способ получения трипсина
Классы МПК: | C12N9/76 трипсин; химотрипсин |
Автор(ы): | Попова Вера Михайловна (RU), Самуйленко Анатолий Яковлевич (RU), Гуславский Александр Игнатьевич (RU), Беро Иван Леонтьевич (RU), Школьников Ефим Эмануилович (RU), Нежута Александр Александрович (RU), Еремец Владимир Иванович (RU), Лукина Виктория Алексеевна (RU), Скотникова Татьяна Анатольевна (RU), Скороходова Лариса Александровна (RU), Еремец Наталья Киреевна (RU), Кочиш Иван Иванович (RU) |
Патентообладатель(и): | ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РАСХН (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2009-06-04 публикация патента:
10.11.2010 |
Изобретение относится к биотехнологии. Подготовленную поджелудочную железу убойных животных измельчают до размеров 7-11 мм и подвергают экстрагированию в подкисленной дистиллированной воде при температуре 7-15°С и периодическом перемешивании. Разделяют суспензию на осадительно-фильтрующей центрифуге с автоматической выгрузкой осадка с применением фильтрующего элемента с размером пор 1-5 мм. Разделение на фракции после высаливания балластных веществ и трипсина проводят с использованием фильтрующего элемента с размером пор 16-20 мкм с последующим высушиванием целевого продукта методом распыления или сублимации. При этом обессоливание проводят диафильтрацией на ультрафильтрационных аппаратах с использованием полых волокон. Изобретение обеспечивает повышение выхода очищенного препарата, его активности и срока хранения. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.
Формула изобретения
1. Способ получения трипсина, предусматривающий двойное замораживание и двойное размораживание поджелудочной железы убойных животных, измельчение исходного сырья с последующим двойным экстрагированием в подкисленной дистиллированной воде, разделение суспензии на фракции фильтрованием, высаливание балластных веществ и трипсина, разделение на фракции с последующим высушиванием и расфасовкой целевого продукта, отличающийся тем, что измельчение исходного сырья проводят до размеров 7-11 мм, экстрагирование проводят при температуре 7-15°С и периодическом перемешивании в автоматическом режиме, разделение суспензии после экстрагирования осуществляют на осадительно-фильтрующей центрифуге с автоматической выгрузкой осадка с применением фильтрующего элемента с размером пор 1-5 мм, а разделение на фракции после высаливания балластных веществ и трипсина проводят с использованием фильтрующего элемента с размером пор 16-20 мкм с последующей сушкой целевого продукта методом распыления или сублимацией.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что удаление солей, используемых для высаливания балластных веществ и трипсина, проводят диафильтрацией с использованием аппаратов на полых волокнах.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биотехнологии, к технологии получения энзимов, а именно протеолитического фермента трипсина для использования в производстве культуральных вирусных вакцин, ветеринарии, медицине и других отраслях. Способ предусматривает измельчение поджелудочной железы убойных животных с последующим экстрагированием в подкисленной дистиллированной воде, разделением суспензии на фракции после экстрагирования на осадительно-фильтрующей центрифуге с автоматической выгрузкой осадка с применением фильтрующего элемента с размером пор 1-5 мм, высаливанием балластных веществ и фермента, разделением на фракции после высаливания на осадительно-фильтрующей центрифуге с автоматической выгрузкой осадка с применением фильтрующего элемента с размером пор 16-20 мкм, с последующим высушиванием целевого продукта методом распыления или сублимации и расфасовкой целевого продукта, обессоливанием фермента методом диафильтрации на ультрафильтрационных аппаратах с использованием полых волокон (см. табл.1, 2).
Изобретение относится к биотехнологии, получению энзимов, таких как протеолитический фермент трипсин для использования в производстве культуральных вирусных вакцин, ветеринарии, медицине и других отраслях.
