъюгату. Для обеспечения активного транспорта Q может включать аминокислотный или пептидный остаток, остаток сахаров, остаток жирных кислот, С_6-18 -алкил, замещенный арил, гетероарил, -С(=O), -C(=S) или -C(=NR ₂₈), где R₂₈ означает Н, низший алкил и т.д.

Данный аспект изобретения преимущественно основан на том принципе, что биологически активные материалы, пригодные для включения в полимерные конъюгаты, сами по себе могут быть веществами/соединениями, которые являются не активными после гидролитического высвобождения из полимерного субстрата, но могут стать активными после протекания дальнейшего химического процесса/взаимодействия. При этом варианте осуществления терапевтический или диагностический агент, пептид, полипептид и т.д., доставляемые в кровоток с помощью полимерной системы, остаются неактивными до вхождения или активного транспорта в представляющую интерес клетку-мишень, после чего активируются посредством внутриклеточных химических процессов, например, под действием фермента или ферментативной системы, присутствующей в данной ткани или клетке.

Отвечающие данному аспекту изобретения соединения получают таким образом, что гидролиз in vivo конъюгата на полимерной основе расщепляет конъюгат с высвобождением биологического материала (обозначенного здесь В') во внеклеточной жидкости при все еще связанной Q составляющей. Биологически активные материалы по данному аспекту изобретения предпочтительно, но не исключительно, представляют собой низкомолекулярные терапевтические и/или диагностические агенты. Например, одной из потенциальных комбинаций Q-B' является лейцин-доксарубацин, другой аминокислотносвязанный камптотецин или паклитаксел, и излечиваемой тканью является опухолевая ткань.

Не вдаваясь в какую-либо теорию или гипотезу, объясняющую действие изобретения, считается, что в зависимости от дополнительной составляющей, выбираемой в качестве транспортного усилителя, скорость транспорта биологически активного материала в опухолевые клетки определяется скоростью доставки биологически активного материала в экстрацеллюлярную ткань, например ткань, обладающую EPR-эффектом, в защищенной и/или транспорт-усиленной форме.

Согласно еще одному варианту, транспортный усилитель (Q) выбирают из числа известных субстратов для системы транспорта к клеточным мембранам. Просто в качестве примера, известно, что клетки активно транспортируют некоторые питательные элементы и эндокринные факторы и тому подобное, и такие питательные элементы или их аналоги легко использовать для усиления активного транспорта биологически эффективного материала в клетки-мишени. Примеры таких питательных элементов включают аминокислотные остатки, пептиды, например короткие пептиды с размером приблизительно в пределах от 2 до 10 остатков или более, моносахариды и жирные кислоты, эндокринные факторы и тому подобное.

Короткими пептидами являются, например, пептиды, содержащие приблизительно от 2 до 10 или более аминокислотных остатков, как упомянуто выше. В данном варианте осуществления изобретения считается, что такие пептидные усилители транспорта не должны быть гидрофобными, но должны действовать другим образом, усиливая поглощение и/или защищая связанные низкомолекулярные агенты от преждевременного гидролиза в общем кровотоке. Например, считается, что пептидные усилители транспорта и другие усилители транспорта в тех же молекулярно-массовых пределах пространственно затрудняют отщепление биологически активного агента под действием плазменных гидролитических ферментов, но затем отщепляются в клетке-мишени под действием различных пептидов и/или протеаз, таких как каптезин.

В некоторых предпочтительных вариантах Q является гидрофобной составляющей. Не вдаваясь в какую-либо теорию или гипотезу, объясняющую, каким образом гидрофобность вносит вклад в эффективность, считается, что гидрофобная составляющая ингибирует внеклеточное отщепление транспортного усилителя от активного биологического агента, ингибируя атаку гидролитических ферментов и т.д., присутствующих во внеклеточном тканевом пространстве, например в плазме. Таким образом, некоторые предпочтительные транспортные усилители включают, например, гидрофобные аминокислоты, такие как аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, пролин, фенилаланин, тирозин и триптофан, а также производные неприродного происхождения и соответствующие аналоги, как упомянуто выше.

Согласно еще одному варианту, транспортный усилитель представляет собой гидрофобную органическую составляющую. Просто в качестве примера, органическая составляющая может означать С_6-18- или выше алкил, арил или гетероарил - замещенный или незамещенный. Также рассматривается транспортный усилитель с органической составляющей, включающий органические функциональные группы, например, -C(=S) и/или -С(=O).

G. Синтез гетеробифункциональных полимерных конъюгатов

Синтез конкретных гетеробифункциональных полимерных соединений приведен в примерах. Обратимся теперь к приведенной в целях иллюстрации фиг.1, один из предпочтительных способов включает:

1) взаимодействие амин-защищенного, активированного гетеробифункционального полимера ПЭГ с гетеробифункциональным полимером ПЭГ в условиях сочетания в присутствии основания, приводящее к образованию первого промежуточного соединения, и

2) взаимодействие первого промежуточного соединения с подходящей активирующей группой, такой как NHS-активированный сложный эфир,

3) повторное взаимодействие по стадии 1) с получением второго промежуточного соединения,

4) снятие защиты второго промежуточного соединения и

5) взаимодействие активированного первого промежуточного соединения со вторым промежуточным соединением, со снятой защитой, в условиях сочетания, приводящее, таким образом, к высокомолекулярному гетеробифункциональному конъюгату ПЭГ.

Другой способ получения конъюгата по изобретению включает:

а) взаимодействие соединения формулы (i)

где:

A₁ означает активирующую группу;

Т означает защитную группу;

X₁, Х₃ и X ₅ независимо означают О, S или NR₁;

R₄₄ означает полиалкиленоксид;

R ₁ выбирают из группы, включающей водород, C_1-6 -алкилы, С_3-12-разветвленные алкилы, С_3-8 -циклоалкилы, C_1-6-замещенные алкилы, аралкилы и С _3-8-замещенные циклоалкилы;

R_40-41 независимо выбирают из группы, включающей водород, C_1-6 -алкилы, С_3-12-разветвленные алкилы, С_3-8 -циклоалкилы, C_1-6-замещенные алкилы, С_3-8 -замещенные циклоалкилы, арилы, замещенные арилы, аралкилы, C _1-6-гетероалкилы, замещенные C_1-6-гетероалкилы, C_1-6-алкокси, фенокси и C_1-6-гетероалкокси;

n означает 1 или целое положительное число;

y означает ноль или целое положительное число;

t означает целое положительное число и

p равно нулю или единице;

с соединением формулы (ii)

где:

Х₂ , Х₄ и Х₆ независимо означают О, S или NR₁;

R_44' означает полиалкиленоксид;

R₁ выбирают из группы, включающей водород, C_1-6-алкилы, С_3-12-разветвленные алкилы, С_3-8-циклоалкилы, аралкилы, C_1-6 -замещенные алкилы и С_3-8-замещенные циклоалкилы;

R_42-43 независимо выбирают из группы, включающей: водород, С_1-6-алкилы, С_3-12 -разветвленные алкилы, С_3-8-циклоалкилы, C_1-6 -эамещенные алкилы, С_3-8-замещенные циклоалкилы, арилы, замещенные арилы, аралкилы, C_1-6-гетероалкилы, замещенные C_1-6-гетероалкилы, C_1-6-алкокси, фенокси и C_1-6-гетероалкокси;

n' означает целое положительное число;

y' означает ноль или целое положительное число;

t' означает целое положительное число и

p' равно нулю или единице;

в условиях, подходящих для образования соединения формулы (iii)

Данный способ может также, необязательно, дополнительно включать стадию снятия защиты (iii), позволяющую получать полезное промежуточное соединение, которое может быть использовано в дальнейшем синтезе, активировано и/или конъюгировано с лекарственным веществом и т.д. Альтернативно, способ дополнительно может включать стадию взаимодействия (iii) с активирующим агентом в условиях, подходящих для образования соединения формулы (iv)

где А₂ означает активирующую группу и все другие переменные принимают вышеуказанные значения.

Согласно дальнейшим аспектам способ может включать стадию превращения аминозащитной группы (Т) формулы (iv) в активирующую группу в условиях, подходящих для образования соединения формулы (v)

где А₃ означает активирующую группу.

Тотчас же после получения соединения формулы (v) указанное соединение может быть подвергнуто взаимодействию с биологически активной составляющей, диагностическим агентом или концевой группой в условиях, подходящих для образования соединения формулы (vi)

где D₂ означает биологически активную составляющую, диагностический агент или концевую группу и все другие переменные принимают вышеуказанные значения.