Известен способ изготовления трипсина для получения однослойных тканевых культур (1), который включает основные этапы: измельчение исходного сырья, экстрагирование фермента, высаливание балластных веществ и фермента, включающие ручные способы фильтрования через тканые мешки после первого высаливания и сбора осадка трипсина на бумажном фильтре, сушкой высола трипсина в калориферной или вакуумной сушилке и последующим измельчением и просеиванием готового продукта. Недостатком этого метода является ручной способ разделения и длительная сушка препарата, в результате которой есть возможность обсеменения конечного продукта посторонней микрофлорой, помимо всего на конечной стадии необходимо его измельчение и просеивание.
Другой известный способ получения трипсина связан с сильной гомогенизацией исходного сырья, что приводит к образованию устойчивой суспензии, а выделение балластных веществ и липидов с помощью раствора хитозана является дорогостоящим компонентом, применение бельтинг-ткани мало производительно для больших производственных серий (2).
В качестве прототипа можно рассматривать способ получения трипсина (3), предусматривающий способы разделения суспензий после экстрагирования и высаливания с помощью центрифугальной техники, а сушку препарата распылительным высушиванием.
Технический результат заявленного изобретения заключается в повышении выхода очищенного препарата, его активности и срока годности. Указанная цель достигается тем, что для избежания устойчивости суспензии при экстрагировании исходное сырье измельчают до оптимальных размеров (7-11 мм) и экстрагируют при периодическом перемешивании в автоматическом режиме с последующим разделением суспензии на фракции на осадительно-фильтрующей центрифуге с применением фильтрующего элемента с размером пор 1-5 мм, а после высаливания балластных веществ и трипсина разделением на фракции на осадительно-фильтрующей центрифуге с использованием фильтрующего элемента с размером пор 16-20 мкм с последующей сушкой целевого продукта методом распыления или сублимации.
Изобретение поясняется следующими примерами:
Пример 1 (оптимальный вариант). Поджелудочную железу (ПЖ) после хранения (не менее 4 месяцев - не более 12 месяцев) и последующего попеременного двукратного замораживания и оттаивания измельчают на электромясорубке с диаметром отверстий решетки заявленного интервала 7-11 мм, что обеспечивает эффективное разрушение клеточных оболочек ткани, исключает при экстрагировании образование устойчивой суспензии, повышает активность фермента и полный его выход по сравнению с аналогами (2 мм и менее 2 мм) /способ 1, 2/ и прототипом (5-6 мм) /способ 3/ (табл.1). Измельчение сырья до размеров 7 и 11 мм /способы 4, 14/ также улучшает все указанные позиции, но несколько уступает способам 5-13 по объему образующегося после экстракции надосадка.
Экстрагирование фермента из поджелудочной железы (100 кг фарша) проводят в водной среде в 2 этапа в эмалированных или нержавеющих реакторах. Дистиллированную воду, подкисленную серной кислотой (7 мл на 1 л), добавляют к сырью в соотношении 2:1 при первом экстрагировании и 1:1 при повторном экстрагировании. Перемешивание суспензии в сравнении с аналогом и прототипом осуществляют в автоматическом режиме при температуре 7-15°С: при перемешивании в течение 3 мин и с остановкой на 7 мин, что исключает пенообразование и получение устойчивой суспензии, наблюдаемое при постоянном перемешивании. При этом происходит образование наибольшего надосадка (199 л) после отстоя на 1 этапе экстрагирования (из 100 кг фарша) и повышение активности фермента (табл.1).
Балластные белки и трипсин выделяли методом фракционного осаждения из экстрактов в два этапа с помощью сульфата аммония (230 г на 1 л при высаливании балластных белков и - 180 г на 1 л при получении высола трипсина).
В таблице 1 представлены данные известных (1, 2, 3) и предлагаемых способов (4-14), отличающиеся разделением суспензии на фракции после экстрагирования на центрифуге с размером пор фильтрующего элемента - от 0,5 мм до 10-12 мм и разделением на фракции после высаливания на центрифуге с размером пор фильтрующего элемента - от 12 мкм до 26-28 мкм. Предлагаемые способы 4, 7, 8, 12, 13, 14 при применении разделения суспензий на фракции после экстрагирования на центрифуге с размером пор фильтрующего элемента 1-5 мм и разделения на фракции после высаливания на центрифуге с размером пор фильтрующего элемента с размером пор 16-20 мкм наиболее оптимальные. Технологический процесс при этом сокращается на 25 час по сравнению со способом 3 и на 48 час по сравнению со способом 1.