Неограничивающий список подходящих агентов сочетания включает: 1,3-диизопропилкарбодиимид (DIPC), любой подходящий диалкилкарбодиимид, 2-галоген-1-алкилпиридинийгалогениды (реагенты Mukaiyama), 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид (EDC), циклический ангидрид пропанфосфоновой кислоты (РРАСА) и фенилдихлорфосфаты и т.д., доступные, например, из коммерческих источников, таких как Sigma-Aldrich Chemical, или синтезируемые с использованием известных методик.

Предпочтительно взаимодействие заместителей осуществляют в инертном растворителе, таком как тетрагидрофуран (ТГФ), ацетонитрил (CH₃CN), метиленхлорид (DCM), хлороформ (CHCl₃), диметилформамид (ДМФА) или смеси указанных растворителей. Подходящие основания включают диметиламинопиридин (DMAP), диизопропилэтиламин, пиридин, триэтиламин, КОН, третбутилат калия и NaOH и т.д. Взаимодействие обычно осуществляют при температуре в пределах от примерно 0°С до примерно 22°С (комнатная температура).

В частности, один из способов получения высокомолекулярных полимерных конъюгатов включает:

1) взаимодействие амин-защищенного активированного полимерного остатка формулы

где n означает целое положительное число,

с гетеробифункциональным полимерным остатком формулы

где n означает целое положительное число,

с образованием соединения формулы

2) взаимодействие промежуточного соединения со стадии 1) с активирующей группой, биологически активной составляющей, диагностическим агентом или концевой группой, приводящее к образованию соединения формулы

где D₂ означает активирующую группу, биологически активную составляющую, диагностический агент или концевую группу, такую как, например, ала-камптотецин

3) снятие защиты с аминогруппы и активация указанной группы такой составляющей, как малеимид, с получением соединения формулы

4) и в дальнейшем взаимодействие малеимидного промежуточного соединения с биологически активной составляющей, такой как одноцепочечной антигенсвязывающий белок моноклонального антитела СС49 (связанный с TAG-72) или другой фрагмент любой из вышеуказанных составляющих, все здесь для удобства обозначены как "SCA", приводящее к образованию SCA-иммуноконъюгата формулы

где n означает целое положительное число.

Вышеуказанное представляет активированный карбонат с гетеробифункциональностью и карбаматным линкером. Специалисту понятно, что активированный сложный эфир может быть использован вначале способа для создания амидного линкера.

Для специалиста в данной области очевидно, что конъюгаты, полученные способами по настоящему изобретению, могут быть увеличены на одно или множество полимерных звеньев, что приводит, таким образом, к получению повторяющихся в определенном или статистическом порядке звеньев полимера в зависимости от выбранного способа получения требуемого конъюгата.

Вне зависимости от выбранного способа некоторые из предпочтительных соединений, получаемые по нижеописанным синтетическим методиками, включают

где В и В' означают уходящие группы, активирующие агенты, биологически активные агенты, диагностические агенты и т.д. и SCA означает одноцепочечное антитело.

Некоторые другие предпочтительные соединения включают:

Н. Способы лечения

Другой аспект настоящего изобретения составляют способы лечения различных заболеваний у животных. Способы включают введение нуждающемуся в таком лечении млекопитающему эффективного количества гетеробифункционального полимерного вещества по изобретению, полученного, как указано выше. Эти вещества полезны, помимо прочего, для лечения новообразований, уменьшения опухолевой массы, предупреждения метастазов новообразований и предупреждения рецидивов роста опухолей/новообразований у млекопитающих.

Количество вводимого соединения зависит от включенной исходной молекулы, например пептида, полипептида, белка, фермента, низкомолекулярных лекарственных средств и т.д. Обычно количество соединения, используемого в терапевтических методах, является таким количеством, которое эффективно обеспечивает требуемый терапевтический результат в организме млекопитающих. Естественно, дозировки различных соединений варьируются в зависимости от исходного соединения скорости гидролиза in vivo, молекулярной массы полимера и т.д. Специалисты в данной области должны установить оптимальную дозу соединения, выбираемую на основе клинического испытания и терапевтического показания. Фактические дозировки могут быть определены специалистом без проведения излишнего эксперимента.

Соединения по настоящему изобретению могут быть включены в одну или более подходящих фармацевтических композиций для введения млекопитающим. Фармацевтические композиции могут быть представлены в форме раствора, суспензии, таблетки, капсулы или тому подобного, полученных способами, хорошо известными из уровня техники. Также предусматривается, что введение таких композиций может осуществляться пероральным и/или парентеральным способами в зависимости от потребности специалиста. Раствор и/или суспензия композиции могут быть получены, например, в несущем растворителе для инъекции или инфильтрации композиции любыми известными из уровня техники способами, например, внутривенной, внутримышечной, подкожной инъекцией и тому подобным.

Такое введение может быть также осуществлено путем инфузии в определенную область или полость, а также ингаляционным и/или интраназальным способами. Однако согласно предпочтительному аспекту изобретения соединения вводят нуждающимся в такой терапии млекопитающим парентерально.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры приведены с целью дополнительного пояснения изобретения и никоим образом не рассматриваются как ограничивающие действительный объем изобретения. Номера соединений, перечисленные в примерах, отвечают номерам, приведенным на фиг.1-9.

Общие методики

Все взаимодействия осуществляют в атмосфере сухого азота или аргона. Промышленно выпускаемые реагенты используют без дополнительной очистки. Все соединения ПЭГ перед употреблением сушат в вакууме или азеотропной перегонкой из толуола. Спектры ЯМР получают, используя ЯМР-спектрометр Varian Mercury®300 и дейтерированный хлороформ в качестве растворителя, если не оговорено особо. Химические сдвиги в сторону слабого поля относительно тетраметилсилана (ТМС) ( ) приведены в миллионных долях (м.д.).

Метод ВЭЖХ. Мониторинг реакционных смесей и чистоты промежуточных соединений и конечных продуктов осуществляют с помощью ВЭЖХ-аппаратуры Beckman Coulter System Gold®, используя колонку с обращенной фазой ZOBAX® 300 SB C-8 (150×4,6 мм) или колонку с обращенной фазой Phenomenex Jupiter® 300А С18 (150×4,6 мм) с многоволновым УФ-детектором, при градиенте 30-90% смеси ацетонитрила в 0,5% трифторуксусной кислоте (TFA) и скорости потока 1 мл/мин.

Соединение 3. Раствор 1 (0,623 г, 0,180 ммоль), 2 (0,623 г, 0,180 ммоль) и N,N-диметиламинопиридина (DMAP, 0,110 г, 0,90 ммоль) в дихлорметане (DCM, 20 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 12 час. Раствор промывают 0,1 н. HCl (2×20 мл), сушат (MgSO₄), фильтруют, растворитель удаляют при пониженном давлении и кристаллизуют из изопропилового спирта (IPA, 25 мл), получая 3 (0,910 г, 0,134 ммоль, 74,3%).

¹³С ЯМР (67,8 МГц, CDCl₃) 171,91, 155,79, 155,30, 66,15, 63,32, 40,34, 39,91, 34,26, 28,02.

Соединение 4. Раствор 3 (0,707 г, 0,104 ммоль) в смеси DCM/трифторуксусная кислота (TFA) (8 мл:4 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 3,5 час. Растворитель удаляют при пониженном давлении и образующийся твердый продукт промывают диэтиловым эфиром, получая 4 (0,707 г, 0,104 ммоль, ~100%).

¹³С ЯМР (67,8 МГц, CDCl ₃) : 172,18, 155,94, 66,62, 66,32, 63,49, 40,49, 39,71, 34,46.

Соединение 5. К раствору 3 (0,910 г, 0,134 ммоль), 2-меркаптотиазолина (2-МТ, 0,0319 г, 0,268 ммоль) и DMAP (0,0327 г, 0,268 ммоль) в DCM (15 мл), охлажденному до 0°С в течение 15 мин, добавляют 1-[3-(диметиламино)пропил]-3-этилкарбодиимидгидрохлорид (EDC, 0,0513 г, 0,268 ммоль) и реакционный раствор оставляют постепенно нагреваться до комнатной температуры и затем перемешивают в течение 12 час. Производное ПЭГ осаждают с помощью диэтилового эфира, собирают фильтрованием и кристаллизуют из IPA (19 мл), получая 5 (0,820 г, 0,121 ммоль, 90,0%).