Отделение балластных белков и липидов при добавлении к гомогенату 1% хитозана (способ 2) сокращает процесс, но для больших серий в производственных масштабах не приемлем, так как он дорог по сравнению с солями, используемыми при осаждении балластных белков и трипсина и срок хранения ниже.
Пример 2. Пример осуществляют аналогично примеру 1, который отличается тем, что для удаления солей используют аппараты УВА-2-5ПА, УВА-2-15ПА, УВА-2-50ПА, УВА-2-100ПА на полых волокнах ВПУ-5ПА, ВПУ-15ПА, ВПУ-50ПА, ВПУ-100ПА из ароматического полиамида с пределом задержания по белку 5, 15, 50, 100 кДа с использованием гидросистемы с помощью центробежного насоса марки ЦНГ-0,5/10.
Раствор трипсина (0,25%) очищают и концентрируют на ультрафильтрационных аппаратах (табл.2), при обессоливании препарата применяют метод диафильтрации (в фильтруемый раствор вводят растворитель, равный объему фильтрата). Аппараты УВА-2-5ПА, УВА-2-15 ПА (с полыми волокнами ВПУ-5ПА, ВПУ-15ПА и с пределом задержания по белку 5, 15 кДа) при ультрафильтрации исходного раствора трипсина дают мутный фильтрат, в то же время УВА-2-50 ПА, УВА-2-100ПА (с полыми волокнами ВПУ-50ПА, ВПУ-100ПА и большим пределом задержания по белку 50, 100 кДа) обеспечивают получение прозрачного фильтрата. Наибольшая степень обессоливания трипсина на 1 этапе происходит на аппарате УВА-2-50 ПА при высокой степени концентрирования, а на аппарате УВА-2-100ПА концентрирование на всех этапах имеет высокую степень, увеличивающуюся до значения 7,25 по мере удаления солей. При диафильтрации на этой установке эффект обессоливания исходного раствора возрастает с каждым последующим циклом. Ультрафильтрационные установки на полых волокнах позволили в благоприятных гидродинамических условиях осуществлять на компактных аппаратах очистку, концентрирование и обессоливание диафильтрацией ферментного раствора трипсина в стерильных условиях.
Таблица 2 | ||||||
Характеристики | Растворы | Цикл | Наименование разделительных аппаратов | |||
УВА-2-5ПА | УВА-2-15 ПА | УВА-2-50 ПА | УВА-2-100ПА | |||
Степень удаления солей диафильтрацией | Концентрат | 1 | 1,38 | 1,06 | 6,30 | 1,10 |
2 | 2,49 | 2,10 | 4,00 | 1,70 | ||
3 | 4,00 | 3.60 | 2,60 | 2,50 | ||
4 | 2,75 | 2.70 | 1,10 | 3,50 | ||
Степень концентрации | Концентрат | 1 | 1,87 | 6,04 | 5,94 | 5,23 |
2 | 1,22 | 4,15 | 5,99 | 6,00 | ||
3 | 1,63 | 2,79 | 4,09 | 5,41 | ||
4 | 3,44 | 3,05 | 4,32 | 7,25 | ||
Прозрачность | Фильтрат | 1-4 | мутный | мутный | прозрачный | прозрачный |
Производительность, л/мин | Фильтрат | 1 | 0,76 | 0,78 | 1,10 | 0,58 |
2 | 1,00 | 0,78 | 1,10 | 0,50 | ||
3 | 1,90 | 0,72 | 0,55 | 0,45 | ||
4 | 1,00 | 0,76 | 0,29 | 0,42 |
Источники информации
1. РСТ Латвийской ССР 424-84 ТУ ОКП 921.828.1500.
2. Патент РФ 2265053, С12N 9/76.
3. Авторское свидетельство SU 1628526, С12N 9/76.
Класс C12N9/76 трипсин; химотрипсин