¹³С ЯМР (67,8 МГц, CDCl₃) : 200,94, 171,73, 155,85, 155,36, 65,75, 63,37, 55,54, 40,37, 39,94, 38,73, 28,08.

Соединение 6. К раствору 4 (0,668 г, 0,098 ммоль) в DCM (15 мл) добавляют DMAP с целью доведения рН до 7,0. Добавляют соединение 5 (0,677 г, 0,098 ммоль) и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 12 час. Раствор промывают 0,1 н. HСl (2×20 мл), сушат (MgSO₄), фильтруют, растворитель удаляют при пониженном давлении и остаток кристаллизуют из изопропилового спирта (IPA, 25 мл), получая 6 (1,053 г, 0,077 ммоль, 79,0%).

¹³С ЯМР (67,8 МГц, CDCl₃) : 171,97, 170,72, 155,87, 155,36, 66,83, 66,24, 63,39, 40,40, 39,99, 38,74, 36,50, 34,34, 28,08.

Соединение 8. К раствору 6 (0,616 г, 0,045 ммоль), соли 20-(S)-камптотециналанината с трифторуксусной кислотой (0,0706 г, 0,136 ммоль} и DMAP (0,111 г, 0,906 ммоль) в DCM (10 мл), охлажденному до 0°С в течение 15 мин, добавляют EDC (0,026 г, 0,136 ммоль) и реакционный раствор оставляют нагреваться до комнатной температуры. После перемешивания в течение 12 час раствор промывают 0,1 н. HCl (2×20 мл), сушат (MgSO₄), фильтруют, растворитель удаляют при пониженном давлении и остаток кристаллизуют из изопропилового спирта (IPA, 13 мл), получая 8 (0,536 г, 0,038 ммоль, 85,0%).

¹³С ЯМР (67,8 МГц, CDCl₃) : 171,09, 170,83, 170,63, 166,48, 156,82, 155,99, 151,82, 148,46, 146,01, 144,98, 130,77, 130,12, 129,40, 128,06, 127,77, 127,58, 119,7.2, 95,58, 66,97, 66,77, 63,57, 49,74, 47,56, 40,55, 40,14, 38,90, 36,70, 36,41, 31,48, 28,22, 17,58, 7,40.

Соединение 9. Раствор 8 (0,536 г, 0,038 ммоль) в смеси DCM/TFA (8 мл : 4 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 2 час. Растворитель удаляют при пониженном давлении и остаток промывают диэтиловым эфиром, получая 9 (0,536 г, 0,038 ммоль, ~100%).

¹³С ЯМР (67,8 МГц, CDCl ₃) : 170,99, 170,81, 170,60, 166,25, 156,58, 155,79, 151,56, 148,19, 145,79, 144,79, 130,71, 129,92, 129,12, 127,91, 127,63, 127,37, 119,46, 95,44, 66,71, 66,54, 63,34, 49,59, 47,45, 40,34, 39,59, 38,78, 36,34, 36,08, 31,24, 17,24, 7,20.

Соединение 11. К раствору 9 (0,818 г, 0,059 ммоль) в DCM (15 мл) добавляют DMAP с целью доведения рН до 7,0, затем добавляют 10 и раствор охлаждают до 0°С. К реакционной смеси добавляют 1,3-диизопропилкарбодиимид (DIPC, 0,0554 мкл, 0,354 ммоль) и смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры при перемешивании в течение 12 час. Раствор промывают 0,1 н. НСl (2×20 мл), сушат (MgSO₄), фильтруют, растворитель удаляют при пониженном давлении и остаток кристаллизуют из изопропилового спирта (IPA, 16 мл), получая 11 (0,65 г, 0,046 ммоль, 78%).

¹³С ЯМР (67,8 МГц, CDCl₃) : 172,22, 171,10, 170,84, 170,60, 170,32, 166,48, 156,83, 155,99, 151,82, 148,48, 146,04, 144,98, 133,70, 130,76, 130,13, 129,43, 128,06, 127,78, 127,60, 119,75, 95,56, 66,99, 66,77, 63,58, 49,74, 47,56, 40,57, 38,92, 37,39, 36,72, 36,43, 36,05, 31,48, 28,08, 26,17, 25,18, 24,86, 17,30, 7,40.

Соединение 12. А. Редукция белка СС49: к раствору 28 мг (2,79 мг/мл) СС49 в 100 мМ фосфата натрия, рН 7,8, при 37°С, добавляют 2 мМ EDTA с 2 мМ DTT и взаимодействию позволяют протекать в течение 2 час. DTT удаляют с помощью деминерализующей колонки, уравновешенной раствором 100 мМ фосфата натрия, рН 6,5, и 2 мМ EDTA. Конечная концентрация редуцированного белка составляет 0,39 мг/мл (~23 мг, ~60 мл, 83%).

В. ПЭГилирование: СС49 и 11 смешивают при молярном соотношении 1:10 в растворе 100 мМ фосфата натрия, рН 6,5, 2 мМ EDTA и осуществляют взаимодействие при 25°С в течение 2 час.

С. Очистка СС49-ПЭГ-СРТ: значение рН реакционной смеси доводят до 5 с помощью НОАс и воды (~200 мл) для снижения электропроводности раствора до значения менее 2 мс и смесь загружают на колонку Poros HS при 5 мл/мин. Продукт элюируют 1 М NaCl в 10 мМ раствора фосфата натрия и пиковые фракции белка объединяют и концентрируют, используя центрифужную пробирку Centriplus 30k. Осуществляют диализ концентрированной пробы против физиологического раствора и анализируют на активный компонент. Испытание при помощи йодного пятна показывает отсутствие не конъюгированных с белком частиц ПЭГ в продукте.

Соединение 13. Раствор 6 (4,50 г, 0,335 ммоль) в смеси DCM/TFA (30 мл:15 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 3,5 час. Растворитель удаляют при пониженном давлении и образующийся твердый продукт промывают диэтиловым эфиром, получая 13 (4,30 г, 0,320 ммоль, 95,6%).

¹³С ЯМР (67,8 МГц, CDCl ₃) : 171,59, 155,58, 66,36, 65,89, 63,02, 40,05, 39,36, 38,61, 35,85, 33,96.

Соединение 14. К раствору 13 (4,30 г, 0,320 ммоль) в DCM (50 мл) добавляют DMAP до рН 7,0. Затем добавляют соединение 5 (2,20 г, 0,320 ммоль) и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 12 час. Раствор промывают 0,1 н. HCl (2×30 мл), сушат (MgSO₄), фильтруют, растворитель удаляют при пониженном давлении и остаток кристаллизуют из изопропилового спирта (IPA, 25 мл), 14 (5,30 г, 0,260 ммоль, 81,2%).

¹³С ЯМР (67,8 МГц, CDCl₃) : 171,77, 170,60, 155,75, 66,73, 66,12, 63,28, 40,29, 39,86, 38,66, 36,41, 34,19, 27,99.

Соединение 15. Раствор 14 (5,30 г, 0,260 ммоль) в смеси DCM/TFA (30 мл : 15 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 3,5 час. Растворитель удаляют при пониженном давлении и образующийся твердый продукт промывают диэтиловым эфиром, получая 15 (5,30 г, 0,260 ммоль, ~100%).

¹³С ЯМР (67,8 МГц, CDCl₃) : 171,77, 170,60, 155,75, 66,73, 66,12, 63,28, 40,29, 39,86, 38,66, 36,41, 34,19.

Соединение 18. К раствору основания родамина В (1,00 г, 2,09 ммоль), гидрохлорида трет-бутилового эфира глицина (0,670 г, 4,0 ммоль) и DMAP (0,767 г, 8,0 ммоль) в DCM (30 мл), охлажденному до 0°С в течение 15 мин, добавляют EDC (0,767 г, 4,0 ммоль). Реакционную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры и перемешивают в течение 12 час. Раствор промывают 0,1 н. HCl (2×30 мл), сушат (MgSO₄), фильтруют, растворитель удаляют при пониженном давлении и остаток очищают хроматографией на колонке с силикагелем, используя гексан и этилацетат (3:2, об./об.) в качестве элюирующих растворителей, что дает 18 (0,937 г, 1,58 ммоль, 76%).

¹³С ЯМР (67,8 МГц, CDCl₃) : 167,30, 166,73, 153,06, 153,01, 148,36, 132,05, 130,60, 129,31, 127,63, 123,46, 122,67, 107,64, 104,69, 97,21, 80,80, 64,74, 44,10, 42,03, 27,63, 12,41.

Соединение 19. Раствор 18 (0,937 г, 1,58 ммоль) в смеси DCM/TFA (16 мл:8 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 2 час. Растворитель удаляют при пониженном давлении и образующийся твердый продукт промывают диэтиловым эфиром, получая 19 (0,930 г, 1,57 ммоль, ~100%).

¹³С ЯМР (67,8 МГц, CDCl ₃) : 169,30, 167,83, 152,72, 152,15, 144,14, 133,09, 130,28, 128,83, 123,64, 123,41, 112,32, 103,89, 64,69, 48,47, 41,49, 11,44.

Соединение 20. К раствору 19 (0,421 г, 0,785 ммоль), 2-МТ (0,140 г, 1,18 ммоль) и DMAP (0,287 г, 2,30 ммоль) в DCM (15 мл), охлажденному до 0°С в течение 15 мин, добавляют EDC (0,226 г, 1,18 ммоль) и реакционный раствор оставляют постепенно нагреваться до комнатной температуры и затем перемешивают в течение 12 час. Раствор промывают 0,1 н. HCl (2×20 мл), сушат (MgSO₄), фильтруют, растворитель удаляют при пониженном давлении, получая 20 (0,450 г, 0,706 ммоль, 90%).

¹³С ЯМР (67,8 МГц, CDCl₃) : 200,68, 168,90, 167,73, 153,27, 152,07, 148,10, 139,66, 132,47, 130,20, 129,39, 127,94, 123,63, 122,85, 108,19, 98,14, 65,11, 55,77, 51,31, 45,68, 44,68, 33,67, 29,09, 12,53.

Соединение 21. К раствору 15 (2,7 г, 0,134 ммоль) в DCM добавляют DMAP, доводя рН до 7. Добавляют соединение 20 (171 мг, 0,268 ммоль) и реакционный раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 12 час. Реакционную смесь промывают 0,1 н. НСl, растворитель выпаривают при пониженном давлении и твердый продукт кристаллизуют из IPA, получая 21 (2,3 г, 0,112 ммоль, 84%).

¹³С ЯМР (67,8 МГц, CDCl₃) : 201,00, 170,78, 167,73, 155,88, 152,86, 148,80, 132,51, 129,86, 128,06, 127,87, 123,59, 122,53, 108,14, 98,09, 66,86, 63,45, 55,57, 44,37, 43,99, 40,43, 38,80, 38,54, 36,57, 34,32, 28,10, 12,18.

Соединение 22. К раствору 21 (2,3 г, 0,112 ммоль), 2-МТ (0,027 г, 0,224 ммоль) и DMAP (0,027 г, 0,224 ммоль) в DCM (15 мл), охлажденному до 0°С, добавляют EDC (0,043 г, 0,224 ммоль). Реакционный раствор постепенно нагревают до комнатной температуры и перемешивают в течение 12 час. Производное ПЭГ осаждают диэтиловым эфиром, фильтруют и кристаллизуют из IPA, получая 22 (2,0 г, 0,097 ммоль, 86%).

¹³С ЯМР (67,8 МГц, CDCl₃) : 200,00, 171,70, 170,64, 167,.96, 167,68, 155,79, 152,86, 148,24, 132,38, 129,86, 127,84, 127,72, 123,55, 122,38, 104,12, 97,47, 66,80, 63,37, 55,51, 44,91, 40,37, 38,72, 38,44, 36,50, 28,08, 12,26.

Соединение 23. Раствор 22 (2,0 г, 0,097 ммоль), 3,5-диметил-4-гидроксибензилового спирта (0,059 г, 0,388 ммоль) и DMAP (0,048 г, 0,388 ммоль) в DCM (10 мл) нагревают до температуры кипения с обратным холодильником в течение 12 час. Производное ПЭГ осаждают диэтиловым эфиром, фильтруют и кристаллизуют из IPA, получая 23 (1,9 г, 0,096 ммоль, 99%).

¹³С ЯМР (67,8 МГц, CDCl₃) : 170,40, 168,40, 167,64, 167,38, 155,59, 152,65, 148,01, 132,13, 129,66, 129,11, 127,66, 126,16, 123,31, 122,14, 107,48, 103,99, 97,26, 66,88, 63,34, 43,70, 40,15, 38,52, 38,25, 36,26, 34,37, 15,76, 12,07.

Соединение 24. К раствору 23 (1,9 г, 0,097 ммоль) и N.N'-дисукцинимидилкарбоната (0,199 г, 0,775 ммоль) в DCM (20 мл) и ДМФА (2 мл), охлажденному до 0°С, добавляют пиридин (0,063 мкл, 0,775 моль). Реакционный раствор постепенно нагревают до комнатной температуры и перемешивают в течение 12 час. Производное ПЭГ осаждают диэтиловым эфиром, фильтруют и кристаллизуют из IPA, получая 24 (1,58 г, 0,075 ммоль, 77%).

¹³С ЯМР (67,8 МГц, CDCl ₃) : 171,22, 170,49, 168,35, 168,05, 167,73, 167,47, 155,65, 152,71, 148,07, 132,24, 129,69, 128,09, 127,72, 123,39, 122,23, 107,53, 104,02, 97,30, 66,65, 63,19, 43,77, 40,22, 38,57, 38,31, 36,22, 34,43, 24,89, 15,79, 12,13.

Соединение 25. Активированный ПЭГ-линкер 24 добавляют к раствору GFP (2 мг/мл) в 0,05 М HEPES, pH 7,8, при молярном соотношении 30:1 (ПЭГ:GFP). Раствор перемешивают при 25°С в атмосфере N ₂ в течение 45 мин, pH раствора снижают добавлением натрийфосфатного буфера, pH 6,4, до конечной концентрации 50 мМ.

Свободный ПЭГ удаляют на колонке Superdex 200 Hiload 16/60 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), используя Biocad Perfusion Chromatography Workstation. Элюирующий буфер содержит 10 мМ фосфата натрия, рН 6,8, и 150 мМ NaCl. Фракции, обладающие способностью к поглощению при 280 нм и флуоресценцией, объединяют и концентрируют, используя фильтрующее центрифужное устройство ultrafree-15 с мембраной NMWL 30k (Millipore Corp., Bedford, MA). Концентрацию ПЭГ-GFP (25) устанавливают с помощью УФ при 489 нм, используя коэффициент экстинкции 55000 см^-1М^-1.

Соединение 27. К раствору 6, 26 и DMAP в DCM добавляют EDC и раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 12 час. Растворитель удаляют при пониженном давлении и твердый продукт кристаллизуют из IPA, получая 27. Структуру 27 устанавливают методом ¹³С-ЯМР.

Соединение 28. Раствор 27 в смеси DCM/TFA перемешивают при комнатной температуре в течение 12 час. Растворитель удаляют при пониженном давлении и твердый продукт кристаллизуют из IPA, получая 28. Структуру 28 устанавливают методом ¹³С-ЯМР.

Соединение 29. К раствору 10, 2-МТ и DMAP в DCM, охлажденном до 0°С в течение 15 мин, добавляют EDC и реакционный раствор оставляют постепенно нагреваться до комнатной температуры и затем перемешивают в течение 2 час. После чего раствор промывают 0,1 н. HCl, сушат (MgSO ₄) и растворитель удаляют при пониженном давлении, получая 29. Структуру 29 устанавливают методом ¹³С-ЯМР.

Соединение 30. Раствор 28, 29 и DMAP в DCM перемешивают при комнатной температуре в течение 12 час. Растворитель удаляют при пониженном давлении, и твердый продукт кристаллизуют из IPA, получая 30. Структуру 30 устанавливают методом ¹³С-ЯМР.

Соединение 31. К раствору 30, 7 и DMAP в DCM, охлажденному до 0°С в течение 15 мин, добавляют EDC и реакционный раствор оставляют нагреваться до комнатной температуры. После перемешивания в течение 12 час раствор промывают 0,1 н. НСl, сушат (MgSO ₄), фильтруют и растворитель удаляют при пониженном давлении и остаток кристаллизуют из IPA, получая 31. Структуру 31 устанавливают методом ¹³С-ЯМР.